nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien d pteronyssinus (DP) và ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc xây dựng tiêu chuẩn cơ s

Các tác giả đã đi sâu nghiên cứu các đặc tính sinh học, hóa sinh, miễn dịch của các dị nguyên nói trên, sử dụng các dị nguyên này trong chẩn đoán và điều trị các bệnh dị ứng đã mang lại

Bộ khoa học và công nghệ Công ty VẮC XIN pasteur Đà lạt

Báo cáo kết quả đề tài nhánh

KC 10-10/ 06-10/05

“Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của VẮC XIN dị nguyên

mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus gây các bệnh

dị ứng: Hen phế quản, Viêm mũi dị ứng, Viêm kết mạc”

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS.Lương Hồng Châu

Thời gian thực hiện: 01/07/2007 - 25/05/2009

7598-5 20/01/2010

Hà nội , 05 – 2009

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY VẮC XIN PASTEUR ĐÀ LẠT

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỂ TÀI NHÁNH

KC 10-10/06-10/05

“XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA VẮC XIN DỊ NGUYÊN

MẠT BỤI NHÀ ACARIEN D.PTERONYSSINUS GÂY CÁC BỆNH DỊ ỨNG:

HEN PHẾ QUẢN, VIÊM MŨI DỊ ỨNG, VIÊM KẾT MẠC”

Chủ nhiệm đề tài nhánh : TS Lương Hồng Châu

Cán bộ tham gia :

Ths Huỳnh Quang Thuận GS.TSKH Vũ Minh Thục

PGS.TS Nguyễn Tấn Phong BSCKII Phạm Thị Ngọc

Ks.Đinh Văn Minh

Hà nội, 05 - 2009

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay dị ứng chiếm một vị trớ quan trọng trong y học hiện đại, trờn thế giới 15 - 20% dõn số bị dị ứng, trong đú 20% bệnh nhõn mẫn cảm với dị nguyờn đường khớ, 300 triệu người hen Số người tử vong trờn thế giới là 20 vạn người tớnh trung bỡnh là cứ 40-60 người/triệu dõn, Mỹ > 6000 người, Anh, Đức, Phỏp > 3000 người, Việt Nam > 3000 người Tới năm 2015 cú thể

cú tới 1/2 dõn số mắc bệnh dị ứng Bệnh dị ứng đứng thứ 3 sau tim mạch, ung thư [13]

Do vậy, cỏc bệnh dị ứng là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng lớn ở nhiều khớa cạnh khỏc nhau, bao gồm cả việc làm giảm chất lượng cuộc sống, mất năng suất lao động, giảm khả năng học tập, chi phớ tốn kộm để điều trị, thậm chớ tử vong khi chỳng tiến triển thành hen

Ngày nay không còn ai nghi ngờ rằng nhiều bệnh dị ứng ( như Hen phế quản atopy, Viêm mũi dị ứng, mày đay, eczema atopy, và nhiều bệnh khác) do tác động của bụi nhà là một trong những nguyên nhân thông thường nhất (Helk et al, 1986; Berardino et al,1987; Plátt-Mills et al, 1987; Bousquet et al, 1988; Saint-Remy et al, 1988)

Tuy nhiên, mặc dù tỷ lệ mắc bệnh dị ứng trên thế giới rất cao, bản chất dị nguyên của mạt bụi nhà chưa được nghiên cứu đầy đủ

Để chẩn đoán một bệnh dị ứng, trước hết cần phải xác định nguyên nhân gây dị ứng (một hoặc nhiều DN đặc hiệu) Vì vậy tiến hành test mẫn cảm (sensitivity testing) với các DN điều chế được vẫn là phương pháp chủ yếu để tìm nguyên nhân của bệnh Mặt khác, phương pháp điều trị bằng DN còn gọi

là phương pháp “giảm mẫn cảm đặc hiệu” hoặc “liệu pháp miễn dịch” là phương pháp điều trị hiệu quả, nhất là khi người bệnh phải thường xuyên tiếp xúc với DN Phương pháp này chính là đưa DN vào cơ thể đã mẫn cảm với nó nhằm làm cho cơ thể thay đổi cách đáp ứng miễn dịch : thay đổi cân bằng

2

giữa các quần thể lympho bào T : Th1/Th2 nghiêng về Th1, làm giảm dòng

Th2/Tho đặc hiệu dị nguyên, dẫn tới sự giảm mẫn cảm các tế bào đích (tế bào

dị ứng) mastocyte, basophille làm giảm sự giải phóng các chất trung gian và

do đó hạn chế được các triệu chứng dị ứng Đó cũng là cơ sở của biện pháp tiêm chủng vaccin chống dị ứng

Ngày nay chúng ta đang chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của dị ứng học Dị ứng học hiện đại - là một khoa học tổng hợp, sử dụng những thành tựu của miễn dịch học phân tử, hóa miễn dịch, dược học, những kết quả của y học lâm sàng Tất cả những điều đó được phản ánh trong các phương pháp điều chế, chuẩn hóa và sơ đồ ứng dụng DN Đồng thời thông tin khoa học thực nghiệm

đã giúp cho việc điều chế các dạng chế phẩm DN thương mại hết sức nhanh chóng để đáp ứng nhu cầu của một số lớn bệnh nhân rất cần chẩn đoán và điều trị bằng các DN

Khi thảo luận vấn đề ứng dụng DN trong lâm sàng, cần phải nhấn mạnh rằng hiệu quả của liệu pháp miễn dịch liên quan chặt chẽ với độ chính xác lựa chọn bệnh nhân mà sự lựa chọn đó lại phụ thuộc đáng kể vào khả năng chẩn

đoán đặc hiệu bởi DN Do đó trao quyền sử dụng phổ DN rộng lớn cho các nhà lâm sàng là hết sức quan trọng

Hiện nay, việc điều chế cũng như ứng dụng DN nói chung và DN D.pteronyssinus nói riêng đã được tiến hành ở nhiều trung tâm dị ứng của nhiều nước trên thế giới với nhiều loại DN sản xuất ra mỗi năm, cung cấp cho nhiều nước như allergam, allergen, allerglobulin ở Việt Nam, trong nhiều năm gần đây việc điều chế và đưa vào ứng dụng các dị nguyên bụi nhà, bụi

bông, lông vũ đã được các tác giả Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hướng, Nguyễn Văn Sửu, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, v.v thực hiện thành

công Các tác giả đã đi sâu nghiên cứu các đặc tính sinh học, hóa sinh, miễn dịch của các dị nguyên nói trên, sử dụng các dị nguyên này trong chẩn đoán

và điều trị các bệnh dị ứng đã mang lại hiệu quả tích cực Song các tác giả chưa đi sâu nghiên cứu thành phần chính có khả năng tạo nên hoạt tính của dị

3

nguyên bụi nhà, đó là các loài mạt có trong bụi nhà và các sản phẩm thải của chúng Bụi nhà chỉ là môi trường sống của mạt Mặt khác, một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng dị nguyên bụi nhà để điều trị cho bệnh nhân hen phế quản và viêm mũi dị ứng cho kết quả thấp hơn so với dùng dị

nguyên mạt bụi nhà để điều trị

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng, nóng, có độ ẩm cao Đây là điều kiện thuận lợi cho mạt bụi nhà phát triển, đặc biệt đối với loài

phổ biến như D pteronyssinus Do đó việc nghiên cứu nghiên cứu các đặc tính sinh học của dị nguyên mạt bụi nhà D pteronyssinus để có thể ứng dụng vào

thực tế y học nước ta là một yêu cầu cấp thiết và có ý nghĩa khoa học Xuất phất từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Xõy dựng Tiờu chuẩn cơ sở của Văcxin dị nguyờn mạt bụi nhà

Acarien D.pteronyssinus gõy cỏc bệnh dị ứng: Hen phế quản, viờm mũi dị

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ CỦA DỊ ỨNG VÀ ĐIỀU TRỊ DỊ ỨNG VỚI DỊ NGUYÊN MẠT BỤI NHÀ

1879 - Dr John Bostock lần đầu tiên mô tả chính xác bệnh sốt mùa hè là một bệnh ảnh hưởng tới đường hô hấp trên

1869 - Với phát hiện ra chính bệnh sốt mùa hè của mình, Dr Charles Blakely thực hiện test da đầu tiên bằng cách dùng phấn hoa qua một vết sứt nhỏ trên da của ông Ông đưa ra quan điểm rằng phấn hoa gây ra bệnh sốt mùa hè

1911 - Noon và Freeman tạo ra các chiết xuất phấn hoa vô trùng và chứng minh rằng các lần tiêm lặp lại làm cải thiện sự dung nạp lâm sàng khi tiếp xúc với dị nguyên, tạo ra cơ sở cho điều trị miễn dịch dùng chiết xuất dị nguyên

Các chiết xuất dạng dung dịch đầu tiên: Curtis (1900)

Những phát hiện mang tính hệ thống về phương pháp chiết xuất: Wodehouse và Walker (1917) và Coca (1920)

Các nhà dị ứng học đầu tiên điều chế các chiết xuất trong phòng thí nghiệm của chính họ để sử dụng cho bệnh nhân của họ

1967 - Các nhà khoa học khẳng định rằng mạt bụi nhà thông thường là nguồn chính gây ra dị ứng trong nhà

1978 - Mạt được xác định là nguyên nhân chủ yếu gây hen cho trẻ em ở Vương quốc Anh

1983 - Các nghiên cứu về tránh mạt chứng minh sự cải thiện sức khoẻ ở trẻ em và người lớn bị hen

1987 - 35 bác sỹ, với sự hỗ trợ của tổ chức Y tế thế giới, mô tả mạt bụi nhà là một nguyên nhân chủ yếu gây bệnh dị ứng trên toàn thế giới

1988 - Phân tích DNA đầu tiên xác định dị nguyên chính của Mạt (Der p1) là một enzym có hoạt tính

1992 - Một nghiên cứu về tránh mạt sâu hơn ở trẻ em bị hen chứng minh

sự cải thiện sức khoẻ; ngoài ra các bác sỹ đã đưa ra các hướng dẫn để hỗ trợ việc tránh dị nguyên trong điều trị bệnh

1995 - Một bài báo tổng hợp tất cả nghiên cứu về mạt, sinh học của mạt

và vai trò của mạt trong dị ứng được xuất bản; và có thêm bằng chứng khoa học của sự phá huỷ tế bào gây ra do các thành phần từ mạt

1996 - Có các bằng chứng mô tả các thành phần mạt có thể gây ra các triệu trứng kiểu dị ứng trước khi phát triển thành dị ứng thực sự

1997 - Các Hướng dẫn mới về hen khuyến cáo tránh dị nguyên mạt trong điều trị hen

1998 - Các nhà khoa học mô tả cách thức các dị nguyên mạt có thể gây

ra hen dị ứng

2000 - Sự khẳng định về Y học rằng sự nhạy cảm với mạt bụi nhà ở trẻ

em phụ thuộc vào liều lượng, và ở trẻ nhỏ bị hen do mạt càng tiếp xúc với mạt nhiều thì tình trạng hen càng nặng

2001 - Các nhà khoa học mô tả cách thức các dị nguyên mạt có thể gây

ra ngứa, đỏ mắt và chảy nước mắt là bằng cách phá huỷ hàng rào bảo vệ của mắt để gây viêm kết mạc

2003 - Dị nguyên mạt chính (Der p1) có thể làm giảm sự bảo vệ phổi tự nhiên chống lại vi khuẩn thông thường và có hại

2003 - Chó có thể bị eczema do tiếp xúc với mạt bụi nhà

2003 - Tránh dị nguyên mạt để cải thiện tình trạng hen vẫn chưa được chấp nhận là có hiệu quả bởi các tổ chức y tế

2005 - Sự cải thiện về sức khoẻ và giảm sử dụng thuốc được xác định ở trẻ bị hen sử dụng cách bọc giường và đồ ngủ với vật liệu có lỗ siêu nhỏ để giảm tiếp xúc với mạt

2007 - Sự dị ứng với mạt vẫn đang tăng lên thậm chí ở các thành phố có không khí sạch

Ngày nay, dị ứng học đã trở thành một lĩnh vực quan trọng của y học không chỉ bởi người ta ngày càng tìm ra nhiều bệnh có cơ chế dị ứng: hen phế quản, viêm mũi dị ứng, mày đay, phù Quinke, dị ứng thuốc, xơ cứng bì mà còn do tỷ lệ người mắc bệnh dị ứng ngày càng gia tăng [1], [8]

Các thống kê dịch tễ học gần đây ở trong và ngoài nước cho thấy, các bệnh dị ứng đường hô hấp trên - chủ yếu là VMDƯ và hen phế quản (HPQ) chiếm tỷ lệ từ 10-15% dân số, tương ứng với 2,5% - 3,5% tổng số người bệnh đến khám bệnh ở mọi chuyên khoa và chiếm một phần đáng kể trong kinh phí dành cho y tế

- Thụy Điển: 25,87% VMDƯ; 8,1% HPQ

- Na Uy: 24,95% VMDƯ; 8,51% HPQ

- Việt nam : 15 - 20% VMDƯ; 5 - 7 % HPQ

- Một số nước Đông Nam Á: VMDƯ ở Thái Lan: 38,63%; Singapore: 39,58%; Indonexia: 41,45% [9], [11], [14], [28], [32], [41], [44]

Giống như phần lớn các môn hóa sinh, lịch sử thuật ngữ dị nguyên quay trở về thời gian khi các dị nguyên phân lập được bằng cách sử dụng một số kỹ thuật tách sinh hóa "kinh điển", và phần hoạt tính (phần lớn có tính dị nguyên) thường được đặt tên theo ý nghĩ chợt nảy ra của nhà nghiên cứu Đã có những

cố gắng sớm để tinh lọc dị nguyên phấn hoa và dị nguyên mạt bụi nhà, sử dụng chiết phenol, kết tủa muối và các kỹ thuật điện di trong những năm

7

1940-1950 Trong những năm 1960, sự trao đổi ion và môi trường lọc trong gel đã được đưa vào sử dụng, và dị nguyên đầu tiên được tinh lọc là "kháng nguyên E" của cỏ phấn hương Dị nguyên này được King và Norman đặt tên

vì nó ở một trong năm phân đoạn kết tủa (đánh dấu từ A đến E)

Đỉnh cao phát triển đầu những năm 1970 là những nghiên cứu về các kháng nguyên của Marsh, mô tả các tính chất phân tử của các dị nguyên, các yếu tố ảnh hưởng đến tính dị nguyên, đáp ứng miễn dịch với dị nguyên, và các nghiên cứu miễn dịch di truyền của đáp ứng IgE với các dị nguyên phấn hoa tinh lọc Những nghiên cứu đầu tiên của Marsh định nghĩa rõ ràng về một dị nguyên "chính" là một dị nguyên tinh khiết cao gây đáp ứng test da tức thì ở

> 90% bệnh nhân có đáp ứng test da Hiện nay, nói chung một dị nguyên

chính là dị nguyên mà hơn 50% bệnh nhân dị ứng phản ứng với nó

Một dị nguyên chính thường có các tiêu chuẩn sau:

1 Tỷ lệ mẫn cảm > 80% (>2 ng IgE đặc hiệu dị nguyên/mL) ở một quần thể lớn bệnh nhân dị ứng

2 Một tỷ lệ đáng kể IgE toàn phần (>10%) có thể là đặc hiệu dị nguyên

3 Sự hấp thu dị nguyên từ nguyên liệu nguồn làm giảm đáng kể hiệu năng chiết xuất

4 Sự hấp thu huyết thanh bằng dị nguyên tinh khiết làm giảm đáng kể IgE đặc hiệu với chiết xuất dị nguyên

5 Dị nguyên chiếm một tỷ lệ đáng kể protein có thể chiết xuất được trong chất liệu nguồn

6 Có thể sử dụng dị nguyên làm một dấu hiệu đánh giá tiếp xúc môi trường

7 Có thể đo được cả đáp ứng kháng thể và đáp ứng tế bào với dị nguyên trong một tỷ lệ cao bệnh nhân dị ứng

8 Dị nguyên đã chứng tỏ hiệu quả như một phần của một vacxin dị ứng

8

Tài liệu trên thế giới thường xuyên được bổ sung bởi các sách hướng dẫn xem xét toàn diện các vấn đề về dị ứng học Người ta đang thảo luận các điều kiện hình thành các loại tăng độ mẫn cảm khác nhau, các cách chẩn đoán, điều trị và phòng các trạng thái dị ứng Việc giải quyết những nhiệm vụ này phụ thuộc đáng kể vào danh mục và chất lượng của các DN Số lượng các tập chuyên khảo nói về DN như một loại sinh phẩm không nhiều Tuy nhiên, những tiến bộ của dị ứng học ứng dụng, hóa miễn dịch và công nghệ sinh học thường xuyên mở ra những triển vọng mới đối với việc tạo nên các chế phẩm

DN Việc nghiên cứu sâu các thành phần DN phối hợp với những kết quả nghiên cứu lâm sàng cho phép tách các thành phần ít hoạt tính và để lại các phân đoạn chính của DN [23], [25], [32], [41], [95]

Thực tiễn y học đã sử dụng rộng rãi các chế phẩm DN được chiết xuất bởi nước - muối để chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh dị ứng và đặc trị bằng MDĐH Việc mở rộng danh mục các DN đã dẫn tới sự cần thiết phải tiến hành một số lượng lớn các mẫu thử nghiệm chẩn đoán trên da, kết hợp với việc tăng số lượng bệnh nhân đã làm phức tạp công việc của ngành dị ứng học Ngoài ra đi đôi với việc dùng các chiết xuất nước - muối để chữa bệnh đôi khi gây nên các phản ứng quá mẫn tại chỗ, từng vùng và từng hệ thống ở những người mẫn cảm cao, đặc biệt là khi sử dụng các mũi tiêm DN có nồng

độ lớn Thời gian của đợt điều trị cũng là một vấn đề rất quan trọng đối với bệnh nhân, đòi hỏi các bác sĩ lâm sàng phải mất nhiều thời gian chăm sóc Chính vì vậy mà trong thời gian vừa qua đã có nhiều đề xuất về cấu trúc các dạng DN mới Ví dụ, với mục đích chẩn đoán, người ta đã áp dụng các hệ thống hấp thu DN bằng phóng xạ RAST (Radio Allergosorbent Test) và ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Trong nghiên cứu các thể

DN điều trị, một trong những xu hướng được chú ý là biến đổi những KN làm mất đi khả năng phản ứng với những kháng thể đặc hiệu loại IgE mà vẫn duy trì hoạt tính miễn dịch (hình thành trong cơ thể các kháng thể bao vây loại

9

IgG) Đã có dự tính sử dụng các kháng nguyên với nồng độ nhỏ nhất để chữa bệnh bằng cách nối chúng với các chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu [48], [53], [54], [55], [63], [64], [65], [94], [96], [97], [98]

Việc sử dụng an toàn và có hiệu quả các seri DN khác nhau ở một mức

độ đáng kể tùy thuộc vào việc tiêu chuẩn hóa chúng và phương pháp kiểm tra chất lượng Trong các công trình điều chế và tiêu chuẩn hóa DN của Việt Nam, chúng tôi sử dụng phương pháp điều chế DN theo dạng nước - muối Chúng tôi cố gắng phản ánh đầy đủ tình hình hiện nay trong lĩnh vực nghiên

cứu và điều chế DN nói chung, đặc biệt là DN D.pteronyssinus, phát hiện các

đặc điểm lý-hóa, miễn dịch và ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị GMCĐH [9], [11], [15], [39], [40], [63], [83], [93], [94], [95]

1.3 MẠT BỤI NHÀ DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS

1.3.1 DỊ NGUYÊN MẠT BỤI NHÀ D.PTERONYSSINUS

Mạt bụi nhà (tiếng Anh - house dust mites, tiếng Pháp - les acariens) được nhà da liễu Scheremetevsky (Nga) phát hiện năm 1876, Bogdanov (Nga

1894) mô tả dưới tên Dermatophagoides scheremetewskji Sau đó, các nhà nghiên cứu ở châu Âu thấy Dermatophagoides pteronyssinus mà đôi khi gọi

chúng là những con mạt nhỏ (Microacariens) ở trên giường, mặc dù chúng sống cả ở trong vải bọc gỗ mềm, tấm thảm và các đồ đạc có vải bọc khác [9], [22], [25], [43], [47], [68]

Kern (1921), Cooke, Storm van Leeuven (1922) phát hiện phản ứng da dương tính với dịch chiết bụi nhà có mạt trong đó ở các bệnh nhân dị ứng Năm 1925, Varekamp đã thu nhận được chế phẩm từ dịch chiết mạt và thử nghiệm trong lâm sàng dị ứng Tác giả đã chỉ ra vai trò của MBN trong việc gây bệnh dị ứng nhưng chưa khẳng định được tính KN chủ yếu của chúng trong thành phần của bụi nhà Tuy nhiên, mối quan tâm rộng rãi tới nguồn DN gây cảm ứng bệnh chỉ được thể hiện trong nửa sau của thế kỷ XX

10

Năm 1964, Voorhorst và cộng sự nhận thấy rằng mạt Dermatophagoides

(Bogdanov, 1894) có mặt trong bụi nhà là nguyên nhân gây HPQ; Voorhorst

và cộng sự (1969) kết luận rằng Dermatophagoides pteronyssinus

(Trouessart, 1897) là nguồn DN chủ yếu gây bệnh cơ địa dị ứng do bụi nhà

Các tác giả đã chứng minh sự phụ thuộc trực tiếp của tần số phản ứng với chế

phẩm bụi nhà ở các bệnh nhân vào độ bão hòa mạt trong bụi nhà Trong

nghiên cứu này, người ta đã xử lý đặc biệt một trong các phần bụi được thu

thập ở vùng núi cao Thụy Sĩ với số lượng mạt không đáng kể, sau đó làm cho

tất cả mạt đều chết Tiếp theo chia nguyên liệu làm 2 phần, rồi đưa một lượng

nhỏ mạt sống vào 1 trong 2 phần đó Cả 2 phần nguyên liệu giữ trong điều

kiện tối ưu cho mạt sinh sản trong 3 tháng Sau đó tách chiết DN theo cùng

một kỹ thuật Kết quả cho thấy chế phẩm tách chiết từ phần có mạt bụi nhà

sống có hoạt tính KN mạnh gấp 100 lần Nghiên cứu này đã khẳng định cơ sở

tác dụng gây dị ứng của bụi nhà là D pteronyssinus Từ đó các nhà nghiên

cứu hướng vấn đề dị ứng vào MBN [9], [10], [11], [16], [18], [25], [47]

Hàng loạt các công trình nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới đã

chứng minh chính MBN, đặc biệt là loài D pteronyssinus - thành phần quan

trọng nhất của bụi nhà quyết định hoạt tính KN của nó và cho rằng DNBN chỉ

mang tính KN khi có mạt trong bụi [9], [11], [25], [43], [79], [100]

Hình 1.1 Mạt D pteronyssinus

2003 của nhiều nhóm tác giả [2, 6, 8] mới chỉ dừng lại ở dị nguyên bụi nhà toàn phần, dị nguyên lông vũ, dị nguyên bụi bông Sự khẳng định của các công trình khoa học trên thế giới: thủ phạm chính gây nên HPQ, VMDƯ,

Viêm kết mạc do bụi nhà chính là Acarien D pteronyssinus, hoạt tính kháng nguyên của dị nguyên bụi nhà phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng Acarien D

pteronyssinus có trong bụi nhà Bởi vậy, ngay từ những năm 90 các nhóm

nghiên cứu trong nước đã hướng tới việc phân lập, nuôi cấy mạt bụi nhà D

pteronyssinus nhưng chưa thành công do chưa nghiên cứu được các môi

trường nghiên cứu cho mạt bụi nhà D pteronyssinus tồn tại và phát triển Đến

năm 2003, nhóm nghiên cứu của Labo Miễn dịch dị nguyên thuộc Bệnh viện Tai Mũi Họng TW bước đầu đã nghiên cứu thành công một số môi trường

nuôi cấy đã điều chế dị nguyên D pteronyssinus từ các môi trường này và

bước đầu thử nghiệm trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu trong VMDƯ đã cho kết quả hết sức khả quan từ 75-85% Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu ban đầu rất đáng khích lệ này, nhóm nghiên cứu chúng tôi hy vọng rằng được thực hiện đề tài này nhằm xây dựng và hoàn thiện quy trình công

nghệ sản xuất vắc xin dị nguyên D pteronyssinus để phục vụ công tác dự

phòng chẩn đoán và điều trị bệnh dị ứng: HPQ,VMDƯ, Viêm kết mạc do dị

nguyên D pteronyssinus tại Việt Nam

1982 : Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục v.v… nghiên cứu về bụi nhà toàn phần

1987 : Vũ Minh Thục, Nguyễn Năng An, Nguyễn Chí Phi : “Nghiên cứu

về thành phần hóa sinh miễn dịch của dị nguyên bụi nhà”

1990 : Vũ Minh Thục : Nghiên cứu về vai trò của mạt bụi nhà trong bệnh dị ứng (Luận văn PTS)

1993 : Nguyễn Văn Hướng và CS nghiên cứu về : “Điều chế, tiêu chuẩn hóa và ứng dụng trong lâm sàng của dị nguyên bụi nhà toàn phần”

2001 : Vò Minh Thôc, Ph¹m Quang Chinh, Lưu Tham Mưu nghiªn cøu

®iÒu tra 2 loµi m¹t bôi nhµ g©y bÖnh dÞ øng: D.pteronyssinus vµ G domesticus

ë Hµ Néi vµ c¸c vïng phô cËn

2002 : Vò Minh Thôc, Ph¹m Quang Chinh, §¸i Duy Ban : “Nu«i cÊy m¹t

bôi nhµ D.pteronyssinus t¹o nguån dÞ nguyªn gãp phÇn chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ

bÖnh dÞ øng do m¹t bôi nhµ”

ë nưíc ta, theo c«ng tr×nh nghiªn cøu cña Vò Minh Thôc (1990) thÊy r»ng

Glycyphacus domesticus vµ Dermatophagoides pteronyssinus lµ 2 loµi D pteronyssinus phæ biÕn nhÊt ë Hµ Néi TÇn sè ph¸t hiÖn chóng trong c¸c mÉu

bôi tư¬ng øng lµ 89,09% vµ 43,64%, tû lÖ trªn tæng sè D.pteronyssinus tư¬ng

øng lµ 42,3% vµ 49,0% Sè lưîng cña chóng trong 1g bôi trung b×nh lµ 332,76±163,1 vµ 385,24±220,38 con [4]

1.3.2 VAI TRÒ CỦA MẠT BỤI NHÀ TRONG BỆNH DỊ ỨNG

Khi bạn hút bụi, quét, làm sạch bụi nhà vệ sinh nhà cửa (hoặc có mặt trong lúc đó) mà bạn bị chảy nước mũi, ngứa mũi và hắt hơi từng hồi, thì có thể là bạn đã dị ứng với một chất nào đó trong bụi nhà Thành phần chính xác nào gây ra dị ứng cho bạn có thể được khẳng định bằng phản ứng thử dị ứng tiến hành trên da, hoặc bằng phản ứng huyết thanh của bạn [9], [10], [25] Nếu bạn bị dị ứng với bụi nhà thì những triệu chứng của bạn thường xuất hiện cả trong hoặc ngoài nhà, ở trong nhà thường tệ hơn ngoài trời, và càng ở lâu trong nhà thì lại càng bị nặng hơn Thường thì các triệu chứng dị ứng với bụi thể hiện một cách xấu nhất vào lúc sáng, khi ngủ dậy Ngủ trên một cái giường bẩn hoặc một cái đệm bẩn thì có thể góp phần làm xuất hiện các triệu chứng, cũng như nằm ngủ dưới quạt trần hay quạt quay đi quay lại

13

một cách giao động khiến cho bụi trong nha bay quanh quẩn trong không khí khi bạn đi ngủ Những triệu chứng do một chất nào đó trong bụi nhà gây ra sẽ giảm đi hoặc sẽ mất đi khi bạn đi nghỉ, và sẽ trở nên tồi tệ khi bạn hết kỳ nghỉ trở về nhà [1, 4, 5, 15]

1.3.2.1 Mạt bụi nhà với bệnh dị ứng đường hô hấp

MBN là nguồn DN quan trọng và rất phổ biến trên thế giới Mẫn cảm dị ứng với MBN chiếm 10 – 20% dân số, nhưng biên độ dao động rất lớn, từ 8 – 40% Theo Dutau, MBN chiếm 60 – 70% nguyên nhân gây dị ứng đường hô hấp và tỉ lệ mẫn cảm tăng lên theo tuổi: 11,4% dưới 2 tuổi; 25% từ 2 đến 6 tuổi; 59,1% trên 6 tuổi; 70% trên 16 tuổi Loại mạt thường gặp trong các mẫu

bụi là D pteronyssinus và D farinae, bản chất dị nguyên của chúng là enzym

proteaza [1], [8], [9], [10], [20], [25], [28]

Mức độ mẫn cảm với MBN thường cao, do đó các dịch chiết mạt thậm chí ở nồng độ thăm dò 10-7 có thể gây phản ứng tại chỗ lẫn các phản ứng toàn thân và phản ứng ổ có biểu hiện Tuy nhiên, cần phải nhận thấy rằng bụi nhà khác nhau có thể khác nhau về độ bão hòa mạt Khi phân tích gần 300 mẫu bụi từ các căn hộ bệnh nhân HPQ, mạt được phát hiện ở 30,6% số mẫu bụi Mạt xâm nhập cơ thể bằng con đường hít Người ta phát hiện chúng ở da, đôi khi ở trong nước tiểu và chỗ ẩm ướt [41], [43], [44], [52], [54]

Đối với bụi nhà, MBN chiếm hơn 70% tính dị ứng nguyên Vì vậy người

ta đặt vấn đề xem xét lại thuật ngữ “dị ứng với bụi nhà”

Theo Pepys và cộng sự, tần số phát hiện D pteronyssinus trong các mẫu

bụi nhà là hơn 80%

Nhiều nhà nghiên cứu đã phát hiện thành phần khu hệ mạt nhà ở và tỉ lệ

dị ứng do MBN ở các khu vực khác nhau và nhận thấy rằng D pteronyssinus

là loài mạt có hoạt tính gây dị ứng cao phổ biến nhất, chiếm từ 70 – 98% tổng

số mạt phát hiện được Thành phần hệ MBN phụ thuộc nhiều yếu tố khác

MBN là nguyên nhân gây các bệnh HPQ, viêm mũi, viêm kết mạc dị ứng Ngoài ra, chúng còn là căn nguyên của bệnh mày đay mạn tính, viêm da

dị ứng Nhiều nhà nghiên cứu đã xác nhận mối liên hệ của các bệnh dị ứng kể

trên với mạt D pteronyssinus

Tỉ lệ mạt trong bụi nhà là yếu tố bệnh căn của HPQ và các bệnh khác, dao động lớn và phụ thuộc vào điều kiện địa lý-khí hậu Ở nước có khí hậu

duyên hải ẩm, sự mẫn cảm với DN D pteronyssinus chiếm 70 – 100% số

trường hợp bệnh nhân HPQ dị ứng Ở nước có khí hậu lục địa khô, tỉ lệ này thấp hơn và dao động từ 14,1 đến 43,2% [1], [9], [10], [11], [20], [22], [25] Tovey và cộng sự đã chứng minh các mẫu phân mạt cũng là một nguồn DNBN quan trọng Kanchurin và cộng sự nhận thấy về hoạt tính, phân mạt không khác so với các chế phẩm từ cơ thể mạt Việc sử dụng ức chế RAST của Stewart và cộng sự đã cho thấy hoạt tính tiềm tàng của dịch chiết mạt nguyên vẹn cao hơn 3 lần so với dịch chiết từ vỏ cuticul của chúng hoặc từ môi trường nuôi cấy chúng [1], [32], [43], [46], [65]

Ở các nước khác nhau, có 14 - 100% số bệnh nhân dị ứng cho thử

nghiệm da dương tính với DN mạt Dermatophagoides sp do đó ở các nước

trên thế giới, đang tiến hành nghiên cứu vấn đề dị ứng với MBN

Sự mẫn cảm với DN mạt xảy ra chủ yếu bằng đường mũi Khi giũ đồ trải giường, quét dọn phòng, các DN mạt lọt vào đường hô hấp Lúc này những thành phần mạt khô và bị hủy hoại bay lên và được hít vào cùng với không khí Hoạt tính của DN mạt tỉ lệ thuận với thành phần mạt trong nó Khi giảm hoặc loại trừ được MBN khỏi môi trường chung quanh bệnh nhân, tính phản

sử dụng DNBN chuẩn để phát hiện bệnh dị ứng ở các nước Vấn đề này rất quan trọng đối với dị ứng học thực hành, đặc biệt, nếu chú ý đến ý kiến của Ado cho rằng bụi có tính đặc hiệu đối với từng bệnh nhân Khi nghiên cứu tính chất DN của bụi có nguồn gốc khác nhau, Ado và cộng sự nhận thấy ý nghĩa của “bụi cá nhân” trong bệnh sinh HPQ

Nhiều tác giả cho rằng ngoài con đường hít còn có thể có con đường tổn

thương do tiếp xúc với mạt D pteronyssinus Chẳng hạn, các nhà nghiên cứu Nhật Bản chỉ ra rằng giống mạt Dermatophagoides có thể đóng vai trò bệnh sinh của mày đay Các tác giả đã tiến hành thử nghiệm dưới da với DN D

pteronyssinus và D farinae ở 138 bệnh nhân mày đay mạn tính Đã phát hiện

phản ứng dương tính với D pteronyssinus ở 37 bệnh nhân (26,8%), còn với

D farinae – ở 68 bệnh nhân (40,3%) Titova và cộng sự, Kanchurin,

Vaitsekauskaite đã chỉ ra vai trò của mạt trong bệnh căn mày đay, chứng

minh sự mẫn cảm với D pteronyssinus ở những bệnh nhân mày đay bằng các

thử nghiệm da và phản ứng phân hủy tế bào mast gián tiếp

Đã có những tài liệu nói về vai trò bệnh căn của MBN trong các bệnh da

dị ứng của người như viêm da dị ứng và viêm da thần kinh

Kể từ khi Voorhorst R (1964) chỉ ra vai trò của MBN trong việc phát sinh HPQ dị ứng, đến nay nhờ tạo ra được các KT đơn dòng người ta đã đo

16

được số lượng DN trong môi trường sống, mức độ DN có thể gây mẫn cảm cũng như mức độ DN dẫn đến xuất hiện triệu chứng bệnh lý

Các hạt phân của mạt chứa phần lớn DN Der p I, có kích thước trung

bình 20 µm, trong đó 4% Der p I có kích thước dưới 5 µm có thể được hít thẳng vào phổi DN MBN có hoạt tính enzym, do đó làm tăng tính thấm của hàng rào biểu mô đường hô hấp Các phần tử DN này có nhiều trong bụi của vải bọc nệm giường, chăn, gối, thảm Khi quét dọn hoặc giũ các đồ đạc trên, chúng lơ lửng trong không khí khoảng 20 – 30 phút Đối với DN có kích cỡ lớn sẽ bị giữ lại ở niêm mạc mũi, còn DN có kích cỡ nhỏ đi thẳng vào phổi Tại các nơi đó, DN sẽ gây nên bệnh cảnh lâm sàng

Phần lớn các báo cáo đều cho thấy mức độ DNBN gây mẫn cảm là 2 µg/g bụi mịn (tương đương số mạt hơn 100 con/g) và mức độ gây xuất hiện triệu chứng bệnh lý là 10 µg/g bụi mịn (tương đương hơn 500 con/g)

Theo Platts-Mills và cộng sự, liều 2 µg/g bụi mịn của Der p I gây mẫn cảm, còn Dreborg chỉ ra liều 10 µg/g bụi mịn gây cơn hen cấp ở người mẫn cảm Nghiên cứu của Sporile và cộng sự ở Anh cho thấy nồng độ DN mạt trong bụi nhà của những đứa trẻ bị hen cao hơn nồng độ DN ở nhà những đứa trẻ khỏe mạnh Trẻ sơ sinh nếu sớm tiếp xúc với môi trường có nồng độ hơn

10 µg Der p I /g bụi sẽ xuất hiện bệnh hen trong 10 năm đầu

Mức độ biểu hiện bệnh cảnh lâm sàng của cá nhân có cơ địa mẫn cảm (atopy) tiếp xúc với môi trường có DN phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Độ mẫn cảm của từng cá nhân Liều lượng chung gây mẫn cảm và

biểu hiện dị ứng là 2 - 10 µg/g, một vài nghiên cứu cho thấy với liều DN mạt

từ 1 – 2 µg/g đã gây mẫn cảm ở một số trẻ nhỏ Ở môi trường có nồng độ DN thấp chỉ có cơ địa rất mẫn cảm mới thể hiện, môi trường có mức độ DN cao thì ngay cả người có cơ địa mẫn cảm yếu có thể bộc lộ triệu chứng của bệnh

17

+ Thời gian tiếp xúc Với liều DN thấp nhưng nếu tiếp xúc hàng ngày,

thường xuyên cũng làm xuất hiện triệu chứng ở người mẫn cảm Nghiên cứu của Ihre và cộng sự cho thấy nếu hít hàng ngày trong 1 tuần với liều DN rất thấp (dưới 1 mg/ngày hoặc dưới 1 pg/phút) sẽ tăng phản ứng phế quản

Mức độ DN mạt trong không khí thay đổi theo mùa và ảnh hưởng bởi sự thông khí, nhiệt độ, độ ẩm nên mức độ mẫn cảm và triệu chứng của bệnh cũng thay đổi theo

Ở nước ta, theo Nguyễn Năng An , Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục,

dị nguyên mạt bụi nhà chiếm vị trí lớn trong bệnh căn HPQ, Viêm mũi dị ứng

và nhiều bệnh dị ứng khác Các nghiên cứu trong nước đã chú ý tới vai trò

mạt thuộc họ Pyroglyphidae, trong đó D pteronyssinus – một loài MBN

thường gặp ở nước ta có ý nghĩa to lớn Có thể là do độ ẩm không khí cao gần như quanh năm, số ngày sương mù nhiều, nhiệt độ trung bình hàng năm tương đối cao đã tạo điều kiện thuận lợi cho mạt phát triển ở nước ta và làm cho vấn đề dị ứng với MBN ngày càng trở nên quan trọng Tuy nhiên, các công trình nói trên mới chỉ đánh dấu bước khởi đầu trên con đường nhận thức vai trò của MBN trong bệnh căn và bệnh sinh của các bệnh dị ứng ở nước ta

1.3.2.2.Vai trò của dị nguyên mạt trong cơ chế bệnh lý (quá mẫn typI)

a Cái gì trong bụi nhà đã gây ra dị ứng:

Một cuộc tranh cãi đã nổ ra trong nhiều năm tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới là chỉ một chất kháng nguyên đặc biệt duy nhất có trong bụi nhà gây ra dị ứng, hoặc triệu chứng do dị ứng gây ra có thể quy cho một trong những chất đã được thừa nhận là có trong bụi đáng nghi ngờ nhất, đó là những con mạt trong bụi nhà Tuy nhiên, mọi thành phần trong bụi nhà đều có thể là nguyên nhân của những triệu chứng, các loại côn trùng khác và phân của chúng, nhất là con gián, cũng như những mảnh vụn ở lông, da của các con vật nuôi trong nhà (chó và mèo) Thật là không may vì nhiều người có cơ địa

dị ứng lại thường dễ bị cảm ứng với nhiều thành phần trong bụi nhà của họ

18

Họ có thể phản ứng với mạt bụi nhà, bào tử nấm, phấn hoa và nước tiểu của mèo [9], [11], [77], [78], [79], [80]

b Thành phần nào của mạt bụi nhà gây ra dị ứng:

Người bị dị ứng với hạt tròn phân mạt Một con mạt sản ra một lượng khoảng 200 lần trọng lượng cơ thể nó, hạt tròn phân mạt chứa tiềm năng gây

dị ứng cao chỉ có trong thời gian ngắn ngủi của cuộc đời nó Khi thải ra ngoài, được không khí mang đi khi các vật dùng như thảm đệm, các đồ đạc.v.v bị xáo lộn Với kích thước siêu nhỏ (phải nhìn qua kính hiển vi mới thấy) những tiểu thể trên rất dễ hít vào mũi và phổi, ở đó nó làm khởi phát triệu chứng dị ứng, mật độ quần thể bọ sống trong nhà quyết định mức độ vấn đề mà bạn phải đương đầu với những tiểu thể phân chúng Mặc dù xác những con bọ chết có thể được khống khí mang đi, nhưng chúng không góp gì đáng kể cho việc bị dị ứng với MBN [77], [78], [79], [80], [82], [100]

c Cơ chế bệnh lý

+ Giai đoạn mẫn cảm: DN lần đầu tiên xâm nhập vào cơ thể mẫn cảm

tạo ra các kháng thể IgE đặc hiệu với DN (chưa có biểu hiện lâm sàng)

+ Giai đoạn tức thì: xảy ra trong 10 – 15 phút khi cơ thể tiếp xúc lại với

DN đã gây mẫn cảm Các triệu chứng như hen, ngạt mũi là do kết quả gắn kết giữa IgE và DN làm hoạt hóa tế bào mast ở niêm mạc mũi Các chất trung gian hóa học giải phóng ra từ các hạt trong tế bào như histamin, tryptaza Các chất trung gian mới hình thành có nguồn gốc từ màng tế bào như leucotrien, prostaglandin Các chất trung gian có nguồn gốc lipit như yếu tố hoạt hóa tiểu cầu cũng xuất hiện Các chất này gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến phù nề, ngạt mũi Các tuyến nhầy mũi tăng tiết Các dây thần kinh hướng tâm bị kích thích làm ngứa mũi, hắt hơi Các chất trung gian, đặc biệt

là histamin, kích thích sợi thần kinh hướng tâm và sợi trục giải phóng các nơropeptit tại chỗ (chất P và tachykinin) Những chất này lại kích thích tế bào

19

mast thoát hạt Ngoài ra, DN làm lympho bào T (CD4+Th0) hoạt hóa thành lympho T (CD4+Th2)

+ Giai đoạn muộn: xảy ra từ 2 – 48 giờ Đáp ứng tế bào chiếm ưu thế do

sự tương tác giữa các tế bào dưới ảnh hưởng của các cytokin Tính chất đặc trưng của HPQ, VMDƯ là sự tích tụ tại chỗ các tế bào viêm như lympho TCD4, eosinophil, basophil, nơrophil Trong đó, eosinophil giải phóng ra một lượng rất lớn các protein cơ bản gây độc tế bào biểu mô đường hô hấp và sự

có mặt của các ion kích thích tế bào mast thoát hạt

Các biểu hiện trên đều do các cytokin điều biến Ngoài các tế bào lympho T, cytokin còn tiết ra từ các tế bào mast, basophil, đại thực bào và tế bào biểu mô IL-4 kích thích lympho B tăng sản xuất IgE, tăng bộc lộ các phân tử kết dính (ICAM) ở thành mạch để thu hút eosinophil đến mô tổ chức, chuyển lympho Th0 thành lympho Th2, bộc lộ các thụ thể IgE có ái lực thấp (CD23), ức chế tạo thành IFNγ, kích thích tế bào mono biệt hóa thành tế bào trình diện kháng nguyên IL-13 kích thích lympho B sản xuất IgE, bộc lộ thụ thể IgE có ái lực thấp (CD23), hoạt hóa tế bào nội mô bộc lộ phân tử kết dính

để thu hút các tế bào viêm tới tổ chức IL-5 có đặc tính chọn lọc đối với eosinophil, gồm kích thích biệt hóa và trưởng thành của các eosinophil từ tủy xương, hoạt hóa các eosinophil và làm tăng thời gian sống của nó ở tổ chức

20

Hình 1.2 Vai trò của dị nguyên MBN trong cơ chế bệnh lý

1.3.3 CÁC ĐẶC TÍNH HÓA SINH VÀ MIỄN DỊCH CỦA DỊ NGUYÊN MẠT BỤI NHÀ

Sự nghiên cứu chi tiết thành phần bụi nhà đã kích thích mối quan tâm

tới mạt mà bụi nhà là môi trường sống tự nhiên của chúng

Các số liệu cho thấy DNBN là glycoprotein có KLPT 25.000 – 40.000

Da, chịu nhiệt

Theo Fradkin, mặc dù phức glycoprotein là cơ sở dị nguyên của dịch chiết mạt, các KN đặc tính protein đóng vai trò chủ yếu Nhiều tác giả độc lập

với nhau đã nghiên cứu thành phần KN của các dịch chiết D pteronyssinus và

D farinae bằng các phương pháp hóa lý, hóa MD, đã tách được các phân

đoạn dị nguyên có dấu hiệu dị nguyên chính Những nghiên cứu chi tiết hơn cho thấy đây là polypeptit có KLPT 14.500 – 28.000 Da, chịu nhiệt Tuy nhiên, nghiên cứu của Platts-Mills, Chapman cho thấy tính nhạy cảm cao của

nó với nhiệt độ Nghiên cứu các dịch chiết của MBN bằng các phương pháp khác nhau (điện di miễn dịch chéo, siêu lọc, sắc ký, lọc gel v.v ), nhiều tác giả kết luận rằng tính gây dị ứng của DN mạt chủ yếu liên quan đến các phân đoạn có KLPT 24.000 – 50.000 Da Theo số liệu của nhiều nhà nghiên cứu

đoạn DN từ D farinae gồm có các glycoprotein, bao gồm 5 chất đường chủ

yếu: riboza, mannoza, D-galactoza, arabinoza, L-galactoza Wolden và cộng

sự đã nghiên cứu phần gluxit của DN D pteronyssinus đã tinh chế và ý nghĩa

của nó trong chẩn đoán mẫn cảm bằng phương pháp RAST Trước hết người

ta tinh chế DN, dùng phương pháp lọc gel trên sephadex G-100 và sắc ký trao đổi ion (phương pháp sau không cho phép tách các hợp phần gluxit) Phần gluxit của DN chủ yếu gồm có mannoza, galactoza, glucoza, N-acetylglucozamin, N-acetylgalactozamin, polysaccarit Polysaccarit gồm có hexozamin với các mạch bên có nhóm tận cùng là galactoza Sau khi xử lý đường bằng các chất oxi hóa, khả năng của DN mạt kết hợp với IgE đặc hiệu (trong test ức chế RAST) giảm rõ rệt Như vậy, mặc dù chế phẩm nghiên cứu chủ yếu là protein (65%), vai trò của phần gluxit của nó biểu hiện rõ ràng

Có tác giả cho rằng thành phần chủ yếu của DN mạt là protein, nhiều công trình nghiên cứu định tính và định lượng thành phần axit amin của các dịch chiết mạt và các phân đoạn của chúng, đã xác định được 16 axit amin

trong thành phần của DN mạt D pteronyssinus: asparagin, glutamin, glycin,

alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, cystein, prolin, phenylalanin, tyrosin, histidin, lysin, arginin, trong đó các axit amin không phân cực chiếm

tỉ lệ lớn Các số liệu thực nghiệm chứng tỏ khả năng KN tiềm tàng của DN mạt được quyết định bởi chính hàm lượng các axit amin không phân cực

22

Thành phần axit amin tương tự cũng được phát hiện ở DN mạt D farinae

Tuy nhiên, trong trường hợp này các tác giả phát hiện có methionin, không có isoleucin Các hydroxi axit amin được phát hiện với tỉ lệ khá lớn (serin – 6,84%, threonin – 4,58%) [6], [9], [11], [21], [25], [30], [43], [49], [53], [55]

Romagnani và cộng sự đã tiến hành thẩm tách dịch chiết D

pteronyssinus và D farinae và thẩm tách DNBN bình thường ngược với dung

dịch NaCl đẳng trương (đã đệm hóa) Chỉ thẩm tách được một phần nhỏ DN

Để phân đoạn các thành phần không thẩm tách, người ta sử dụng phương pháp lọc gel trên sephadex G-200, G-100, G-50, G-25 và DEAE-xenluloza Phát hiện protein trong mỗi phân đoạn bằng quang phổ kế (280 nm) KLPT của các phân đoạn không thẩm tách tương ứng với 10.000 – 50.000 Da Vị trí hoạt tính cực đại trong các dịch chiết mạt và bụi nhà là như nhau (chiết hấp ở 0,3 – 0,2M NaCl) Khi tiêm trong da cho bệnh nhân mẫn cảm với DN trong đời sống tất cả các phân đoạn cho kết quả giống với kháng nguyên của dịch chiết bụi nhà

Theo tài liệu của Fradkin, Ricci đã nghiên cứu thành phần KN của các

dịch chiết D pteronyssinus, D farinae, gàu người và bụi nhà toàn phần nhờ

kháng huyết thanh thỏ đặc hiệu thu được do gây MD động vật bằng dịch chiết

có tá dược Freund Bằng các phương pháp khuếch tán MD và điện di MD đã xác định được các KN giống nhau trong thành phần của các chế phẩm kể trên Khi phân đoạn dịch chiết mạt trên sephadex G-75 và DEAE-xenluloza đã cho thấy phân đoạn chịu nhiệt có KLPT khoảng 30.000 có hoạt tính KN lớn nhất Bằng sắc ký đã phân biệt được 3 thành phần chịu nhiệt, trong đó một thành phần không giống thành phần môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi mạt và

cũng không giống với dịch chiết từ D farinae

Để đánh giá dịch chiết nước – muối của mạt D pteronyssinus, Krilis và

cộng sự đã dùng phương pháp siêu lọc, sắc ký trên gel và hội tụ đẳng điện Hoạt tính của các phân đoạn thu được được đánh giá bằng test lẩy da, RAST,

Krilis và cộng sự phản đối thuật ngữ “DN chính”, đề nghị thay nó bằng

“DN có ý nghĩa lâm sàng” mà đối với các bệnh nhân khác nhau nó có thể khác nhau Cần chú ý rằng theo quan điểm di truyền MD, mức độ đáp lại DN hoặc phân đoạn của nó phụ thuộc nhiều vào kiểu gen bệnh nhân có thể phản ứng cao hoặc thấp Vả lại, vấn đề đang thảo luận tiếp tục được nghiên cứu mạnh mẽ và được bổ sung những sự kiện mới Stewart và cộng sự đã xác định

được 9 KN ở D pteronyssinus có tính chất gây dị ứng Trong dịch chiết vỏ

cuticular của mạt hoặc môi trường sống của chúng chỉ có 5 KN như vậy Các dịch chiết chứa các enzim (esteraza, photphataza, aminopeptidaza, glycosidaza), tuy nhiên, không một enzim nào trong số chúng có hoạt tính gây

có tên là DN Dermatophagoides pteronyssinus I (hoặc Der p I) Đây là một

glycoprotein, KLPT 24.000 Da, có 2 chuỗi đồng nhất với papain và có hoạt

tính enzim Kháng thể đơn dòng đối với Der p I được thông báo năm 1984

Protein này được giải trình tự một phần năm 1985, được nhân dòng vô tính và

24

được Thomas và cộng sự giải trình tự hoàn toàn năm 1988 Dị nguyên chính thứ hai được Lind xác định lần đầu tiên và mô tả là Dp X bởi khó xác định nó trên điện di miễn dịch chéo

Bảng 1.1 Các nhóm dị nguyên MBN

(kDa)

Chức năng

Nhóm 1: Der p I (P1, Ag42) 25 cystein- proteaza

Der f I (Ag11) 25 cystein- proteaza

Nhóm 2: Der p II (Dp X) 14 chưa biết

Nhóm 3: Der p III 29 serin- proteaza

Các nhóm còn lại:

Ghi chú: Der p I (II, III ) – dị nguyên Dermatophagoides pteronyssinus nhóm I (II, III ); P1, Ag42 – tên gọi đầu tiên của dị nguyên D pteronyssinus nhóm I; Dp X – tên gọi đầu tiên của dị nguyên D pteronyssinus nhóm II;

Der f I (II, III) – dị nguyên D farinae nhóm I (II, III); Ag11 – tên gọi đầu

tiên của dị nguyên D farinae nhóm I; Der m I (Ag6) – dị nguyên D

microceras nhóm I và tên gọi đầu tiên của nó; Eur m I – dị nguyên

phõn mạt Tương tự đối với 2 DN ớt quan trọng khỏc: Der p III (KLPT 29.000

Da) và amylaza (cỏc DN nhúm 4) cú KLPT 60.000 Da, chỳng cũng là cỏc enzim tiờu húa Hiện nay cỏc xột nghiệm nhạy cảm được sử dụng để đo cỏc

DN nhúm 1, cũn đối với cỏc DN khỏc, kỹ thuật xột nghiệm phức tạp hơn Cỏc DN mạt nhúm 2 đồng nhất về cấu trỳc và chủ yếu liờn quan với phần cơ thể của mạt Chỳng tương đối chịu nhiệt và sự thay đổi của pH mụi trường, chuỗi axit amin của chỳng cho ta thấy khụng cú sự đồng nhất đỏng kể

nào với cỏc protein đó biết Bằng kỹ thuật nhõn dũng vụ tớnh gen mó húa Der

p II, đó xỏc định KLPT của nú là 14,1 kDa Der f II cũng được nhõn dũng vụ

tớnh và giải trỡnh tự Der p II và Der f II cho phản ứng chộo về MD học nhưng

biểu lộ một số yếu tố quyết định đặc hiệu loài đối với KT liờn kết và đối với phản ứng với cỏc dũng tế bào T CD4 dương tớnh của người

1.4 CHUẨN HểA DỊ NGUYấN

Cho đến nay vẫn chưa có một hệ thống quốc tế thống nhất nào về chuẩn hóa DN, bởi vì khó khăn nhất trong vấn đề này là thế giới DN rất rộng rãi và rất đa dạng [48, 50]

Vấn đề chọn DN nào tạo nên chế phẩm chuẩn còn nhiều khó khăn Hiện nay có hàng trăm tên gọi của các loại DN đã biết và đã được sử dụng trong lâm sàng Song bản chất hóa học, cấu trúc các chất hoạt hóa trong thành phần của một DN nào đó đến nay vẫn chưa xác định được hoặc xác định chưa đầy

đủ Mặt khác, các cách tác dụng của DN lên cơ thể cũng như hoạt tính KN của chúng rất đa dạng và về nhiều phương diện chưa được nghiên cứu một cách

đầy đủ

26

+ Nguyên tắc: Việc chuẩn hóa chế phẩm DN được thực hiện chủ yếu bằng

so sánh hoạt tính của chúng với hoạt tính của chế phẩm chuẩn (chế phẩm quy chiếu) Nó được biểu diễn bằng các đơn vị khối lượng hoặc bằng các đơn vị hoạt tính sinh học được xác định trên các quần thể đối tượng dị ứng đại diện trung bình Chuẩn hóa cho phép so sánh những lô chế phẩm liên tiếp với tiêu chuẩn xác định, đảm bảo khả năng tái sản xuất những lô này; chuẩn hóa là sự

đảm bảo chất lượng của sản phẩm được giới thiệu cho giới y học và cho bệnh nhân

Chuẩn hóa DN trải qua các giai đoạn: xác định các dịch chiết chuẩn (quy chiếu), xác định các phương pháp kiểm tra đối với các dịch chiết này, các chuẩn mực chấp nhận và các đơn vị sinh học biểu thị hoạt tính DN Những mưu toan điều hòa quốc tế không thành và những nhà chế tạo dịch chiết DN trở lại khái niệm chuẩn hóa quốc gia Tuy nhiên, dịch chiết quy chiếu quốc gia cần được so sánh với dịch chiết chuẩn quốc tế

+ Kỹ thuật chuẩn hóa đòi hỏi dịch chiết chuẩn để so sánh hoàn toàn xác

định Các dịch chiết này cần được mô tả chi tiết và mối liên hệ giữa thành phần cấu tạo, hiệu lực và kết quả trong LPMD phải được thiết lập

Mỗi nhà sản xuất có thể sử dụng các tiêu chuẩn của riêng mình để chuẩn hóa Đây là sự quy chiếu nội địa, được sử dụng để làm phù hợp các dịch chiết Tuy vậy, các tiêu chuẩn này cần được so sánh với tiêu chuẩn quốc tế Theo cách này, những sự chuẩn hóa nội địa khác nhau được thực hiện với những kỹ thuật xác định

Trong sản xuất dịch chiết DN thông thường, không thể đánh giá kết quả lâm sàng trên mỗi mẻ Trong thực tế chuẩn hóa, các mẻ được so sánh với tiêu

chuẩn nội địa bằng kết hợp các kỹ thuật in vitro khác nhau để thu được thành

phần và hiệu lực không thay đổi Việc thực hiện kiểm tra này là cần thiết để bảo đảm rằng những thay đổi trong tác dụng lâm sàng sẽ không xảy ra

1.4.1 Chuẩn hóa theo tính chất lý học

Kiểm tra bằng cảm quan nhằm mục đích kiểm tra màu sắc và mùi của dị nguyên so với mẫu chuẩn

1.4.2 Chuẩn hóa theo tính chất hóa sinh

Hiện nay cách chuẩn hóa dị nguyên theo trọng lượng chất (nguyên liệu chiết xuất từ phấn hoa chẳng hạn) trong dị nguyên mà trước đây áp dụng

27

đang bị phê phán Một đơn vị Noon thể hiện một lượng chất chiết xuất nhận từ

10-6 g dị nguyên Rõ ràng hàm lượng chất liệu dị nguyên hoạt động trong các chất chứa dị nguyên khác nhau đến nỗi khi đưa chúng về mẫu số chung thông qua số đơn vị trọng lượng của nguyên liệu thô ban đầu chứa dị nguyên đều không có ý nghĩa gì cả Các nghiên cứu so sánh các dị nguyên theo đơn vị Noon cho thấy cách tiêu chuẩn hóa này không có triển vọng

Đơn vị hoạt tính:

Trên thế giới hiện đang sử dụng nhiều đơn vị hoạt tính (bảng 2) Các đơn

vị này bao gồm các đơn vị tương đương như P/V và PNU- đóng vai trò chỉ dẫn cách pha loãng mà không nói lên hoạt tính sinh học của chế phẩm DN và các

đơn vị hoạt tính sinh học như AU (Allergy Unit), BU (Biological Unit), SQ (Standardized Quality Unit), IU (International Unit)

Đơn vị PNU là đơn vị chỉ số lượng nitơ protein chứa trong 1 ml dịch chiết chế

phẩm DN Một PNU tương đương 10-5 mg (0,01 àg) nitơ protein

0,01 àg nitơ protein toàn thế giới

AU Đơn vị dị ứng Thử nghiệm da đến

điểm cuối (endpoint) Mỹ

BU Đơn vị sinh học Thử nghiệm da so với

histamin Châu Âu

SQ Đơn vị chất lượng chuẩn Liều duy trì trong

IU Đơn vị quốc tế Phương pháp in vitro so

với chuẩn của WHO toàn thế giới

Để bảo đảm cho sản xuất và ứng dụng DN trong lâm sàng, các nhà dị ứng học đã tạm thời thống nhất vấn đề chuẩn hóa DN trên một số phương diện: chọn chất ban đầu để tách chiết, đơn vị tác dụng, tiêu chuẩn hóa các tá chất, các phương pháp tiêu chuẩn hóa trên bệnh nhân, các phương pháp tiêu chuẩn hóa ngoài cơ thể bệnh nhân, các vấn đề hòa tan, pha loãng, chất bảo quản…

ƒ Định lượng protein

Lượng protein của dịch chiết được đánh giá theo Bradford (Bio - Rad - Dosage

of proteins, Richmond, USA) sử dụng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn

ƒ Phân tích axit amin

Các axit amin được sinh ra từ thủy phân protein được phân tích bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Perfomence Liquid Chromatography) theo phương pháp PICO-TAG (Millipore Waters, Saint Quentin en Yvelines, France), được xác định và định lượng bằng quy chiếu với axit amin chuẩn

ƒ Tiêu điểm đẳng điện (IEF)

Cho phép phân tách các thành phần của dịch chiết theo điểm đẳng điện của

29

chúng (dựa vào các vạch protein của dịch chiết chưa biết tương ứng với các vạch của dịch chiết quy chiếu)

ƒ Điện di trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)

Các protein được phân tách theo khối lượng phân tử của chúng Điện di dịch chiết quy chiếu mới được so sánh với cái dịch chiết quy chiếu có trước

1.4.3 Chuẩn hóa theo tính chất sinh học

ƒ Kiểm tra độ vô trùng

Thông thường người ta cấy những mẫu dị nguyên vào các môi trường khác nhau: môi trường vi khuẩn hiếu khí, môi trường đặc, môi trường tìm nấm mốc nhằm phát hiện tạp trùng và nấm mốc

ƒ Kiểm tra độ an toàn và độc tính cấp

Tiêm dị nguyên nồng độ thấp vào dưới da bụng cho chuột nhắt trắng Theo dõi tình trạng chung, sự thay đổi trọng lượng và số lượng chuột chết trong 10 ngày Thử độc tính cấp: Tiêm dị nguyên nồng độ cao vào dưới da bụng cho chuột nhắt Theo dõi tình trạng chung của chuột và tỷ lệ chuột chết trong

72 giờ

1.4.4 Chuẩn hóa theo tính chất miễn dịch

ƒ Phản ứng phân hủy tế bào mast (Theo Ishimova)

Dựa vào sự thay đổi hình thái của tế bào mastocyte của chuột cống trắng dưới tác dụng của phức dị nguyên - kháng thể để đánh giá kết quả

ƒ Gây mẫn cảm chuột lang

Gây mẫn cảm bằng tiêm dị nguyên nồng độ cao, 4 lần x 4 ngày/lần Ngày thứ 21 tiêm mũi cuối cùng và xác định chỉ số sốc theo các mức độ biểu hiện

ƒ ức chế RAST (Radio allerosorbent test)

ức chế RAST là kỹ thuật miễn dịch phóng xạ cho phép so sánh hiệu lực tương đối của một dịch chiết dị nguyên chưa biết với dịch chiết quy chiếu Sơ đồ xét nghiệm RAST như sau: dị nguyên sử dụng - được gắn hóa trị với

đĩa giấy, phản ứng với IgE đặc hiệu trong mẫu máu bệnh nhân nghiên cứu Sau khi rửa IgE không đặc hiệu người ta bổ sung các kháng IgE được đánh

30

dấu bằng iốt phóng xạ Trong quá trình ủ tạo thành phức đĩa giấy – dị nguyên

- IgE (kháng IgE đánh dấu) Đo hoạt tính phóng xạ và so sánh kết quả với mẫu chuẩn được tiến hành song song

ƒ Test lẫy da (Prick test) (Theo Dreborg)

Đưa DN đặc hiệu vào da, DN sẽ kết hợp với KT IgE bám trên bề mặt TB mast V TB bị phân hủy, giải phóng các chất trung gian gây phù nề, sẩn ngứa nơi thử test Dựa vào đường kính ban sẩn để đánh giá KQ

ƒ Test kích thích (Provocation test) (Theo Ado AD)

Tạo lại bệnh cảnh lâm sàng khi cho người bệnh hít DN

ƒ Chuẩn hóa In Vivo

Chuẩn hóa in vivo xác định chỉ số phản ứng IR Một dịch chiết dị nguyên

100 IR chỉ số phản ứng (index ò reaction) nghĩa là khi sử dụng bằng prick test với một stallerpointđ ở 30 đối tượng mẫn cảm với dị nguyên này, nó gây nốt sẫn đường kính 7 mm Phản ứng da của những đối tượng này đồng thời được biểu lộ bởi prick test dương tính với photphat codein 9%

1.4.5 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHIẾT XUẤT DỊ NGUYấN

1.4.5.1.Cỏc chất pha loóng sử dụng trong tạo hỗn hợp vacxin dị nguyờn

Do cỏc chiết xuất dị nguyờn cú xu hướng mất hiệu năng theo thời gian, sự ảnh hưởng này tăng lờn do bảo quản ở nhiệt độ cao và mức độ pha loóng lớn hơn nờn người ta cho thờm một số chất vào vừa để bảo quản hiệu năng vừa để phũng ngừa sự phỏt triển cỏc vi sinh vật Sự bảo quản hiệu quả nhất tớnh toàn vẹn và hiệu năng chiết xuất khụng phải là thờm một chất bảo quản mà bằng sự đụng khụ Kỹ thuật này khụng thể ỏp dụng thường xuyờn hàng ngày do quỏ trỡnh đụng khụ làm tăng thờm giỏ thành sản phẩm

Glycerin

Glycerin là chất bảo quản hiệu quả nhất cho cỏc chiết xuất dị nguyờn Nú rất hiệu quả ở nồng độ 50% ở nồng độ này nú ức chế một số, nhưng khụng phải tất cả, enzym phõn huỷ protein Điều này cú thể đúng gúp nhưng khụng hoàn toàn giải thớch cho sự hiệu quả của nú với vai trũ là chất bảo quản Hiệu

31

quả bảo quản của nó đã chứng tỏ giảm xuống ở các nồng độ 25% và 10%, tuy nhiên ngay cả 10% glycerin cũng hiệu quả như 0,03% albumin huyết thanh người Có thể sự hiện diện của những lượng glycerin đã giải thích cho thiếu

sự phân huỷ protein của chiết xuất phấn hoa do các chiết xuất mạt bụi nhà trong một số nghiên cứu tạo hỗn hợp

Glycerin là chất bảo quản hiệu quả nhất nhưng dung nạp kém khi tiêm ở dung dịch 50% glycerin Các dung dịch 10% và 20% glycerin gây ra một số khó chịu ngắn ngủi, nhưng thường dung nạp được

Phenol

Phenol được cho vào các lọ dị nguyên để ngăn ngừa sự phát triển các vi sinh vật Phenol làm biến chất protein, kể cả những protein là dị nguyên và tác dụng có hại của phenol tăng lên cùng với tăng độ pha loãng dị nguyên Phenol phân huỷ chiết xuất trong các vacxin ở dung dịch 50% glycerin Albumin huyết thanh người có tính bảo vệ nhiều hơn so với glycerin chống lại ảnh hưởng của phenol lên hiệu năng chiết xuất

1.4.5.2 Các điều kiện bảo quản

Việc duy trì hiệu năng của vacxin dị nguyên điều trị là hàm số của mức độ pha loãng, chất pha loãng, sự hiệu quả của chất bảo quản, nhiệt độ bảo quản,

và sự hiện diện của các enzym phân huỷ protein Các quá trình dẫn đến mất hiệu năng vacxin và các biện pháp có thể sử dụng để làm giảm tác động này thể hiện trong bảng sau:

32

Các cơ chế mất hiệu năng của chiết xuất dị nguyên

Cơ chế Tạo thuận lợi bởi Tránh bởi

Nhiệt độ cao Hiện diện enzym trong chiết xuất

Albumin huyết thanh người, glycerin

Bảo quản ở nhiệt độ thấp Glycerin, bảo quản ở nhiệt độ thấp

Nhiệt độ

Chiết xuất dị nguyên và vacxin nhậy cảm với mất hiệu năng nếu bảo quản

ở nhiệt độ phòng thay vì ở nhiệt độ buồng lạnh Mất hoạt tính do bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể là do các protease trong khi đó mất hiệu năng do tiếp xúc ngắn ngủi với nhiệt độ cao có lẽ liên quan với tính kém chịu nhiệt của một số protein dị nguyên Một số chiết xuất, như mèo, đã được báo cáo tương đối kháng với tác dụng kém chịu nhiệt này Các chiết xuất khác, bao gồm sồi trắng, cây đu, cỏ ngón, cỏ Bermuda, cây phấn hương và mạt bụi nhà, mất hiệu năng ở nhiệt độ cao (250 C-1000 C) Do mất hiệu năng là hệ quả hoặc của protease nhậy cảm nhiệt hoặc các protein kém chịu nhiệt, nên chiết xuất bảo quản sẽ có kiểu đặc hiệu thay đổi do sự tồn tại ưu thế của các protein kháng nhiệt, dẫn đến sự thay đổi kiểu phản ứng test da và có thể cả hiệu quả điều trị

Pha loãng

Chiết xuất và vacxin nhậy cảm hơn với mất hiệu năng khi bảo quản ở nồng

độ pha loãng thay vì cô đặc Tăng tính nhậy cảm của chiết xuất loãng có lẽ là

do lượng protein ít hơn và do vậy sự hấp phụ tương đối của dị nguyên vào thành lọ chứa lớn hơn Tuy nhiên, cho thêm albumin huyết thanh người không ngăn chặn hoàn toàn sự mất này và tất cả chiết xuất dị nguyên không nhậy cảm bằng nhau với tác động này, chứng tỏ các yếu tố khác có thể liên quan

33

Các nghiên cứu trường hợp đơn lẻ với chiết xuất pha loãng báo cáo hiệu năng bảo tồn một cách ngạc nhiên trong những khoảng thời gian dài Các nồng độ làm test da trong bì của chiết xuất cỏ đuôi mèo, phấn hoa cây bulô, mèo, và mạt bụi nhà bảo quản cùng với albumin huyết thanh người đã thể hiện hiệu năng bảo tồn sau 24 tháng bảo quản ở nhiệt độ 60 C Chưa có sự giải thích rõ ràng cho kết quả bất thường rõ rệt này, nhưng hiện tượng này có thể liên quan với kiểu mẫn cảm của quần thể nghiên cứu

Mất hiệu năng liên quan với lượng protein toàn phần của chiết xuất hay vacxin Không đổ đầy hoàn toàn lọ chứa đã chứng tỏ làm tăng mức độ mất hiệu năng do tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của thành lọ so với thể tích dung dịch mà từ đó protein hấp phụ Tác dụng này giảm xuống bằng cách cho thêm các chiết xuất khác vào vacxin, như vậy làm tăng lượng protein toàn phần Có thể đạt được tác dụng bảo vệ tương tự bằng cách cho thêm protein từ ngoài như albumin huyết thanh người

Sự phân hủy chiết xuất dị nguyên và vacxin tăng lên cùng với việc pha loãng và thời gian để chúng ở nhiệt độ trong phòng

1.4.6 THỂ CHẾ CỦA MỘT DỊCH CHIẾT QUY CHIẾU NỘI

Lợi ích của việc chuẩn hóa dịch chiết DN đã được chứng minh trong tất

cả các tài liệu khoa học, từ đó lập nên hồ sơ khoa học

Trên cơ sở hồ sơ, một quyển sổ ghi các mẻ điều chế chứng minh các tiêu chuẩn kỹ thuật cần thiết đối với luật lệ và sự điều chế dịch chiết quy chiếu nội

và xác định:

- Các số liệu do tài liệu khoa học đưa ra

- Kinh nghiệm trong các kỹ thuật phân tích khác nhau

- Các đặc thù địa lý có thể xảy ra

- Các đặc tính của nguyên liệu và huyết thanh có sẵn

34

Kết luận :

Mặc dù chưa có một hệ thống quốc tế thống nhất về tiêu chuẩn hóa các

DN, nhưng trong sản xuất các nguyên tắc chuẩn hóa DN có ý nghĩa hàng đầu

Nó đảm bảo độ an toàn, độ tinh khiết và hoạt tính của các dạng thành phẩm Hiệu quả điều trị và chẩn đoán các bệnh DƯ phụ thuộc vào chất lượng DN Mục đích ban đầu của chuẩn hóa là xác định thủ tục và các phương pháp đảm bảo chất lượng của sản phẩm thương mại và việc tái sản xuất chúng Sự hiệu chỉnh các phương pháp này cho phép hiểu biết tốt hơn các thành phần của dịch chiết DN, trong một số trường hợp là tách riêng chúng Sự tiến bộ của chuẩn hóa hướng về định lượng các thành phần này và biểu thị bằng đơn

vị khối lượng

Để đảm bảo cho việc sản xuất DN và được ứng dụng trong lâm sàng các nhà dị ứng học Việt Nam đã tạm thời thống nhất về vấn đề chuẩn hóa DN trên một số phương tiện: chọn chất để chiết tách ban đầu, đơn vị tác dụng, tiêu chuẩn hóa các tá chất, các phương pháp tiêu chuẩn hóa trên bệnh nhân, các phương pháp tiêu chuẩn hóa ngoài cơ thể bệnh nhân, các vấn đề hòa tan, pha loãng, chất bảo quản

Theo Fradkin AV, Berjest V.M, Petrova U, Petrova CV, Nguyễn Năng

An, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, Lê Văn Khang tạm thời thống nhất chuẩn hóa DN theo một số tiêu chuẩn sau:

- Chất liệu ban đầu dùng để chiết tách DN là gì? (bụi nhà, sinh khối nuôi Acarien, bụi bông, lông vũ, phấn hoa, v.v ) đồng thời qui về các nhóm có phần tương đồng về DN cơ bản để so sánh

- Đơn vị tác dụng hiện tại là PNU (Protein Nitrogen Unit) 1 đơn vị PNU tương đương 10-5 mg protein trong 1 ml dịch chiết tách

- Các phương pháp tiêu chuẩn hóa trên bệnh nhân bằng các test: prick test, test kích thích (Provocation test)

35

- Cỏc phương phỏp tiờu chuẩn húa ngoài cơ thể bệnh nhõn thường sử dụng trờn động vật thực nghiệm bằng in vivo hay in vitro như: kiểm tra độ vụ trựng của DN, kiểm tra độ an toàn và độc tớnh cấp của DN, test phõn hủy tế bào mast, gõy mẫn cảm trờn chuột lang

Túm lại, về vấn đề tiờu chuẩn húa DN cho đến nay vẫn chưa cú một hệ thống quốc tế thống nhất để đảm bảo cho việc sản xuất và ứng dụng DN trong lõm sàng, cỏc nhà miễn dịch học, húa sinh học, dị ứng học mới tạm thời thống nhất một số tiờu chuẩn để chuẩn húa chung cho cỏc loại DN gồm: chất liệu ban đầu, thống nhất đơn vị tỏc dụng của DN là PNU, tiờu chuẩn húa tỏ chất, cỏc phương phỏp tiờu chuẩn húa trờn bệnh nhõn, ngoài cơ thể bệnh nhõn, cỏc vấn đề pha loóng, thành phần dịch pha loóng và chất bảo quản

Năm 1994, Volle E Macaire N đó nờu vấn đề chuẩn húa DN là: việc chuẩn húa sinh học cho phộp so sỏnh với tiờu chuẩn xỏc định (dịch chiết quy chiếu) những lụ liờn tiếp, đảm bảo khả năng tỏi sản xuất những lụ này Chuẩn húa là việc bảo đảm chất lượng của sản phẩm được giới thiệu trong giới y học, cho bệnh nhõn [92], [93], [94], [95], [96], [97]

1.5 ứng dụng của dị nguyên mạt bụi nhà trong y học

Kể từ khi Varekamp lần đầu tiên thu được chế phẩm dịch chiết MBN và thử nghiệm trong lâm sàng dị ứng năm 1925, đặc biệt là từ khi Voorhorst phát hiện vai trò của mạt trong bụi nhà, các nhà nghiên cứu đã hướng vấn đề dị ứng vào MBN, nghiên cứu MBN trong vai trò gây bệnh dị ứng cũng như sinh học của chúng, nhờ đó người ta có thể nuôi cấy MBN, điều chế và tiêu chuẩn hóa loại DN này và sử dụng chúng trong y học Mặt khác, từ khi phương pháp chẩn đoán đặc hiệu và liệu pháp đối với bệnh dị ứng qua trung gian IgE (quá mẫn typ I) được giới thiệu trong y học, người ta đã cần đến các dịch chiết DN Dịch chiết DN có khả năng phát hiện các bệnh dị ứng, có nghĩa, tất cả các dòng IgE chống lại 1 thành phần nào đó của nguồn DN có sẵn từ môi trường Khả năng này làm cho dịch chiết DN hữu ích đối với LPMD đặc hiệu để

nguyên D pteronyssinus phát hiện các đặc điểm lý-hóa, miễn dịch của chúng

để ứng dụng chúng trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu bằng dị nguyên

37

Ch−¬ng 2 §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p

Trong sản xuất văcxin và sinh phẩm, chất lượng là rất quan trọng Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin đòi hỏi tính khách quan, chính xác với đội ngũ cán bộ trung thực, có tay nghề và trình độ chuyên môn Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các kỹ thuật và phương pháp của TCYTTG , kiểm định quốc gia quy định nhằm đảm bảo độ chính xác cao

2.1 Đối tượng

- Dị nguyên D.pteronyssinus do khoa Miễn dịch - Dị nguyên, Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương điều chế

- Các tiêu chuẩn cơ sở của Vắc xin dị nguyên D.pteronyssinus

a Tiêu chuẩn vật lý : cảm quan, độ hoà tan

b Tiêu chuẩn hoá sinh

ƒ Xác định pH : Là dạng thuốc tiêm, uống nên cần có pH giống như máu

ƒ Định lượng đơn vị nitơ protein - PNU theo phương pháp Kjeldahl (Dược điển Việt Nam tập III)

ƒ Định lượng Protein theo đơn vị gam/lit Là kháng nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch Protein phải được tinh khiết để tránh các những phản ứng phụ do các protein lạ gây ra

ƒ Xác định các thành phần acid amin của DN D.pteronyssinus bằng máy phân tích acid amin tự động

c Tiêu chuẩn sinh học

ƒ Kiểm tra độ vô trùng

ƒ Kiểm tra độ an toàn và độc tính của DN D.pteronyssinus

d Tiêu chuẩn miễn dịch

38

ƒ Gây mẫn cảm trên động vật thực nghiệm bằng DN D.pteronyssinus

ƒ Xác định hoạt tính của DN D.pteronyssinus bằng chỉ số

shock phản vệ trên chuột lang

ƒ Xác định hoạt tính kháng nguyên của DN D.pteronyssinus

bằng test lẩy da (Prick test) trên bệnh nhân Viêm mũi dị ứng

ƒ Xác định hoạt tính kháng nguyên của DN D.pteronyssinus

bằng phản ứng phân hủy mastocyte

ƒ Xác định hoạt tính kháng nguyên của DN D.pteronyssinus

bằng phản ứng tiêu bạch cầu đặc hiệu

2.2 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của vaccin DN

D.pteronyssinus (Tiêu chuẩn hóa)

a Các phương pháp xác định tính chất lý học

ƒ Màu sắc: Lấy 10ml dung dịch DN cho vào ống nghiệm đường

kính 15 mm, quan sát màu bằng ánh sáng ban ngày, nhìn ngang ống (có thể so sánh với màu chuẩn)

ƒ Mùi: Nếu chế phẩm có mùi mạnh thì lấy 1 lượng nhỏ (2-3 giọt)

nhỏ lên mặt kính đồng hồ để ngửi Nếu chế phẩm có mùi nhẹ hoặc nghi ngờ, lấy 2 ml chế phẩm đưa lên giấy lọc có kích thước 10 × 10

cm và ngửi cách xa 2- 4 cm

b Các phương pháp xác định tính chất hóa sinh

ƒ Xác định pH bằng máy tự động

ƒ Định lượng Protein theo phương pháp đo độ đục

ƒ Định lượng nitơ bằng phương pháp micro Kjeldahl

* Nguyên lý: Dùng axit sulfuric đậm đặc vô cơ hóa nguyên liệu Các chất hữu cơ bị đốt cháy thành CO2, H2O Còn nitơ được chuyển thành sulfat amon (NH4)2SO4 Cho NaOH tác dụng với (NH4)2SO4 sẽ giải phóng NH3