Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm ĐTN hoàn thiện công nghệ lên men nước quả có độ cồn thấp

Tuyển chọn và xác định đặc tính sinh học các chủng nấm men cider Việt Nam có các khả năng cạnh tranh, lắng trong, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm và đặc biệt là khả năng sinh tổng hợ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội CNTE

BAO CAO TONG KET

KHOA HOC VA KY THUAT

Dé tai

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym

trong chế biến một số nông sản thực phẩm

Ma sé: KC 04-07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: PGS.TS Ngô Tiến Hiển

Đề mục

HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ LEN MEN

NƯỚC QUẢ CÓ ĐỘ CỒN THẤP

Chủ nhiệm đẻ tài: TS Lê Việt Nga

Bộ môn Công nghệ đồ uống

Viện Công nghiệp thực phẩm

1 — 5YOFAS

§12405

MO DAU Những năm gần đây, nhờ có chính sách của Nhà nước giao đất, giao rừng cho

người dân, khuyến khích phát triển kinh tế trang trại, nguồn hoa quả Việt Nam ngày càng đổi dào, phong phú Việc thúc đẩy sản xuất chế biến sản phẩm đồ uống mới từ

nguồn nguyên liệu quả trong nước sẽ đem lại lợi ích đáng kể cho nền kinh tế nông

nghiệp Việt Nam Vì vậy, trong Quyết định số 28/2002/QĐ-TTg của Thủ Tướng Chính

phủ ban hành ngày 6/02/2002 về Quy hoạch tổng thể phát triển ngành Rượu-Bia-Nước

giải khát Việt Nam đến năm 2010, tăng năng lực sản xuất nước quả được nhấn mạnh là

hướng ưu tiên đầu tư của ngành công nghiệp nước giải khát Theo quy hoạch này, đến năm 2005, ngành công nghiệp chế biến nước quả phấn đấu đạt 124 triệu lí/ năm và đạt

28U triệu lí/ năm vào năm 2010 [7]

Vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu công nghệ đồ uống là khảo sát, nghiên

cứu tìm ra những công nghệ mới để từ những nguồn hoa quả trong nước có thể sản xuất ra nhiều loại đồ uống đạt tiêu chuẩn chất lượng quốc tế, hợp thị hiếu người tiêu

dùng ở thị trường trong và ngoài nước [23] /

Trên thế giới, đặc biệt ở châu Âu, châu Ức và châu Mỹ, cider - loại nước quả

lên men có độ cồn thấp từ táo rất được ưa chuộng Cũng như rượu vang, loại đồ uống

lên men này đã được biết đến từ vài nghìn năm trước công nguyên và hiện được tiêu

thu hang ty lit/ nam [16 va 53] Cider cé thể sản xuất theo phương pháp cổ truyền lên men dịch quả bằng các chủng giống tự nhiên có sẵn trong dịch quả hoặc theo phương pháp hiện đại quy mô công nghiệp lên men dịch quả bàng các chủng giống nấm men thuần khiết được tuyển chọn [77]

Muốn sản xuất cider theo phương pháp hiện đại quy mô công nghiệp, ngoài vấn

đề nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu quả, quy trình công nghệ phù hợp và thiết

bị phù hợp, chất lượng của chủng giống nấm men được tuyển chọn là một yếu tố cần

được quan tam hang dau [110]

Đặc biệt, bên cạnh các đặc điểm công nghệ đảm bảo tốt độ trong và hương vị của sản phẩm, tính cạnh tranh cao của các chủng nấm men cider công nghiệp là chỉ

tiêu hết sức quan trọng, nhất là ở điều kiện sản xuất tại các vùng khí hậu nhiệt đới

nóng ẩm với vi sinh vật nhiễm tạp đa dạng Các khả năng cạnh tranh của nấm men

cider công nghiệp là khả năng sinh trưởng và lên men nhanh ở những môi trường dịch quả nghèo dinh dưỡng và có pH thấp, khả năng lên men ở nồng độ cao của SO; trong dịch quả, khả năng lên men dưới áp suất cao của CO; và khả năng lên men ở nhiệt độ

thấp [1 17]

Một xu hướng nghiên cứu mới hiện nay của thế giới trong nâng cao tính cạnh

tranh của các chủng nấm men rượu thuần chủng là tuyển chọn và lai tạo các chủng

nấm men rượu có khả năng sinh tổng hợp zymocin Zymocin là một loại kháng sinh của nấm men tiêu diệt được nấm men dại đồng thời tự bảo vệ mình khỏi sự tấa công của các nấm men dại sinh tổng hợp zymocin khác trong quá trình lên men, góp phần

nâng cao chất lượng sản phẩm {47, 57, 63, 81, 82, 101, 110, 129 và 131]

Từ những vấn để nêu trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: [1//oàn thiện công nghệ sản xuất nước quả lên men có độ cồn thấpD với những nội dung sau

đây:

1 Tuyển chọn và xác định đặc tính sinh học các chủng nấm men cider Việt Nam có

các khả năng cạnh tranh, lắng trong, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm và đặc biệt

là khả năng sinh tổng hợp zymocin - chỉ tiêu mới nhằm nâng cao tính cạnh tranh của nấm men

2 Nghiên cứu nâng cao chất lượng chế phẩm chủng giống nấm men cider Việt Nam

bằng giải pháp phối trộn hỗn hợp chủng giống nấm men và lai tạo chủng giống mới có

tính cạnh tranh cao hơn, có khả năng sinh tổng hợp zymocin và tạo hương vị thơm

ngon hơn cho sản phẩm

3 Ứng dụng chủng nấm men con lai mới vào sản xuất cider Việt Nam - loại đồ uống lên men có độ cồn thấp từ nguồn quả trong nước theo một quy trình công nghệ sản

xuất cider quy mô công nghiệp với các thông số kỹ thuật thích hợp

PHAN 1: TONG QUAN

1.1 GIGI THIEU VE CIDER - NUGC QUA LEN MEN CO BO CON

THAP TREN THE GIO

1.1.1 Giới thiệu về cider

Cider là loại nước quả lên men từ dịch chiết táo hoặc hỗn hợp dịch của táo và

lê có độ cồn thấp, thấp nhất là 2,5% v/v theo tiêu chuẩn châu Âu (Customs

Classification Heading 22.07) hoac tit 0,5 dén 8,4% v/v theo tiêu chuẩn của Mỹ Tên

cổ của cider là sicera Ngoài ra, cider con có tên theo các nước khác nhau là sidrc,

apflewein, cidre, cyder, la cidraie

Cider được sản xuất từ hơn 2000 năm trước và đã từng là đồ uống phổ biến hơn

cả bia ở châu Âu vào thế kỷ thứ I1 và 12 [77 và 117]

Các nước sản xuất cider nhiều nhất là Anh, Đức, Tây Ban Nha, Pháp, Bỉ, Thuy

Điển, Phần Lan, Thuy Sĩ và ngày nay còn có thêm Canada, Mỹ, Australia và New Zealand Nhờ nguồn dinh dưỡng từ quả và hương vị hấp dẫn của sản phẩm lên men mà các sản phẩm này luôn được tiêu thụ với số lượng lớn

Mức tiêu thụ trên thế giới của loại nước giải khát có rượu này khoảng 500 triệu lí/ năm vào những năm 1970 Vào những năm cuối của thế kỷ 20, sản lượng cider được bán ra đã tăng vọt, ví dụ tại Anh, những năm 80 đã có 60 triệu galông cider được tiêu thụ (xấp xỉ 270 triệu lít/ năm) và vào năm 1994 thì con số đó đã tăng lên 92 triệu

galông (xấp xỉ 387 triệu lí) [117]

Cider có nhiều loại khác nhau như:

+ Loại cider nạp CO; và loại cider có CO; tự nhiên

+ Loại cider khô và loại cider cho thêm đường

+ Loại cider đóng chai thanh trùng và loại cider uống tươi

+ Loại cider trong hoặc cider đục nhưng cider dạng trong vẫn được ưa chuộng hơn cả

Tại Mỹ, người ta còn có cả loại cider trắng (lên men từ dịch táo tẩy màu hoặc tẩy màu dịch đã lên men) và cả loại cider đen (trộn lẫn giữa cider và dịch mait đen lên men) [10] _ 0

Vị của cider có thể là chua, ngọt hay đắng phụ thuộc vào loại nguyên liệu táo

được dùng để sản xuất cider (bảng 1.2)

2

Bảng 1.2: Thành phần chính của các loại _cider thương phẩm [12,77 va 117] -

| Thanh phan | = Axit tong D6 ngot Độ rượu Tannin | SO, tong

(%, tinh theo (%) (%, viv) (%) (mg/ f)

|

ị

axit lactic) Giới hạn 040-569 |156-5,58| 0,5— 8,4 0,028 - 64 — 189

0,171 Người ta đã tìm ra 66 hợp chất bay hơi có trong các loại cider thương phẩm, trong

đó có một số chất gây ảnh hưởng chính tới hương vị cider (bảng 1.3) {1 17]

Bảng 1.3: Hàm lượng một số hợp chất bay hơi

của các loại cider thương phẩm [117]

Bên cạnh các yếu tố về chất lượng nguyên liệu quả, công nghệ và điều kiện

trang thiết bị sản xuất, các vi sinh vật luôn đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên

men và bảo quản cider để ổn định và nâng cao chất lượng của sản phẩm [77]

1.2 BIEN PHAP CONG NGHE TIEU DIET VA HAN CHE SU PHAT

TRIEN CUA CAC VI SINH VAT CO HAI TRONG QUA TRINH LEN

MEN CIDER

1.2.1 Biện pháp xử lý vi sinh vat dịch quả

Để tiêu diệt bớt các vi sinh vật có hại có sẵn trong dịch qua, trước khi lên men bằng các nấm men rượu thuần khiết, nguyên liệu dịch quả được xử lý bằng các biện pháp thanh trùng theo phương pháp Pasteur hoặc sunphít hoá dịch quả bằng khí SO,

1.2.1.1 Thanh trùng dịch quả theo phương pháp Pasteur

Thanh trùng dịch quả trước khi lên men được áp dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất cider Canada dé hạn chế tối đa lượng vi sinh vật nhiễm tạp trong quá

trình lên men

Thanh trùng dịch quả theo phương pháp Pasteur trước lên men thường được tiến

hành gia nhiệt đến 65-80°C trong thời gian 10 đến 30 phút [26]

Phương pháp này có khả năng tiêu diệt đa số các loài nấm mốc, nấm men va vi khuẩn nhiễm tạp trừ một số rất ít chủng vi sinh vật tạo bào tử chịu nhiệt, đặc biệt rất

hữu hiệu để tiêu diệt các loài nấm men Zygosaccharomyces gây hại có khả năng chống chịu SỐ: và các chất bảo quản khác

Tuy nhiên, thanh trùng theo phương pháp Pasteur không phải là một biện pháp phổ biến trong sản xuất cider trên thế giới do nhược điểm là làm mất hương tươi, mất một phần vitamin C của dịch quả và làm sãm màu sản phẩm

Ngoài ra, dịch quả đã thanh trùng theo phương pháp Pasteur sẽ bị giảm hàm

lượng thiamin, gây ảnh hưởng đến sự phát triển của các loại nấm men rượu có nhu cầu

dinh dưỡng cao [L1] và 117]

Bởi vậy, nếu lên men cider từ dịch quả đã qua thanh trùng theo phương pháp Pasteur thì bát buộc phải tuyển chọn các chủng nấm men rượu có nhu cầu dinh dưỡng

1.2.1.2 Sunphít hoá dịch quả

Sunphít hoá dịch quả trước lên men là một biện pháp công nghệ phổ biến để hạn

chế và tiêu diệt vi sinh vật có hại được áp dụng trong công nghệ lên men rượu vang quả

và cider trên thế giới Khí SO; đốt từ lưu huỳnh hoặc khí SO; giải phóng từ các loại muối sunphit, bisunphit hay metabisunphit cia natri hay kali dugc suc vao dich quả với các nồng độ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ nhiễm tạp và pH của dịch quả [36, 40,

tạp có sẵn trong dịch quả sẽ bị tiêu diệt sau quá trình sunphít hoá dịch quả

Tuy nhiên, còn rất nhiều loài nấm men vẫn còn sống sót sau khi dịch quả được

xử lý bằng SO; Đó là các loài nấm men thuộc giéng Saccharomyces nhu: S cerevisiae, S bayanus, Š capernsis, Š carlsbergensis và S wvarum Đây là những loài tham gia hoạt động trong thời kỳ đầu của quá trình tự lên men và cạnh tranh với nấm

men cider thuần chủng

Đặc biệt, một số loài nấm men gây hại và vi khuẩn gây bệnh có đặc tính tạo bào tử và có khả năng chống chịu SO; tự do tới nồng độ hơn 500 mg/ l như: Z baili,

S Iudwigii, Zvmomonas anaerobia, Bacillus spp., Clotridium spp

Mặc dù vậy, hàm lượng SO; trong dịch quả lên men cũng không thể vượt quá giới hạn cho phép 200 mg/ 1 để tránh dư lượng SO, tự do quá cao trong sản phẩm gây hại cho sức khoẻ người uống cũng như làm cho sản phẩm lên men có mùi khó chịu do

các phức chất của lưu huỳnh [1 17]

Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam, hàm lượng khí SO; trong dịch quả không được vượt quá 300 mgí I [Š]

Theo quy trình sản xuất ciđer của Pháp, người ta sử dụng tác nhân hoá học là

khí SO; với nồng độ là 50 mg/ ! đến 100 mg/l dịch quả để xử lý nguyên liệu về mắt vi sinh trước khi lên men và duy trì lượng khí này trong suốt quá trình lên men [77]

Khí SO; ức chế sự phát triển của của các nấm men rượu thuần chủng không có khả năng chống chịu SO; Do đó, để lên men dịch quả đã sunphít hoá, người ta phải sử dụng các chủng nấm men có khả nãng chống chịu nồng độ SO; cao hơn 50mg/ I

Để giảm bớt lượng khí SO; đưa vào dịch quả và ngăn chặn sự nhiễm tạp từ

không khí khu vực sản xuất, người ta còn áp dụng lên men dưới áp suất của CO Sau đây là giới thiệu về biện pháp lên men dưới áp suất của CO

1 22 Các điều kiện công nghệ hạn chế sự phát triển của vi sinh vật nhiễm tạp trong sản xuất cider

1.2.2.1 Lên men cider dưới áp suất của CO,

Công nghệ lên men cider dưới áp suất của CO; có tác dụng hạn chế sự nhiễm

tạp và phát triển của các vi sinh vật có hại trong quá trình lên men Áp suất của CO,

trong dịch lên men có tác dụng khống chế sự lên men của các vi sinh vật hiếu khí

nhiễm tạp như các vi khuẩn axetic gây chua cũng như của các loài nấm men S ludwiggii, Z bailii thường gây đục sản phẩm Khí CO; còn ngăn chặn được các nấm men tạo váng làm đục và hỏng dịch lén men nhu Pichia spp., Candida mycoderma, Willia Hansen, Brettanomyces spp [75]

Ngoài ra, khí CO; còn là một khí trơ bay hơi nhanh kéo theo các hợp chất bay hơi có mùi khó chịu trong dịch lên men như các thành phần lưu huỳnh, các mercaptan

và thiol Các nghiên cứu ở Nhật Bản, Mỹ, Nam Phi đã chỉ ra rằng các loài nấm men S

cerevisiae sẽ sinh đầu fusel ít hơn khi lên men ở điều kiện áp suất cao Khí CO; tác dụng với một số chất có trong thành phần của dịch lên men, tạo ra các este dạng đơn

và phức chất, thúc đẩy quá trình làm dậy mùi thơm cho sản phẩm và làm sản phẩm có

vị dịu hơn, Vì vậy, khí CO; có thể được coi như một tác nhân hoá lý làm ngấu sản phẩm giúp rút ngắn thời gian lên men phụ [75, 77 và 99]

Trong sản xuất cider tại một số vùng của Canada, biện pháp công nghệ về thanh

trùng theo phương pháp Pasteur dịch quả đã được áp dụng đồng thời với biện pháp lên men dưới áp suất CO; cao 2,8 KG/ cm” để hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của vi sinh vật

gây hỏng cider [12 ]

Tuy vậy, tác dụng phụ của CO; là làm giảm tốc độ phát triển của nấm men cider

thuần chủng Trong quá trình lên men, khí CO; với áp suất 0,5 đến 3,9 KG/ cm? sẽ làm thay đổi thành phần các hợp chất béo trong tế bào nấm men, gây ảnh hưởng tới tới sự

phân chia của tế bào nấm men và làm nấm men phát triển chậm lại [107] Vì thể, để lên men cider dưới áp suất CO;, yêu cầu đặt ra khi tuyển chọn các chủng nấm men rượu thuần khiết là chúng phải có khả năng sinh trưởng và lên men dưới áp suất của

cCỌ;

Một biện pháp công nghệ nữa nhằm hạn chế sự nhiễm tạp của vi sinh vật gây hỏng nữa là lên men ở nhiệt độ thấp

1.2.2.2 Lên men cider ở nhiệt độ thấp

Việc ứng dụng công nghệ lên men cider ở nhiệt độ thấp sẽ hạn chế rất lớn sự

nhiễm tạp trong quá trình lên men cider và do đó hạn chế được các loại hoá chất diệt vi

sinh vật đưa vào sản phẩm [99 và 117]

Nhiệt độ lên men là một yếu tố quan trọng trong công nghệ sản xuất cider Khi lên men ở nhiệt độ thấp, đa số các vi sinh vật nhiễm tạp ưa ấm trong dịch quả còn lưu

lại sau các khâu xử lý sẽ khó có điều kiện phát triển, đặc biệt là các nấm mốc và vi

khuẩn gây chua

Lên men ở nhiệt độ thấp sẽ giúp duy trì quá trình lên men phụ kéo dài từ vài

tuần đến 6 tháng đủ để làm ngấu sản phẩm tạo mùi hương hấp dẫn và hạn chế được

quá trình oxy hoá rượu do các vi sinh vật ưa ấm có hại gây ra Nhiệt độ lên men thấp còn hạn chế sự tạo ra các sản phẩm không mong muốn như: Rượu bậc cao, các axit bay hơi và hạn chế quá trình oxy hoá các hợp chat polyphenol lam sim mau san pham

Lên men lạnh là biện pháp công nghệ mà các nhà sản xuất cider thường lựa

chọn để ngăn chặn sự nhiễm tạp trong sản xuất đồng thời giữ mầu sáng cho cider nhờ

ngăn chặn quá trình oxy hoá các hợp chất polyphenol trong táo ở nhiệt độ thấp Nhiệt

độ lên men cider ở các nước Pháp, Nhật, Canada và Mỹ không hoàn toàn giống nhau

Nhật 5-6 Vai ngay 2 1 thang

Trong đó, Nhật Bản là nước ứng dụng công nghệ lên men cider ở nhiệt độ rất thấp để đảm bảo cider có màu sắc và mùi vị phù hợp thị hiếu người tiêu dùng nội địa Nếu sử dụng những chủng nấm men rượu không có khả năng chịu lạnh trong công nghệ lên men cider ở nhiệt độ thấp thì tốc độ phát triển và lên men rượu sẽ bị

chậm lại rất nhiều, thậm chí ngừng hẳn đối với các chủng nấm men ưa ấm Công

nghệ này đồi hỏi phải tuyển chọn các chủng nấm men rượu có khả năng lên men ở nhiệt độ thấp từ 4-5°C

1.2.3 So sánh các biện pháp tiêu diệt và hạn chế sự phát triển của các

vỉ sinh vật có hại trong quá trình sản xuất cider

Mỗi biện pháp công nghệ hạn chế sự nhiễm tạp của vi sinh vật gây hại trong quá trình sản xuất rượu vang đều có ưu nhược điểm riêng và phụ thuộc vào mức độ nhiễm

tạp của dịch quả từng địa phương

Lên men dịch quả đã thanh trùng theo phương pháp Pasteur được đảm bảo an toàn

khỏi vi sinh vật có sẵn trong dịch quả lúc thu hoạch, giảm hàm lượng hoá chất xử lý nhưng lại gây mất hương tươi của quả và làm chậm sự phát triển của nấm men rượu

Lên men địch quả sunphít hoá tuy được đảm bảo an toàn vi sinh với một số chủng

vi khuẩn và nấm mốc nhưng vẫn bị nhiễm tạp bởi rất nhiều chủng nấm men chống

chịu SO; và đòi hỏi phải tạo các chủng nấm men rượu chống chịu SO; Lên men dịch quả dưới áp suất CO; chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật rơi từ không khí khu

vực sản xuất vào dịch lên men, hạn chế sự phát triển của nhiều vị sinh vật gây hại hiếu khí, hạn chế sự bổ sung hoá chất bảo quản nhưng lại đòi hỏi sự đầu tư trang thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi tuyển chọn nấm men lên men chịu áp suất CO; cao

Lên men chính ở nhiệt độ thấp bảo đảm sĩ; lên men thuần khiết của chủng nấm

men lựa chọn vì đại đa số vi sinh vật gây hại không ưa lạnh Tuy nhiên, biện pháp này

6

đòi hỏi phải có sự đầu tư lớn về trang thiết bị cũng như tiêu tốn điện năng làm lạnh,

thời gian lên men kéo dài và lựa chọn khát khe về nấm men chịu lạnh Tiến hành lên men chính cider ở nhiệt độ thấp là một biện pháp không phổ biến trên thế giới và khó

có thể mang lại hiệu quả kinh tế cao cho các nhà sản xuất cider Việt Nam

Do đó, những nghiên cứu lựa chọn biện pháp công nghệ thích hợp cho quy

trình công nghệ sản xuất cider Việt Nam theo kiểu công nghiệp và có những nghiên cứu tìm kiếm chủng nấm men rượu có các đặc điểm thích ứng với quy trình là rất quan trọng

1.3 TÍNH CẠNH TRANH CỦA NẤM MEN CIDER

1.3.1 Vai trò quan trọng của tính cạnh tranh của nấm men cider

Các chủng nấm men rượu vang thuộc loài § cerevisiae thường được sử dụng trong công nghiệp sản xuất cider Nhật bản, Canada và Mỹ Trong khi tại ngành công

nghiệp sản xuất cider cba Anh và Pháp, các chủng Š wvarưm lại được ưa chuộng hơn

[46, 53 va 117]

Cũng như các chủng nấm men lên men rượu vang, các chủng nấm men lên men cider cần phải có các đặc tính cân thiết để lên men dịch quả tạo rượu etylic và hương vị thơm ngon cho sản phẩm

Tuy nhiên, khác với quá trình lên men rượu vang, lên men cider với nồng độ chất khô ban đầu của dịch lên men không cao và độ cồn được tạo ra thấp là một môi trường thuận lợi cho rất nhiều loại nấm mốc, nấm men dại cũng như vị khuẩn gây chua

sự phát triển của các vi sinh vật có hại

Đối với công nghệ lên men cider Pháp và Mỹ, nấm men rượu cần phải có khả năng

lên men nhanh, sinh trưởng tốt, khả năng chống chịu SỐ; và khả năng lên men dịch quả có pH thấp

Các đặc tính cần thiết của nấm men cider đã được các nhà công nghệ Pháp tiêu

chuẩn hoá (bảng 1.6) [77]

Bảng I.6: Các đặc tính cần thiết của nấm men cider [77]

1 | Khả năng sinh sản tốt, sống lâu và tốc | Lên men mạnh để tạo rượu etylic và

độ lên men nhanh CO, để ức chế các vi sinh vật khác 2_| Khả năng chống chịu SO; và pH thấp | Canh tranh tốt với men dại

3 | Lên men triệt để Có khả năng sử dụng các loại đường

khác nhau trong dịch quả

53 | Sinh enzym polygalacturonaza Thuỷ phân pectin

6 | Lang trong rất tốt Dễ lọc sản phẩm, cider đạt độ bền

8 | Tạo ra SO; ở mức tối thiểu Ngăn chặn nồng độ SO: bị vượt quá

giới hạn cho phép

9 | Tạo ra ít các hợp chất gắn kết với ion | Hạn chế sự tạo phức chất với SỐ;

10 | Khong tao ra H,S và axit axetic Ngăn chặn các sản phẩm trao đối

Đối với công nghệ lên men cider Canada dưới áp suất cao của CO; nấm men rượu

cần phải có khả năng lên men chịu áp suất cao của CO; [12]

Đối với công nghệ lên men cider Nhật Bản, nấm men cần phải mang đồng thời các

đặc tính chống chịu khí SO;, lên men chịu lạnh và chịu áp suất của CO; [73]

Tóm lại, ngoài các đặc tính đảm bảo chất lượng cảm quan như độ trong và

hương thơm của sản phẩm, nấm men cider cần phải là một chủng nấm men rượu có các

khả năng cạnh tranh tốt

Trên thực tế sản xuất, vẫn tồn tại rất nhiều chủng nấm men gây hại nhiễm tạp có

đầy đủ các khả năng cạnh tranh này và thậm chí chúng còn có khả năng sinh tổng hợp zymocin tiêu điệt nấm men rượu thuần chủng không mang gen kháng zymocin Vì vậy,

xu hướng mới nâng cao tính cạnh tranh của nấm men là tuyển chọn và lai tạo các

chủng nấm men rượu có khả năng sinh tổng hợp zymocin để hạn chế sự nhiễm tạp của

vi sinh vật trong quá trình lên men nước quả [47, 57, 63,104, 105, 109 và 110]

1.3.2 Vai trò có lợi của nấm men rượu sinh tổng hợp zymocin

Người ta đã tìm thấy nấm men sinh tổng hợp zymocin trong 88% các quá trình lên

men rượu quả, từ công đoạn xử lý nguyên liệu đến lên men và tàng trữ Trong quá trình

lên men rượu quả, sự tương tác giữa các nấm men sinh tổng hợp zymocin với các nấm

men mẫn cảm đã gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm [102]

Phần lớn các nấm men rượu sinh tổng hợp zymocin có lợi trong sản xuất đồ uống

thuộc về loài nấm men rượu thuộc loài § cerevisiae khi chúng vừa có khả năng lên men rượu và vừa có tính cạnh tranh cao tiêu diệt các nấm men có hại nhiễm tạp [132]

Việc sử dụng các chủng giống § cerevisiae thuần khiết sinh tổng hợp zymocin với

các đặc điểm công nghệ lên men rượu tốt đã được ghi nhận là biện pháp rất quan trọng, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm do chúng ngăn chặn được hiện tượng “3” trong lên men do các nấm men nhiễm tạp thuộc giống Candida, Hanseniaspora, Pichia và Saccharomyces gây ra [136]

Tuy nhiên, tác dụng có lợi của nấm men sinh tổng hợp zymocin còn có nhiều hạn

chế do phổ tiêu diệt nấm men nhiễm tạp của mỗi chủng nấm men SŠ cerevisiae sinh tổng hợp zymocin còn nằm trong diện hẹp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ,

pH và chủng loại zymocin Đây là tiên để cho rất nhiều nghiên cứu cho đến nay của các nhà khoa học nhằm tiếp tục tuyển chọn từ các nguồn tự nhiên và lai tạo ra những chủng giống nấm men rượu sinh tổng hợp zymocin và kháng nhiều loại zymocin Và

8

nhờ đó, rất nhiều chủng nấm men rượu có tính cạnh tranh cao hơn đã được tạo ra

[132]

1.3.3 Tình hình sử dụng nấm men sinh tổng hop zymocin trong

công nghiệp thực phẩm trên thế giới

Bên cạnh việc ứng dụng một số loài nấm men sinh tổng hợp zymocin như Kluyveromyces lactis, Williopsis mralii để sản xuất zymocin làm chất bảo quản thực

phẩm mới, nấm men rượu sinh tổng hợp zymocin cũng đã và đang được nghiên cứu

ứng dụng rộng rãi trong lên men bia, rượu và cider (13, 14, 58, 91 va 132]

Các chủng nấm men sinh tổng hợp zymocin có mặt trong rất nhiều sưu tập chủng

nấm men dùng trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất bia, bánh mỳ, rượu vang

quả, rượu Sa kê và cider [81, 85, 95, 97, 98 va 101)

Sưu tập nấm men Viện Nghiên cứu Nho và sản xuất rượu vang (USSR) đã lưu giữ

16 chủng nấm men rượu vang sinh tổng hợp zymocin thuộc các giống Š bayanus, S

paradoxus và S cerevisiae [109]

Sưu tập các chủng vi sinh vật công nghiệp rượu vang Forchungsanstalt

Geisenheim (Cộng hoà liên bang Đức) có 4 chủng nấm men rượu có tên thương hiệu

Schloss Boeckelheim, Geisenheim 74, WE-14 và WE 372 mang đặc tính sinh tổng

Ching S cerevisiae K1-1116 1a ching ném men rượu sinh tổng hợp zymocin đầu

tiên được đưa ra bán rộng rãi trên thị trường thế giới dưới dạng nấm men khô thương phẩm do Pierre Barre và cộng sự thuộc Viện Nghiên cứu rượu vang Montpellier-

Canada nghiên cứu tuyển chọn

1.4 DAC ĐIỂM CỦA ZYMOCIN DO NẤM MEN RƯỢU

SACCHAROMYCES CEREVISIAE SINH TONG HOP

1.4.1 Phan loai zymocin

Zymocin do nấm men sinh tổng hợp được phân thành các loại khác nhau dựa trên

sự tương tác tiêu diệt hoặc không tiêu diệt với các nấm men khác, nhiệt độ và pH tối ưu cho zymocin hoạt động Các nấm men sinh tổng hợp cùng một loại zymocin không

tiêu diét lẫn nhau và dựa vào đặc điểm này người ta phân loại được zymocin đó thuộc

về loại nào

Zymocin do nấm men Š cerevisiae sinh tổng hợp chủ yếu thuộc về các loại K1,

K2, K3 và K28 với dải pH tối ưu từ 4,0+5,0 và nhiệt độ thấp hơn 25°C Hơn 90%

zymocin của nấm men rượu vang sinh tổng hợp thuộc loại K2

Một số ít nấm men § cerevisiae sinh tổng hợp zymocin thuộc loại KHR và KHS

- loại zymocin đặc biệt bền nhiệt tới 70 °C và hoạt động với dải pH rộng hơn các zymocin K1, K2 [132]

1.4.2 Bản chất xymocin của nấm men S cerevisiae

Bản chất của các zymocin do nấm men § cerevisiae sinh tổng hợp là protein

như zymocm loại K1, KHR và KHS hoặc là glycoprotein như zymocin loại K2 và

K28 Vẻ mặt cấu trúc, các zymocin loại KHR và KHS là những phân tử protein mạch

đơn (monomer) trong khi các zymocin KI, K2 và K28 lại ở dạng gồm 2 phân tử protein hoặc glycoprotein œ và B (œ B dimer) được gắn với nhau bằng liên kết sưnphít [132]

Kích thước của các zymocin của nấm men Š cerevisiae đã được xác định trong

rất nhiều nghiên cứu trước đây

Số lượng các axit amin trong các phân tử zymocin loại khác nhau là không giống nhau Trong các phân tử zymocin loại K2, các thành phần hyđrat cacbon là các loại đường được nối với một số axit amin bằng liên kết O-glucosit Các zymocim loại K2 của các ching ném men S cerevisiae khdc nhau có trình tự axit amin và trọng lượng phân tử khác nhau mặc dù chúng có chung nhiệt độ và pH tối ưu khi hoạt động Trình tự axit amin của zymocin của rất nhiều nấm men sinh tổng hợp zymocin đã được công bố và lưu trong các ngân hàng đữ liệu về gen [109]

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của zymocin do nấm men

S cerevisiae sinh tong hop

Phần lớn zymocin của nấm men Š cerevisiae rất nhạy cảm với nhiệt độ cao Các loại zymocin khác nhau của nấm men 3 cerevisiae có tính bên nhiệt khác nhau:

Các zymocin loại K28, KHS và KHR có khả năng chịu nhiệt tốt hơn so với zymocin K1, K2 và K3

Các zymocin loại KI, K2 và K3 của nấm men Š cerevisiae bị mất dần hoạt tính nhanh chóng khi nhiệt độ cao hơn 25 °C Tại nhiệt độ 30°C, hoạt tính của các zymocin này đã bị giảm so với ban đầu là 50% và tại nhiệt độ 35 °C thì chúng hoàn toàn bị mất

hoạt tính [133]

1.4.3.2 pH hoạt động của zymocin

Các zymocin khác nhau của các nấm men Š cerevisiae hoạt động trong các khoảng

pH khác nhau [108 và 133]

Zymoenn loại KI thường hoạt động trong dải pH hẹp từ 4,2 đến 4,9

Zymocin loại K2 hoạt động trong dải pH rộng hơn từ 2,8 đến 4,8 với giá trị pH tối

ưu từ 4,0 đến 4,4

Zymocin loại K28 hoạt động trong dải từ 5,0 đến 5,8 với giá trị pH tối ưu bằng 5

Riêng với zymocin loại K3 chưa có nhiều nghiên cứu vẻ dải pH tối ưu cho hoạt tính của zymocin, ngoài kết luận zymocin K3 hoạt động ở pH 4,5 [131]

1.4.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân hoá học

Hoạt tính zymocin của nấm men Š cerevisiae cũng chịu ảnh hưởng của một số hoá chất có mặt trong môi trường của nấm men hoặc trong quá trình tính sạch và bảo quản zymocin {51, 66, 106 va 139]

Các zymocin còn bị các enzim thuy phan protein làm bất hoạt như: enzim proteinza, pepsin, papain [130, 132 va 134] Cac enzim nay sé anh hưởng mạnh nhất

tới hoạt tính của zymocin loại K1, K2 và K3 khi pH môi trường ở vào khoảng 4,2 đến 4,6

Ngoài ra một số hoá chất phụ gia như bentonit, axit tannic, tananh thường dùng

trong sản xuất rượu quả lên men cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính của zymocin Người

10

ta đã quan sát thấy khi nồng độ bentonit trong dung dịch chứa zymocin lên đến 10 g/

hl, zymocin cua S cerevisiae sé bi tic ché hoan toan [119]

Vấn đẻ nghiên cứu đặc tính sinh tổng hợp zymocin của nấm men rượu va img g dụng trong quá trình sản xuất cider đã được tiến hành ở một số nước trên thế giới, cụ thể như phần dưới đây

1.5 CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN LAI TẠO NẤM MEN RƯỢU SINH

TONG HGP ZYMOCIN

Từ những năm 1980, các kỹ thuật di truyền như đột biến và lai tạo đã được áp

dụng rộng rãi để nâng cao chất lượng các chủng nấm men công nghiệp [34] Rất nhiều phương pháp lai tạo khác nhau đã được ứng dụng để tạo các chủng nấm men mới với

các đặc tính mong muốn [9, 63, 64, 74, 83, 84, 95, 103, 104, 105, 116, 129 và 137]

Các kỹ thuật di truyền thường được sử dụng để cải tạo nấm men là:

+ Lai hữm tính lặp lại (Back-crossing)

+ Đột biến (Mutation)

+ Lai hiếm (Rare mating)

+ Dung hợp tế bào trần (Protoplast fusion)

+ Chuyển nhiễm sắc thể đơn (Single chromosome transfer)

+ Biến nạp (Transformation)

Trong số đó, một số kỹ thuật đã được ứng dụng thành công để tạo đặc tính sinh

tổng hợp zymocin cho các chủng nấm men công nghiệp thực phẩm (bảng 1.9 )

Đi đầu trong ứng dụng kỹ thuật di truyền để tạo đặc tính sinh tổng hợp

zymocin cho các chủng giống lên men rượu là các nhà nghiên cứu Nhật Bản với sự áp dụng phổ biến 3 phương pháp lai: lai hữu tính lặp lại (back-crossing), dung hợp tế bào trần (protoplast fusion) và dung hợp khối nguyên sinh chất tế bào (cytoduction) [74,

105, 121 và 129]

1.5.1 Phương pháp lai hữu tính lap lai

Phương pháp lai hữu tính để tạo ra chủng nấm men rượu vang có khả năng lên

men lạnh và sinh tổng hợp zymocin đã được Shodo Hara và cộng sự thực hiện thành công [121] Chủng nấm men con lai mới có đồng thời khả năng lên men chịu lạnh và khả năng sinh tổng hợp zymocin đã được tạo ra khi lai hữu tính hai chủng: KL-88 là

chủng men dại sinh tổng hợp zymocin tìm thấy trong quá trình sản xuất Sa kê với

chủng WL-7 là một chủng men rượu vang lên men chịu lạnh tốt nhất Kết quả là con lai đã được ứng dụng như trong lên men vang quả ở nhiệt độ thấp và có khả năng ngăn

chặn sự nhiễm tạp của nhiều loài nấm men tạo màng

Theo phương pháp này, một dòng đơn bội của chủng KL-88 đã được lai với một dòng đơn bội của chủngWL~7 để tạo ra con lai thế hệ thứ nhất Trong số các con lai thế hệ thứ nhất, người ta đã chọn các dòng đơn bội có khả năng sinh tổng hợp zymocin và chịu lạnh lai tiếp với dòng đơn bội WL-7 để tạo con lai thế hệ thứ 2 Trong số con lai thế hệ thứ 2, con lai 2HYL đã được lựa chọn sau khi tiến hành các thí nghiệm so sánh

đặc tính cần có với các chủng nấm men bố mẹ Con lai này có khả năng tiêu diệt các

chung S cerevisiae cé trong dịch nho

Cũng bằng phương pháp lai hữu tính cổ điển này này, Ouchi và cộng sự cũng tạo được chủng giống nấm men rượu Sa kê-một loại vang gạo truyền thống của Nhật Bản

có khả năng sinh tổng hợp zymocin [ 104]

1.5.2 Phương pháp lai dung hợp tế bào trần

Nhờ có các kỹ thuật di truyền hiện đại, người ta đã phát hiện được các plasmid điều khiển chức năng sinh tổng hợp zymocin của nấm men Hai plasmid mạch thẳng pGKII và pGKI2 của chủng nấm men Kiwyverơmyces lactis có chức năng sinh tổng hợp zymocin tiêu diệt các chủng S cerevisiae, S italicus, S rouxii, K lactis, K

intermedia

Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần, Norio Gunge và cộng sự đã chuyển được plasmid pGKII và pGKI2 của nấm men K /aciis sinh tổng hợp zymocin loại KI vào ching ndm men S cerevisiae khong có khả năng sinh tổng hợp zymocin Sau đó,

chủng chủ § cerevisiae đã có khả năng sinh tổng hợp zymocin giống hệt K lactis va

đồng thời có khả năng kháng lại chính zymocin này [102]

Các tác giả đồng thời đã chứng minh được trong số hai plasmid ADN mạch thẳng này chỉ có pGKI1 là chứa các gen mã hoá tính trạng sinh tổng hợp zymocin loại KI] va chống chịu zymocin KI mà thôi

1.5.3 Phương pháp lai dung hợp khối nguyên sinh chất tế bào

Với phương pháp dung hợp khối nguyên sinh tế bào mà không dung hợp nhân tế bào giữa hai chủng nấm men, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã tạo được các chủng nấm men rượu vang gạo và vang quả có đặc tính sinh tổng hợp zymocin [105]

Các tác giả đã sử dụng ethidium bromit để đột biến nấm men nhằm làm mất khả

nang dung hợp nhân của tế bào khi dung hợp tế bào trần Thể đột biến karl-1 có thể

tiếp hợp với tế bào khác một cách bình thường nhưng lại không có khả năng dung hợp

nhân tế bào trong suốt quá trình lai Các thể dung hợp tế bào của thể đột biến kar1-1

với tế bào nấm men khác thường phân tách thành nhiều kiểu tế bào chất mới hay thể dung hợp nguyên sinh chất tế bào mới và luôn chứa một nhân của tế bào bố hoặc mẹ

kar1-]

Tetsuji Seki và cộng sự lặp lại thành công phương pháp này trong lai tạo chủng nấm

men rượu vang sinh tổng hợp zymocin 1368R từ chủng nấm men sinh tổng hợp

zymocin Wickner-1368R và chủng nấm men rượu vang Mỹ Montrachet — 552 [129] Dac điểm của phương pháp dung hợp khối nguyên sinh chất tế bào là sự giữ nguyên các tính trạng trước lai do các gen nằm trong nhân của tế bào nấm men bố mẹ quy định

do không có sự dung hợp nhân tế bào bố mẹ

Như vậy: Ngoại trừ các kỹ thuật lai hiếm Nakatomi và chuyển nhiễm sắc thể đơn,

hau hết các kỹ thuật lai ghép di truyền còn lại đếu đã được ứng dụng thành công vào

việc tạo đặc tính sinh tổng hợp zymocin cho nấm men rượu

1.5.4 Phương pháp lai hiếm Nakatomi

Tuy chưa được ứng dụng để tạo đặc tính sinh tổng hợp zymocin cho nấm men nhưng phương pháp lai hiếm Nakatomi là một phương pháp lai được ứng dụng phổ biến tại Nhật Bản để cải tạo nấm raen bia, nấm men rượu và nấm men bánh mỳ

12

Phương pháp này thích hợp cho lai ghép giữa một chủng nấm men công nghiệp đồng

tản với một chủng nấm men dị tản [9, 32 và 135]

Khi sinh sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng, tế bào nấm men Š cerevisiae

dị tản lưỡng bội có giới tính a/ œ sẽ giảm phân thành 4 bào tử đơn bội chứa trong nang

bào tử Hai bào tử có giới tính lai a và hai bào tử có giới tính lai œ Sự phân chia bào tử bào tử một là ngẫu nhiên không tuân theo trình tự phân ly của 4 nhiễm sắc thể tách ra

từ mối nhiễm sắc thể trong quá trình giảm phân Vì vậy, bốn bào tử trong mỗi nang

được gọi là bộ bốn không xếp hàng [9]

Khi 4 bào tử thoát ra khỏi nang, gặp môi trường dinh dưỡng đây đủ sẽ nảy chồi

và phát triển thành các tế bào đỉnh dưỡng ở thể đơn bội tự dưỡng mang giới tính lai Bên cạnh đó, bằng tác nhân đột biến hoá học như ethidium bromit, tế bào chủng nấm

men cong nghiép sẽ bị mất các ADN ty thể (mLADN) chuyển thành thể petite giảm khả

năng hô hấp nhưng vẫn giữ nguyên khả năng lên men Thể petite sẽ có khả năng lai với

thể đơn bội tự dưỡng có giới tính lai và có khả năng hô hấp bình thường của các chủng

nấm men đị tản khác để tạo con lai Quá trình lai xảy ra sự dung hợp nguyên sinh chất

và dung hợp nhân của hai loại tế bào bố mẹ Vì vậy, chủng nấm men con lai sẽ tập hợp được các tính trạng quí do các gen trong và ngoài nhân tế bào của cả nấm men bố và

mẹ mã hoá

Thể con lai có nhân dung hợp được tiếp tục tạo bào tử, phân tích đặc điểm di truyền và lai chéo tiếp tạo hệ con lai như ý

1.6 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG CHỦNG NẤM MEN

VÀ ỨNG DỰNG VÀO SẢN XUẤT CIDER VIỆT NAM

Phù hợp với định hướng chế biến nước quả xuất khẩu là hướng được ưu tiên khuyến khích đầu tư do Chính phủ ban hành, nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men

cider như công nghệ sản xuất cider của thế giới vào chế biến quả từ nguồn quả Việt

Nam sẽ góp phần thúc đẩy sản xuất một loại sản phẩm đồ uống vốn được ưa chuộng

trên thế giới phục vụ mục đích xuất khẩu và mở thị trường tiêu thụ mới trong nước

Cơ sở để tiến hành nghiên cứu nâng cao chất lượng chủng nấm men và ứng dụng

sản xuất cider Việt Nam được dựa trên nguồn nguyên liệu quả, nguồn chủng giống

nấm men và điều kiện trang thiết bị trong nước, đồng thời trên cơ sở tham khảo các

quy trình công nghệ sản xuất cider trên thế giới

1.6.1 Nguồn nguyên liệu quả tại Việt Nam

Để phục vụ cho định hướng ưu tiên phát triển chế biến đồ uống từ quả của

Chính phủ, bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quy hoạch 26 vùng cây ăn quả tập trung với quy mô tổng cộng trên 460 nghìn hecta và sản lượng thu hoạch dự kiến

đạt 3,2 triệu tấn quả/ năm nhằm đáp ứng nguồn trái cây cho các cơ sở chế biến nước

quả trong nước (phụ lục 1) [24]

Ở nhiều địa phương đã hình thành các vùng trồng cây ăn quả quy mô lớn

Những tiến bộ mới trong kỹ thuật chọn giống và canh tác đã góp phần nâng cao chất

lượng và sản lượng của các loại quả [4 va 30]

Nhờ việc triển khai áp dụng giống dứa mới và kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô,

đứa-loại quả có thể sử dụng lên men rượu, hiện được trồng trên diện tích rất lớn tại

nhiều vùng quả khác nhau của cả 3 miền Bắc Trung Nam Trong vòng 10 năm tới

diện tích trồng dứa sẽ còn tiếp tục mở rộng lên hàng trăm lần và các sản phẩm chế biến từ dứa được dự định xuất khẩu chủ yếu sang các nước Liên Bang Nga, Tây Bắc

Âu Đông Âu, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Australia và một số nước khác ở châu Á

141

Dau, man, mo, vai thiểu, táo của Việt Nam cũng là các loại quả được trồng với

số lượng rất lớn ở phía Bắc Việt Nam có thành phần thịt quả thích hợp cho lên men

các sản phẩm đồ uống chứa rượu[9, 20, 22và 4l] Sau thu hoạch, các loại quả này mới

chỉ được chế biến dưới đạng siro quả, quả đóng hộp và quả sấy khô ở quy mô công nghiệp tại một số tỉnh là vùng nguyên liệu với sản lượng nhỏ [9, 21, 24 và 44]

Ngoài ra, Việt Nam còn có nhiều loại quả khác với thành phần dinh dưỡng phù

hợp lên men rượu quả như nho, cam, điều, táo mèo [20]

Trong thành phần của táo tây, nguyên liệu được chọn lựa để sản xuất cider trên thế

giới, protein chỉ chiếm có 0,3%, ít hơn rất nhiều so với hàm lượng protein trong quả

nho (chiếm 1,4%) [75 và L17]

Bên cạnh đó, hàm lượng axit trong quả táo tây rất cao (0,4-1,85%, tính theo axit

xitric), vì thế dịch ép táo có độ pH rất thấp từ 3,2— 3,5 [77] Phần lớn các loại quả Việt Nam nêu trên có thành phần quả tương tự như vậy {9 và 22]

Do đó, Việt Nam hoàn toàn đủ khả năng cung ứng nguyên liệu quả trong nước cho công nghệ sản xuất cider Việt Nam ,

1.6.2 Nguồn chúng giống nấm men rượu lên men quả Việt Nam

Trước đây, ở Việt Nam đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công về tuyển

chọn chủng nấm men và công nghệ phù hợp lên men rượu vang quả Việt Nam [8, 9,

17, 28, 29, 37, 40 và 45]

Các tác giả đã chú trọng tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men phù hợp với đặc tính các loại quả nhiệt đới của Việt Nam Theo các nghiên cứu này,

thông thường các chỉ tiêu bắt buộc cho chủng nấm men lên men dịch quả Việt Nam là:

có khả năng lên men quả có độ chua cao, khả năng lắng trong tốt, lên men khoẻ, tạo hương thơm hấp dẫn, thuỷ phân pectin để làm trong sản phẩm

Tuy nhiên, việc tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho công nghệ sản xuất cider từ nguồn quả trong nước và việc nâng cao tính cạnh tranh của nấm men nhằm hạn chế sự nhiễm tạp của vi sinh vật có hại trong quá trình lên men địch quả Việt Nam hiện vẫn chưa được đi sâu nghiên cứu

Tính cạnh tranh cao là chỉ tiêu hết sức quan trọng khi lựa chọn nấm men lên men dịch quả có độ cồn thấp từ quả nhiệt đới, đặc biệt tại môi trường khí hậu nóng ẩm

như Việt Nam, nơi nấm men nhiễm tạp sinh tổng hợp zymocin đã được tìm thấy với

mật độ cao trong dịch quả Việt Nam [38]

Vì vậy, những nghiên cứu nhằm tuyển chọn hoặc lai tạo ra những chủng nấm men phù hợp cho công nghệ sản xuất cider ở Việt Nam và có khả năng sinh tổng hợp zymocin là cần thiết

1.6.3 Thiết bị lên men cider tại Việt Nam

Thiết bị phù hợp với công nghệ lên men cider ở qui mô công nghiệp có nhiều đặc điểm tương tự hệ thống thiết bị lên men bia hiện đang rất phổ biến tại Việt Nam

Thiết bị lên men bia là loại thiết bị lên men hai vỏ, có khả năng giữ áp suất do

CO., điều chỉnh nhiệt độ, chịu độ ăn mòn của các axít trong dịch quả nhiệt đới và

14

chiểu cao thiết bị vừa phải không gây áp suất thuỷ nh lên nấm men rượu Nhiều xưởng bia tại Việt Nam nếu chưa sử dụng hết công suất thiết bị có thể tận dụng công

suất thiết bị còn dư vào sản xuất loại sản phẩm nước quả lên men này Ngoài ra, một số

cơ sở sản xuất nước quả có quy mô lớn, hệ thống thiết bị hiện đại cũng là địa chỉ lý

tưởng để triển khai công nghệ lên men cider [24]

1.6.4 Quy trình công nghệ sản xuất ciler

Công nghệ sản xuất cider trên thế giới có sự thay đổi theo mỗi chủng loại cider

cũng như theo tập quán của mỗi Quốc gia Tuy nhiên, về cơ bản công nghệ này đều

phải dựa trên các bước:

1 Thu nhận và xử lý dịch quả

2 Lên men dịch quả (gồm 2 giai đoạn: giai đoạn lên men chính để tạo rượu etylic va giai đoạn tàng trữ để tạo hương và làm ổn định chất lượng sản phẩm)

3 Hoàn thiện sản phẩm

Sơ đồ công nghệ chung về sản xuất cider và các sơ đổ công nghệ sản xuất cider của

các nước Pháp, Nhật và Canada được trình bày dưới đây (hình 1 2, 1.3, 1.4 và 1.5) [73]

Quy trình công nghệ chung để sản xuất cider được trình bày ở sơ đồ 1.1 dưới đây:

Cider đựng vào thùng chứa

Hình 1.2: Quy trình chung của công nghệ sản xuất cider [13]

15

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYEN LIEU

2.1.1 Vi sinh vat

Hai mươi sáu chủng nấm men sau đây đã được sử dụng trong quá trình nghiên cứu:

*Nấm men rượu:

+ Mười một chủng nấm men rượu thuộc loài S cerevisiae : Y-7033, Y-705, Y-7012,

Y-708, Y-7014, Y-7029, Y-7030, Y-7049, Y-7043, Y-7052 và Y-7028 (được đặt tên

trong nghiên cứu này là LE]) từ Sưu tập Giống vi sinh vật công nghiệp, Viện Công

nghiệp thực phẩm Việt Nam (CNTP)

+ Chủng nấm men LE2 là nấm men sản xuất cider của vùng Queensland (Úc) đã được

dinh tén loal 1a S cerevisiae

+ Ching S bayanus EC-1118 ding dé san xuất Sam panh có đặc tinh sinh tổng hợp

zymocin và chủng § cerevisiae K1-1116 dùng để sản xuất rượu vang có đặc tính sinh

tổng hợp zymocin loại K2 từ sưu tập giống nấm men Lallemand-Canada

* Nấm men sinh tổng hợp zymocin:

+ Chủng nấm men Š.cerevisiae NCYC738 sinh tổng hợp zymocin loại K2 chuẩn từ Sưu

tập giống nấm men quốc gia Anh (NCYC- Anh)

+ Chủng nấm men S.cerevisiae NCYC T61 sinh tổng hợp zymocin loại K3 chuẩn từ

Sưu tập giống nấm men quốc gia Anh (NCYC- Anh)

+ Chủng nấm men Kiwyveromyces lactis DSM70799 sinh tổng hợp zymocin loại K]

chuẩn từ Sưu tập giống vi sinh vật và tế bào Cộng hoà liên bang Đức (DSMZ-

Germany)

* Nấm men mẫn cảm với zymocin

+ Bốn chủng nấm men thuộc loài Š cerevisiac DSM?0471, DSM70449, DSM70487,

+ Hai chủng nấm men thuộc loài S pastorianus DSM70680, DSM658 1

+ Hai chủng nấm men thuộc loài S bayanus DSM70412, DSM 70547

đều từ Sưu tập giống vi sinh vật và tế bào Cộng hoà liên bang Đức (DSMZ-

Germany)

* Nấm men có giới tính lai chuẩn

Ching S cerevisiae MATa (cé giéi tinh lai a) va ching S cerevisiae MATa (cé gidi

tinh lai œ) đã bị bất hoạt gen chuyển đổi giới tính HO có đặc tính không kết cụm trong

môi trường YPD pH 5,2 được cung cấp từ phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ

sinh học, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam

Hoá chất - — Nguồn gốc | _Hoachat | Nguéngéc |

Ethidium bromit Fluka, Đức Glucoza Sigma, My

Agar - Prolab, Phap ¡ Xanh methylen ' Trung Quốc

: Paraffin Sigma, My Na,SO Bactol, Pháp

Enzim Zymolyza_| Sigma, My Mgs0, Sigma, My

16

Adenine blue Sigma,My ' MgCl, PERKIN

2.1.3 Nguồn quả

Bảy loại quả được dùng trong nghiên cứu là các loại quả có thể sử dụng để lên men

rượu và được quy hoạch trồng với diện tích lớn tại Việt Nam theo Đề án phát triển rau quả, hoa cây cảnh thời kỳ 1999-2010 [4] Cụ thể:

+ Dâu tằm được thu hoạch tại Ba Vì (Hà Tây) vào tháng 3

+ Vải được thu hoạch tại Lục Ngạn (Bắc Giang) vào tháng 6

+ Dứa được thu hoạch tại nông trường Đồng Giao (Ninh Bình) vào tháng 6 và tháng

19

+ Mận Hậu được thu hoạch tại Lạng Sơn vào tháng 6

+ Mơ được thu hoạch tại Lập Thạch (Phú Thọ) vào tháng 3

+ Táo (loại táo tròn và ngọt) được thu hoạch tại Gia Lộc (Hải Dương) vào tháng 2

+ Nho (loại nho đỏ quả nhỏ) được thu hoạch tại Nha Hố (Ninh Thuận) vào tháng 11

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU

2.2.1 Phương pháp vát lý

- Xác định nồng độ chất khô hoà tan bằng khúc xạ kế (Refractometer)

- Xác định pH dịch lên men bằng pH mét (Orion, Mỹ)

- Xác định độ trong của dịch và khả năng lắng của nấm men bằng phương pháp so màu

trên máy so màu (Thermo Spectronic, Mỹ)

- Xác định thành phần hoá học của dịch quả bằng máy sắc ký lỏng cao 4p HPLC (Shimazu, Nhat Ban) va bằng máy sắc ky khi GC (Shimazu, Nhat Ban)

- Xác định hàm lượng rượu bằng bộ chưng cất và đo mẫu bằng cồn kế Gay Lusac

- Cô đặc zymocin bằng phương pháp đông khô chân không

- Cô đặc zymocin bằng phương pháp màng siêu lọc [60, 70, 100 và 1201

Cơ sở phương pháp: Dưới áp suất nén của khí nitơ, các phần tử chứa trong dịch lên men có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ của màng siêu lọc sẽ lọt qua, các phần tử -

có kích thước lớn hơn sẽ được giữ lại trên màng

Tiến hành: Dịch nấm men sinh tổng hợp zymocin được loại tế bào bằng màng tiệt tring Pre-sterilized membrane Express™ 0.22um (Steritop™, Millipore, MY) và

Millipak —100 (Millipore, MY) Zymocin duge loc qua các loại màng siêu lọc có kích thước lỗ khác nhau: 100 KDa, 50KDa, 30KDa, 10KDa, 5KDa của hãng Satorius (Đức)

2.2.2 Phương pháp hóa học

-_ Xác định hàm lượng axit toàn phần bằng phương pháp trung hoà (%){9]

- _ Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Graxianov [9]

- _ Phân tích hàm lượng SO, trong dich qua theo TCVN 6328-1997 [6]

2.2.3 Phương pháp vi sinh vật

* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được mô tả chỉ tiết ở phụ lục 6

* Phương pháp xác định đặc điểm hình thái nấm men

Các chủng nấm men được cấy vào các đĩa petri chứa môi trường thạch Mc Clays

chứa muối axetat natri và nuôi cấy ở 20 C trong 2-7 ngày

Bào tử nang được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi Zeiss Axiophot- Đức với

sự trợ giúp của phần mềm máy tính [mage Pro Plus (The proven Solution™, version 4.0

for Window 95) Hình dạng bào tử được so sánh với các hình dạng bào tử mẫu của nấm men trong khoá phân loại nấm men của Kurzman và Barmet [54, 62 và 89] Hình dạng khuẩn lạc nấm men được quan sát trên môi trường YPD đặc sau 4 ngày nuôi cấy

ở nhiệt độ 25 °C Hình đạng tế bào sinh dưỡng được quan sát sau 18 giờ nuôi cấy trong

môi trường YPD dịch thể ở nhiệt độ và 25 °C

* Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của nấm men [54 và 5Š] Các test thử sinh lý sinh hoá bao gồm: lên men trên môi trường lỏng chứa

glucoza (2% glucoza), thử khả năng sinh trưởng trên môi trường agar chứa muối nitrat

(0.08% KNO,) va sit dung API kit (Pháp) đặc chủng để khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các nguồn cácbon khác nhau trong thời gian 15 - 21 ngày ở nhiệt độ

25 °

Dịch tế bào của từng chủng nấm men được hoà cùng 1ml dung dịch YNB 0,7%

để đạt mật độ 1x10” tế bào/ mÌ Dùng micropipet đưa dịch nấm men đã trộn với nguồn

nitơ này vào từng giếng trên Kit API Gitt kit thử ở nhiệt độ 25 °C

Các kết quả được phân tích bằng phần mềm máy tinh Yeast Identification PC Program Version 2.0 để phân loại nấm men [55]

* Đánh giá khả năng tạo sinh khối của nấm men bằng sử dụng buồng đếm

hồng cầu Goriaev [29]

* Đánh giá khả năng lên men của nấm men bằng bình Einhorn - Smith [29]

Để đánh giá khả năng lên men, chủng nấm men được tiếp vào bình Einhom Smith chứa môi trường lên men sao cho mật độ tế bào ban đầu là 1,2-2,0 x105/ ml Đánh giá khả năng lên men dựa trên thời gian CO; tạo thành đấy cột dịch môi trường ở đầu

nhánh của bình tụt xuống 5ml Thời gian càng ngắn chứng tỏ khả năng lên men càng

mạnh

* Phát hiện zymocin bàng phương pháp định tính [114]

Phương pháp định tính phổ biến nhất để xác dinh khả năng sinh tổng hợp

Zzymocin của nấm men là phương pháp đục lỗ của Bevan trên môi trường đĩa thạch YPD-xanh methylen chứa tế bào mẫn cảm

Cơ sở phương pháp: Nấm men sinh tổng hợp zymocin thải ra ngoài môi trường

sống zymocin của nó làm chết tế bào nấm men nhạy cảm sống chung trên môi trường

YPD chứa xanh metylen Các tế bào nấm men nhạy cảm đã chết có khả năng bắt màu xanh với chất màu xanh metylen, trong khi các nấm men không nhạy cảm với zymocin

sẽ không chết mà tiếp tục phát triển trên môi trường chứa xanh metylen làm chuyển

màu môi trường sang màu xanh nhạt hơn hoặc vàng theo thời gian nuôi cấy và mật độ nấm men nhạy cảm trong môi trường,

18

Thực hiện: Chuẩn bị môi trường YPD-xanh _metylen, hấp thanh trùng và làm nguội đến 48°C Tiếp địch huyền phù nấm men mẫn cảm vào môi trường thạch | dang còn ở dạng lỏng để có mat dd 1,5.10°va dem dé dia petri

Khi thạch trong đĩa petri đã đông lại, dùng ống kim loại hình trụ vô trùng có đường kính trong là 6 mm để đục các lỗ trong thạch (nhưng không đục sát đáy của đĩa petri) Canh trường chứa tế bào nấm men cần thử tính trạng sinh tổng hợp zymocin được nhỏ vào lỗ trên đĩa thạch Sau đó đĩa thạch được nuôi cấy ở nhiệt độ 25 °C trong

2 ngày

Dac tính zymocin dương tính được biểu hiện ở vòng vô khuẩn màu xanh và trong

xung quanh lỗ sau vài ngày nuôi cấy

Các chủng nấm men mẫn cảm được thử là các chủng chuẩn đã được định tên chính xác trong Sưu tập giống vi sinh vật và tế bào CHLB Đức (DSM42)

* Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 5165-1990 [6]

2.2.4 Phương pháp sinh học phán tử

* Phương pháp chiết tách ADN của nấm men bằng sóng siêu âm [124]

* Xác định quan hệ di truyền giữa nấm men con lai và nấm men bố mẹ theo phương pháp nhân gen - Khuếch đại ADN đa hình ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymophism DNA) [122]

* Phương pháp kiểm tra sự có mật của gen M-ARN và gen L-ARN của nấm

men sinh tổng hợp zymocin [39]

2.2.5 Phương pháp di truyền

*Phương pháp xác định khả năng tạo bào tử của nấm men trên môi trường SPO

và môi trường Mc Clays [32 và 54]

* Phuong pháp tách bào tử nấm men [ 32]

Cơ sở phương pháp: Bào tử nấm men được giải phóng ra ngoài nang bào tử nếu vỏ

của nang bào tử được thuỷ phân bằng enzim proteinaza Trọng lượng của bào tử nhỏ hơn rất nhiều so với tế bào nấm men nên có thể khuếch tán vào pha paraffin trong hỗn hợp paraffin và nước Vì vậy, có thể tách bào tử khỏi hỗn hợp với tế bào nấm men bằng phương pháp khuếch tán sử dụng paraffin lỏng

Tiến hành: Chuyển toàn bộ bào tử nang của nấm men sau 5 ngày nuôi cấy trên

môi trường tạo bào tử Mc Clays vao ống Eppendorf chứa l ml nước cất vô trùng

Bổ sung 0,1 ml dịch enzim zymolyza có nồng độ 9Oul/ ml, lắc đều và nuôi cấy ở nhiệt độ 30 °C từ 2-3 giờ Kiểm tra sự thuỷ phân của thành tế bào dưới kính hiển vi

Khi thành của tế bào gần vỡ, đem lắc mạnh để giải phóng bào tử trong đệm paraffin vô trùng

Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng phút trong 40 giây Hút toàn bộ pha paraffin chứa bào tử với trọng lượng nhẹ hơn tế bào sinh dưỡng để cấy trải sang đĩa thạch DYE, nuôi

ở nhiệt độ 25 °C trong 3 ngày Các bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc chứa tế bào

sinh dưỡng

Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ có kích thước nhỏ để cấy chấm lên đĩa thạch YPD

nhằm mục đích thu các dòng bào tử khác nhau

* Phương pháp xác định giới tính lai của nấm men [32]

Cơ sở phương pháp: Các tế bào nấm men mang giới tính a có khả năng tương tác với các tế bào mang giới tính œ để tạo thành kết tủa dạng bông trong môi trường YPD dich thế Khi chủng nấm men bị làm bất hoạt gen thay đổi giới tính HO thì tế bào của chúng chỉ có-thể mang giới tính a hoặc œ Các chủng mang giới tính chuẩn này được

dùng để xác định giới tính tế bào nấm men đơn bội trong lai tạo nấm men

Tiến hành: Các tế bào nấm men đơn bội mang giới tính a hoặc œ sẽ có khả năng

tương tác với Nuôi lắc sinh khối chủng nấm men S cerevisiae MATa cé gidi tinh a chuẩn và chủng nấm men § cerevisiae MATGœ có giới tính œ chuẩn trong môi trường YPD dịch thể ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ

+ Hút 500 tì môi trường YPD dịch thể cho vào mỗi giếng a và giếng œ, hút 60 HÌ dịch tế bào giới tính œ chuẩn cho vào các giếng œ và 60 pl dich té bao gidi tinh a

chuẩn cho vào các giếng a

+ Hút 20 kì dịch tế bào cần xác định giới tính cho vào giếng a và giếng a

+ Giếng đối chứng: cho 20 kì dịch tế bào a chuẩn vào giếng œ, 20 tl dịch tế bào

ơ chuẩn vào giếng a

.Nuôi tĩnh ở 25°C Sau 5 giờ, kiểm tra giếng đối chứng nếu có kết cụm thì sẽ đọc kết quả ở các giếng a và œ

Tế bào không kết cụm ở cả 2 giếng a và œ thì không mang giới tính lai

Nếu tế bào kết cụm ở giếng chứa dịch tế bào a chuẩn thì sẽ mang giới tính lai ơ Nếu tế bào kết cụm ở giếng chứa dịch tế bào œ chuẩn thì sẽ mang giới tính lai a

Các tế bào mang giới tính lai được đánh đấu và cấy riêng rẽ trên môi trường YPD

* Phương pháp đột biến tế bào bằng tác nhân hoá học {9, 32 và 59]

Cơ sở phương pháp: Dưới tác động của cthidium bromit ở nồng độ thấp 0,2%, một số đoạn gen ADN trong ty thể của tế bào nấm men (mt ADN) bị thay đổi hoặc

biến mất, trong khi bộ gen trong nhân tế bào nấm men không bị ảnh hưởng Tế bào

nấm men sẽ chuyển thành thể petite bị giảm khả năng hô hấp hoặc mất khả năng phát

triển trên môi trường chứa lactat natri (là nguồn cacbon không lên men được) mặc dù chúng vẫn có khả năng lên men yếm khí trên môi trường chứa đường glucoza

Tiến hành: Tế bào nấm men được nuôi cấy trong ống nghiệm vô trùng chứa 5ml

môi trường YPD ở nhiệt độ 25°C trong 2 ngày Thêm vào ống nghiệm 0,lml dung dịch ethidium bromit nồng độ 10% và nuôi cấy tiếp 3 ngày ở cùng nhiệt độ Sau đó, cấy dàn đều các tế bào nấm men qua đột biến lên đĩa petri chứa môi trường YPD nuôi cấy ở nhiệt độ 25 °C sau 5 ngày Quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa

Những khuẩn lạc nhỏ bất thường, không có khả năng mọc trên môi trường YNB

chứa muối lactat natri là những khuẩn lạc đã bị đột biến ty thể được chọn để chuẩn bị

lại

* Phương pháp lai hiếm Nakatomi [9, 32 va 135]

Cơ sở phương pháp: Phương pháp lai này dựa trên sự lai ngẫu nhiên giữa tế bào

đột biến ty thể của chủng nấm men với tế bào đơn bội mang giới tính lai của chủng

nấm men khác

Tiến hành: Nuôi cấy lắc sinh khối tế bào sinh dưỡng đơn bội mang giới tính lai a

hoặc œ của chủng nấm men số 1 trong môi trường YPD dịch thể ở nhiệt độ 25 °C trong

24 giờ

20

Nuôi cấy lắc sinh khối tế bào đột biến ty thể của chủng nấm men số 2 trong môi trường YPD dịch thể ở nhiệt độ 25 °C trong 24 giờ

Trộn 0,1m1 dịch huyền phù nấm men số 1 và 0,Iml dịch huyền phù nấm men số 2

trong ống nghiệm, thêm vào 5 ml môi trường YPD dịch thể và giữ ở nhiệt độ 25 °C trong 2 ngày Cấy dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường DYE Chọn con lai có màu sắc khuẩn lạc khác màu của nấm men bố mẹ trên môi trường DYE

2.2.6 Phương pháp công nghệ

* Phương pháp lên men

Dịch quả được lên men theo phương pháp lên men gián đoạn Sinh khối nấm men

được tiếp vào dịch quả duy nhất một lần ngay từ đầu quá trình lên men để đảm bảo mật d6 1,2 x 10° tế bao/ ml dich

Sinh khối nấm men được thu được nhờ quá trình nhân giống trên môi trường YPD

dich thể hoặc nước chiết malt 12°Bx sau 24 giờ nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 25°C

* Phương pháp trích li và làm trong dịch quả sử dụng enzim [9]

* Phương pháp sấy thăng hoa [16]

Mẫu được sấy ở nhiệt độ thấp : 0°C, 4°C, 10°C trong điều kiện chân không trên

máy đông khô Operon (Mỹ) va & nhiét dé 15°C, 20°C, 22°C va 25°C trong binh cé chân không nối bơm Hanil (Hàn Quốc)

* Phương pháp sunphit hoa dich qua [78]

Dich qua sau trích ly và xử lý enzim pecunaza được sunphít hoá bằng muối metabisunphít natri (Na;S;O.) chứa 60% SO¿

2.2.7 Phương pháp cảm quan

Chỉ tiêu cảm quan của dịch lên men như hương, vị, độ trong, màu sắc được hội đồng cảm quan gồm 5 thành viên đánh giá theo phương pháp cho điểm đối với rượu nhẹ có

ga, TCVN 3215-79 [42 và 43]

2.3 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

+ Buồng cay Bioblock (Phap), Clean Bench (Sanyo, Nhat Ban) va Bio-Hazard (Diic)

+ Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật Ban) va Zeiss Axiphot (Đức) nối máy tinh + May PCR Gene AmP PCR system 9700 (Applied Biosystem, MY), Perkin Eimer

9600 (Pharmacia Biotech, My) va Eppendorf (Ditc)

+ Máy doc trinh ts ADN PCR Sequencer 373A DNA (Appied Biosystems, Diic) + Máy l¡ tâm cao tốc Biofuge A (Heraeus, Đức)

+ Bộ diện di gel agaroza Amersham (Pharmacia Biotech, Mỹ), Agaroza (BioRad-

Mỹ)

+ Bộ diện di gel Polyacrylamid (BIO-Rad, Mỹ)

+ Máy sắc ký khí GC Shimazu (Nhật Bản) và sắc ký lỏng Shimazu (Nhật Bản)

+ May li tam lạnh Eppendorf (Đức), SLA —3000 (Solvall, Mỹ) và Biofuge Pico (Sorval, Mỹ)

+ Máy li tam chân không Eppendorf (Đức)

+ Tủ nuôi lắc ổn nhiệt KE-240 (Bimder, Đức) và Vision scientific com., (Hàn Quốc) + Máy đông khô lạnh sau chan kh6ng FDU-86 (Operon, Mj)

+ Hệ thống thiết bi siéu loc Amicon 8200 (Grace company, MY)

+ Nồi ổn nhiệt Mermert (Đức)

+ Máy Votex Rotolab (OSI, Pháp)

+ Cân điện tử XT220 A (Precisa, Thuy S1)

+ Máy siêu âm Soniprep 150 (Anh)

+ Thiết bị ép dịch quả thuy lực (Việt Nam)

+ Nồi xử lý enzim điều nhiệt (Việt Nam)

+ Thùng lên men chịu áp lực và điều khiến nhiệt độ 500 lít(Việt Nam)

+ Thiết bị lọc khung bản (Việt Nam)

+ Thiết bị nạp CO; (Việt Nam)

+ Thiết bị đóng chai (Việt Nam)

+ Thiết bị hai vỏ thanh trùng bằng hơi nước (Việt Nam)

PHAN 3: KET QUA VA BAN LUAN

3.1 NGHIEN CUU TUYEN CHON CHUNG NAM MEN CIDER VIET NAM

Như đã đề cập ở phần tổng quan về tính cạnh tranh của nấm men (1.4), bên cạnh

việc đảm bảo các đặc tính lắng trong và sinh hương để tạo sản phẩm có chất lượng cảm

quan tốt, một chủng nấm men muốn được sử dụng trong sản xuất cider cần phải có đầy

đủ các đặc tính cạnh tranh như: Khả năng tạo sinh khối tốt trên môi trường nhân giống

nấm men, khả năng lên men rượu nhanh trên môi trường dịch quả nhiệt đới có pH thấp,

khả năng lên men chống chịu nồng độ SO; cao, khả năng lên men chống chịu áp suất

CO

Đặc biệt, nhằm nâng cao tính cạnh tranh của nấm men cider Viét Nam, kha nang

sinh tổng hợp zymocin của nấm men đã được đưa vào quá trình khảo sát tuyển chọn

như một nội dung mới và quan trọng của đề tài nghiên cứu

Vì vậy, từ 14 chủng nấm men rượu có nguồn gốc từ các sưu tập giống nấm men

Việt Nam và nước ngoài: Y-7033, Y-705, Y-7012, Y-708, Y-7014, Y-7029, Y-7030, Y-7049, Y-7043, Y-7052, LE1, LE2, EC1118 va K1-1116, ném men cider Việt Nam

được tuyển chọn cần phải thoả mãn các chỉ tiêu chủ yếu như sau:

1/ Có các đặc tính cạnh tranh của nấm men cider:

+ Khả năng tạo sinh khối tốt trên môi trường nhân giống nấm men

+ Khả năng lên men rượu nhanh trên môi trường dịch quả nhiệt đới có pH thấp + Khả năng lên men chống chịu nồng độ SO; cao

+ Khả năng lên men chống chịu áp suất của CO¿

2/ Có các đặc tính đảm bảo chất lượng cảm quan sản phẩm:

+ Khả năng kết lắng tốt

+ Khả năng tạo hương thơm tốt

3/ Có khả năng sinh tổng hợp zymocin

3.1.1 Khảo sát khả năng tạo sinh khối của 14 chúng nấm men trên môi trường nhân giống

Mười bốn chủng nấm men rượu: Y-7033, Y-705, Y-7012, Y-708, Y-7014, Y-

7029, Y-7030, Y-7049, Y-7043, Y-7052, LE1, LE2, EC1118 va K1-1116 được nuôi

sinh khối trên máy lắc 130 vòng/ phút, ở nhiệt độ 25°C trên các môi trường YPD dich

thể và nước chiết malt 12°Bx

22

Sau 24 giờ, mật độ và hình thái kích thước tế bào đã được quan sát và so sánh (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Đặc điểm sinh trưởng của 14 chủng nấm men rượu

trên các môi trường nhân giống

Tên Môi trường YPD dịch thể Môi trường nước malt 12°Bx

chủng Hình thái Mật độ nấm Hình thái Mật độ nấm

nấm men tế bào men tế bào men sau 24 giờ

nấm men sau 24 giờ nấm men (x10 tế bào/

ml)

Y-7029 Tron 1,02 Tròn - 0,75

Qua số liệu ở bang 3.1 chúng tôi thấy, cả 14 chủng nấm men đều có kha nang

tạo sinh khối tốt trên môi trường YPD dịch thể

Trên môi trường nước chiết maÌt, trừ hai chủng nấm men LE1 va K1-V1116 van

có khả năng sinh sản tốt, phần lớn các chủng nấm men còn lại đều sinh sản kém đi

Chung LE1 có khả năng tạo sinh khối tốt nhất trên cả 2 loại môi trường YPD

và nước chiết malt Đây là một ưu điểm của chủng nấm men LEI vì trong thực tế sản xuất, môi trường nhân giống nước chiết mailt là loại môi trường dễ kiếm và rẻ tiền hơn

rất nhiều so với môi trường YPD dịch thể

Như vậy, cả 14 chủng nấm men đều có khả năng sinh sản tốt trên môi _trường giàu dinh dưỡng YPD và tạo đủ sinh khối nấm men để tiếp giống cho quá trình lên men dịch quả

3.1.2 Khảo sát khả năng lên men dịch quả Việt Nam của 14 chủng

ndin men

3.1.2.1 Khao sát thành phần hoa học của một số loại dịch quả Việt Nam

Bảy loại quả có khả năng lên men rượu được trồng quy mô lớn và ngày càng mở

rộng ở Việt Nam là đứa, dâu tằm, vải thiểu, mận, mơ, táo và nho đã được phân tích các thành phần hoá học cơ bản như nước, protein, axit và gluxit theo phương php ly hod trình bày ở mục 2.2.1.4 và 2.2.2.1, Kết quả phân tích thành phần của các loại này đã

được so sánh với thành phần quả táo tây-nguyên liệu để sản xuất cider trên thế giới (bảng 3.2)

Bảng 3.2: Thành phần quả táo tây và một số loại quả cao sản Việt Nam ~

Các số liệu trong bảng 3.2 cho thấy, 7 loại quả đứa, dâu tằm, mận, mơ, táo, nho

và vải thiểu đều có thành phần tương tự quả táo tây, do vậy có thể sử dụng làm nguyên liệu để lên men cider Việt Nam

Đặc điểm chung của 7 loại quả nhiệt đới khảo sát là chứa hàm lượng axít rất cao

nên độ pH của dịch các quả này đều thấp hơn 4 Bên cạnh đó, trừ quả nho, 6 loại quả

còn lại đều chứa hàm lượng đạm thấp (nhỏ hơn 0,8%) Đây là một môi trường nghèo

dinh dưỡng và pH thấp làm hạn chế sự phát triển của đại đa số vi sinh vật trong đó có

các vì sinh vật gây bệnh và đồng thời hạn chế cả các nấm men rượu có nhu cầu dinh

Bảng 3.3: Thời gian lên men tạo khí CO, đây 5ml dịch trên cột của bình Einhorn- Smith trên môi trường dịch quả nghèo protein và pH thấp của 14 chủng nấm men

Chủng | Thời gian khí CO; tạo Ching Thời gian khí CO;

nấm men thành đẩy 5 ml cột nấm men tạo thành đẩy 5 mi

Thời gian tạo khí CO; càng ngắn chứng tỏ tốc độ lên men của nấm men càng nhanh

và khả năng lên men của nấm men càng mạnh

Số liệu trong bảng 3.3 cho thấy, tốc độ lên men tạo khí CO; của các chủng là không giống nhau Các chủng Y-7033, Y-705, Y-708, Y-7014, Y-7049 và Y-7052 lên

men rất chậm trên môi trường dịch quả 12 °Bx, pH 3,5

Phần lớn các tế bào của các chủng này trong môi trường địch quả ít nảy chổi và chứa không bào to bất thường, chứng tỏ tế bào của chúng bị thiếu dinh dưỡng

Do đó, 8 chủng nấm men Y-7043, Y-7030, Y-7033, Y-705, Y-/08, Y-7014, Y-

7049 và Y-7052 đã bị loại khỏi tuyển chọn vì không thể thích nghĩ với môi trường dịch

quả nghèo dinh dưỡng và pH thấp

Ngược lại, tế bào của 6 chủng nấm men Y-7012, Y-7029, LE1, LE2, K1-V1116

và EC-1118 vẫn nảy chéi mạnh, lên men nhanh trong đó, chủng LE1 là chủng lên men nhanh nhất

Như vậy: Chỉ có 6 chủng nấm men Y-7012, Y-7029, LE1, LE2, K1-V1116 va

EC-I118 được lựa chọn tiếp tục nghiên cứu khảo sát các đặc tính khác của một chủng nấm men cider như: khả năng lên men chống chịu SO;, khả năng lên men dưới áp suất

của CO, khả năng lắng trong và tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm lên men

3.1.3 Khảo sát khả năng lên men chống chịu SO; của 6 chủng nấm

men

Sáu ching ném men Y-7012, Y-7029, LE1, LE2, K1-V1116 va EC-1118 duge str

dụng với mật độ tế bào ban đầu 1,2 x 10 tế bao/ ml

Môi trường lên men là dịch quả 12 °Bx sunphít hoá bằng muối Na;S;O, để tạo nồng

độ SO, trong dich qua lan lượt là 25, 50, 100, 200, 250 và 300 mg/ I

Nhiệt độ của quá trình lên men trong bình Einhom- Smith ổn định ở 25 °C

Thời gian lên men của 6 chủng nấm men để tạo lượng khí CO; đẩy 5ml dịch trên

cột của bình Einhom- Smith chứa môi trường dịch quả đã sunphít hoá được thể hiện trong bảng 3.4

Bảng 3.4: Thời gian lên men tạo khí CO; đẩy 5ml dịch trên cột của bình Einhorn-

Smith trên môi trường dịch qua sunphit hod của 6 chúng nấm men

Chủng Thời gian khí CO; tạo thành đấy 5 ml cột dịch (giờ)

Số liệu nghiên cứu trong bảng 3.4 cho thấy: mức độ lên men chống chịu SO; của 6 chủng giống này là khác nhau Hai chủng nấm men Y-7012, Y-7029 phát triển rất

chậm trên môi trường nước quả được sunphít hoá với nồng độ SO; từ 25 đến 50mg/ Ì và

không lên men trên môi trường đã được sunphít hoá với nồng độ SO; cao hon 50mg/ 1 Riêng chủng nấm men EC-I118 không có khả năng phát triển trên môi trường nước

quả chứa SO› nồng độ 50mg/ l

Nồng độ SO; 50 mg/ ! là ngưỡng tối thiểu được sử dụng trong quá trình lên men cider của đa số các công nghệ sản xuất cider của các vùng có khí hậu ôn đới trên thế

giới [99 và 117] Tuy nhiên, nồng độ khí SO; khi sunphít hoá dịch quả Việt Nam có thể sẽ cao hơn ngưỡng này vì nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy dịch táo thu hoạch tại các nước có khí hậu ôn đới có tỷ lệ vi sinh vật nhiễm tạp thấp hơn rất nhiều so với

tỷ lệ vị sinh vật nhiễm tạp trong dịch quả nhiệt đới [11, 79 và † 18]

Do vậy, nấm men cider Việt Nam cần có khả năng chống chịu SO; ở nồng độ

bằng hoặc cao hơn 50mg/ | Vi thé, 3 ching Y-7012, Y-7029 va EC-1118 đã bị loại khỏi quá trình tuyển chọn với lý do không thể đáp ứng khả năng chống chịu SO; cao -

là khả năng cạnh tranh của nấm men cider Ba chủng LEI, LE2 và KI-VI116 có khả năng lên men nhanh xấp xỉ nhau ở môi trường chứa SƠ; nồng độ cao từ 25 đến 250mg/

|, trong dé chủng nấm men LE1 có khả năng lên men nhanh nhất Điều đó chứng tỏ 3

chủng nấm men này có khả năng chống chịu nồng độ SƠ; cao trong dịch quả Tuy nhiên ở nồng độ SO; cao hơn 150mg/ I, tốc độ lên men của cả 3 chủng đều bị giảm đi đáng kể

Như vậy, các chủng LEI, LE2 và VI-LI16 có khả năng chống chịu nồng độ SO, cao trong dịch quả được tiếp tục khảo sát kha nang chịu áp suất của CO; trong quá trình lên men

3.1.4 Khảo sát khả năng lên men điều kiện chịu áp suất của CO; của

3 chứng nấm men LEI, LE2 và KI-V11 1ó

chủng nấm men LE1, LE2 và K1-V1116 được sử dụng để lên men ở nhiệt độ

25°C trên môi trường dịch quả 12 °Bx nạp khí CO; với các giá trị áp suất 0,5 KG/ cm”,

1 KG/ cm’, 1,5 KG/ cm? va 2,0 KG/ cm? va 2,5 KG/ cm’ Kha nang lén men chống chịu CO; của 3 chủng nấm men thể hiện trong bang 3.5

Bảng 3.5: Khả năng lên men trong bình chịu áp suất CO;

của 3 chủng nấm men LEI, LE2 và K1-V1116

Áp suất của CO, Thời gian để độ Bx của dịch quả đạt đến 5°Bx (giờ)

Thời gian để nồng độ Bx của dịch quả lên men trong bình chịu áp giảm xuống từ 12°Bx đến 5°Bx ngắn hay dài đánh giá khả năng lên men tốt hay kém của các chủng nấm men này ở môi trường dịch quả dưới áp suất cao của khí CO;

Ở điều kiện áp suất CO; bằng và nhỏ hơn 1,0 KG/ cm”, sự lên men dịch quả của 3

chủng LE1, LE2 và KI-V1116 vẫn diễn ra bình thường tuy có chậm đi chit it Ching

LE] vẫn là chủng lên men nhanh nhất, chủng LE2 lên men chậm hơn chủng LEi và chúng KI-VI11 16 là chủng lên men chậm nhất

Khi áp suất CO; trong bình lên men tăng cao hơn 1,0 KG/ cm, chủng nấm men

KI-VII 16 lên men chậm dần và ngừng hẳn lên men dịch quả khi áp suất đạt đến 1,5

KG/ cm? Trong khi đó, hai chủng nấm men LE1 và LE2 van có khả năng lên men khi

áp suất CO; trong bình lên men cao trong khoảng 1,0 KG/ em? dén 1,5 KG/ cm? va chi - ngimg lén men khi 4p suat CO, dat 2,5 KG/ cm”

Theo công nghệ lén men cider chịu áp của Canada, áp suất CO; trong quá trình

lên men chính là 1,0 KG/ cmˆ nhằm hạn chế sự nhiễm tạp của các vi sinh vật gây chua

và gây đục cho cider [12] Do đó, cả 3 chủng nấm men LE1, LE2 va K1-V1116 déu cd khả năng lên men chính dưới áp suất CO; cao 1,0 KG/ cm” của công nghệ sản xuất

Nhu vay, ba ching ném men LE1, LE2 va K1-V11 16 có đầy đủ các đặc tính cạnh tranh của nấm men cider như tiêu chí để ra ban đầu như: khả năng tạo sinh khối nhanh trên môi trường nhân giống, khả năng lên men nhanh trên môi trường dịch quả Việt Nam có hàm lượng đạm và pH thấp, khả năng lên men chống chịu SO; và khả năng lên men chịu áp suất của CO;

Các chủng nấm men LE1, LE2 và K1-V1116 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát

các đặc tính bảo đảm chất lượng cảm quan của cider như: khả năng lắng trong và khả năng tạo hương vị tốt

3.1.5 Khảo sát khả năng lắng trong và tạo hương vị của 3 chúng

nam men LEI, LE2 và KI-V1116

Thí nghiệm được tiến hành trong bình chịu áp chứa dịch nước quả 12°Bx được sunphít hoá với nồng độ SO; 50 mg/ Ì và tiếp tế bào nấm men của từng chủng nấm men

LEI, LE2 và KI-VI116 với mật độ tế bào ban đầu 1,2x10° tế bào/ ml Quá trình lên

men chính được thực hiện ở nhiệt độ 25°C/ 48 giờ dưới áp suất CO; 1 KG/ cm?

Các dịch lên men lấy từ van ở vị trí giữa chiều cao bình chịu áp của 3 chủng giống được xác định chỉ số OD, phân tích một số thành phần hoá học chính và đánh

giá cảm quan để so sánh với nhau và với các loại ciđer trên thế giới (bảng 3.6)

Bảng 3.6: Chỉ tiêu lý hoá và cẩm quan của dịch lên men

bởi 3 chủng nấm men LEI, LE2 và KI-VI116

Chủng giống khảo sát cider

*; Xem bảng tổng hợp kết quả đánh giá cảm quan số 1 (phụ lục 2)

Các số liệu trong bảng 3.6 cho thấy, dịch lên men của 2 chủng nấm men LE1,

LE2 và KI-VI116 có các hàm lượng rượu etylic, axit và đường sót nằm trong khoảng

giới hạn của các loại cider trên thế giới

Hai chủng LE1 va LE2 sinh ra một hàm lượng đáng kể hợp chất tạo hương thơm

là etylaxetat và ¡zobutanol trong quá trình lên men của chúng, trong khi chủng KI-

V1116 lai sinh hàm lượng etylaxetat rất thấp và hàm lượng propanol (rượu bậc cao có mùi hôi khó chịu) cao hơn giới hạn của hàm lượng propanol trong các loại cider trên

Nếu sử dụng các chủng nấm men có khả năng kết lắng kém để lên men cider sẽ

dẫn đến hiện tượng dịch quả lên men bị đục, khó lọc trong và làm sản phẩm kém hấp

dẫn [77, 90 và 110] So với chủng nấm men LE2, khả năng kết lắng của chủng LEI

còn kém hơn rất nhiều, mặc dù chủng LE1 được đánh giá là chủng nấm men có khả năng kết lắng tốt và khả năng lên men nhanh trên môi trường địch quả Việt Nam trong nhiều nghiên cứu trước đây G3, 8, 9, 29 và 43]

So sánh chất lượng cảm quan của dịch lên men giữa 3 chủng nấm men LEI,

LE2 và KI-VI1116, dịch lên men của chủng LE2 được đánh giá cao nhất về độ trong cũng như mùi vị hài hoà

So với dịch lên men của chủng LE2, dịch lên men cia ching LE! it được ưa thích hơn do đục hơn, ít thơm và kèm vị đắng nhẹ Điểm đánh giá chất lượng cảm quan của dịch lên men của chủng K1-V1116 rất thấp do độ đục, mùi hôi và vị không ngon

Do vậy, chủng K1-V1116 đã bị loại bỏ khỏi quá trình tuyển chọn

Hai chủng nấm men LEI1 và LE2 được tiếp tục lựa chọn khảo sát khả nàng sinh tổng hợp zymocin- một khả năng cạnh tranh mới của nấm men rượu hiện được rất quan

tâm nghiên cứu trên thế giới

3.1.6 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp zymocin của 2 chủng nấm men

LEI và LE2

Nấm men LEI và LE2 với mật độ tế bào ban đầu đạt 1,2x10° tế bào/ ml được

tiếp vào môi trường nước quả 12 °Bx, pH 3,5 được thanh trùng nhiệt ở 115°C/ 30 phút -

28

Quá trình nuôi cấy và lên men được giữ ở nhiệt độ 25°C Dịch lên men sau 24 giờ được thử đặc tính sinh zymocin theo phương pháp xác định vòng vô khuẩn (mục 2.2.3.6)

Khả năng tiêu diệt của LE1 và LEI đối với các chủng nấm men mẫn cảm-được

thể hiện bằng kích thước vòng vô khuẩn (bảng 3.7)

Bảng 3.7: Khả năng tiêu diệt các chủng nấm men mẫn cam

của hai chủng nấm men LE1I và LE2

Kiểm tra khả năng mẫn cảm của chủng LE2 với chủng nấm men sinh tổng hợp

zymocin loại K2 NCYC 738 cũng cho thấy, nấm men LE2 không bị zymocin của

chủng NCYC 738 tiêu diệt

Roger D.T, Young T.W và nhiều tác giả khác đã khẳng định: Các nấm men sinh tổng hợp cùng một loại zymocin không tiêu diệt lẫn nhau [114, 133 và 134]

Vì thế, zymocin của nấm men LE2 (gọi tắt là zymocin LE2) được xác định thuộc về loại K2 của các nấm men §, cerevisiae sinh tổng hợp zymocin

Như vậy, chủng nấm men LE2 có khả năng tiêu điệt các loài nấm men nhiễm

tạp mẫn cảm thuộc giống Saccharomyces va cé kha nang mién dịch đối với các zymocin loại K2 của các chủng nấm men sinh tổng hợp zymocin nhiễm tạp khác có trong dịch quả Việt Nam

Theo kết quả nghiên cứu trước đây của Vũ Nguyên Thành, rất nhiều nấm men

nhiễm tạp có sẵn trong dịch quả Việt Nam thuộc về giống nấm men S2ccharomyces có

khả năng sinh tổng hợp zymocin [38]

Đo đó, nếu chủng nấm men LE2 được sử dụng để lên men cider, chủng này sẽ

có khả năng ngăn chặn được hiện tượng “ì” hoặc gián đoạn trong lên men cider do các nấm men nhiễm tạp có hại thuộc giống $accharomyces sinh tổng hợp zymocin loại K2

gây ra

Sau quá trình sàng lọc 14 ehủng giống nấm men tham gia quá trình tuyển chọn,

duy nhất chỉ có chủng nấm men( LE2/đã đáp ứng toàn bộ các tiêu chuẩn đặt ra cho nấm men cider Việt Nam

Tuy nhiên, bên cạnh các đặc tính nổi trội về khả năng sinh tổng hợp zymocin, kha nang lắng trong và khả năng tạo hương vị hài hòa, chủng nấm men LE2 vẫn còn có nhiều điểm thua kém chủng n4m men LEI

So với chủng nấm men LE1, chủng nấm men LE2 có tốc độ lên men chậm hơn trên môi trường dịch quả Việt Nam, có khả năng chống chịu SO; và áp suất CO; kém hơn, đồng thời chủng LE2 còn có khả năng phát triển sinh khối rất kém trên môi

trường nước chiết malt 12°Bx

Nếu có thể kết hợp các đặc tính ưu việt của cả hai chủng giống vào lên men

cider, đặc biệt là các đặc tính cạnh tranh nhằm hạn chế và tiêu diệt các vị sinh vật

nhiễm tạp thì chất lượng cider Việt Nam sẽ cao hơn

Xuất phát từ các kết quả nghiên cứu ở mục 3.1, phần nghiên cứu nâng cao chất

lượng chủng giống nấm men bằng phương pháp vi sinh (phối trộn chủng giống) và

phương pháp di truyền (lai tạo chủng giống mới) từ chủng nấm men LE] và chủng

nấm men LE2 đã được tiến hành

CIDER BẰNG GIẢI PHÁP PHỐI TRỘN CHUNG GIONG

3.2.1 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của hai chúng nấm men LEI và LE2

Để tiến hành nâng cao chất lượng nấm men cider Việt Nam bằng giải pháp phối

trộn 2 chủng LEI và LE2, nghiên cứu tìm hiểu sâu sắc các đặc điểm hình thái và sinh

lý sinh hoá của hai chủng để có thể so sánh và phân biệt từng chủng trong suốt quá trình tiến hành phối hợp chủng giống là rất cần thiết

3.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của hai chủng nấm men LE1 và LE2 a/ Xác đỉnh hình dang tế bào

Hai chủng nấm men LE1 và LE2 được nuôi cấy trong ba loại môi trường YPD

lỏng, nước chiết malt 12 °®Bx và dịch quả 12 °Bx ở nhiệt độ 25 °C Sau 24 giờ nuôi cấy,

tế bào sinh dưỡng của hai chủng nấm men LE1 và LE2 được chụp ảnh đưới kính hiển

Ký Trên môi trường Trên môi trường Trên môi trường

giống Hình Kích Hình | Kíchthước| Hình | Kích thước

đáng thước dáng (um) dang (um)

(um)

30

LE1 | Té bao 3+5 Tế bào |4:+6(dà) |Tế bào | 5+7 (dai)

ovan có | (dai) elip có| 2:3 (rộng) |elip có |2+3 (rộng)

lẫníttế |2;3 lẫn ít tế lẫn ít tế - bào tròn | (rộng) bào tròn bào tròn

LE2 | Tế bào 3+5 Tế bào 3+5 Tế bào 3+5

Có thể thấy rõ, khi chuyển nấm men LE2 từ môi trường YPD sang nuôi cấy trên

môi trường nước chiết malt 12° Bx và môi trường dịch quả 12° Bx, tế bào của nấm men

LE2 luôn ở hình dạng tròn và không thay đổi kích thước

Trong khi đó, chủng nấm men LEI lại thay đổi rõ rệt hình đạng tế bào sinh

dưỡng khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau

Trên môi trường YPD, tế bào nấm men LEI hình oval và tròn có kích thước 4-

5um Nhưng trên môi trường nước chiết malt và môi trường địch quả 12°Bx, tế bào của

chủng nấm men LEI dường như có xu hướng kéo dài (độ dài tế bào 6-7tim)

Trong môi trường nước chiết malt và dịch quả phần lớn tế bào của chủng LEI

có hình oval dài, tuy nhiên một số tế bào của chủng LEI vẫn có dạng tròn có kích

thước nhỏ giống tế bào nấm men LE2 như trên hình 3.5

Như vậy, chủng nấm men LE1 và LE2 khi lên men chung trên cùng môi trường

lỏng đều chứa các dạng tế bào nấm men hình tròn

b/ Xác định hình thái khuẩn lac của 2 chủng nấm men LEI1 và LE2

Để quan sát hình dạng, kích thước và màu sắc khuẩn lạc của 2 chủng LEI và

LE2, sinh khối nấm men lấy từ ống giống gốc của hai chủng được cấy điểm trên đĩa petri chifa môi trường nhuộm màu nấm men DYE và môi trường YPD

Hình thái khuẩn lạc của 2 chủng LE1 và LE2 mọc trên môi trường YPD được quan sát và chụp ảnh sau 4-5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25 °C (hình 3.5 và 3.6)

Hình thái khuẩn lạc nấm men mọc trên môi trường nhuộm màu DYE được quan sát và chụp ảnh sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25 °C (hình: 3.7)

Các đặc điểm về hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc các chủng nấm men LEI và LE2 trên môi trường thạch YPD và thạch DYE được tóm tắt trong bảng 3.9

Bang 3.9: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường VYPD và DVE của hai chẳng nấm men LEI và LE2

- Mép nhãn | - Mép nhân - Chóp thấp - Chép hơi cao

- Chóp thấp | - Chóp hơi cao và | - Nhão có núm

Trong khi đó, trên môi trường nhuộm màu DYE, khuẩn lạc của hai chủng LEI

và LE2 trông hoàn toàn khác nhau cả về hình dáng lẫn màu sắc Màu sắc cơ bản của khuẩn lạc chủng LEI là màu xanh da trời và xanh xám trong khi màu sắc cơ bản của

khuẩn lạc của chủng nấm men LE2 là màu hồng và đỏ booc-đô

Vì thế, phân biệt khuẩn lạc của 2 chủng trên môi trường nhuộm màu DYE là rất

dé dang

Hình 3.7: Hình thái và màu sắc của khuẩn lạc hai chẳng nấm men LEI và LE2

trên môi trường nhuộm màu DYE sau ố ngày nuôi cấy

(khuẩn lac mau xanh:LE1, khuẩn lạc màu d6:LE2)

Đặc điểm của môi trường DYE là có chứa hai chất màu ponceau 3R và adenin blue Đây là các chất có khả năng phản ứng với các loại protein trên màng tế bào nấm men

để tạo thành các phức chất có màu sắc khác nhau [32] Các tế bào nấm men thuộc hai chủng nấm men LE] và LE2 có phức hệ protein trên màng không giống nhau, vì vậy chúng đã bắt màu khác nhau đối với chất màu ponceau 3R va adenin blue

Như vậy, phương pháp phân lập trên môi trường nhuộm màu DYE là phương pháp

đơn giản và hiệu quả giúp phân biệt tế bào của hai chủng nấm men LE1 và LE2

3.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và sinh hoá của hai chủng nấm men LEI

và LE2

Kết quả khảo sát trên kít thử API-SOCH để tìm hiểu đặc điểm sinh lý sinh hoá

cho thấy, 2 chủng nấm men LEI và LE2 khác nhau về khả năng đồng hoá các nguồn

Ching nấm men LEI có thể đồng hoá để phát triển trên các loại nguồn cacbon

phong phú hơn so với chủng nấm men LE2 vì chủng LE2 không có khả năng đồng hoá

đường maltoza Đây là lý do giải thích tại sao chủng nấm men LE2 lại có khả năng tạo sinh khối tế bào kém trên môi trường nước chiết maÌlt như kết quả nghiên cứu ở mục 3.1.I Chủng nấm men LE2 chỉ có khả năng đồng hoá mạnh để phát triển tốt trên môi trường chứa các loại đường glucoza, sacaroza và fructoza Như vậy, để nuôi sinh khối chủng nấm men LE2 các loại đường glucoza, sacaroza và fructoza là thành phần không thể thiếu

trong môi trường nuôi cấy Đối với chủng LE1, môi trường chứa maltoza như nước mailt

12°Bx đã cung cấp đủ nguồn cacbon cho sự phát triển của nó vì chủng nấm men LEI có khả năng đồng hoá mạnh các loại đường maÌ(oza, sacaroza và glucoza có mặt trong dịch chiét malt

Hai ching ném men LE} va LE2 đều có khả năng lên men rượu etylic từ đường glucoza và không có khả năng đồng hoá gốc nitrat Đó là đặc điểm chung của các chủng

nấm men rượu

3.2.1.3 Nghiên cứu đặc tính sinh tổng hợp zymocin của chủng nấm men

LE2

a/ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt đô nuôi cấy

Chung nấm men LE2 được nuôi cấy trên môi trường nước quả 12°Bx trong 24 giờ ở các nhiệt độ khác nhau Bán kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng chứa dịch sinh khối ở những nhiệt độ khác nhau thể hiện trong bảng 3.1 1

Bảng 3 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cây đến khả năng sinh tổng hợp symocit của chủng nấm men LE2

Chúng Bán kính vòng zymocin của dịch nấm men LE2

man cam nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau (mm)

Bang 3.11 cho thấy, ở nhiệt độ 22 °C chủng nấm men LE2 có khả năng sinh

tổng hợp zymocin tốt nhất Khi nhiệt độ lớn hơn 25 °C hoặc nhỏ hơn 22 °C, kha nang sinh tổng hợp zymocin của chủng nấm men LE2 bị giảm đi rồi biến mất khi nhiệt độ thấp hơn 17 °C hoặc cao hơn 27 °C Do đó, muốn đảm bảo khả năng sinh tổng hợp zymocin của chủng nấm men LE2 đạt mức tối ưu, nhiệt độ nuôi cấy và lên men phải ở

trong khoảng 22°C-25°C

B/ Ước lương trong lượng phân tử của zymocin LE2

Dịch nuôi cấy nấm men LE2 trên môi trường nước quả 12°Bx trong 1 ngày ở nhiệt

độ 25°C được loại bỏ tế bào bằng l¡ tâm và lọc qua màng tiệt trùng Sau đó, dịch được

cô đặc bằng phương pháp đông khô rồi phân tách các hợp chất chứa trong dịch cô đặc theo kích thước phân tử bằng phương pháp màng siêu lọc

Các loại dịch chứa các phần tử có kích thước phân tử khác nhau được đem thử

đặc tính zymocin trên đĩa chứa môi trường YPD - xanh metylen trộn nấm men mẫn

34