Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm ĐTN nghiên cứu sản xuất đường fructooligsacarit bằng công nghệ đa enzym và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng

Thực tế từ bao đời nay loài người đã biết đến chức năng của thực phẩm trong việc phòng và chữa bệnh tật, ví như dùng các loại thảo dược để chữa bệnh, ăn các loại cây quả đặc hiệu để dài

ViÖn c«ng nghiÖp thùc phÈm

B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt

Hµ néi,10/ 2004

Danh sách người thực hiện đề tài

Mục lục

Các chữ viết tắt

Tóm tắt

1.1 Giới thiệu về fructooligosacarit (FOS)……… 3

1.1.1 Fructôligosacarit trong tự nhiên và cấu tạo……… 3

1.1.2 Tính chất của FOS ……… 5

1.1.3 Tính an toàn của FOS ……… 10

1.2 ứng dụng của FOS ……… 11

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới … 12

1.3.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS ………… 12

1.3.2 Nghiên cứu và sản xuấtFOS 50 ( FOS phổ thông )……… 14

1.3.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ 15

1.4 Giới thiệu về fructosyltransferaza (FTS) 17

1.5 Giới thiệu về enzim glucooxidaza (GOD) 18

1.5.1 Đặc tính của enzim GOD 18 1.5.2 Cơ chế xúc tác của enzim GOD 18 1.6 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam 20 Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 22 2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất ……… 22

2.1.1 Giống vi sinh vật ……… 22

2.1.4 Hoá chất ……… ……… 22

2.2 Các thiết bị chủ yếu ……….…… 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……….…… 24

2.3.1 Phương pháp vi sinh vật ……… …… 24

2.3.2 Các phương pháp hoá sinh, hoá lý ……….……… 25

2.3.3 Phương pháp toán học ………… ……… 27

2.3.4 Phương pháp đánh giá cảm quan ……….……… 27

2.3.5 Các công nghệ và quá trình cơ sở ……….……… 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận 28 3.1 Nghiên cứu sản xuất đường FOS cao độ bằng phương pháp nối tiếp 28 3.1.1 ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt lực của FTS….…… 28

3.1.2 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định của enzim ….…… 30

3.1.3 Tối ưu hoá các điều kiện chuyển hoá FOS….…… 30

3.1.4 Tối ưu hoá các điều kiện chuyển hoá đường glucoza bằng hệ enzim GOD- CAT 35

3.2 Nghiên cứu sản xuất FOS cao độ bằng phương pháp đồng thời 41

3.3 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phấm đường FOS 42

3.3.1 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phẩm đường FOS 50 42

3.3.2 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phẩm đường FOS cao độ 43

3.4 Phân lập và tuyển chọn giống cho lên men sinh tổng hợpenzim FTS 44 3.5 Định tên và phân loại vi sinh vật 46

3.6 Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất một số thực phẩm chức năng

50

3.6.1 Nghiên cứu ứng dụng đường FOS trong sản xuất bột dinh 51

3.6.3 Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất kẹo 61 3.7 Nghiên cứu thử nghiệm trên cơ thể người để đánh giá trị của sản phẩm đường FOS

67

Glucoza Kestoza Nystoza Fructosylnystoza Glucoizomeraza Glucooxydaza S¾c ký láng cao ¸p

§¬n vÞ ho¹t lùc enzim quèc tÕ Ho¹t lùc fructosyltransferaza

Ho¹t lùc thuû ph©n

lời cam đoan ……… I lời cảm ơn ……… II mục lục ……… III Các chữ viết tắt ……… VI danh mục các Hình ……… VII danh mục các bảng……… X

Mở đầu ……… 1

Chương 1 : Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu về FOS ………

3 1.1.1 Đường FOS trong tự nhiên và cấu tạo……… 3

1.1.2 Tính chất và đặc tính chức năng của FOS ……… 5

1.1.3 Tính an toàn của FOS ……… 12

1.1.4 ứng dụng của FOS ……… 12

1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới ……… 13

1.2.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS ………… 14

1.2.2 Nghiên cứu và sản xuất FOS 50 ……… 21

1.2.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ ……… 22

1.3 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam ……….………… 30

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất ……… 32

2.1.1 Giống vi sinh vật ……… 32

2.1.2 Enzim ……… 32

2.2 Các thiết bị chủ yếu ……….…… 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……….…… 34

2.3.1 Phương pháp vi sinh vật ……… …… 34

2.3.2 Các phương pháp hoá sinh, hoá lý ……….……… 36

2.3.3 Phương pháp toán học ………… ……….……… 44

2.3.4 Quy trình công nghệ và quá trình 44 Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc và tối ưu hoá quá trình lên men sinh tổng hợp enzim ……… 46

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn …… ……… 46

3.1.2 Phân loại và định tên cho chủng nấm mốc VVTP 84 ……… 46

3.1.3 Nghiên cứu các điều kiện lên men sinh tổng hợp FTS của chủng Asp flavipes VVTP84……… 51

3.1.4 Nghiên cứu các điều kiện lên men tổng hợp FTS trong thùng lên men 25 lít ……… 60

3.2 Thu nhận chế phẩm và xác định đặc tính của FTS……… 66

3.2.1 Chiết tách enzim ……… 66

3.2.2 Tinh chế enzim ……… 67

3.2.3 Xác định cấu tạo và tính chất của FTS ……….…… 70

3.2.4 Một số đặc tính của FTS ……… 72

3.2.5 Xác định hệ số động học Km và hệ số ức chế Ki của FTS …… 76

3.3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất FOS bằng phương pháp đơn giản 78 3.3.1 ảnh hưởng của pH đến hoạt động của FTS trong tế bào …… 79

3.3.2 ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của FTS trong tế bào 80 3.3.3 Xác định hệ số động học của FTS trong tế bào ……… 81

3.3.4 Tối ưu hoá các điều kiện chuyển hoá FOS ……… 82

3.4.1 ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của GOD ………… 89

3.4.2 ảnh hưởng của pH đến hoạt động của GOD ………… …… 92

3.4.3 Xác định các thông số công nghệ để nâng cao độ tinh khiết của FOS ……… 94

3.5 Tinh chế, phân tích kết cấu và một số tính chất FOS……… 103

3.5.1 Phân ly hỗn hợp FOS……… 104

3.5.2 Thuỷ phân bằng axit……… 104

3.5.3 Thuỷ phân bằng enzim ……… ……… 105

3.5.4 Tính khử của đường S1, S2 ……… 106

3.5.5 Xác định cấu tạo hai đường S1 và S2 bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân 13CNMR ………

106 3.5.6 Đánh giá chất lượng và một số tính chất sản phẩm FOS …… 112

3.5.7 Tính chịu nhiệt, chịu axit của FOS ……… 114

3.6 Định hướng cho sản xuất và sơ bộ tính toán giá thành ……… ``

3.6.1 Định hướng sản xuất cho sản phẩm FOS ……… 116

3.6.2 Sơ bộ tính toán giá thành ……… … 120

Kết luận ……… …………

124 TàI liệu tham khảo ………

125

Các bàI báo đã công bố có liên quan đến luận án 140

Mở đầu

Ngày nay, do sự phát triển của khoa học kỹ thuật, sản lượng nông sản thực phẩm trên toàn thế giới đạt được ngày càng nhiều, đặc biệt ở các nước phát triển, lương thực, thực phẩm và hàng hoá đang có xu hướng dư thừa Yêu cầu của con người về thực phẩm vì thế cũng có nhiều thay đổi Nếu như trước kia chúng ta đặt vấn đề hàm lượng dinh dưỡng cao, khả năng cung cấp nhiều năng lượng của thực phẩm là hàng đầu thì bây giờ không hẳn là như vậy Đã có nhiều người chuyển hướng tìm cho mình các loại thức ăn không có hoặc có ít dinh dưỡng, thức ăn thấp năng lượng Một số khác lại có nhu cầu sử dụng thực phẩm để phòng và chữa bệnh v.v Và thế là có sự ra đời của thực phẩm chức năng (functional food) Thực tế từ bao đời nay loài người đã biết đến chức năng của thực phẩm trong việc phòng và chữa bệnh tật, ví như dùng các loại thảo dược để chữa bệnh, ăn các loại cây quả

đặc hiệu để dài tóc, trắng da vv… Nhưng chỉ khi khoa học phát triển đến độ cao, con người có thể khám phá cấu trúc từng phân tử, phân tích được mối liên quan giữa cấu trúc sinh hoá với chức năng của hàng loạt các thành phần hoá học cấu tạo nên một thực phẩm nhất định và ảnh hưởng của nó đến sức khoẻ con người; Khi

mà con người đã nhận rõ rằng trong một số loại thực phẩm, vì nó mang các thành phần sinh hoá đặc biệt nên có tác dụng đặc biệt đối với sự phát triển của cơ thể sống như điều khiển sự tăng trưởng, cân bằng trạng thái tinh thần hoặc kích thích

sự hoạt động của các cơ quan chức năng vv… thì khái niệm “thực phẩm chức năng” mới chính thức ra đời Và như vậy thực phẩm chức năng được định nghĩa như là một loại thực phẩm chứa các thành phần có hoạt tính sinh học, có khả năng phòng chống một số bệnh tật, tăng cường sức khoẻ dựa trên cơ sở của các quá trình dinh dưỡng

Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do phát hiện thấy

có nhiều đặc tính sinh học có lợi cho sức khoẻ như chống sâu răng, chống bệnh tiểu đường, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hoá

v.v Các đường chức năng mới xuất hiện có: đường panatinozamaltitol, sorbitol, lactitol, fructooligosacarit xylooligosacarit, galactooligosacarit , izomaltooligosacarit, soybeanoligosacarit v.v [12] [74], Trong số đó đường fructooligosacarit (FOS) được nhiều nhà nghiên cứu chú ý hơn cả bởi công nghệ sản xuất đơn giản, sản phẩm có hương vị thơm ngon, lại có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể của người

Công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nói chung và đường chức năng nói riêng đang được phát triển mạnh trên thế giới, song ở Việt Nam lĩnh vực này còn đang rất mới mẻ Để hoà đồng cùng xu thế phát triển khoa học của thế giới, để

đáp ứng nhu cầu mới của người tiêu dùng, đề tài nghiên cứu sản xuất đường fructooligosacarit bằng công nghệ đa enzim và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ

em và bánh kẹo chức năng được tiến hành với các nội dung chính như sau:

- Nghiên cứu quy trinh công nghệ sản xuất đường FOS có độ tinh khiết cao bằng phương pháp đa enzim

- Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em

- Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất bánh kẹo chống sâu răng, chống béo phì và cho người mắc bệnh tiểu đường

- Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất bánh bích quy chống sâu răng, chống béo phì và cho người mắc bệnh tiểu đường

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu về fructooligosacarit (FOS)

1.1 1 Fructooligosacarit trong tự nhiên và cấu tạo

Fructooligosacarit là những oligoza mà trong phân tử của chúng có một gốc glucoza gắn kết với một vài gốc fructoza Loại đường này có nhiều trong thiên nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, mận, đào , quýt, cây atiso, cà chua, hành, tỏi v.v Hàm lượng FOS trong một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng 1.1[38]

Bảng 1.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô)

Loại cây quả Kestoza

(GF2)

Nystoza (GF3)

Fructosyl- nystoza (GF4)

Tổng FOS (GFn) Chuối

0,1 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 1,2 94,3 6,7

0,0 1,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,4 0,4 0,0 0,4 0,4 98,1 4,2

6,0 2,8 3,5 0,8 2,0 3,0 0,3 0,1 0,6 1,1 0,5 0,6 10,3 286,2 26,4 Trong tự nhiên FOS được hình thành dưới tác dụng của enzim chuyển hoá fructoza Do các nguồn gốc của enzim chuyển hoá fructoza khác nhau mà các sản phẩm chuyển hoá thu được không giống nhau về cấu tạo hoá học Ví dụ enzim

chuyển hoá fructoza thu từ các loại nấm mốc như Aureobasidium pululans [35] và

Aspergillus niger [8],[30] chỉ xúc tác tạo FOS dạng 1F, trong khi đó enzim thu

được từ chủng Claviceps purpurea[15] và từ củ măng tây [50], [51], [52], [53] lại

xúc tác tạo đồng thời cả hai loại FOS dạng 1F và 6G

Vì đều là β- D-fructan nên nhiều người thường gọi tất cả các loại đường fructan, glucofructan và innunin là FOS [28], [39] Nhưng thực tế, FOS được gọi chỉ đối với 1- gluco- (2- β- fructofuranosyl)n-1 oligofructoza, trong đó giá trị n= 2,3 hoặc 4 và được viết tắt dưới dạng hỗn hợp của 3 loại đường GF2 (Kestoza), GF3(Nystoza) và GF4 (Fructosylnystoza) Như vậy FOS là hỗn hợp các dẫn xuất của sacaroza mà trong cấu tạo phân tử có chứa 1 gốc sacaroza nối thêm 1, 2 hoặc 3 gốc fructoza thông qua mối liên kết β (2-1) glucosit [9] Công thức cấu tạo phân tử của FOS được viết một cách tổng quát như ở hình 1.1 Chỉ có cấu tạo như trên FOS mới mang hoạt tính sinh học có lợi cho sức khoẻ con người và động vật

CH2

O HOCH2

Nystoza

o

Fructosylnystoza

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của FOS [9]

Theo số liệu tính toán, người phương Tây với mức ăn tiêu chuẩn một ngày hấp thụ trung bình 2g- 4g FOS [46] Tuy nhiên thành phần dinh dưỡng của thực phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chủng loại cây trồng, điều kiện thổ nhưỡng, canh tác, thời gian thu hoạch, thời gian bảo quản v.v… [11][57], do đó mức hấp thụ FOS của con người tại các địa phương khác nhau không giống nhau Để tăng cường sự hấp thụ FOS nhằm lợi dụng được nhiều đặc tính sinh học ưu việt của chúng, nhiều nơi người ta lựa chọn ăn những loại thực phẩm có hàm lượng FOS cao

1.1.2 Tính chất của FOS

1.1.2.1 Tính chất hoá lý

Mặc dù đã có nhiều bài báo công bố về FOS, song cho tới nay thông tin về tính chất hoá lý của đường này vẫn còn rất ít Theo ý kiến của Gross [22], thì kestoza là loại đường kết tinh màu trắng có góc quay cực [α]D20 là +280 và nhiệt độ nóng chảy là 199 0C – 200 0C Độ ngọt của kestoza, nystoza và fructosylnystoza

so với sacaroza tương ứng là 31%, 32% và 16% Còn độ ngọt tổng của hỗn hợp ba

đường này (FOS) chỉ bằng 30% độ ngọt của sacaroza Đường FOS hút ẩm mạnh, nên khó bảo quản ở trạng thái tinh thể trong thời gian dài ở cùng một nồng độ, FOS có độ nhớt tương đương với độ nhớt của sacaroza Độ bền nhiệt của FOS cao hơn sacaroza [43] Đường FOS bền trong dải pH 4.0- 7.0 và nhiệt độ cao tới 1400C Một số tác giả khác khi nghiên cứu về tính chất hoá lý của FOS đều đưa ra một kết luận chung là có nhiều tính chất hóa lý tương tự sacaroza như độ hoà tan, độ đông

đặc, nhiệt độ sôi và các thông số về quá trình kết tinh [68] Khác với đường sacaroza FOS mang nhiều đặc tính sinh học ưu việt hơn Đây chính là đặc điểm khiến các nhà thực phẩm chú ý và tập chung khai thác loại đường oligoza này

1.1.2.2 ảnh hưởng của FOS đến sự chuyển hóa hydratcabon

Fructooligosacarit không hoặc rất ít bị thuỷ phân bởi hệ enzyme đường ruột, nên khi ăn lượng đường trong máu không bị biến động [43],[61] Thí nghiệm về sự thay đổi hàm lượng đường và insulin trong máu theo thời gian sau khi ăn FOS đã

cho kết quả như hình 1.2; 1.3 và 1.4 Kết quả cho thấy trái với sacaroza khi ăn 25 g FOS, trong khoảng thời gian 120 phút, lượng đường trong máu không hề thay đổi

050100150200250

Từ kết quả của một số nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người bị mắc bệnh tiểu đường nếu mỗi ngày ăn 8g FOS, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong vòng 14 ngày [70]

Những biến đổi có tính tích cực phát sinh khi chuyển hoá glucoza và chất béo trong quá trình trao đổi chất với sự hiện diện của FOS được Wang X và các cộng

sự của ông nghiên cứu [67] Các tác giả đã kết luận rằng nguyên nhân của các hiệu ứng này là do FOS không bị tiêu hoá ở ruột non bởi tác dụng của hệ enzim đường

ruột, mà bị lên men trong ruột già dưới tác dụng của vi khuẩn Bifidobacterium (là một chi trong họ Lactobacteraceae, tế bào hình que, phân nhánh, thẳng hoặc cong,

bất động, gram +, sống kỵ khí, ưa ấm, không sinh bào tử, thường gặp trong ruột già) Kết quả của quá trình là sinh ra các axit béo đoản mạch (SCFA) như axit acetic, axit propionic và axit butyric Các chất này sauđó được thấm vào thành ruột

già hoặc chuyển lên gan và ức chế sự gia tăng của glucoza và chất béo trong máu

0306090120

Thí nghiệm trên cơ thể chuột của Tokunaga [61] cũng chứng tỏ kết luận trên Tác giả này đã chỉ ra rằng hàm lượng axit béo đoản mạch trong 1g phân của nhóm chuột ăn FOS cao hơn rất nhiều so với nhóm chuột đối chứng ăn sacaroza

Đối với bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường (có hoặc không rối loạn tiết insulin) ngoài sự bất bình thường về hàm lượng đường trong máu, chất béo trong máu cũng luôn bị rối loạn Cả hai nhân tố trên đều có ảnh hưởng như nhau đối với bệnh lý [5] Vì thế việc hạn chế sự gia tăng hàm lượng chất béo trong máu cũng là một biện pháp để chữa bệnh tiểu đường Với ý tưởng trên, Agheli và các cộng sự gần đây đã nghiên cứu và chỉ ra rằng nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường có kháng tiết isulin khi ăn thức ăn có chứa 10% FOS đã giảm đáng kể hàm lượng chất béo tự

do và triglycerit trong máu Kết quả này đã khẳng định lại báo cáo trước đó của Delzenne [14], người đã chỉ ra rằng FOS có khả năng làm giảm lượng chất béo trong máu của chuột Cũng theo Agheli FOS không chỉ làm thay đổi hàm lượng chất béo trong máu mà còn có thể điều chỉnh sự tạo ra các enzim tổng hợp axít béo Trong gan, hoạt lực của enzim trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ

được bình thường hoá bởi sự cung ứng FOS Như vậy FOS có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét ở góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu Vì thế FOS hiện nay được dùng nhiều như là một chất ngọt thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng mắc bệnh tiểu

đường

1.1.2.3 ảnh hưởng của FOS đến hệ vi sinh vật đại tràng

Tác động của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột đã được nhiều tác giả nghiên cứu Bằng thí nghiệm ngoại thể Gross D khi nghiên cứu hệ vi sinh vật trực

tràng cho thấy các nòi Bifidobacterium spp và Bacteroides spp có thể phát triển mạnh trong môi trường dinh dưỡng có chứa FOS, ngược lại Escherichia coli và

Clostridium perfringens lại bị tiêu diệt trong môi trường này [18],[22] Còn kết

quả thí nghiệm trên cơ thể cho thấy cả hai đối tượng người và động vật ở các lứa

tuổi khác nhau sau khi ăn FOS cho thấy số lượng vi sinh vật Bifidobacterium và Lactobacilli trong đại tràng tăng lên, trong khi đó số lượng vi sinh vật Clostridium

perfringens lại giảm xuống [21][28] Thí nghiệm còn chỉ rõ rằng do FOS có cấu

tạo mạch thẳng ngắn nên đã tác động đến khả năng lên men của các vi sinh vật nói trên Còn các loại fructooligoza mạch nhánh hoặc innulin mạch thẳng nhưng dài thì ảnh hưởng trên rất hạn chế

Hiện nay Bifidobacterium được đặc biệt quan tâm trong lĩnh vực sinh học

bởi nó mang nhiều lợi ích cho cơ thể sống Vi khuẩn Bifidobacterium tồn tại và phát huy tác dụng ngay trong cơ thể chủ, điều này rất có ý nghĩa vì nó có thể

phòng chống các bệnh tật về đường ruột, do Bifidobacterium có khả năng sản sinh

các axit mạch ngắn như axit axetic, axit lactic trong quá trình lên men đường Sự gia tăng hàm lượng axit sẽ có tác dụng giảm pH trong đường ruột, giữ gìn hoạt

động trao đổi chất của các vi sinh vật đường ruột khác ổn định, đúng quy luật, hạn chế hoặc ngăn ngừa sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và các vi sinh vật gây thối rữa ở mức độ cao hơn nghiên cứu còn chỉ ra rằng quá trình giảm pH trong đường ruột có tác dụng trực tiếp phòng và trị bệnh ung thư ruột thông qua

việc ngăn trừ sự phát triển của bacterium hoại sinh và ức chế hoạt lực của các

enzim như nitroreductaza, β- glucoronidaza và decarboxylaza [37] Đây là những enzim tham gia quá trình chuyển hoá nitơ tạo các sản phẩm trung gian có khả năng gây ung thư (những dẫn xuất phenol của tyrosin và tryprophan) [9] Ngoài ra vi

khuẩn Bifidobacterium còn có khả năng tạo vitamin, nhất là vitamin nhóm B, giảm

cholesterol trong máu và tái sinh hệ vi sinh vật đường ruột cho các bệnh nhân sau khi dùng nhiều kháng sinh điều trị bệnh

1.1.2.4 ảnh hưởng của FOS đến bệnh sâu răng

Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn Streptococci đột biến và các liên cầu

khuẩn gây nên Các vi sinh vật trên có rất nhiều trong khoang miệng của người và

động vật Khi thức ăn đưa vào, chúng sẽ lựa chọn các thành phần dinh dưỡng phù hợp để lên men, phát triển và gây bệnh Vì vậy nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc chứa ít chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh Để xét ảnh hưởng của FOS đến bệnh sâu răng người ta đã thí nghiệm trên cơ thể chuột Kết quả cho thấy nhóm chuột thí

nghiệm (ăn FOS) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn sacaroza) Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi trường FOS đã chứng tỏ cơ chế về khả năng phòng bệnh sâu răng của nó Đó là do FOS không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh trên phát triển [31] Ngoài ra Ikeda T còn nghiên cứu cho thấy FOS không những chỉ có khả năng phòng mà còn có khả năng chữa bệnh bệnh sâu răng [32] Vì thế ngày nay nhiều nơi trên thế giới người ta đã dùng FOS thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng

1.1.2.5 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ caxi của FOS

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng FOS có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào [39], [40] Nhờ đặc tính này, FOS có thể giúp cho con người phòng và chống các bệnh về chuyển hoá và bệnh loãng xương Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của FOS xảy ra trong ruột già [41] Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác

định một cách rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu

tố sau [42] :

♦ Đường FOS trong ruột già bị các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hoà tan của các muối canxi

♦ Trong ruột già vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có

chứa FOS sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuyếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi

♦ Sự dịch chuyển FOS trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất canxi-protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo

điều kiện tốt cho sự hấp thụ vào máu Ngoài canxi, FOS đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magiê[40], [41] Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng

cường hàm lượng canxi trong xương

1.1.3 Tính an toàn của FOS

Để khẳng định tính an toàn của FOS đối với cơ thể sống, đã có nhiều nghiên cứu về tế bào và gen của động vật ăn FOS Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung

để trả lời các câu hỏi là khi động vật sử dụng FOS có ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của tế bào hay không? Có gây ra đột biến về gen dẫn đến sự tổng hợp ADN bất qui tắc hay không? Tất cả các nghiên cứu đã đi đến kết luận là FOS không gây độc hại đến tế bào của chủ thể [61] Tác giả Clevenger M.A còn làm thí nghiệm trên chuột để kiểm tra về độc tố cấp tính và mãn tính cũng như khả năng gây ung thư của FOS Kết quả cho thấy FOS không có biểu hiện của các độc

tố khi cho chuột ăn hơn 2,17mg/kg/ngày [11]

1.2 ứng dụng của FOS

Phụ thuộc vào độ tinh khiết, FOS thương phẩm chủ yếu có hai loại là FOS phổ thông (độ tinh khiết từ 45% đến 60%) và FOS cao độ (độ tinh khiết cao hơn 75 %)

Đường FOS phổ thông thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm hoặc như một chất ngọt bổ sung trong chế biến các loại thực phẩm khác Còn FOS cao

độ thường để chuyên dùng cho các đối tượng mắc bệnh, ăn kiêng Ngoài ra còn có loại tinh khiết 100 % dùng cho công việc phân tích hoá học Loại có độ tinh khiết thấp có thể dùng làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bifidobacterium

Theo tài liệu công bố thì cơ thể người một ngày chỉ có thể hấp thụ 2-12g FOS, nên việc dùng FOS bổ sung vào thực phẩm khác như một chất phụ gia để tăng cường hoạt tính sinh học của thực phẩm là ứng dụng đầu tiên và quan trọng của FOS trong lĩnh vực chế biến thực phẩm Do FOS có đặc tính là có vị ngọt, thấp năng lượng và có hoạt tính sinh học nên thường được bổ sung vào các loại bánh, kẹo, bánh quy và các sản phẩm của sữa hoặc kết hợp trộn lẫn vào trong các chất ngọt khác

ở Nhật Bản FOS được dùng để bổ sung vào hơn 500 loại thực phẩm [65] Năm 1984 ở nước này đã có một thị trường rộng lớn cho FOS Đến năm 1990 lượng FOS tiêu thụ trong cả nước lên đến 4000 tấn Đường FOS bán trên thị trường Nhật Bản rất đa dạng, từ loại có hàm lượng rất thấp đến loại có độ tinh khiết cao

đến 98%, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, loại hàm lượng thấp dùng làm

chất kích thích trong môi trường lên men cho vi khuẩn Bifidobacterium, chất có

hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích [75]

ở Mỹ và Nhật Bản người ta còn sử dụng FOS để làm chất bổ sung trong thức

ăn cho gia súc Nhờ đặc tính của FOS là có thể tăng cường hoạt động của hệ tiêu hoá nên giúp cho gia súc ăn nhiều, tăng cân nhanh

Tại Trung Quốc đến tận năm 1992 công nghiệp sản xuất FOS mới bắt đầu, nhưng trong vòng mười năm ngành công nghiệp này đã có bước phát triển vượt bậc Nếu như năm 1999 toàn Trung Quốc mới chỉ có 2 nhà máy sản xuất FOS tại Vân Nam và Giang Tô với công suất 2000 tấn/năm thì đến đầu năm 2002 số nhà máy sản xuất FOS trong toàn quốc đã lên đến mười cơ sở với công suất từ 2000 tấn

đến 4000 tấn/năm Sản phẩm FOS ở nước này được dùng nhiều cho các đối tượng già, trẻ em và những người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khoẻ để tăng cường hoạt động tiêu hoá, giúp cho các đối tượng trên nhuận tràng, ăn tốt

ở Mỹ và Châu Âu, nhiều công ty đã và đang xin chứng chỉ của GRAS (Generally Recognized As Safe) cho việc sử dụng sản phẩm FOS của mình [75], và như thế FOS đã được công nhận chính thức bằng văn bản về độ an toàn thực phẩm [54], [63] Nhờ đó số lượng người tiêu dùng FOS ngày càng tăng cao

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới

Fructooligosacarit có thể thu nhận được bằng cách chiết suất chúng từ các loại cây quả, hoặc bằng các phương pháp hoá học, hoá lý, hoá sinh v.v Nhưng cho tới nay phương pháp được coi là hiệu quả và có khả năng công nghiệp hoá nhất là phương pháp công nghệ sinh học Bắt đầu bằng sự phát hiện một số chủng nấm men và nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzim xúc tác quá trình chuyển hoá sacaroza thành FOS, cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về lĩnh vực sản xuất

đường này theo công nghệ sinh hóa Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập tuyển chọn giống để sinh tổng hợp enzim , ứng dụng enzim trong sản xuất FOS và nghiên cứu tinh chế FOS v.v

1.3.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS

Vì enzim chuyển hoá fructoza trong thực vật có hoạt tính thấp và thường là hỗn hợp của một vài loại và lại bị hạn chế khai thác do có tính thời vụ, nên việc chiết tách enzim từ thực vật để phục vụ cho công nghiệp sản xuất FOS không có tính khả thi

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất enzim ngày càng nhiều Cũng như các loại enzim khác, nguồn cung cấp enzim chuyển hoá fructoza cho công nghiệp chế biến FOS chủ yếu là từ vi sinh vật Hidaka và các cộng sự [29], [30], [31] là những người đầu tiên nghiên cứu khả năng công nghiệp hoá sản xuất FOS từ đường kính Ông cũng là người đã đưa ra phương pháp xác định hoạt lực FTS và đại lượng biểu thị mối liên quan giữa hoạt lực FTS và hiệu suất chuyển hoá sacaroza thành FOS (tỷ lệ hoạt tính chuyển hoá với hoạt tính thuỷ phân UT/UH) mà cho tới nay vẫn được coi như là phương pháp cơ

sở cho hầu hết các nghiên cứu liên quan tới FOS Bằng nghiên cứu của mình

Hidaka đã tìm ra nhiều chủng vi sinh vật thuộc các loài như Aspegillus awamori, Saccharomices cerivisiae, Aspegillus niger… có khả năng tổng hợp FTS Thông

qua quá trình phân lập, tuyển chọn theo hoạt lực chuyển hoá và tỷ lệ hoạt tính chuyển hoá với hoạt tính thuỷ phân (UT/UH), tác giả đã khẳng định nấm mốc Asp

niger là nguồn vi sinh vật tốt nhất cho lên men tổng hợp FTS

Khả năng sinh tổng hợp FTS của A.pullulans cũng được Jung K.H và các

cộng sự nghiên cứu [34] Tác giả này đã kết luận rằng sacaroza là nguồn cacbon lý tưởng cho lên men sinh tổng hợp FTS và hiệu suất tổng hợp FTS của chủng vi sinh vật trên tăng tỷ lệ thuận với nồng độ sacaroza trong môi trường lên men Khi

nghiên cứu thu nhận FTS từ F oxysporum, tác giả người Anh Patel V và các cộng

sự [44] còn đi đến kết luận rằng quá trình lên men của vi sinh vật trong môi trường chứa sacaroza có sự tổng hợp FTS mang hoạt tính invectaza và hoạt tính chuyển

hoá Năm 1992 Bo Jiang [8] đã phân lập được một chủng Asp niger AS0023 có

khả năng tổng hợp FTS với hoạt lực cao Ngoài ra còn rất nhiều tác giả khác như

Hayashi [27] đã nghiên cứu chọn ra chủng Aureobasidium sp dùng để sinh tổng

hợp FTS cho sản xuất FOS Jung[34] và Smith [52] cũng có các công bố về khả

năng sinh FTS của loài Aureobasidium pullulans Van Balken [66] đã nghiên cứu thành công quá trình tổng hợp FTS từ Aspegillus phoenicis và đã ứng dụng để sản xuất FOS đạt độ tinh khiết 60% Fujita [20] đã phát hiện giống A bacterium cũng

có khả năng tổng hợp FTS Gần đây Takeda còn tìm ra loại mốc Scopulariosis

brevicaulis có khả năng tổng hợp FTS chỉ xúc tác tạo đường 1-kestoza Ngoài ra

các vi sinh vật khác như A.japonicus [10] Penicillium rigolosum [7], Acetobacter

diazo-trokicus SRT4 [59] cũng có khả năng tổng hợp FTS, các vi sinh vật này đã

được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp sản xuất FOS

Một đặc điểm chung cho tất cả các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, hầu hết FTS trong các vi sinh vật tìm được chủ yếu là enzim nội bào và luôn chứa đồng thời cả hai hoạt tính là thuỷ phân và chuyển hoá Tỷ lệ hoạt lực của hai hoạt tính trên thay đổi phụ thuộc vào chủng loại giống và điều kiện lên men, điều kiện phản ứng vv…

1.3.2 Nghiên cứu và sản xuất FOS 50 (FOS phổ thông)

Hiện nay ở Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ và các nước khác, FOS đã

được sản xuất ở qui mô công nghiệp và hàng năm cho ra thị trường hàng ngàn tấn sản phẩm [64] Thông thường FOS phổ thông được sản xuất theo phương thức liên tục và không liên tục Trong phương thức sản xuất liên tục công nghệ cố định enzim hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuất không liên tục thì sử dụng enzim đã chiết tách [8], [26], [69], [73] Giải pháp cố định enzim và cố đinh tế bào trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất được liên tục, tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ v.v… nhưng tính ổn định kém và cần máy móc thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn Mặc dù vậy, đây lại là phương pháp có khả năng công nghiệp hoá cao và được tập trung nghiên cứu nhiều

ở các nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc v.v…

Các công bố kết quả nghiên cứu về cố định enzim để sản xuất FOS rất

nhiều Điển hình có Hayashi S [26] Tác giả này đã cố định FTS tổng hợp từ A

pullulans sp để sản xuất FOS Ngoài ra Yun J.W., một tác giả người Hàn Quốc

cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất FOS liên tục bằng phương pháp cố định FTS trên các hạt nhựa trao đổi ion

Đối với công nghệ cố định tế bào, Jiang Bo đã tìm ra chất mang thích hợp

cho cố định tế bào phát triển Asp niger AS0023 để sản xuất FOS là canxi alginat

Tác giả sau đó cũng đã xác định được các thông số kỹ thuật thích ứng cho quá trình chuyển hoá FOS từ sacaroza trên cột phản ứng

Phương thức không liên tục trong sản xuất FOS đòi hỏi phải trang bị thêm một công đoạn trích ly enzim và làm sạch tạp chất sau quá trình chuyển hoá Bù lại

kỹ thuật sản xuất lại đơn giản và thiết bị cũng rẻ tiền hơn Phương pháp này được

sử dụng nhiều ở các qui mô nhỏ, đầu tư thấp Nghiên cứu công nghệ này có Yun, J W., [33], theo phương pháp này tác giả đã kết hợp FTS với các enzim khác sản xuất ra FOS có độ tinh khiết cao tới 98% Ngoài hai giải pháp trên hiện nay người

ta còn dùng phương pháp đơn giản, với phương pháp này tế bào vi sinh vật được sử dụng như một nguồn enzim Phương pháp đơn giản này đang được dùng trong một

số nhà máy ở Trung Quốc

1.3.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ

Quá trình chuyển hóa sacaroza thành FOS phổ thông dưới tác dụng của FTS

có thể biểu diễn một cách tổng quát như sau:

GF + GF –––––> G + GF + GF + GF + GF

Sacaroza Sacaroza Glucoza Sacaroza FOS

Qua phương trình phản ứng ta thấy, ngoài FOS ra, sản phẩm thu được còn chứa một lượng glucoza nhất định Đường glucoza xuất hiện trong phản ứng không những làm giảm độ tinh khiết của FOS mà còn ức chế hoạt tính của enzim Vì chất

ức chế này mà ta chỉ thu được dịch đường phổ thông có nồng độ FOS không quá

55 % còn lại hơn 45 % là sacaroza và glucoza Vì thế muốn thu được FOS có độ tinh khiết cao (FOS cao độ) hoặc FOS tinh khiết, cần thiết phải tách bỏ hoặc chuyển hoá lượng glucoza và sacaroza còn sót lại Cho tới nay các phương pháp loại bỏ được áp dụng chủ yếu bao gồm:

+ Lọc gel [35], [60]: ở Nhật gần đây phương pháp này đã được đưa vào áp dụng ở qui mô công nghiệp Dựa trên nguyên lí của sự khác nhau về kích cỡ phân

tử của các cấu tử phân tán trong dịch mà người ta phân li được riêng rẽ từng loại

đường, nhờ đó có thể tách, loại bỏ glucoza ra Phương pháp này cần có hệ thống thiết bị tinh lọc đồng bộ đắt tiền do đó hiệu quả kinh tế không cao

+ Lọc Nano: Đây là một phương pháp mới, sử dụng kỹ thuật thẩm thấu ngược, có nhiều tính ưu việt rất phù hợp với qui mô công nghiệp

+ Dùng công nghệ lên men: Phương pháp này được thực hiện thông qua việc

sử dụng vi sinh vật để lên men glucoza có trong dung dịch, loại vi sinh vật hay

được dùng là nấm men [4][47] Phương pháp này được sử dụng rất nhiều bởi nó cho hiệu quả kinh tế cao, tuy thế nó cũng còn tồn tại là sản phẩm FOS bị nhiễm bẩn và gây mùi vị lạ

+ Dùng công nghệ enzim: Có hai loại enzim được sử dụng để phân giải glucoza là glucoizomeraza (GI) và glucooxidaza (GOD) [69]

- Sử dụng enzim GI [8], [71]: Trong phương pháp này enzim GI có vai trò trong chuyển hoá glucoza có trong dịch thành fructoza Về lí thuyết fructoza mới sinh ra lại gắn kết với sacaroza để tạo thành FOS Nhưng trong thực tế thí nghiệm cho thấy fructoza mới tạo ra không có khả năng gắn kết với sacaroza, kestoza hoặc nystoza Vì thế trong phương pháp này chỉ có thể làm giảm glucoza trong dịch thủy phân chứ không nâng cao độ tinh khiết của dịch FOS được

- Sử dụng enzim GOD [72]: Bằng cách này enzim GOD có nhiệm vụ phân giải glucoza thành axit gluconic Đây là loại enzim được coi là có hiệu quả nhất trong việc chuyển hoá glucoza trong sản xuất FOS [36]

Cũng như trong sản xuất FOS phổ thông, công nghệ sản xuất FOS tinh khiết

có thể thực hiện bằng hai phương pháp là cố định và không cố định enzim (tế bào)

Đại đa số các nghiên cứu đã chọn hệ enzim FTS, GOD và catalaza (CAT), cố định trên chất mang như canxi alginat và hạt trao đổi ion rồi được nhồi vào cột phản ứng Với công nghệ này Yun, J W [73] đã liên tục sản xuất được FOS có độ tinh khiết cao hơn 90 % Jiang Bo còn kết hợp cố định tế bào nấm mốc AS0023 với

GOD và GI để sản xuất FOS đạt độ tinh khiết 72 % Còn Lamia bằng phương pháp không liên tục cũng dùng hệ enzim GOD và CAT để sản xuất FOS cao độ Tác giả

đã tìm được ra điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzim trên và đã nâng cao

được độ tinh khiết của FOS phổ thông từ 50 % lên 82 %

+ Phương pháp trao đổi ion[72], [60] : Trong phương pháp này các đường thành phần được phân li khi đi qua cột có chứa các hạt nhựa trao đổi ion Nhờ đó ta

có thể tách glucoza và sacaroza ra khỏi dịch FOS [55]

1.4 Giới thiệu về fructosyltransferaza (FTS)

FTS là tên gọi chung cho các enzim có hoạt tính xúc tác quá trình chuyển dịch gốc fructoza Quá trình trên có thể xảy ra theo hai cách là cắt không gắn và cắt rồi gắn Khả năng xúc tác cắt không gắn của enzim là hoạt tính thuỷ phân (viết tắt là UH) , còn khả năng cắt rồi gắn là hoạt tính chuyển hoá (viết tắt là UT) Phụ thuộc vào vị trí gắn các gốc fructoza lên chất nhận, enzim này được phân ra nhiều loại với các tên gọi khác nhau như: 6G-fructosyltransferaza (6G-FT), 6F-fructosyltransferaza (6F-FT) và 1F-fructosyltransferaza (1F-FT) Các enzim trên xúc tác lên phân tử sacaroza tạo ra các loại FOS có phân tử lượng như nhau nhưng không giống nhau về cấu trúc phân tử [48] Ba enzim 6G-FT , 6F-FT và 1F-FT xúc tác gắn vào phân tử đường ở các vị trí khác nhau tạo ra các đường tương ứng được trình bày trên hình 1.5

Các FTS có nguồn gốc từ thực vật chỉ có hoạt tính UT, nhưng mang tính đặc hiệu cơ chất tương đối (gắn gốc fructoza vào phân tử đường sacroza khác ở nhiều

vị trí khác nhau), trong khi đó FTS có nguồn gốc từ vi sinh vật lại có cả hai loại hoạt tính UT và UH nhưng hoạt tính gắn lại có tính đặc hiệu cơ chất gần như tuyệt

đối [5], [6], [24], [56] Enzim FTS có nguồn gốc khác nhau cũng khác nhau về cấu tạo hoá học FTS tổng hợp từ vi sinh vật là những enzim đa cấu tử, có phân tử lượng cao (> 10.000 Da), trong phân tử có chứa các nhóm glucozit Nhiệt độ hoạt

động thích hợp của enzim này là 50 0C – 55 0C, pH thích hợp là 5 Khác với enzim tổng hợp từ vi sinh vật, FTS trong thực vật có phân tử lượng nhỏ hơn và trong phân

tử không chứa nhóm glucozit Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chúng là 30 0C – 450C Cần nói thêm FTS là loại enzim đặc hiệu, nó chỉ có thể tác dụng xúc tác

phân cắt và gắn kết gốc fructoza trong phân tử sacaroza hoặc các dẫn xuất của sacaroza để tạo thành FOS Còn ở trong dung dịch chỉ có fructoza và glucoza thì enzim này không có khả năng xúc tác tạo FOS

Vì FOS có sẵn trong tự nhiên, tồn tại trong các loại cây củ nên nguồn enzim tổng hợp FOS đầu tiên phải là từ các loại thực vật trên Alen và Bacon [5] đã phát hiện trên lá cây củ cải đường có chứa enzim xúc tác sacaroza tạo ra hai trioza thuộc nhóm fructooligosacarit là 1-kestoza và 6-kestoza Trong cây atiso chứa enzim tổng hợp đường tetrasacarit (GF3) và các enzim tổng hợp đường fructooligosacarit

có phân tử lượng lớn hơn (GFn) [16][17] Trong củ hành tây và măng tre còn chứa phức hệ ba enzim [48], [49], [50], [11] có tên gọi là:

1.5 Giới thiệu về enzim glucooxydaza (GOD)

1.5.1 Đặc tính của enzim GOD

Các nghiên cứu về cấu tạo và đặc tính của enzim GOD đã được A Crueger

và W.Crueger thực hiện năm 1990 [13] Các tác giả đã kết luận enzim GOD là hợp chất glucoprotein, có phân tử lượng khoảng 155 X 103 DA GOD chứa 2 phân tử FAD và 16% khối lượng phân tử là hydratcacbon ( mannoza, galactoza và glucosamine dưới dạng N-acetyl) Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia xúc tác và cấu tạo của nó cho tới nay cũng chưa được nghiên cứu rõ ràng Enzim GOD sinh tổng hợp từ A niger có cấu tạo bởi 583 axit amin [32]

Điểm đẳng điện của enzim này là pH 4.2 [58], [64] Enzim GOD có tính đặc hiệu rất cao, chỉ cần một thay đổi nhỏ trong cấu trúc thì hoạt lực oxy hóa của enzim đã khác hẳn nhau, ví dụ gốc glucoza trong phân tử enzim ở dạng β - D glucoza có hoạt tính oxy hóa mạnh hơn α - D glucoza 157 lần [52] Enzim GOD còn có một

đặc tính quan trọng là rất an toàn về mặt thực phẩm [25]

1.5.2 Cơ chế xúc tác của enzim GOD

Phản ứng oxy hoá của glucoza dưới xúc tác của enzim GOD được thực hiện theo các phương trình biểu diễn ở hình 1.5

Theo phương trình phản ứng ta thấy, đầu tiên glucoza dưới tác dụng của enzim GOD bị oxy hoá tạo thành β-D-glucolacton, sau đó tự phân thành axit gluconic Sự tạo thành axit gluconic sẽ làm giảm pH của môi trường, nên trong quá trình phản ứng phải đồng thời bổ sung kiềm để điều chỉnh pH (phương pháp potentionmetric)

Theo cơ chế hoạt động của enzim GOD thì quá trình oxy hoá glucoza luôn

có sự hình thành H2O2., chính sản phẩm phụ này lại ức chế hoạt động của enzim GOD

Hình 1.5: Quá trình oxy hoá glucoza dưới tác dụng của enzim GOD

Về ảnh hưởng của H2O2 trong phản ứng oxy hoá glucoza đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Kleppe [35], Bourdillon [8], Tse và Googh [62] Các kết quả

đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ với sự tăng của nồng độ H2O2 Và vì thế trong sản xuất FOS nếu chỉ dùng một enzim GOD thì ta chỉ có thể chuyển hóa

được một phần nhất định lượng glucoza sinh ra và độ tinh khiết của FOS cũng sẽ bị hạn chế ở mức thấp Kết quả nghiên cứu của Lamia [36] cho thấy mặc dù đã dùng nhiều phương phấp để cải thiện điều kiện phản ứng oxy hóa glucoza có enzim

GOD xúc tác nhưng hàm lượng FOS trong sản phẩm không thể vượt quá 61.26 %

và lượng glucoza bị chuyển hóa chỉ hạn chế trong khoảng 16% Hoạt lực của enzim GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng

Để giải quyết tồn tại trên, cần thiết phải loại bỏ nhân tố ức chế enzim GOD

là H2O2 Điều này có thể tiến hành bằng cách bổ sung thêm một loại enzim khác

có khả năng chuyển hóa H2O2 đó là catalaza (CAT) Quá trình oxy hóa glucoza dưới tác dụng của hệ enzim GOD- CAT được thể hiện theo phương trình phản ứng

ở hình 1.6

1.6 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam

Việt Nam là một nước có ngành công nghiệp mía đường phát triển từ rất sớm Thực hiện chủ trương và chính sách của chính phủ, đến năm 2000 đã có 47

nhà máy trrên toàn quốc đi vào hoạt động và sản lượng đường đạt tới một triệu tấn

Cây mía có thể trồng ở tất cả các địa danh toàn quốc Các vùng tập trung trồng mía

nhiều là các tỉnh thuộc Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Đồng

Bằng Sông Cửu Long Sản lượng mía và đường mía hàng năm không ngừng được

nâng cao Quá trình tăng trưởng của ngành công nghiệp mía đường từ năm 1998

đến năm 2001 được trình bày trên bảng 1.2 [3]

Số liệu thống kê trên bảng 1.2 cho thấy Việt Nam có sản lượng đường mía

tương đối cao, đó là nguồn nguyên liệu dồi dào cho ngành sản xuất FOS, một mặt

hàng chưa được phát triển trong thị trường nội địa

Bảng 1.2 : Diễn biến tăng trưởng của ngành công nghiệp mía đường

Cùng với nguồn nguyên liệu dồi dào, Việt Nam còn có nguồn nhân lực lớn, có

trình độ khoa học để làm chủ công nghệ sinh học nói chung và chế biến thực phẩm

nói riêng Vì vậy việc mở ra một ngành sản xuất mới sử dụng công nghệ hiện đại

để tạo nên sản phẩm FOS với nhiều đặc tính ưu việt, có giá trị cao hơn đường kính

về đặc tính chức năng, cung cấp cho thị trường trong nước và xuất khẩu, làm

nguyên liệu cho các sản phẩm chức năng như bánh kẹo, thực phẩm cho người mắc

bệnh tiểu đường, sữa và bột ding dưỡng cho trẻ em v.v… là cần thiết và hoàn toàn

khả thi

Chương 2 Nguyên liệu, thiết bị và phương

pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất

2.1.1 Giống vi sinh vật

- Phân lập từ các mẫu đất ở các nhà máy đường phía Bắc Việt Nam

- Bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Công nghiệp thực phẩm

2.1.2 Enzim

- Fructosyltransferaza (FTS) từ trường đại học Giang Nam Trung Quốc

- Glucooxydaza (GOD) (EC 1.1.3.4) từ Aspergillus niger: Công ty hoá chất

Sigma, Mỹ

- Catalaza (CAT) (EC1.11.1.6) từ gan bò : Công ty hoá chất Sigma, Mỹ

- Amylaza: Hãng Novo Đan Mạch

- Than hoạt tính: Sigma, Mỹ

- Bản mỏng sắc ký TLC silica gel 60 F 254: Merck, Đức

- Hạt trao đổi ion: Trung Quốc

- Các loại nguyên liệu khác: Mua tại thị trường Việt Nam

2.1.4 Hoá chất

- Glucoza, fructoza tiêu chuẩn : Trung Quốc

- Nystoza, kestoza tiêu chuẩn : Fluka, Nhật Bản

- N-propynol, ethylacetat, diphenylamin, anilin, axit photphoric, dinitrihipophotphat, axit citric, pepton, magesulphat, kalihipophotphat của Công ty hoá chất Y dược, Thượng Hải, Trung Quốc

- Các loại hoá chất khác có độ tinh khiết cho phân tích sắc ký và phân tích,

được mua tại thị trường hoá chất Trung Quốc và Việt Nam

2.2 Các thiết bị chủ yếu

- Thiết bị nuôi cấy và lên men

+ Tủ sấy: Sanyo , Nhật Bản

+ Tủ cấy vô trùng: Việt Nam

+ Tủ ấm: Trung Quốc

+ Máy lắc ổn tốc, ổn nhiệt: Việt Nam

+ Tủ lạnh: Sanyo, Nhật

- Thiết bị phản ứng

+ Nồi cách thuỷ ổn nhiệt: Lauda, Đức

+ Thiết bị khuấy từ gia nhiệt: HB4 basic Malaysia

+ Thiết bị cô chân không: B⎫chi Potavapor R-114

+ Thiết bị đo pH ORION, model 410A

- Thiết bị phân ly

+ Cột sắc ký trao đổi ion : φ 4,5cm x 50cm Thượng Hải, Trung Quốc

- Thiết bị phân tích

+ Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC: Nhật Bản

+ Máy so màu Genesis, Mỹ

+ Chiết quang kế: Trung Quốc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp vi sinh vật

2.3.1.1 Phân lập, tuyển chọn giống

- Phân lập theo phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường khoai tây

- Phân lập theo hoạt lực của enzim [8]

2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường nước chiết khoai tây [8] : 200 g/l khoai tây, 20g/l đường kính,

20 g/l aga, pH 6,0 Thanh trùng ở áp lực1kg/cm2 trong 20 phút

- Môi trường nhân giống: đường kính 150 g/l, cao nấm men 5 g/l, pepton 10 g/l; MgSO4.7H2O 1 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, pH 6,5 Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút

- Môi trường lên men: 150 g/l đường kính, 5 g/l cao nấm men, 10 g/lpepton, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,5 g/l KH2PO4, pH 6,5 Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2trong 20 phút

- Môi trường nước chiết malt: 10 – 11 0Bx nước chiết malt, 2-2,5% agar, 0,3

% pepton, pH 5,6 Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút

- Môi trường Czapek: 30 g/l đường kính, 0,2 % tinh bột, 0,001% FeSO4, 0,05 % MgSO4, 0,05 % KCl, 0,1 % KH2PO4, 0,3 % NaNO3, 2,5 % agar Thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong 20 phút

2.3.1.3 Nuôi cấy vi sinh vật [2], [1]

- Nuôi cấy trên hộp lồng: nhiệt độ 30 0C trong 48 giờ

- Nuôi cấy trên ống thạch nghiêng: nhiệt độ 30 0C trong 3 ngày

- Nuôi cấy giống cấp 1: nuôi trong bình tam giác 500 ml có chứa 50 ml dịch, lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/ phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30 0

C trong thời gian 24 giờ

2.3.1.4 Phương pháp phân loại và định tên vi sinh vật

Quá trình phân loại của chủng nấm mốc VVTP 84 được tiến hành bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên ba môi trường đặc trưng đó là môi trường nước chiết khoai tây, môi trường Czapek và môi trường nước chiết malt Vi sinh vật được

quan sát theo dõi trong suốt thời gian nuôi cấy bằng mắt thường, kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử Cuối cùng vi sinh vật được xác định tên dựa

trên các khoá phân loại thích ứng

2.3.1.5 Lên men tổng hợp enzim

Lên men chìm trong bình tam giác: bình tam giác 250 ml có chứa 30 ml dịch hoặc bình tam giác 500 ml chứa 50 ml dịch trong được lên men trên máy lắc với tần số 200 vòng/phút, biên độ 10 mm, nhiệt độ 30 0C trong thời gian 36 giờ

2.3.2 Các phương pháp hoá sinh, hoá lý

- Chiết tách enzim: Sau khi phá vỡ tế bào, hỗn dịch được ngâm 3 giờ ở nhiệt

độ 40C Cuối cùng enzim thô được tách ra từ hỗn dịch bằng cách lọc chân không, hoặc li tâm lạnh Enzim thô sau đó được đem phân tích hoạt lực Quá trình tuyển chọn giống sẽ căn cứ vào hoạt lực của enzim

2.3.2.2 Xác định hoạt lực enzim

Hoạt lực của enzim được xác định theo phương pháp của Hidaka cải tiến [29] Phương pháp này được tiến hành như sau: dịch phản ứng chứa 25% đường sacaroza (10ml), dung dịch đệm pH 5 (5ml), enzim thô 0,5ml Phản ứng xảy ra trong thời gian 1giờ ở nhiệt độ 50oC Kết thúc phản ứng enzim được bất hoạt trong nước sôi 10 phút Hoạt tính UH và UT được xác định thông qua lượng đường kestoza và fructoza tương ứng được tạo thành sau phản ứng Một đơn vị hoạt lực

được định nghĩa là lượng enzim cần thiết cho sự tạo thành 1 àmol đường tương ứng trong thời gian 1 phút dưới điều kiện phản ứng như trên

Trong quá trình sơ tuyển giống thì hoạt lực enzim được sơ bộ xác định thông qua sắc ký bản mỏng

2.3.2.3 Xác định thành phần đường (định tính) bằng sắc ký bản mỏng

Sắc ký bản mỏng được làm theo phương pháp của Jiang Bo Cách làm được tiến hành như sau:

- Dung dịch chạy: n-propynol : ethylacetate : nước cất ( 7/1/2)

- Chất hiện màu: Dung dịch difenylamin, benzoamin, axit phosphoric và acetol

- Cách làm: Bản sắc ký phải được sấy khô trước khi thực hiện thí nghiệm Mẫu thí nghiệm được chấm lên giấy với lượng khoảng 0,5àl, đem sấy khô rồi để mẫu chạy trong 4 giờ Sau khi kết thúc quá trình chạy bản sắc ký

được phun chất hiện màu rồi sấy khô

Phân tích mẫu: thay thế đường glucoza tiêu chuẩn bằng mẫu thí nghiệm rồi tiến hành tương tự như trên để xác định độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm rồi căn cứ vào đường chuẩn để xác định hàm lượng đường glucoza

2.3.2.6 Phân tích hoá lý theo các phương pháp thông dụng

2.3.5 Các công nghệ và quá trình cơ sở

2.3.5.1 Quy trình sản xuất enzim fructoosyltransferaza

Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Lên men ––––> Tách sinh khối

––––> Phá vỡ tế bào ––––> Trích ly enzim thô

2.3.5.2 Công nghệ sản xuất FOS cao độ bằng phương pháp đồng thời

Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Phản ứng enzim ––––> lọc ––––> Làm sạch ––––> Cô đặc

2.3.5.3 Công nghệ sản xuất FOS cao độ bằng phương pháp nối tiếp

Nguyên liệu ––––> Phối trộn ––––> Phản ứng chuyển hoá đường sacaroza

–––> Phản ứng chuyển hoá đường glucoza ––––> lọc ––––> Làm sạch ––––>

Cô đặc

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.1 Nghiên cứu sản xuất đường FOS cao độ bằng phương pháp nối tiếp

Phương pháp nối tiếp được phân ra làm hai phân đoạn: phân đoạn phản ứng FTS và phân đoạn phản ứng GOD - CAT Tại phân đoạn 1, enzim FTS xúc tác lên

đường sacaroza tạo ra đường FOS và đường glucoza Còn tại phân đoạn 2 hệ 2 enzim GOD - CAT tác dụng lên đường glucoza và chuyển hoá chúng thành axit gluconic rồi thành muối gluconat natri và được loại ra khỏi dung dịch bằng cách trao đổi ion Để có được hiệu quả cao, để đạt được mục đích có đường FOS cao độ

Cả hai điều kiện chuyển hoá trên phải được nghiên cứu tối ưu ho

3.1.1 ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt lực của FTS

Trong phản ứng có enzim, độ axit hoặc kiềm của môi trường có vai trò rất quan trọng, nó ảnh hưởng không những đến hoạt lực của enzim mà còn ảnh hưởng

đến cấu hình enzim, từ đó ảnh hưởng đến các tính năng khác của enzim như tính

đặc hiệu ( chỉ xúc tác phân cắt hay gắn kết ở những mối liên kết nhất định), đến khả năng phân li các phân tử của cơ chất và enzim, đến lực liên kết giữa enzim và cơ chất, đến độ ổn định của enzim v.v… Nếu pH của dịch thuỷ phân quá xa với khoảng thích hợp sẽ làm bất hoạt enzim

Vì thế việc xác định pH tối ưu và khoảng pH mà ở đó enzim không bị thay đổi các đặc tính của mình (ổn định) là việc cần thiết trước khi sử dụng Để xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzim, thí nghiệm được tiến hành bằng cách xác định hoạt lực của các mẫu enzim trong điều kiện pH khác nhau từ 3 tới 10 Hình 3.1 là kết quả cho thấy mối liên quan của pH môi trường với hoạt lực của enzim Ta dễ dàng nhận thấy hoạt lực của enzim đạt giá trị cao nhất khi pH của môi trường là 5.0 So sánh với các kết quả đã công bố thì kết quả này cũng phù hợp vì hầu hết

các FTS đều có pH tối ưu cho hoạt động là từ 5.0 đến 6.8 như FTS của Aspergillus

japonicus [10], Aspergillus niger ATCC20611 [30], Aureobasidium pullulas [34]

Chỉ duy nhất có FTS từ Aspergillus oryzae [34] là có hoạt lực tối đa tại pH 8

3.5 4.5 5.5 6.5 7.5

pH

Hình 3.1: ảnh hưởng của pH đến hoạt lực của enzim

Để xác định khoảng pH mà tại đó FTS ổn định (các đặc tính không bị thay

đổi), thí nghiệm được tiến hành bằng cách ngâm các mẫu enzim vào những môi trường có pH khác nhau thay đổi trong khoảng 3 đến 10 trong thời gian 2 giờ Sau

đó hoạt lực của enzim được đem phân tích để xác định hoạt lực tương đối (tỷ lệ phần trăm hoạt lực của enzim sau và trước khi bị xử lý) Kết quả như hình 3.2 đã thể hiện Ta thấy enzim FTS ổn định trong dải pH khá dài từ 4 đến 10

020406080100120

3.1.2 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định hoạt lực của enzim

Cũng như pH nhiệt độ môi trường phản ứng có ảnh hưởng rất lớn đến tính chất cũng như hoạt lực của enzim Để xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzim, chúng tôi tiến hành xác định hoạt lực của enzim ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau từ 40 oC đến 60 oC Thí nghiệm giữ enzim trong nồi cách thuỷ ở những nhiệt độ khác nhau trong thời gian 1 giờ đã xác định được độ bền nhiệt của enzim Kết quả được trình bày trên đồ thị hình 3.3 Ta thấy enzim có hoạt lực cao nhất khi

ở nhiệt độ 50oC và enzim này tương đối ổn định trong dải nhiệt từ 35 oC đến 55oC Kết quả này cũng phù hợp với các công bố của Jiang Bo [8] khi tác giả nghiên cứu

FTS thu nhận từ Aspergillus niger AS0023

20406080100

Hoạt lực tương đối Hoạt lực tuyệt đối

Hình 3.3: ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực của enzim

3.1.3 Tối ưu hoá các điều kiện chuyển hoá FOS

Qui hoạch toán học thực nghiệm là phương pháp được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh học, bởi phương pháp này có thể giảm số lần thí nghiệm tới mức tối thiểu mà vẫn cho kết quả chính xác Trong phản ứng có enzim xúc tác, hiệu suất của phản ứng bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzim, nồng độ cơ chất v.v…, nên việc xác định điều kiện tối ưu cho quá trình là rất phức tạp Việc sử dụng

phương pháp qui hoạch toán học thực nghiệm sẽ giúp ta dễ dàng hơn trong quá

trình thí nghiệm Trong nghiên cứu này phương pháp qui hoạch thực nghiệm Box-

Willson đã được chọn Các yếu tố cần tối ưu là nồng độ sacaroza (%), nồng độ

enzim FTS (U/g sacaroza), thời gian phản ứng (giờ), chỉ tiêu tối ưu là hàm lượng

FOS tạo thành (%) Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hàmh ở điều kiện nhiệt độ

50 0C và pH 5 thích hợp cho hoạt động của enzim Mục đích của quá trình là tìm

điều kiện phản ứng để thu được hiệu suất cao nhất, tức thu được hàm lượng FOS

cao nhất

Theo phương pháp đã dẫn, quá trình tối ưu hoá được thực hiện theo tiến trình

sau:

Bước 1: Xây dựng mô hình toán học

• Xác định các chỉ tiêu tối ưu và các yếu tố ảnh hưởng

Chỉ tiêu cần tối ưu: y= f(x1, x2, x3)

Trong đó:

y –– Hàm lượng FOS thu được sau thuỷ phân (%)

x1 –– Nồng độ cơ chất (sacaroza): từ 40 % đến 60 %

x2 –– Nồng độ FTS : từ 5U/g cơ chất đến 15U/g cơ chất

x3 –– Thời gian thuỷ phân : từ 5h - đến15h

Bảng 3.1: Mức thí nghiệm của các yếu tố

Các mức của biến số Biến số Mức dưới

(-)

Mức trung bình (0)

Mức trên (+)

• Mức thí nghiệm của các yếu tố được ghi trên bảng 3.1