Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm ĐTN nghiên cứu thu nhận chế phẩm bêta glucozidaza và ứng dụng trong việc khai thác hương liệu nhằm tăng hương cho một số loại đồ uống

Tuy nhiên các enzym này thường có hoạt độ thấp và với lượng không nhiều nên không thể phân huỷ toàn bộ các heterozit, do vậy trong các hoa quả sau khi chín hoặc trong các sản phẩm chế bi

BO KHOA HOC VA CONG NGHE VIEN CONG NGHE THUC PHAM

301 Nguyễn Trãi, Thanh xuân, Hà nội

BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

Đề tài cấp nhà nước:

NGHIÊN CUU UNG DUNG CONG NGHE ENZYM

TRONG CHE BIEN MOT SO NONG SAN THUC PHAM

HƯƠNG CHO MỘT SỐ LOẠI ĐỔ UỐNG

Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nước : TS Nguyên Thị Xuân Sâm

Hà Nội, 10-2004 Bản thảo viết xong tháng 9-2004

Danh sách các cán bộ tham gia đề tài

5 Đỗ Biên Cương-ĐHBK ĐHBK-HN Phân 1 và 3 |

BAI TOM TAT

Hiện nay các nghiên cứu về enzym cho biết B glucozidaza duoc coi la dong lực xúc tác cho quá trình thuỷ phân xenluloza Mặt khác enzym này cũng được xem

là một enzym chìa khoá trong sự giải phóng ra các cấu tử thơm từ các tiền chất glucozit có mặt trong các dịch quả hoặc từ các sản phẩm lên men từ quả

Trong quá trình chín của hoa quả, các tiền chất thơm này sẽ được phân huỷ thành các cấu tử thơm bởi một số enzym trong đó có § glucozidaza của chính các tế

bào của chúng Tuy nhiên các enzym này thường có hoạt độ thấp và với lượng không nhiều nên không thể phân huỷ toàn bộ các heterozit, do vậy trong các hoa

quả sau khi chín hoặc trong các sản phẩm chế biến từ chúng vẫn còn tiểm tàng một lượng lớn các cấu tử thơm Chính những phát hiện này đã thu hút được nhiều nhà khoa học, nhiều công trình nghiên cứu sử dụng nguồn glucozidaza của bản thân nguyên liệu hoặc bổ sung từ bên ngoài vào để khai thác cũng như cải thiện hương cho một số sản phẩm thực phẩm

Hơn nữa, nhờ có: phổ tác dụng rộng:mà ngày: nay enzym này còn được coi là một trong những tác nhân khử các chất gây vị đắng (amigdalin) có trong họ citrus,

như cam,-chanh, budi;.mo lam tang giá trị cảm quan và thương phẩm: cho cúc đồ

uống từ các loại quả này Nhu cầu về chế phẩm B glucozidaza ngày một tăng, trên

thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận enzym này từ một số chủng vi

sinh vật, và thực vật, vài năm gần đây gen mã hoá cho enzym này cũng đang được nghiên cứu tách dòng và biểu hiện Tuy nhiên ở Việt nam, cho tới nay, hầu như chưa

có công trình nào đưa ra được qui trình thu nhận và ứng dụng chế phẩm này một cách cụ thể Do vậy việc nghiên cứu thu nhận, khai thác khả năng sử dụng nguồn :enzym này từ các nguồn vật liệu trong nước là một trong những nỗ lực chung mé i nhiều triển vọng ứng dụng enzym nói chung và B-glucozidaza nói riêng trong chế

biến nông sản thực phẩm Đề tài đã giải quyết được một số nội dung chính sau:

- Xay dung được quy trình thu nhận B-glucozidaza tir Aspergillus niger PBC bing các nguồn nguyên liệu rẻ tiền sắn có của Việt nam như bã mía, vỏ cam

- Xây dựng được quy trình tách tính chế B-glucozidaza từ nhân hạt mơ nguồn

phế liệu của quá trình chế biến nước mơ

Nghiên cứu các điều kiện tỉnh chế, các đặc tính, điều kiện bảo quản hai loại chế

phẩm enzym trên

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzym trong sản xuất rượu vang và chế biến

nước quả mơ nhằm tăng hương và giảm đắng cho sản phẩm

MUC LUC

Mở đầu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vai trò của B-glucozidaza

1.2 Nguôn thu enzym

1.3 Một vài đặc tính của #glucoztdaza

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp /Lglucozidaza

1.5 Tách tỉnh chế và bảo quản enzym

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.2 Môi trường nuôi vị sinh vật

2.3 Hoá chất và thiết bị

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phần 1 Chế phẩm B-glucozidaza từ A niger PBC

3.1.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp Øgiucozidaza trên máy lắc ngang

3.1.2 Nghiên cứu sinh tổng hợp B-glucozidaza trén binh lén men 2 lit

3.1.3 Nghién citu tach va lam sạch enzym

3.1.4 Xác định một vài đặc tính của chế phẩm

3.1.5 Nghiên cứa bảo quản chế phẩm

Phân 2 Chế phẩm -glucozidaza từ nhân hạt mơ

3.2.1 Nghiên cứu thu nhận enzym từ nhân hạt mơ

3.2.2 Tỉnh chế enzym

3.2.3 Khảo sát các đặc tính của chế phẩm

3.2.4 Khảo sát một số phương pháp bảo quản chế phẩm

Phần 3 Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm B-giucozidaza

3.3.1 Tăng hương cho rượu vang bởi -giucozidaza từ A.niger PBC

3.3.2 Khử đẳng nước mơ bởi -glucoztdaza từ nhân hạt mơ

Phần 4 Tổng quát hoá và đánh giá kết quả

CAC CHU VIET TAT

p-nitrophenyl-B-D-glucopyranozit Ethylene diamine tetraacetic acid

MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế Enzym đã dần từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chan nudi, y tế đáp ứng nhụ cầu ngày càng tăng của xã hội Hàng năm, lượng enzym được sản

xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên 300 000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD được phân bổ trong các lĩnh vực khác nhau

Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản suất enzym chính với trên 60 nhà cung cấp lớn Châu Âu với hai hãng sản xuất lớn nhất thế giới là Novo Nordisk

và Gist Brocades chiếm trên 60% lượng enzym thị trường, các chế phẩm enzym của

Mỹ chỉ chiếm 15% trong đó 2/3 lượng enzym được sử dụng nội địa Nhật bản với

các chế phẩm enzym chiếm khoảng 15% thị trường thế giới Trung quốc và Nga các

chế phẩm enzym được sản xuất ra chủ yếu được dùng cho nhu cầu trong nước

Ở nước ta hiện nay đo nhiều nguyên nhân phần lớn các chế phẩm enzym sử dụng đều là các sản phẩm ngoại nhập Một trong những lý do đó là việc sản xuất ở quy mô lớn còn nhiều hạn chế, hoạt tính của các chế phẩm enzym trong nước chưa

ổn định trong quá trình bảo quản và sử dụng Do vậy, việc nghiên cứu thu nhận, tỉnh chế và bảo quản enzym và khai thác khả năng ứng dụng chúng là những vấn đề có ý

nghĩa thực tiễn và lý luận to lớn, tạo cơ sở ban đầu cho sự ra đời của nền công

nghiệp enzym của Việt nam

Dựa trên các kiến thức về nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym, về kỹ

thuật tách tinh chế, bảo quản chế phẩm enzym, về các điều kiện trang thiết bị và nguyên vật liệu sắn có của Việt nam dé tài nhằm nghiên cứu thu nhận chế phẩm B- glucozidaza từ nguồn vi sinh vật (Aspergilius niger PBC) hoặc từ thực vật (nhân hạt

mơ) Việc khai thác ứng dụng chế phẩm enzym này trong một số quá trình chế biên

các dịch qủa và các sản phẩm lên men từ dịch qủa nhằm nâng cao giá trị cảm quan

và thương phẩm cho chúng (tăng hương, giảm đắng) cũng là một trong những nội

dung của để tài nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông

sản thực phẩm

CHUONG I TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Vai trò của B-glucosidaza

Enzym 0-glucosidaza (EC.3.2.1.21), còn có các tên khác là cellobiaza, gentiobiaza, là enzym thuỷ phân các liên kết 1,4-B-D-glucoside ở phía tận cùng đầu không khử của chuỗi glucoside giải phóng ra -D-glucoza Nhờ có phổ tác dụng rộng không những trên các diglucozit, oligosaccarit mà còn trên các liên kết alkyl, aryl glucozit nên ngày nay -glucosidaza được sử dụng với nhiều mục đích và trong

nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó hai lĩnh vực sử dụng B-glucosidaza nhiều nhất là

phân giải xenluloza và công nghiệp thực phẩm

Theo con đường sinh học, để thuỷ phân hoàn toàn xenluloza thành glucoza phải nhờ sự hiệp trợ xúc tác của một phức hệ xenlulaza từ vi sinh vật Cho tới nay, khoa học mới biết được (ít ra) có 3 kiểu enzim tham gia vào phức hệ này Đó là endoglucanaza- EG (EC.3.2.1.4), exoglucanaza- CBH (EC 3.2.1.91) va B-

glucozidaza (EC 3.2.1.21)

Ba enzim này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn

nhau của quá trình thuỷ phân xenluloza đến glucoza Nhiều tác giả cho rằng enzym

xenlobiaza này có vai trò rất quan trọng khi đường hoá xenluloza Bởi lẽ khi xenlobioza không được phân giải kịp thời, tích tụ lại sẽ tạo ra cơ chế kìm hãm ngược đối với endoglucanaza và exoglucanaza Vì vậy tốc độ chung của cả quá trình phụ thuộc chặt chế vào hoạt độ của B-glucoz1daza

Xenlobioza FC /#giucczidaza r| Giucoza —*

Tuy nhiên, đo trong sự tạo thành phức hệ xenlulaza của vi sinh vật thường hay thiếu hụt B-glucozidaza đẫn đến làm giảm tốc độ thủy phân xenluloza Vấn đề đặt ra ở đây là phức hệ xelulaza sử dụng phải được bổ sung B-glucozidaza thêm vào

từ một số loài có khả năng tạo ra một lượng lớn B-glucozidaza

Mặt khác -glucozidaza còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân các heterozit giải phóng gốc monotecpen khỏi gốc đường làm tăng đáng kể các cấu tử thơm trong quá trình lên men sản xuất rượu vang và địch quả (26, 27) Ngoài

ra B-glucozidaza còn có khả năng phân cắt liên kết trong các chất gây đắng có bản

chất là các glucozit (amigdalin) trong một số loại hoa quả chủ yếu là họ citrus để

khử vị đắng, tăng thêm giá trị cho sản phẩm nước quả tự nhiên

Amygdalin tập trung chủ yếu trong nhân hạt mơ với hàm lượng khoảng 3%,

nó cúng tồn tại một lượng nhỏ cỡ 120 - 240ppm trong thịt quả và gây ra vị đắng cho

mơ Đây là một chất thuộc dang cyanogenic gluxit với tên đẩy đủ là: D-mandelonitrile-B-D-gentiobioside, CạoHz;O,¡N, trong dung dịch có tồn tại dưới dạng hai dồng phân: Amygdalin và Neoamygdalin

10

nghiên cứu cho thấy, B-glucozidaza có thể được sinh tổng hợp bởi nhiều loại ví sinh

vật khác nhau bao gồm cả vị khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn

Hiện nay nhóm vi khuẩn bền nhiệt đã được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi

trong quá trình chuyển hoá xenluloza Phổ biến là hai nhóm vi khuẩn hiếu khí và yếm khí Các vi khuẩn yếm khí sinh tổng hợp xenlulaza thường là các vi khuẩn dạ

cỏ của động vật nhai lại, có khả năng phân huỷ xeniuloza rất mạnh, chúng kết hợp với nhau tạo ra phức hệ xenlulaza hoàn chỉnh trong đó nhiều chủng cho hoạt tính B-

glucozidaza cao Tuy nhiên, vi khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza trong tự nhiên thuộc

về nhóm vi khuẩn hiếu khí

Nấm có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza nói chung và § glucozidaza nói

riêng phân bố rất rộng và đa dạng trong tự nhiên cả ở nấm mốc, nấm men và nấm

quả thể, đặc biệt là nấm mốc Đặc điểm nấm mốc là chúng có hệ sợi rất phát triển,

nguồn dinh dưỡng cacbon cho chúng rất đa dạng và phong phú, có sẵn trong tự nhiên thường là các nguồn nguyên liệu có chứa tỉnh bột và các sản phẩm thuỷ phân

từ tính bột

Loài được chú ý đến đầu tiên phải kể đến là Aspergillus niger có khả năng tích luỹ B glucozidaza khá cao và đặc biệt có hoạt tính mạnh trên xenlobioza Chính

vì vậy mà Asperrgillus niger PBC được lựa chọn làm chủng để sinh tổng hợp B

glucozidaza của đề tài nghiên cứu

1.3 Một vài đặc tính của B-glucosidaza

Tính đặc hiệu cơ chất

Mỗi enzym chỉ có khả năng xúc tác chuyển hoá một hoặc một số cơ chất nhất

định Với B-glucosidaza ngoài khả năng thuỷ phân xenlobioza còn có thể thuỷ phân nhiều loại saccarit như CMC, Salisin, B-D-Galactozit , cũng như các aryl, ankyl ølucozit như p-NPG, p-Nitrophenyl-B-D-Xylozit (12)

Aí lực của enzym cho mỗi cơ chất phụ thuộc vào bản chất của nguồn enzym

Thông thường §-glucosidaza thu được từ vi khuẩn hoạt động mạnh trên cả xenlobioza cũng như các aryl gÌucozit, còn -glucosidaza từ nấm sợi hoạt động mạnh trên xenlobioza và các saccarit Còn ở nấm men thì ngược lại, khả năng hoạt

động trén cdc aryl-alkyi-glucozit manh hơn rất nhiều so với trên xenlobioza và các

saccarit điển hình như nấm men Saccharomyces cerevieare chi téng hop cdc B-

glucosidaza cho hoạt tính enzym cao véi cdc alkyl va aryl-B-D-glucozit ma không

có hoạt tính với xenlobioza Ngược lại B-glucosidaza từ A.oryzae lại cho hoạt tính trên xenlobioza cao hơn so với trên p-NPG Ái lực của B-glucozidaza cho mỗi cơ chất cũng thường được so sánh với chức năng sinh lý và sự định vị của nó (29) Một vài ƒ}-glucozidaza không chỉ xúc tác cho các phản ứng thuỷ phân mà còn tham gia vào các phản ứng chuyển nhóm glycozyl tạo ra các oligosacarit như galactooligosacarit (GOS) lam cơ sở cho việc sản xuất các đường chức năng

Nhiệt độ và pH hoạt động của enzym

Các nghiên cứu cho thấy B-glucosidaza được sinh tổng hợp từ vi sinh vật có dải

pH hoạt động trong khoảng 4-6 Nhìn chung, enzym thu được từ nấm sợi và đặc biệt

là các chủng Aspergillus có khả năng phân giải rất mạnh xenlobioza ở pH từ 4-5 Aspergillus niger có pH tối ưu dao động trong khoảng từ 4,6-5,3 (9, 14, 19) Trong khi đó -glucosidaza của vi khuẩn và nấm men thường có pH tối ưu cao hơn một chút

Đa số các nghiên cứu cho thấy B-giucosidaza từ các chủng Aspergillus có khả năng chịu nhiệt cao, chỉ bị ức chế khi nhiệt độ trên 65°C Trong khi đó -

glucosidaza nấm men kém bền nhiệt hơn, hoạt độ giảm rõ rệt khi nhiệt độ lớn hơn

50°C Riêng B-glucosidaza của vi khuẩn Pyrococus furiosus nuôi trên môi trường

xenlobioza rất bền nhiệt, nhiệt độ tối ưu lên tới 102-105 °C (17)

Sự kìm hãm bởi đường glucoza

Su kìm hãm cạnh tranh bởi glùcoza là đặc tính chung của các B-glucosidaza của nấm và là nguyên nhân chính làm hạn chế việc sử dụng chúng trong các quá trình thuỷ phân Hầu hết B-glucosidaza của vi sinh vật bị kìm hãm bởi glucoza ở ngưỡng 0,5-100 mmol Déi véi B-glucosidaza cia Aspergillus gid tri nay hep hon, thường trong khoảng 3-1 1 mmol (29)

Ảnh hưởng của etanol tới hoạt độ B-glucosidaza

12

Hoạt độ B-glucosidaza của phần lớn các vi sinh vật được hoạt hoá bởi etanol

ở nồng độ thấp Trong trường hợp -glucosidaza của A.mger (19) và A.oryzae (27)

khả năng thuỷ phân cơ chất p-NPG tăng lên 30% khi nồng độ etanol là 15%

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp B-glucosidaza

Ảnh hưởng của pH

Các nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp enzym nói chung và đặc biệt là quá trình sinh tổng hợp ÿ-glucosidaza của nhiều tác giả cho thấy pH của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp các enzym của vi sinh vật Khi pH môi trường quá thấp hoặc quá cao so với khoảng pH tối ưu của

chủng nghiên cứu thì khả năng sinh tổng hợp enzym bị giảm đáng kể Chẳng hạn

với T.reesei khoảng pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp B-glucosidaza là 4-6, còn A.niger khoảng pH thích hợp là 4,5-5,5 (18) Trong khi đó các loài nấm ưa nhiệt Chaetimium thermophile có khả năng sinh téng hop B-glucosidaza cao 6 pH 5

Giá trị pH ban đầu môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến khả năng tiết enzym vào môi trường của vi sinh vật Ví dụ với A.oryzae (27) khi pH ban đầu lớn hơn 5 hầu hết B-glucosidaza được tiết vào môi trường, còn ở pH ban đầu nhỏ hơn

4,5 thì enzym bám trên thành tế bào

Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

Một số nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của nguồn nitơ là rất rõ rệt Metz và Rossen khi nghiên cứu trên chủng Myrothecium verrucaria đã nhận thấy nếu nuôi & nồng độ (NH4); SO, cao (100 -500 mM) hệ sợi phát triển tốt, nhưng nếu nuôi ở nồng độ muối thấp (1 - 5 mM) thì hệ sợi kém phát triển (28) Trong môi trường nuôi

sử dụng nguồn dinh dưỡng là muối amôn thì khả năng sinh tổng hợp B-glucosidaza của A.mger cao hơn so với khi sử dụng nitrat (14)

Đối với A.niger một số nghiên cứu cho biết khi sử dụng nguồn cacbon 1a tinh bột hoạt độ enzym rất thấp Tuy nhiên trên môi trường tỉnh bột ngô 1% chủng Á phoenicis lại phát triển tốt và cho hoạt độ B-glucosidaza cao gấp hai lần so với khi phát triển trên môi trường chứa glucoza (1%), xenlobioza Cũng với chủng A.niger

khi nuôi với xenluloza 5% thì hệ sợi kém phát triển, hoạt độ 8-glucosidaza rất thấp Nhưng khi thêm vỏ cam từ 0,25% đến 1% thì hoạt độ B-glucosidaza tăng (14)

Các nguyên tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp

enzym Các nguyên tố này bao gồm cả nguyên tố vi lượng và đa lượng Các nguyên

tố vi lượng thường là Zn, Fe, Cu, Co Các nguyên tố này thường có trong nước hoặc trong các thành phần hữu cơ khác của môi trường (bột, cao ngô) do đó không

cần bổ sung hoặc bổ sung ở dạng vết Các nguyên tố đa lượng có thể được đưa vào

môi trường nuôi cấy ở dạng muối vô cơ nhưng cần phải tính cả hàm lượng các nguyên tố này đã có sẵn trong các thành phần khác của môi trường

Sinh tổng hợp B-glucosidaza có thể nhờ một số cơ chất cảm ứng như:

xenlobioza, CMC, xeniuloza, cám mì, trấu mì Đối với sinh tổng hợp B-glucosidaza

từ A.niger thì cơ chất cảm ứng tốt nhất là xenlobioza và CMC (16)

Đối với các môi trường nuôi cấy chìm, qúa trình phát triển của các vi sinh vật hiếu khí phụ thuộc vào tốc độ khuấy hay tốc độ sục khí Nếu sục khí hoặc khuấy

quá mạnh sẽ làm nấm mốc A.niger, A.oryzae, A.kawachii không phát triển được và

sự kết tạo hạt (pellet) rất kém, đôi khi còn gây ra sự phá huỷ pellet, dẫn đến khả năng tiết enzym vào môi trường giảm mạnh (18) Nhưng đối với Rhyropus, Mucor

sự hình thành pellet chỉ điễn ra dưới điều kiện sục khí hoặc khuấy mạnh Ngược lại nếu sục khí hoặc lắc nhẹ các pellet hình thành lỏng lẻo và gây ra hiện tượng kết mảng trong dịch nuôi cấy, dẫn tới khả năng tiết enzym ra môi trường rất kém

Lượng giống không chỉ ảnh hưởng tới quá trình phát triển của hệ sợi mà còn

ảnh hưởng tới khả năng tiết enzym vào môi trường Nếu nồng độ giống cao sẽ làm

hệ sợi nấm phát triển mạnh, lượng sinh khối tăng nhanh, do đó khả năng tiết enzym vào môi trường bị hạn chế Ngược lại, hàm lượng giống thấp thì hệ sợi nấm không phát triển được, do đó enzym tiết vào môi trường là rất thấp

1.5 Tách, tỉnh chế và bảo quản enzym

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp tách và tinh chế enzym như: điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel Các phương pháp này dùng kết hợp với các phương pháp như: biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ Sự phối hợp các công đoạn trên cho phép thu được chế phẩm có độ tỉnh sạch cao

14

Trong quá trình tách chiết thu chế phẩm enzym nội bào thường dùng các biện

pháp như siêu âm, enzym cắt đặc hiệu, dung dịch đệm thích hợp Sau đó loại bỏ can ban va protein tạp ra khỏi dịch bằng các biện pháp nói trên

Với các biện pháp trên đã cho phép nhiều tác giả thu được enzym có độ thuần khiết cao Chế phẩm B-glucosidaza tit A.kawachii duoc Kazuhiro [washita va cong

sự tách bằng đệm axetat pH 5,0 với 3 enzym chitinaza, yatalaze va zymolyase Sau

đó kết tủa bằng amonsunfat, điện di trên gel polyacrylamit SDS thu được chế phẩm tinh khiết (16) Còn B-glucosidaza của A.niger dugc Marie-Paule Le Traon-Mason

tách chiết bằng đệm axetat pH 5,0 sau kết tủa bằng amonsunfat 90% độ bão hoà và được tinh chế tiếp tục bằng sắc ký trao đổi ion (19)

Không có một phương pháp tách và tinh chế chung cho các enzym sinh tổng

hợp từ các chủng khác nhau Để xây dựng một quy trình tách và tỉnh chế enzym từ

một chủng nào đó cân phải biết lựa chọn và phối hợp nhiều phương pháp một cách

có hiệu quả nhằm mục đích thu được chế phẩm có độ tỉnh sạch cao

Với bản chất protein nên enzym rất dễ bị biến tính bởi một số tác nhân như nhiệt độ cao, pH quá kiểm hay quá axit Do đó cần phải bảo quản enzym ở điều kiện

nhiệt độ thấp và trong dung dịch đệm có pH thích hợp

Do trong thời gian bảo quản cấu trúc phân tử enzym có thể bị thay đổi bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH Để hạn chế điều này ta có thể bổ sung vào một lượng

muối nhất định Chủ yếu là các muối amonsunfat, nó được sử dụng như một chất

phụ gia cho quá trình ổn định hoá và như một chất làm kết tủa phí hoạt tính Để ổn

định các protein trong dung dịch đồng thời tránh sự kết tủa của enzym thông thường

người ta bổ sung muối cho đạt nồng độ cuối trong khoảng từ 20-400mM, hoặc có thể bổ sung các chất thẩm thấu như các polyol, mono và polysacarit với nồng độ cao

(10-40%) Đường được xem như là chất ổn định tốt nhất nhưng nếu bị cắt mạch

chúng có thể tương tác với các nhóm amin của protein dẫn tới vô hoạt enzym Có thể tránh điều này bằng cách dùng các đường chưa cắt mạch Glycerol là một polyol trọng lượng phân tử thấp và nó là một chất rất tốt cho vi sinh vật phát triển, để tránh được điều này có thể dùng xilytol thay thế cho glycerol Ngoài ra còn có thể sử dụng

dithiothreitol (DTT) từ 0,5-1mM, 2-mercaptoethanol từ 5-20mM để tránh các nhóm

—SH của phân tử enzym bị oxy hoá

Trong quá trình bảo quản chế phẩm enzym rất dễ bị nhiễm khuẩn và phân

giải bởi proteaza Để hạn chế vấn đề này có thể bổ sung một số chất như: sodium

azide (NaN;), thiomersal, PMSF (phenyl-metyl-sulphonyl-florua), EDTA, benzoat

CHUONG II VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vat liéu

Ching vi sinh vật: Nấm mốc Aspergilius niger PBC lay tit bo suu tập giống của Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa

Hà nội Chủng được giữ giống trên thạch nghiêng ở 4°C và thường xuyên cấy

truyền sang môi trường mới 4 tháng một lần

Mơ và Nhân hạt mơ: được lấy từ 2 giống mơ lông và mơ trơn được trồng ở 3 vùng

khác nhau: Sơn La, Định Hóa và Bắc Kạn Mơ được mua tại vườn hoặc ở chợ với các độ chín khác nhau Hạt tách ra từ các loại mơ trên có thể được sử dụng ngay cho việc tách chiết enzym hoặc có thể được phơi khô hay bảo quản lạnh đông tuỳ mục đích nghiên cứu Nhân hạt được lấy ra bằng phương pháp cơ học

thủ công đơn giản

Chế phẩm enzym: pectinex ULTra SP- L (Novo- Industry- Đan Mạch)

pectinex 3XL (Novo- Industry- Dan Mach)

2.2 Môi trường nuôi vỉ sinh vật

* Môi trường giữ giống: môi trường thạch-malt (6+8° bolling, 3% thạch)

* Môi trường hoạt hoá chủng (g/]):

- Dịch khoáng A: (NH),SO, (0,5); KH,PO,3H,O (0,2); MgSO,(0,2); CaC1,.2H;O(0,1); FeSO,.6 H;O (0,001); ZnSO4.7 H,O (0,001)

- Glucoza (10)

- Cao nấm men (0,5)

- pHđầu= 5,5 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 10%, HCI 10%)

* Môi trường cho các thí nghiệm sinh tổng hợp enzym trên hệ thống bình lên men Tương tự môi trường hoạt hoá có bổ sung thêm CMC (0,5g/1), bã mía (8g/1), glucose

(2g/) pHđầu= 5,5

2.3 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất:

- Sử dụng các hoá chất kỹ thuật cho nuôi cấy vi sinh vật

-p-nitrophenyl-B-D-glucopyranoside (Sigma-xác định hoạt độ B-glucozidaza)

- Amygdalin (Sigma),

- Các dung dịch đệm: xitrat, axetat, xitrat-photphat 6 cdc pH khdc nhau

Thiét bi

- Máy đo độ hấp phụ quang (Thermo-Đức)

~ Nồi hấp thanh trùng (Hiclave HV-1 10, Đức)

~ May li tam lanh (Beckman allegra 64R-MY)

- Máy trộn mẫu Certomat MV (Đức)

- Máy nuôi lắc ổn nhiệt, (Đức)

- May do pH S- 0,5 (Trung Quốc)

- Hệ thống bình lên men 2 lit (infors AGCH-4103)

- Máy xay sinh tố

- Máy đồng hoá siêu tốc

- May nghiền siêu âm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hoạt hoá chủng

Lấy 1 đến 2 vòng que cấy của chủng cấy vào 100ml mới trường hoạt hoá sao cho cung cấp một lượng khoảng 10”+10 bào tử Chủng được nuôi ở 30°C với tốc độ lắc 200 v/ph Sau 2 ngày nuôi môi trường này được dùng làm môi trường trung gian

để cấy truyền vào các môi trường khác nhau tuỳ theo mục đích nghiên cứu

Sinh tổng hợp enzym

Để tìm điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym từ A

niger PBC, ching sau khi hoạt hoá 2 ngày được nghiền nhỏ, trộn đều và được cấy

truyền với các tỷ lệ giống, chế độ khuấy và các điều kiện cấp oxy khác nhau Các

thông số của quá trình như nhiệt độ, pH được do trực tiếp trên hệ thống Định kỳ thời gian khác nhau mẫu được lấy ra đi xác định hoạt độ

thuy phan co chat p-NPG tao ra 1pmol p-nitrophenol trong thời gian 1 phút ở pH 4,7

và nhiệt độ 50°C

Cách xác định: Hỗn hợp phản ứng gồm 0,2 ml dich enzym trên và 1ml cơ chất p- NPG 0,05 M được giữ ở 50°C trong 15 phút Dừng phản ứng bằng Iml Na;CO; M lạnh, thêm Iml đệm axetat pH 4,7 Phản ứng kiểm chứng được thực hiện tương tự nhưng dịch enzym được trộn trước với Iml Na;CO; 1M lạnh trong 15 phút rồi mới thêm vào 1ml cơ chất p-NPG 0,05M Lượng p-nitrophenol giải phóng ra được đo trên máy so màu quang điện ở bước sóng 405 nm

Xác định hàm lượng protein theo độ hấp thụ ở bước sóng 280nm

Đo độ hấp thụ của dịch phân tích ở bước sóng 280 và 260 nm với đối chứng

là nước cất khử ion Hàm lượng protein của mẫu được xác định theo công thức do Schleif va Wensink dua ra nam 1981:

Ham luong protein = 1,5 x OD449 - 0,75 x OD 569 (ng/ml)

Tach và thu chế phẩm B-glucosidaza từ canh trường nuôi A.niger PBC

Sau 5 ngày nuôi trên bình lên men 2 lít canh trường nấm mốc được lấy ra ly tâm ở 10000v/ph trong thời gian 20 phút ở 4°C, loại bỏ sinh khối, thu dịch nổi chứa enzym cho các công đoạn làm sạch tiếp theo

Kết tủa bằng amonsunfat va etanol

Cho từ từ amonsunfat hoặc etanol vào dịch enzym thô và khuấy đều đến khi đạt được nồng độ cuối thích hợp Sau khi cho hết amonsunfat hoặc etanoi, ta khuấy tiếp 20 phút để amonsunfat hoặc etanol kết tủa hoàn toàn enzym Để dịch enzym đã kết tủa ở 4°C sau 30 phút (đối với kết tủa cồn), và qua đêm (đối với kết tủa amonsunfat) Sau đó ly tâm tách tủa ở 10000v/ph trong 20 phút ở 4°C Loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa Kết tủa sau ly tâm được hoà tan trở lại bằng đệm axetat 0,05M, ` pH4,8 Đối với kết tủa bằng amonsulfat, tủa sau hoà đệm đem thẩm tích loại muối

(thử lại bằng BaC]; bão hoà ) qua đêm ở 4C

Tinh chế B-glucosidaza bằng sắc kí lọc gel Sephadex G-75

Dựa vào sự khác nhau về kích thước giữa các phân tử, enzym nào có kích thước nhỏ sẽ chui vào các lỗ gel, còn các enzym có kích thước lớn sẽ chuyển động

dọc theo cột xuống Sau đó dùng đệm axeiat đẩy những enzym có kích thước khác nhau ra khỏi cột gel theo thời gian khác nhau

Tiến hành: Kết tủa enzym bằng cồn 75% độ bão hoà, tủa được hoà tan trở lại bằng đệm axetat 0,05M, pH4,8 Sau đem phân tích bằng cột sắc ký lọc gel Cột được đẩy

bằng đệm -axetat, tốc độ dòng chảy 0,3ml/phút, thu 3ml/phân đoạn

Tinh chế ñ-glucosidaza bằng sắc kí trao đổi ion DEAE xeluloza A-50

Dựa vào sự trao đổi ion giữa các protein enzym với các ion của nhựa trao đổi ion Protein enzym nào có khả năng đẩy ion linh động của chất nhựa trao đổi ion mạnh hơn thì sẽ được giữ lại trên cột trước còn những protein nào đẩy ion linh động kém hơn thì được giữ lại trên cột sau Tiếp đến dùng đệm thích hợp hoặc muối trung

tính đẩy enzym ra theo các thời điểm khác nhau

Tiến hành

Các phân đoạn có hoạt tính thu được sau sắc ký Sephadex G-75 tiếp tục được

cho qua sắc ký trao đổi ion DEAE xenluloza Sau đó, cột được đẩy bằng NaCl với

nồng độ tăng dần từ 0-1,5M, tốc độ đòng chảy 0,4ml/phút, thu 4ml/phân đoạn Phần chiết có hoạt độ enzym cao nhất sẽ được giữ lại để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

(ôn nhận và tinh chế enzym /@+giucosidaza từ nhân hạt mơ

20

Phương pháp bảo quản chế phẩm enzym

Dịch enzym sau tủa cồn được bổ sung một số hoá chất bảo quản với nồng độ nhất định Mẫu được lấy ra theo định kỳ đem xác định hoạt độ Các kết quả thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

Khử đắng cho các sản phẩm nước mơ

Dịch quả mơ thu được sau khi sử dụng enzim trích ly pectinex Ultra SP-L va pectinex 3XL được phối chế thành một số dạng nước quả và sử dụng chế phẩm ÿ-

glucosidaza để khử đắng Các mẫu thí nghiệm được bổ sung enzym -glucosidaza

với các nồng độ enzym, thời gian và nhiệt độ tác dụng khác nhau tuỳ theo đặc tính của từng loại sản phẩm (Iiít dịch nước mơ/mẫu) Sau khi xử lý enzym theo các thông số nghiên cứu, các mẫu được nâng lên 85°C trong 2 phút dé vô hoạt enzym Các chỉ tiêu chính như hàm lượng amygdalin còn lại, hàm lượng chất khô hòa tan, hàm lượng axit và các chỉ tiêu cảm quan được xác định sau khi mẫu được làm nguội

CHUONG IIL KET QUA VA THAO LUAN

PHAN 1 CHE PHAM 8-GLUCOZIDAZA TU A NIGER PBC

3.1.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp B-glucozidaza tit A.niger PBC trén may lắc

ngang

Mục đích đặt ra cho phần này là tìm được các điều kiện nuôi cấy thích hợp

cho chung A niger PBC nhằm thu enzym ngoại bào có hoạt độ cao ở nhiệt độ nuôi

và tốc độ lắc cố định tương ứng là 30°C và 200v/ph

Xác định môi trường khoáng thích hợp

Môi trường khoáng là một yếu tố khá quan trọng trong sự tổng hợp enzym của vi sinh vật Trong các môi trường khoáng khác nhau thì khả năng tổng hợp enzym là khác nhau Chủng nghiên cứu được nuôi thử với hai dịch khoáng A và B

(khoáng A sử dụng nguồn nitơ là muối amôn còn khoáng B thay bằng muối nitrat),

nguồn cacbon là glucoza (10%), pH đầu= 5,5; lượng giống: 10% Mẫu được lấy ra

hàng ngày để xác định hoạt độ Kết quả thu được trên hình 1

Hình 1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến quá trình

sinh tong hop B-glucozidaza cia A.niger PBC Kết quả phân tích cho thấy từ ngày thứ 3 trở đi hoạt độ enzym bắt đầu tăng dần

và đạt cực đại vào ngày thứ 8 (à 1,9 U/ml) trong điều kiện dịch khoáng A Đối với trường hợp nuôi với dịch khoáng B khả năng sinh tổng hợp enzym thấp;chỉ đạt 0,4 U/ml vao ngày thứ 9 Nhận xét này này cũng được một số tác giả tìm thấy khi thu

nhận 8 -glucozidaza từ A.niger từ các nguồn thải nông nghiệp [14]

22

Ảnh hưởng của pH dau

Trong nhiều tài liệu đã cho thấy pH đầu luôn là một yếu tố gây ảnh hưởng

lớn đến quá trình sống cũng như sinh tổng hợp enzym của hầu hết vi sinh vật Trong

phần này chủng nghiên cứu được nuôi ở 7 giá trị pH đầu khác nhau: 3,5; 4,0; 4,5 ; 5,0; 5,5 ; 6,0 ; 7,0 Điều kiện nuôi được giữ nguyên như phần trên (nguồn cacbon là glucoza 10%, tỉ lệ giống 10% ) và với môi trường khoáng A Hàng ngày mẫu được lấy ra đem xác định hoạt độ Kết quả được thể hiện trong bảng]

Bảng 1 Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tích luy 6 -glucozidaza

nhau thu được cũng rất khác nhau Với pH đầu= 7,0 hoạt độ enzym hầu như không

có, lượng sinh khối rất ít, ở pH axit hoạt độ enzym không cao, thời gian thu enzym đài (11 ngày) Với pH đầu nằm trong khoảng 4,5+5,5 hoại độ enzym khá cao, lượng

sinh khối tương đối, dịch trong, hoạt lực cao nhất là 6 5,5 (2,1 U/ml) va théi gian thu

nhận chế phẩm ngắn (8 ngày)

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Lượng giống cũng có ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh tổng hợp B -

glucozidaza Để khảo sát lượng giống thích hợp: chủng nghiên cứu được nuôi trong các bình tam giác cỡ 250 ml chứa 100 ml dịch môi trường với lượng giống cấy khác nhau: 5%, 10% và 15% Kết quả phân tích thể hiện ở bảng 3, khi lượng giống ít thì

lượng sinh khối tạo ra cũng ít nhưng điều đó không tỷ lệ với hoạt độ enzym Khi tỉ

lệ giống 10% thì khả năng sinh tổng hợp enzym là cao nhất Còn ở nồng độ 15% thì lượng sinh khối nhiều nhưng hoạt độ enzym thấp Do đó ta sẽ lựa chọn nồng độ 10% cho các lần nuôi sau để thu được hoạt độ enzym cao và giảm được thời gian lên

Bang 2 Ảnh hưởng của lượng giống cấy

Lượng Hoạt Ngày cho hoạt độ Đặc điểm hình thái

giống (%) | độ(U/ml) enzym cực đại

5 1,9 9 Lượng sinh khối ít, địch trong

10 2,1 8 Lượng sinh khối nhiều, dịch trong

15 1,3 8 sinh khốt nhiều nhất, dịch trong

Xác định nguồn cacbon thích hợp ˆ

Thí nghiệm được tiến hành với các nguồn cacbon khác nhau là glucoza

(10%), tỉnh bột tan (10%), bã mía (0,8% bã mía + 0,2% glucoza) Hàng ngày mẫu

được lấy ra đi xác định hoạt độ, kết quả phân tích được trình bày ở hình 2

Kết quả cho thấy với mỗi nguồn cacbon khác nhau thì sự phát triển của hệ sợi

và khả năng sinh tổng hợp B -glucozidaza cũng khác nhau Với nguồn tỉnh bột cho

hoạt độ enzym thấp, lượng sinh khối ít, dịch trong Với nguồn glucoza: sự phát triển

hệ sợi nấm tốt, dịch trong, hoạt độ enzym tương đối, thời gian cho enzym cực đại

24

dài Với nguồn bã mía: sinh khối ở dạng hạt rất ít, chủ yếu đưới dạng dịch, môi trường đục lên do bã mía bị phân huỷ, hoạt độ enzym thu được khá cao (3,3 U/ml),

thời gian thu enzym rút xuống còn 5 ngày

Ảnh hưởng của một số cơ chất cảm ứng

Như phần tổng quan tài liệu đã đề cập, sinh tổng hợp cảm ứng B-glucozidaza

có thể nhờ một số cơ chất như: xenlobioza, CMC, tỉnh thể xenluloza, cám mì, trấu

mì, bã củ cải đường, sợi lanh, giấy lọc Để xác định hiệu ứng này cho j- glucozidaza của Aspergillus niger PBC, một số cơ chất được bổ sung vào môi trường

nuôi như: xenlobioza, CMC, œ-xenluloza ở nồng độ 0,5g/1, các điều kiện khác tương

tự như trên Sau 5 ngày nuôi cấy, hoạt tính enzym của các mẫu được xác định và

đem so sánh với mẫu kiểm chứng (môi trường không bổ sung cơ chất cảm ứng) Kết quả bảng 4 cho thấy xenlobioza là cơ chất cảm ứng mạnh nhất cho quá trình sinh

tổng hợp B-glucozidaza của chủng nghiên cứu, tăng gần 150% so với trường hợp không có cơ chất cảm ứng, tiếp đến là CMC tăng 136% và cuối cùng là œ-xenluloza tăng 108%

Bảng 3 Ảnh hưởng của các cơ chất cảm ứng tới sự tổng hợp

B-glucozidaza của Aspergilius.niger PBC

Từ các kết quả phân tích trên ta có thể rút ra được điều kiện nuôi cấy cho

chủng A.miger PBC trên máy lắc ngang để thu chế phẩm ÿ -glucozidaza như sau:

Môi trường khoáng: sử dụng nguồn nitơ là (NH,);SO,„, pH đầu: 5,5

Lượng giống cấy truyền: 10%, Cao nấm men (0,05%)

Nguồn cacbon: bã mía (0,8%), Cơ chất cảm ứng: CMC (0,05%)

Nhiệt độ nuôi = 30°C, Tốc độ lác = 200v/ph,

Thời gian thu chế phẩm: 5 ngày

3.1.2 Nghiên cứu sinh tổng hợp ð-glucosidaza trên hệ thống lên men 2 lít

Để có thể thu được một lượng lớn chế phẩm enzym đáp ứng cho các ứng dụng

sau này quá trình sinh tổng hợp enzym thường phải tiến hành trên các hệ thống bình lên men có dung tích lớn hàng vài chục đến hàng trăm lít Trên các hệ thống này

điều kiện cấp khí thường bằng bơm sục khí kết hợp với hệ thống cánh khuấy do vậy

tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng tích luỹ enzym của vi sinh vật cũng sẽ bị sai khác chút ít so với khi nuôi trên máy lắc ngang Do vậy mục đích của phần này là

nhằm nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym- cao

trên hệ thống bình lên men 2 lít

Dựa trên các kết quả thu được ở trên, một số các điều kiện về môi trường :uôi

như nguồn cacbon (bã mía), nguồn nitơ (nitrat amon), các muối khoáng, pH đầu được giữ nguyên để khảo sát ảnh hưởng của một số thông số như tốc độ khuấy, độ cấp khí và hàm lượng giống tới khả năng thu nhận enzym của chủng nghiên cứu

Kết quả thử nghiệm cho thấy khi khuấy ở tốc độ ¡00 v/ph sau 4 ngày nuê: hoạt

độ B-glucosidaza cao hơn so với ở 240 v/ph Điều này có thé là do khi khuấy quá

mạnh sẽ làm hệ sợi bị phân rã, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triể:: sủa

vi sinh vật, sự tạo thành hạt hầu như không có, do đó khả năng tiết enzym vào môi trường của vi sinh vật thấp hơn so với khi khuấy ở tốc độ vừa phải

tới quá trình sinh tổng hợp j-glucosidaza từ.A.niger:PBC:-

Qua hình:4-ta thấy độ cấp khí có ảnh hưởng.rõ.rệt đến quá trình sinh-t6ng:iop* - enzym Ở độ cấp khí 60% độ bão hoà sau 4 ngày nuôi hoạt độ enzym đã đạt cực đại

và cao hơn so với chế độ cấp khí ở 40% độ bão hoà (3,4 U/ml va 2,6 U/ml tương

ứng) Điều này có thể được giải thích như sau: ở độ cấp khí nhỏ sẽ làm hệ sợi kém phát triển, sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật rất chậm, do đó khả năng tích -

tụ enzym của vi sinh vật rất kém Còn ở độ cấp khí cao sự phát triển của hệ sợi rất mạnh, sinh khối phát triển nhanh, dẫn tới khả năng tích tụ enzym thuận lợi on nữa

ở độ cấp khí cao hoạt độ B-glucosidaza tăng mạnh đến thời điểm cực đại, trong khi

đó ở độ cấp khí thấp hoạt độ B-glucosidaza tăng rất chậm đến thời điểm cực đại

Khảo sát hàm lượng giống thíchhợp ˆ

Để khảo sát hàm lượng giống thích hợp các mẫu được thử nghiệm với các tý lệ giống cấy truyền khác nhau là 2, 5 và 10% (các điều kiện khác được giữ nguyên) Mẫu được lấy ra định kỳ ở các thời điểm khác nhau và đem xác định hoạt độ Kết

quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 5

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng giống có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzym Ở hàm lượng giống 5% sau 5 ngày nuôi thu được hoạt độ ÿ-

glucosidaza cao nhất Điều này có thể là do ở hàm lượng giống lớn dẫn tới sự sinh

trưởng và phát triển của vi sinh vật rất mạnh mẽ, sinh khối tăng nhanh do đó khả năng tiết enzym vào môi trường kém Ngược lại nếu hàm lượng giống thấp sự phát triển của vi sinh vật rất chậm, sinh khối ít, dẫn tới khả năng tích tụ enzym kém

3.5 3¬

2.5 +

24 1.5 5

Thời gian (ngày)

Hình 5 Ảnh hưởng của lượng giống

đến quá trình sinh tổng hop B-glucosidaza tir A.niger PBC

Hơn nữa ở hàm lượng giống 5% hoạt độ B-glucosidaza tăng mạnh đến thời điểm cực đại, còn ở hàm lượng giống 10% hoạt độ B-glucosidaza tăng rất chậm đến thời điểm cực đại, trong khi đó ở hàm lượng giống 2% hoạt độ cao nhất đạt được ở ngày nuôi thứ 4 Do đó hàm lượng giống 5% sẽ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Động thái quá trình sinh tổng hợp B-glucosidaza từ A.miger PBC trên hệ thống

lên men 2 lít

28

Ching nghién cttu được nuôi theo các điều kiện thích hợp vừa tìm được ở

trên Định kỳ 24h mẫu được lấy ra đem xác định hoạt độ, và sinh khối (qua OD), giá

trị pH được tự động đo trên máy Kết quả được thể hiên trên hình 6

Quan sát sự biến động pH môi trường cho thấy trong ngày nuôi đầu pH giảm

từ 5,5 xuống 3,7 rồi tăng trở lại trong khoảng 4 đến 5 ở ngày nuôi thứ 2, 3, pH tiếp tục tăng ở các ngày nuôi tiếp theo Đồng thời với sự tăng pH hoạt độ enzym cũng tăng, đạt cực đại ở ngày nuôi thứ 4 (3,3U/ml) Điều này có thể do pH ở ngày nuôi thứ 4 trong khoảng 5 đến 5,4 thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym của chủng nghiên cứu Tuy nhiên sang đến ngày nuôi thứ 6 hoạt độ enzym:' giảm mạnh trong khi đó pH vẫn tiếp tục tăng trong 2 ngày nuôi tiếp theo

Hiện tượng hoạt độ enzym bị giảm nhanh sau thời điểm cực đại thường thấy ở

nhiều chủng vi sinh vật và được giải thích bởi nhiều lý do khác nhau Có thể là do

pH môi trường lúc này cao hơn khoảng pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp ÿ-

glucosidaza của chủng nghiên cứu ảnh hưởng đến quá trình tiết enzym ra môi trường

hoặc có thể là do pH môi trường lúc này cao, do đó gây biến tính protein enzym

khiến cho hoạt độ enzym giảm mạnh sau thời điểm cực đại

Hình 6 Động thái quá trình sinh tổng hợp B-glucosidaza từ A.miger PBC

3.1.3 Nghiên cứu tách và làm sạch B-glucosidaza từ cach trường nuôi A.mger PBC

Tuỳ thuộc vào mục đích sử dụng khác nhau, chế phẩm enzym có thể được sử dụng trực tiếp từ canh trường nuôi cấy (phân huỷ rơm, rạ ) hoặc dưới dạng chế

phẩm kỹ thuật hay tinh khiết (chế biến thực phẩm, được phẩm ) Mục đích nghiên

cứu của phần này nhằm tim các điều kiện thích hợp để tách và tỉnh sạch enzym khỏi dịch nuôi cho hiệu suất thu hồi cao

Trước tiên enzym được tách khỏi dịch nuôi bằng ly tâm ở 8000v/ph trong thời gian 20 phút ở 4°C, thu lấy dịch trong, loại bỏ cặn lắng Enzym trong dịch trong tiếp

tục được thử kết tủa bằng hai loại dung môi khác nhau

Kết tủa bằng sunfat amôn

Sunfatamôn tính thể được cho từ từ vào dịch enzym thô, khuấy đều đến khi

đạt được nồng độ cuối thích hợp Để dịch ở 4°C, qua đêm cho kết tủa hết:protein

enzym

Dịch enzym được ly tâm ở 8000v/ph trong 20 phút ở 40C Loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa Kết tủa enzym thu được sau li tâm được hòa tan trở lại bằng đệra z;:>:aL 0,05M, pH = 4,7 sau đó thẩm tích loại muối bằng màng bán thấm Thử nghiệm

được tiến hành với 5 nồng độ muối bão hoà khác nhau: 65, 70, 75, 80, 85% Kết

quả được thể hiện ở bảng 4

Bảng 4 Ảnh hưởng của nông độ amonsunfat

đến kha nang thu hdi B-glucosidaza

"Thử nghiệm với etanol

Thử nghiệm được tiến hành với 5 độ bão hào của cồn khác nhau 65, 70, 75,

80, 85% (v/v) Kết quả được thể hiện ở bảng 5

30

Bảng 5 Ảnh hưởng của nông độ côn đến khả năng thu hồi B-glucosidaza

Kết quả thí nghiệm cho thấy: kết tủa ở nồng độ cén 80% (v/v) cho hiệu suất

thu hồi cao nhất nhưng hoạt tính riêng lại thấp hơn kết tủa ở nồng độ 75% (v/v) Hơn nữa hoạt độ riêng khi kết tủa bằng cồn đạt cao hơn so với kết tủa bằng

amonsunfat (1,56 so với 1,27) do đó kết tủa bằng cồn được lựa chọn cho các thí

nghiệm tiếp theo

Tỉnh chế B-glucosidaza trên các cột sắc ký

Trên cơ sở các quy trình tỉnh sạch B-glucosidaza đã được công bố và kết quả khảo sát trên một số cột lọc gel khác nhau ( Sephadex G-150 và G-75) Chế phẩm enzym thu được sau kết tủa cồn ở 75% được hoà tan trở lại trong đệm axetat 0,05M, pH4.8 theo tỷ lệ 1:3 và cho qua cột lọc Sephadex G75 ( đường kính 19 mm, chiều cao 260 mm) Rửa giải bằng đệm trên với tốc độ 0,3 ml/ph, mỗi phân đoạn thu 3 ml

Kết quả cho thấy protein bị đẩy ra ngay từ các phân đoạn đầu tiên và hoạt tính B-glucosidaza có giá trị cao tập trung ở phân đoạn 2 đến 6 và có một đỉnh ở

phân đoạn thứ 3 (hình 7)

Các phân đoạn có hoạt tính 8-glucosidaza cao thu được sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 được tập trung lại và cho qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE

xenluloza A-50 (đường kính 19 mm, chiều cao 260 mm) Rửa giải bằng NaCl, nồng

độ tăng từ 0 đến 1,5M, với tốc độ dòng 0,4ml/phút, mỗi phân đoạn thu 4ml Kết quả hình 8 ta thấy protein bị đẩy ra tại nồng độ NaCl từ 0,5-0,6M, hoạt tính ÿ- glucosidaza có giá trị cao tập trung từ phân đoạn I1 đến 15 và đỉnh ở phân đoạn 13

có hoạt độ riêng thuỷ phân p-NPG là 44,05U/mgPr, với độ sạch gấp 80 lần so với hoạt độ B-glucosidaza trong dịch thô và hiệu suất thu hồi đạt 40%

32

Kết quả phân tích cho thấy, chế phẩm enzym trong dịch nuôi cấy sau khi qua

các bước kết tủa bằng cồn, và 2 qua hai cột sắc ki Sephadex G75 va DEAE xeluloza

A50 độ tỉnh sạch tăng lên được 80 lần với hiệu suất thu hồi 40% (bảng 6)

Bảng 6 Hiệu suất thu hỏi và mức độ làm sạch B- glucosidase

Sau sac ky Sephadex | 66,6 | 12831 | 19,25 35 73

Sau sắc ký DEAE xeluloza A50 11/7 513,2 44,05 80 40

Từ các kết quả phân tích trên ta có thể tóm tắt qui trình tách và làm sạch chế

phẩm -glucosidaza từ A niger PBC như sau: (2 ⁄ a đa

Dịch lên men

‡

Ly tâm 10000v/ph trong 20 phút, ở 4°C

1 Dich trong

+ Sac ky DEAE xenluloza A-50

Ỷ

Chế phẩm beta-glucosidaza tinh sạch