Nghiên cứu ứng dụng qui trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc sinh máu sử dụng cho ghép tủy đồng loài

Nhiều kết quả về nguồn cung cấp tế bào gốc đã được ứng dụng như dịch tuỷ xương, máu ngoại vi huy động, máu cuống rốn.Các nguồn này đã được áp dụng khá rộng rãi cho ghép tự thân hoặc đồng

sử dụng cho ghép tuỷ đồng loài

Chủ nhiệm đề tài : GS TSKH Đỗ Trung Phấn

Cơ quan chủ trì : Viện Huyết học - Truyền máu TW

Viện trưởng: PGS TS Nguyễn Anh Trí

7596

20/01/2010

Hà Nội, 11/ 2008

- PGS.TS Phạm Quang Vinh, Chủ nhiệm môn Huyết học Truyền máu

Đại học Y Hà Nội, Phó Viện trưởng Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

đã hết sức ủng hộ và cung cấp cho đề tài các tài liệu quý giá, trực tiếp góp phần nâng cao tính cập nhật của nghiên cứu này

- Lãnh đạo Quân y Viện 108 đã tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu của Quý Viện thực hiện nhánh của đề tài

- Vụ Khoa học Đào tạo - Bộ Y tế đã hết sức ủng hộ và cho phép kéo dài thời gian nghiên cứu để đề tài thực hiện mục tiêu góp phần vào công tác đào tạo cán bộ sau đại học, thực hiện đề cương nghiên cứu của nghiên cứu sinh Nguyễn Quang Tùng

- Viện Huyết học Truyền máu Trung ương đã tạo mọi điều kiện về trang

bị, cơ sở làm việc cho đề tài thực hiện nhiệm vụ

- Bộ môn Huyết học Truyền máu đã giúp đỡ và cùng tạo mọi điều kiện

hỗ trợ cho chủ nhiệm đề tài khi đã nghỉ chế độ

- Cảm ơn tất cả mọi đồng nghiệp đã giúp đỡ cho đề tài hoàn thành Tuy

có kéo dài thời gian nhưng có hiệu quả

Thay mặt nhóm nghiên cứu xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2008

Chủ nhiệm đề tài

GS.TSKH Đỗ Trung Phấn

Danh sách

Các thành viên tham gia nghiên cứu

Chủ nhiệm đề tài : GS TSKH Đỗ Trung Phấn

Th− ký đề tài : ths nguyễn Quang Tùng

Cán bộ nghiên cứu Chức danh khoa học

1 Đỗ Trung Phấn GS TSKH (Viện HHTMTW)

2 Nguyễn Quang Tùng ThS Y khoa (Đại học Y HN)

3 Trần Thị Mỹ Dung ThS Y học (Đại học Y HN)

4 Nguyễn Thị Thu Hà PGS TS (QY 108)

5 Lê Xuân Hải TS (Viện HHTMTW)

6 Lý Tuấn Khải TS (QY 108)

7 Nguyễn Tiến Hải BSCKI (QY 108)

8 Trần Hồng Thủy BSCKII (Viện HHTMTW)

Với sự hỗ trợ của tập thể cán bộ công nhân viên Viện Huyết học Truyền máu, và bộ môn HHTM, Đại học Y Hà Nội

Đặt vấn đề

Tế bào gốc- một vấn đề lớn của nhân loại thế kỷ XXI Tế bào gốc đang

được nhiều nước tiên tiến trên thế giới như Anh, Mỹ , Nhật quan tâm và đầu tư nghiên cứu Nhiều kết quả về nguồn cung cấp tế bào gốc đã được ứng dụng như dịch tuỷ xương, máu ngoại vi huy động, máu cuống rốn.Các nguồn này đã

được áp dụng khá rộng rãi cho ghép tự thân hoặc đồng loài điều trị các bệnh máu ác tính hoặc bệnh di truyền Riêng về máu cuống rốn – một nguồn vô tận, chất lượng tốt nhưng vì số lượng ít không đủ liều tế bào gốc dùng cho người lớn nên việc sử dụng còn gặp khó khăn

Gần đây một số nhà nghiên cứu đã có sáng tạo khắc phục khó khăn trên như đã thành công sử dụng tế bào gốc MCR nuôi cấy ngoài cơ thể (ex – vivo expansion) tạo ra một lượng lớn tế bào gốc đủ liều điều trị cho người lớn [43, 75] Tuy nhiên để thực hiện được điều này cần có ngân hàng với hàng ngàn mẫu để chọn lựa

Một hướng khác, hiện đại hơn là nuôi cấy dài ngày tế bào gốc “ Trùm”

từ biểu mô của màng nhau thai [56], tế bào biểu mô và trung mô của màng lót dây rốn tạo ra tế bào gốc chuyên biệt cho các cơ quan khác ngoài cơ quan tạo máu như tim, tuỵ, thần kinh, xương [10, 71] Đây là hướng mới đang có nhiều triển vọng

Trong nước đã có một số cơ sở nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu cho điều trị bệnh như bệnh viện TM - HH TPHCM, bệnh viện TW Huế, bệnh viện QĐ 108, viện HH - TM TW, bệnh viện Nhi TW, các nghiên cứu này chủ yếu ứng dụng điều trị các bệnh máu như Lơ xê mi, đa u tuỷ, u lympho, một số bệnh nhân bị bệnh di truyền (Thalassemia [3,5,9] Gần đây bộ KHCN đã phê duyệt chương trình nghiên cứu tế bào gốc từ màng lót dây rốn, công trình chuyển giao công nghệ của GS Phan Toàn Thắng - Đại học Singapore, do xí nghiệp Dựơc phẩm II thành phố HCM chủ trì, đề tài ứng dụng tế bào gốc máu huy động và tuỷ xương điều trị một số bệnh xương khớp do bệnh viện TWQĐ

108 phụ trách, đề tài tế bào gốc ứng dụng điều trị tim mạch do đại học Y Hà Nội phụ trách

Để phục vụ cho nghiên cứu tế bào gốc, việc nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào gốc là cần thiết, đặc biệt là ngân hàng máu cuống rốn Đây là nguồn vô tận, bỏ đi nhưng dễ thu hoạch Trên thế giới đã có hàng trăm ngân hàng máu cuống rốn, các ngân hàng đó đã lưư trữ được hàng vạn mẫu máu cuống rốn đã được sàng lọc và loại bỏ các bệnh nhiễm trùng, di truyền, đã xác

định được Phenotype HLA, nhóm máu ABO, tạo ra nguồn lựa chọn tối ưu cho

điều trị HLA đóng vai trò quyết định thành công của ghép, nếu có nguồn người cho tương đồng 6/6 hoặc 5/6 phenotype thì tiên lượng thành công rất cao Chính vì lẽ đó việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc và thực hiện trao đổi quốc tế trong khu vực và thế giới thì tần suất tìm được nguồn cho tương đồng

là rất lớn, kết quả ghép tế bào gốc càng cao

ở Việt Nam, bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh đã có ngân hàng máu cuống rốn từ 2005, hiện đã chọn được >1400 mẫu, bước đầu

đã sử dụng ghép đồng loài cho 5 bệnh nhân Thalasemia có kết quả[9] ở miền Bắc có một số nơi áp dụng ghép tế bào gốc, nhưng chưa có ngân hàng tế bào gốc Do đó viện Huyết học-Truyền máu TW đã có kế hoạch xây dựng ngân hàng tế bào gốc cung cấp cho điều trị

Xuất phát từ yêu cầu trên đây năm 2002, mặc dù có rất nhiều việc làm cho chương trình an toàn truyền máu (dự án WB), trang thiết bị thiếu thốn, cơ

sở chật hẹp, nhưng chúng tôi đã đề nghị Bộ Y tế xét duyệt đề tài này nhằm góp phần chuẩn bị các điều kiện về kỹ thuật và cán bộ cho xây dựng ngân hàng tế bào gốc tại Viện Huyết học-Truyền máu TW phục vụ cho khu vực phía Bắc, với 2 mục tiêu sau đây:

1 Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, làm sạch và bảo quản tế bào gốc máu ngoại vi huy động, tuỷ xương, máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế bào gốc đồng loài

2 Nghiên cứu đánh giá kết quả bảo quản dài ngày tế bào gốc ở nhiệt độ

-1960C

Chương 1

Tổng quan

1 Tế bào gốc (Stem cells)

Danh từ tế bào gốc có từ trên 60 năm nay, kể từ khi nghiên cứu thành công tạo colony tế bào lách (CFU-S) trong nghiên cứu tạo máu ở chuột (1950).Từ đó dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật: hình thái học, hoá tế bào, miễn dịch, lai phân tử huỳnh quang, PCR, Rt-PCR, nuôi cấy tế bào người ta đã phân lập và biết được quá trình phát triển của cơ thể người và động vật bắt đầu từ tế bào gốc “trùm” (gangleader- stem cells) hay còn gọi là tế bào gốc nguyên thuỷ (primitive stem cells) hay tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells).[11,21,72,80]

1.1 Tế bào gốc “trùm”( Totipotent stem cells)

1.1.1 Đặc điểm tế bào gốc “trùm”:

- Có khả năng tự tái sinh để duy trì nguồn gốc của chúng

- Có số lượng rất ít nhưng có khả năng sinh sản lớn

- Chưa có dấu ấn riêng biệt để có thể nhận biết

- ở điều kiện bình thường chúng ở trạng thái nghỉ ngơi, không quay vòng (noncycling), nhưng khi có kích thích từ môi trường chúng sinh sản và biệt hóa rất nhanh để tạo ra các tế bào kế cận, các tế bào kế cận này là tế bào gốc của các cơ quan riêng biệt [21,80], lúc này chúng mới có các dấu ấn riêng có thể nhận biết đựơc, ví dụ tế bào gốc cơ quan tạo máu có dấu ấn CD34 đây là dấu ấn riêng đầu tiên của tế bào gốc tạo máu, kể từ khi tách khỏi tế bào gốc nguyên thuỷ, đồng thời đó cũng là “tế bào gốc nguyên thuỷ” hay “tế bào gốc trùm “(primitive hematopoietic stem cells) của cơ quan tạo máu

- Cũng như các tế bào khác, tế bào gốc “trùm” cũng có quá trình già tự tiêu huỷ (Apotosis)

- Trong cơ thể người và động vật tế bào gốc “trùm” có mặt ở tất cả các vị trí: tuỷ xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn, giác mạc, não cơ tim, xương,

gan, da ở đây chúng vừa là tế bào dạng “nghỉ ngơi”, vừa là dạng tế bào

“thường trực” để khi cần thiết có nhu cầu chúng sẽ biệt hoá thành các tế bào gốc kế cận tạo ra các tế bào chức năng [72]

1.1.2 Xếp loại và danh pháp tế bào gốc “trùm” (H.1)

Có 2 phương pháp[21]:

a) Theo khả năng sinh sản và biệt hoá

* TBG toàn năng: tế bào gốc “trùm” (gangleader- stem cells) hay còn gọi

là tế bào gốc nguyên thuỷ (primitive stem cells) hay tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells) điều hoà chung sự phát triển của cơ thể, tạo ra tế bào gốc của tất cả các cơ quan trong cơ thể

* TBG đa năng (pluripotent stem cells hay multipotent stem cells) là TBG “trùm” của các dòng tế bào riêng biệt thuộc cùng 1 cơ quan, như cơ quan tạo máu, cơ tim, xương, tuyến tuỵ

* TBG đơn năng (Unipotent stem cells) hay còn gọi là TBG đầu dòng, chỉ sinh ra 1 dòng tế bào nhất định (ví dụ dòng hồng cầu: CFU-E)

b) Theo hướng phát triển phôi

* TBG phôi: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tế bào gốc phôi, tương tự nhu tế bào gốc “trùm” đã mô tả ở trên, khi nuôi tổ chức bào thai trong môi trường có các chất kích thích tăng trưởng như IL-3, Transferrin, Albumin, Retinoic acid, erythropoietin tế bào gốc phôi đã phát triển thành các tế bào máu như HC, bạch cầu , tiểu cầu [77,79] Tương tự như vậy, các nhà nghiên cứu đã thành công khi xây dựng mô hình biến tế bào phôi bất động thành tế bào cơ tim có thể co bóp được (59).Tế bào gốc phôi cũng có thể biến thành tế bào biểu mô sắc tố võng mạc, và nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp chúng sẽ biệt hoá thành tế bào có khả năng cảm thụ ánh sáng [73]

* TBG thai: Gần đây Phan Toàn Thắng đã phân lập thành công và nuôi tế bào gốc từ màng đáy dây rốn trẻ sơ sinh trong môi trường thích hợp đã tạo ra

được tế bào tuyến tuỵ và tế bào thần kinh trưởng thành [71]

* TBG trưởng thành: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, tế bào gốc trưởng thành không chỉ có khả năng taọ tế bào gốc cho chính vị trí chúng cư trú mà cho cả các nơi khác Ví dụ tế bào gốc tách từ tuỷ xương có thể biệt hoá thành cơ tim, thành tế bào thần kinh[52]

1.2 Tế bào gốc tạo máu(memopoietic stem cells: HSC)

1.2.1 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu

HSC là các tế bào được tách ra từ tế bào gốc “trùm”, chúng có đặc điểm sau:

- Có khả năng tự tái tạo (self renewal) để tự duy trì nòi giống của chúng nhưng chỉ có tế bào gốc toàn năng có dấu ấn CD34 mới có khả năng này

- Chúng có dấu ấn đặc hiệu CD34 có thể nhận biết được

- Có khả năng sinh sản và biệt hoá thành tất cả các tế bào máu trưởng thành

TBG tạo máu

TBG tuỷ

TBG xương

TBG cơ

tim

Mỗi cơ quan có TBG "Trùm" riêng, dưới tế bào gốc

"Trùm" là các tế bào gốc kế cận: TBG đa năng, tế gào

gốc đơn dòng, tế bào chức năng

H.1 Sơ đồ tóm tắt phân loại và tên gọi tế bào gốc

- Có khả năng phát triển và phục hồi tạo máu ở cơ thể khác đã chiếu xạ liều chí tử

- Tế bào HSC có số lượng rất thấp, trong tuỷ xương chúng có khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào tuỷ ở trạng thái bình thường

- HSC là tế bào nghỉ ngơi không hoạt động, nhưng ở bất kỳ thời điểm nào

có tác nhân kích thích như nhiễm trùng, chảy máu cấp, hoá chất, chúng sẽ đáp ứng, nhanh chóng phân chia biệt hoá

- Với các tác nhân gây đột biến, HSC có thể trở thành tế bào ác tính (leukemia ) chúng sinh sản rất nhanh, nhưng không biệt hoá hoặc biệt hoá không bình thường (leukemia kinh hoặc rối loạn sinh tuỷ)

- Tế bào HSC có thể giảm sinh hoặc vô sinh gặp trong bệnh giảm sinh hoặc suy tuỷ xương

- Cũng như các tế bào khác, HSC có quá trình già tự tiêu huỷ (Apotosis) [11,33]

1.2.2 Xếp loại và tên gọi tế bào gốc tạo máu (HSC) (H.2)

Trên cơ sở đặc điểm về khả năng phân chia (Proliferation) và biệt hoá (differentiation) của HSC, có thể xếp HSC thành 3 nhóm như sau:

- Tế bào gốc tạo máu toàn năng hay tế bào gốc “trùm” tạo máu (Pluripotential HSC) thí dụ CFU – S Tế bào này có khả năng tạo ra tất các tế bào gốc kế cận của tế bào máu trưởng thành

- Tế bào gốc đa năng (multipotent) thí dụ CFU- GEMM , CFU- L, tế bào này có khả năng tạo ra nhiều (nhưng không phải tất cả) tế bào gốc kế cận thuộc 2 nhóm tuỷ và lymepho, còn gọi là tế bào gốc định hướng

- Tế bào gốc đơn năng (unipotent) thí dụ: CFU – E, CFU – G, CFU – M, CFU – T, tế bào này chỉ có khả năng tạo ra một dòng tế bào chuyên biệt (dòng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu ) nên còn gọi là tế bào gốc đầu dòng (H.2) Tất cả tế bào gốc tạo máu đều có thể nhận biết bằng dấu ấn (CD) Thí dụ, tế bào gốc “trùm” tạo máu CFU-S có CD34+; tế bào gốc đa năng (CFU- GEMM) có

CD33+, CD34+ , tế bào gốc dòng lympho có CD7+, CD34+ Tế bào gốc đơn năng (đầu dòng) dòng hồng cầu có CD38+, CD71+, dòng mẫu tiểu cầu có CD16+,

CD61+, dòng bạch cầu hạt có CD33+, CD13+, dòng mono CD33+, CD14+[58,79]

Hình 2: Sơ đồ tóm tắt quá trình sinh sản và biệt hoá của tế bào gốc

1.2.3 Các nguồn cung cấp tế bào gốc tạo máu

* Tuỷ xương:

Nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép được thu thập từ tuỷ xương, từ máu ngoại vi, máu cuống rốn và gan phôi (nguồn này hiện mới chỉ được ứng dụng trong các thử nghiệm in vitro, chưa được trong các nghiên cứu lâm sàng) Nguồn cung cấp tế bào định hướng tạo máu được sử dụng cho ghép đầu tiên là từ tuỷ xương của người cho Trong 20 năm qua nguồn cung cấp chính

tế bào gốc cho ghép là tuỷ xương Tế bào CD34 trong tuỷ xuơng chiếm khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân trong tuỷ Tuy nhiên một hạn chế lớn của tế bào gốc tuỷ xương là chọc hút tủy phải gây mê và bệnh nhân phải nằm viện khoảng 1 tuần, ngoài ra nếu phải truyền máu thì có thể lây nhiễm các bệnh qua đường truyền máu (tự thân)

Hiện nay, nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương chủ yếu được sử dụng cho ghép

đồng loại, hoặc trong một số trường trường ghép tự thân nhưng không thể huy

động được TBG ra máu Không có nguy cơ lẫn tế bào ung thư (tumor – free graft), đồng thời cung cấp khả năng miễn dịch chống ung thư Những bệnh lý chính được chỉ định kiểu ghép này bao gồm bệnh lý có tổn thương tủy xương, suy giảm miễn dịch, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh hoặc bệnh lý huyết sắc tố Nguồn tế bào sử dụng ghép có thể thu thập từ tuỷ của người cho hoà hợp toàn bộ hoặc một phần, có hoặc không có liên hệ huyết thống Một số ngân hàng dữ liệu về tuỷ xương đã được thiết lập trên khắp thế giới, trong đó lớn nhất là chương trình người hiến tuỷ quốc gia Mỹ, hàng năm có trên 2000 trường hợp được tiến hành ghép (10)

* Nguồn tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi

Đây là nguồn tế bào định hướng tạo máu từ tuỷ xương, được huy động ra máu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trưởng, thường

sử dụng G – CSF (Filgrastime) có kèm theo hoặc không kèm theo hoá trị liệu Các tế bào gốc ra máu sẽ được thu thập bằng cách gạn bạch cầu Thu hoạch tế bào gốc ở máu ngoại vi không cần gây mê, ít thô bạo và trong chế phẩm để ghép chứa ít tế bào ung thư hơn so với thu tế bào gốc từ tuỷ xương trong ghép

từ tuỷ xương Các nghiên cứu lâm sàng so sánh khi sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi với sử dụng tế bào gốc từ tuỷ cho thấy: kết quả mọc ghép sớm hơn, khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến biến chứng ghép ở nhóm sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi thấp hơn, nguy cơ xuất hiện bệnh ghép chống chủ tương đương ở cả hai nhóm [69,80] nhưng bệnh ghép chống chủ mạn lại gặp nhiều hơn ở bệnh nhân nhận tế bào gốc máu ngoại vi huy động[69]

* Nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn

Năm 1989, lần đầu tiên tiến hành ghép thành công tế bào gốc máu cuống rốn cho bệnh nhi Fanconi, và đến nay hàng nghìn trường hợp ghép đã được tiến hành để điều trị bệnh máu ác tính và không ác tính[ 41]

Trong khoảng 15 năm trở lại đây máu cuống rốn đã và đang trở thành nguồn quan trọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài Đây là một nguồn cung cấp tế bào gốc rất lớn đáng lẽ bỏ đi, dễ thu hoạch Trong máu cuống rốn rất

giàu tế bào định hướng tạo máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early and committed progenitor – cells ); số lượng tế bào CD34 từ 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân, có khả năng sinh sản gấp 2 lần tế bào gốc tuỷ và máu ngoại vi người trưởng thành [ 37,42] nhưng có nhược điểm là lượng thu được nhỏ, liều tế bào gốc chỉ đủ ghép cho trẻ em< 10 tuổi Tuy nhiên gần đây một

số tác giả đã dùng tế bào gốc “pool” của 2 mẫu máu cuống rốn có gen HLA tương đồng [49,81] do đó có thể dùng cho cả người trưởng thành Nhưng muốn làm được điều này cần có một lượng lớn máu cuống rốn để lựa chọn

Đây là mục tiêu của việc xây dựng ngân hàng máu cuống rốn Xu hướng hiện tại của các nghiên cứu về tế bào gốc trong máu cuống rốn tập trung vào các vấn đề:

1.Tính an toàn và hiệu quả của ghép tế bào từ máu cuống rốn,

2 Khả năng sử dụng cho ghép TBG người lớn,

3 Mở rộng phạm vi ghép không hoà hợp HLA nhưng vẫn duy trì tính an toàn và hiệu quả mọc ghép

Các nghiên cứu lâm sàng ở những trẻ nhận tế bào gốc từ người cho không có liên quan huyết thống cho thấy nguy cơ xuất hiện GVHD thấp hơn ở nhóm nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn so với ghép tế bào gốc từ tuỷ xương

Điều này phù hợp với số lượng thấp của T lympho trưởng thành ở máu cuống rốn Thời gian phục hồi các dòng tế bào tạo máu cũng có khác nhau, đối với ghép tế bào từ máu cuống rốn, dòng bạch cầu hạt hồi phục sau 26 đến 27 ngày, dòng tiểu cầu sau 60 ngày, trong khi đó, nếu ghép tế bào gốc từ tuỷ xương thì thời gian hồi phục bạch cầu hạt và tiểu cầu lần lượt là 18 đến 19 ngày và 29 ngày [32,69]

* Tế bào gốc từ gan bào thai người:

Gan bào thai người ở tuần thứ 10-22 là nguồn cung cấp tế bào gốc có giá trị [12] Tác giả đã chứng minh ở giai đoạn này gan của phôi chứa chủ yếu là

tế bào máu và tạo máu, ở thời kỳ này tế bào gan còn ít việc phân lập tế bào gốc tạo máu thuận lợi Tế bào gốc gan phôi có một số đặc điểm đáng chú ý: chúng có khả năng sinh trưởng rất nhanh, T lympho ít, hệ HLA phát triển chưa

hoàn chỉnh [ 12,46] Tuy nhiên tế bào gốc gan phôi bị hạn chế vì nó liên quan đến vấn đề y đức, mặc dù ta chỉ thu thập các thai, phần bỏ đi của cuộc đẻ chưa đủ tháng Uphoff (1958) , Scott (1961) là những người đầu tiên đã ghép tế bào gốc tạo máu từ gan phôi cho bệnh nhân suy tuỷ xương Fanconi [66,74]

Như vậy, có 4 nguồn cung cấp tế bào nguồn: tuỷ xương, máu huy động, máu dây rốn, tế bào máu gan phôi Trong đó máu cuống rốn và máu huy động

được nhiều tác giả quan tâm phát triển Hai nguồn này dễ thu hoạch và đạt hiệu quả cao, máu cuống rốn có thể tạo thành ngân hàng lớn Có như vậy mới

có thể chọn lọc được nguồn tế bào gốc ‘pool” tương đồng về miễn dịch (HLA)

sử dụng cho người lớn [25,34,49] Gần đây một số ít các tác giả chú ý nghiên cứu tế bào máu gan phôi bởi vì ở đó có nhiều tế bào gốc “trùm” với khả năng phân chia và biệt hóa lớn, có thể dùng nuôi cấy ex - vivo để tạo ra một lượng lớn đủ dùng cho điều trị[12,46]

* Ngoài ra còn một nguồn nữa ngày nay đang được nhiều nhà nghiên cứu khai thác và có thể có triển vọng lớn, đó là tế bào gốc nuôi cấy, phương pháp này cũng có thể tạo một lượng lớn tế bào gốc, bao gồm 2 loại sau đây:

- Nuôi cấy khuếch đại ngoài cơ thể (ex – Vivo expansion) tế bào gốc máu cuống rốn[22,43,75]

- Nuôi cấy khuyếch đại ngoài cơ thể tế bào gốc máu ngoại vi [55] bằng

IL – 3, G – CSF GM – CSF GF

- Nuôi cấy dài ngày tế bào biểu mô của màng ối [56], hoặc nuôi cấy tế bào biểu mô và trung mô của dây rốn có thể tạo tế bào gốc đa dòng như tế bào gốc tạo máu, tế bào thần kinh, cơ tim [71,72,77], tế bào giác mạc [73] Các loại tế bào gốc này có ưu điểm lớn là khả năng miễn dịch còn thấp nên nguy cơ bệnh ghép chống chủ ít, khả năng đậu ghép nhiều hơn các nguồn khác

1.3 Các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc

Từ các nghiên cứu cơ bản trên đây, nhiều nhà lâm sàng đã tiến vào trận

địa sôi bỏng này Nhiều chính phủ đã đưa vào chương trình nghiên cứu quốc gia như Mỹ, Anh, Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Singapore, Thái lan ở Trung Quốc từ 2001 đã thiết lập trung tâm điều trị bằng liệu pháp tế bào gốc,

đã thành công trong điều trị bệnh tim mạch Năm 2003 ở Brazin, Mỹ đã ghép

tế bào gốc giác mạc cho bệnh nhân hỏng mắt ở Bangkok đã có trung tâm điều trị liệu pháp tế bào gốc trưởng thành lấy từ chính cơ thể bệnh nhân Nhận thấy tâm quan trọng của tế bào gốc trong tương lai, nhiều nước đã có đầu tư lớn cho chương trình này ở Nhật, Chính phủ đã dành khoản kinh phí lớn xây phòng thí nghiệm hiện đại nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc vào điều trị, ở Singapore chính phủ đã đầu từ 600.000 USD xây phòng thí nghiệm hiện đại nghiên cứu tế bào gốc, đầu tư 22 triệu USD cho công ty ES – CELLS đang sở hữu 6 dòng tế bào gốc[10] Triển vọng của các nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng về tế bào gốc là rất lớn, để đáp ứng nhu cầu này, vấn đề phân lập tế bào gốc, nhận biết chúng cần có ngân hàng để bảo quản chúng Các nước phát triển ở Châu Âu, Mỹ, úc, Trung Quốc đều đã có ngân hàng tế bào gốc tạo máu lấy từ tuỷ xương và gần đây lấy máu từ cuống rốn Dòng tế bào gốc phôi đầu tiên được tạo ra bởi Thomson (Mỹ) 1998, tới nay theo thông báo

đã có tới 200 dòng được phân lập từ một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Pháp, Nhật, Singapore, Hàn Quốc, Tiệp, Iran [10] Đó là các ngân hàng tế bào gốc trong tương lai Tuy nhiên, mong mỏi lớn nhất của các nhà khoa học về tế bào gốc tới nay vẫn chưa giải quyết được, đó là làm sao nuôi cấy nhân lên để sản xuất được lượng lớn tế bào gốc đồng gen cho người bệnh để họ không phải dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài sau ghép nhằm chống phản ứng thải ghép và ghép chống chủ (GVHD)

2 Thu hoạch tế bào gốc cho ghép tế bào gốc đồng loài

2.1 Tuyển chọn người cho

Công việc hàng đầu là làm tốt tuyển chọn người cho máu theo đúng tiêu chuẩn, khoẻ mạnh, tình nguyện, chú ý loại người cho có tiền sử gia đình liên quan đến bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng, [4,16,37]

2.2 Các phương pháp thu gom tế bào gốc

2.2.1.Thu gom tế bào gốc từ tuỷ xương

Quá trình thu gom tế bào gốc từ tuỷ xương đối với trường hợp tự ghép hay ghép đồng loại tương tự như nhau và thực hiện trong phòng mổ vô khuẩn

Chọc hút dịch tuỷ ở xương chậu(gai chậu sau trên), chọc nhiều lần mỗi lần hút 3-5 ml với tỷ lệ 10-15ml /kg cân nặng ngưòi cho Trộn dung dịch chống đông cho dịch tuỷ với mỗi lần hút và được lọc trước khi bơm vào túi bảo quản, sau

đó chuyển vào túi vô khuẩn và tiến hành các xử lý và đánh giá: đánh giá chất lượng, khả năng sử dụng, nhãn mác và bảo quản

Liều thông thường là 2.108 tế bào có nhân/kg cân nặng của người nhận Thể tích tuỷ tối đa có thể thu là 1500ml Một số trung tâm ghép tiến hành đếm

tế bào có nhân trong quá trình thu thập để quyết định thể tích cần thu gom Việc truyền máu tự thân có kế hoạch cũng cần phải tiên lượng và tiến hành trước thời điểm thu gom từ 2 – 3 tuần, và chỉ truyền lại sau khi đã hút dịch tuỷ, để tránh hiện tượng pha loãng

2.2.2 Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi sau huy động

Những tế bào có CD34 (+) thu thập từ máu ngoại vi sau kích thích có khả năng phục hồi cả ba dòng tế bào máu Bình thường TBG chiếm tỷ lệ rất thấp, sau khi huy động có thể đạt từ 1- 3%

Tế bào gốc máu ngoại vi sử dụng cho phép đồng loài được huy động bằng các yếu tố kích thích tăng trưởng (growth factors) đơn độc hoặc kết hợp với hoá trị liệu Thường sử dụng các yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt (G – CSF: Granulocyte – Colony stimulating factor), GM – CSF hoặc kết hợp cả hai Nếu chỉ sử dụng các yếu tố kích thích hoá trị liệu đơn độc có thể làm tăng số tượng tế bào có CD34 ra máu lên 10 đến 30 lần Kết hợp cả hai phương pháp có thể làm tăng số lượng CD34 lên 50 đến 200 lần [6,54] Các nghiên cứu ghép tự thân cho thấy thời gian mọc ghép khi sử dụng tế bào gốc huy động từ máu ngoại vi ngắn hơn so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ xương[55], đặc biệt là thời gian phục hồi số lượng tiểu cầu Thời gian nằm viện của người bệnh rút ngắn được khoảng 7 đến 10 ngày[40]

Số lượng bạch cầu, số lượng tế bào đơn nhân và số lượng tế bào có CD34 (+) được sử dụng để chọn thời điểm thu gom thích hợp nhất Với những bệnh nhân điều trị hoá chất lần đầu, có thể tiến hành thu hoạch tế bào gốc khi số lượng bạch cầu bắt đầu tăng lên hơn 5 G/l, nhưng cần nói rõ rằng không có

mối liên quan chặt chẽ giữa số lượng bạch cầu và tỷ lệ tế bào CD34 ở máu ngoại vi Và dựa vào số lượng tế bào CD34 trước khi thu gom để dự toán số lượng tế bào CD34 có thể thu được Khi số lượng CD34 lớn hơn hoặc bằng 10

tế bào/microlit máu thì có thể thu được không ít hơn 1ì106 CD34/kg cân nặng của người cho Một số nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa số lượng tế bào gốc thu được với thể tích máu xử dụng Khi thu gom bằng tách với thể tích máu lớn có thể thu gom được tỷ lệ tế bào CD34 có thể cao hơn từ 2,5 đến

3 lần so với tỷ lệ này trong máu tại thời điểm bắt đầu xử lý [5,18]

Thời gian mọc ghép có liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào CD34 thu hoạch được Mục đích thu gom đủ số lượng tế bào CD34 trong sản phẩm, thường là từ 1.106 đến hơn 5ì106 /kg trọng lượng người nhận là được:

Khi sử dụng tế bào gốc từ máu ngoại vi để ghép đồng loại, liều G – CSF thường dùng từ khoảng 10 đến 16 mcg/kg thể trọng người cho/ ngày, tiêm dưới da từ 1 đến 2 lần/ ngày Số lượng tế bào CD34 tăng lên từ ngày thứ ba và

đạt cao nhất vào ngày thứ năm và thứ sáu[19,20]

Một số biến chứng có thể gặp trong quá trình huy động và gạn tách tế bào gốc: nguy cơ chảy máu và nhiễm trùng tại chỗ đặt cathether Hiện tượng giảm tiểu cầu do G – CSF và do quá trình gạn tế bào cũng là một trong những biến chứng thường gặp Khoảng 90% các trường hợp có biểu hiện đau xương,

đau đầu, đau người, cảm giác mệt, buồn và nôn (9) Các biến chứng nặng có thể gặp như lách to ra, thâm nhiễm bạch cầu hạt dưới da (hội chứng Sweet), huyết khối động mạch, phản vệ [40,54] Tuy nhiên chưa có trường hợp nào mô tả tử vong do huy động tế bào gốc máu ngoại vi [18]

2.2.3.Thu gom tế bào gốc từ máu cuống rốn

Tế bào gốc từ máu rốn thu thập từ bánh rau trước hoặc sau khi sổ rau hoặc kết hợp cả 2 phương pháp Qúa trình thu gom không được gây cản trở việc chăm sóc người mẹ cũng như em bé và nên có kế hoạch thu gom từ trước khi sinh

Để giảm khả năng nhiễm khuẩn, dây rốn cần được sát khuẩn bằng cồn và các dung dịch sát khuẩn khác Sử dụng kim có kích thước lớn, dẫn máu rốn chảy theo trọng lực Dung dịch chống đông nên sử dụng là CPD và CPDA vì

đẳng trương và có pH trung tính

Tiền sử cá nhân và gia đình của người mẹ (và nếu có thể của cả đứa trẻ

và bố đứa trẻ) cần được ghi rõ ràng trước khi thu gom hoặc trong vòng 48giờ

kể từ khi thu gom Đơn vị máu rốn sẽ không được sử dụng cho ghép đồng loại nếu tiền sử gia đình (người mẹ, người bố hoặc anh chị em) có bệnh di truyền

và các bệnh lây truyền qua đường truyền máu

Bắt buộc tiến hành định nhóm ABO/Rh của đơn vị máu cuống rốn sau khi thu thập, sàng lọc kháng thể bất thường Tiến hành định nhóm HLA, sau

đó tiến hành bảo quản Nêu lưu trữ đồng thời mẫu huyết thanh của người mẹ

để kiểm tra các bệnh lý truyền nhiễm mới sau này, tại thời điểm sử dụng đơn

vị máu cuống rốn Nên tiến hành đếm số lượng CD34 và tỷ lệ tế bào sống tại thời điểm giải đông đơn vị máu rốn trước khi sử dụng

2.2.4 Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy exvivo (Exvivo expansion)

Nuôi cấy khuyếch đại (expansion) exvivo tế bào gốc có số lượng ít, như

tế bào gốc máu cuống rốn, số lượng tế bào gốc máu cuống rốn có khoảng 0.04-0.05% nhưng nếu nuôi trong môi trường có đủ chất dinh dưỡng và phát triển thì có thể tạo ra 1 lượng lớn đủ đáp ứng cho nhu cầu điều trị Ví dụ nuôi cấy khuyếch đại tế bào gốc máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế bào gốc ở người lớn Kết quả nghiên cứu của Astori cho thấy với môi trường nuôi cấy

đặc biệt, tế bào gốc máu cuống rốn khuyếch đại rất nhanh: tế bào có nhân tăng gấp 180 lần, tế bào tạo GM-CSF tăng gấp 20 lần[ 22]

2.2.5 Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy dài ngày tế bào góc “trùm”

Nuôi cấy tế bào gốc biểu mô, tế bào gốc trung mô của dây rốn, tế bào gốc phôi có thể thu được tế bào gốc cho cơ tim, thần kinh[71], tế bào gốc tạo máu[77].Hướng này rất có ý nghĩa cho phát triển ghép tế bào gốc trong tương lai.Nó còn có thể có giá trị làm giảm phản ứng miễn dịch đối với ghép tế bào gốc đồng loài [72]

3 Kỹ thuật chọn lọc và làm sạch tế bào gốc

3.1 Chọn lọc tế bào CD34

Trong quá trình biệt hoá và trưởng thành, số lượng phân tử CD34 giảm dần bề mặt tế bào định hướng tạo máu Dựa vào đặc điểm này, người ta sử

dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với những nhóm quyết định kháng nguyên của phân tử CD34, để xác định giai đoạn biệt hoá và tách tế bào

Hiện tại có một số kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi như: Tách tế bào sử dụng huỳnh quang (FACS: fluoresence activated cells sorting) và kỹ thuật sử dụng hạt từ (immunomagneti beads) Qúa trình tách CD34 có thể đồng thời tiến hành với loại bỏ tế bào lympho T và tế bào ung thư: Tuy nhiên, cho đến nay, hiệu quả lâm sàng của tách CD34 đồng thời với làm sạch tế bào u, tế bào lympho T vẫn chưa được xác định

a) Tách tế bào có sử dụng hạt từ miễn dịch: trực tiếp hoặc gián tiếp

+ Sử dụng hạt từ có gắn kháng thể CD34 đem ủ với hỗn hợp tế bào đơn nhân, những tế bào có CD34 sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu và tạo mạng ngưng kết Sau đó sử dụng nam châm để tách các hạt ngưng kết

+ Một kỹ thuật mới để tách CD34 hiện đang được nghiên cứu thử nghiệm

in vitro tại Mỹ, sử dụng nguyên lý tách tế bào từ tính (MACS: magnetic cell sorting) Nguyên lý là sử dụng các hạt nhỏ, gắn kháng thể với phân tử sắt và phân tử sắt được gắn với phân tử đường Những tế bào gắn từ sẽ được tách qua cột có độ chênh lệch từ tính cao và bộ vi sử lý sẽ tách được tế bào có CD34

b) Tách tế bào bằng ly tâm phân lớp

+ Nguyên lý tách dựa vào kích thước và tỷ trọng tế bào sử dụng dòng ly tâm liên tục để tạo ra cặp đối lực (lực ly tâm và lực dòng chảy) tác dụng lên tế bào Những tế bào có tỷ trọng thấp sẽ được phân lập trước

+ Hiện nay, kỹ thuật này chủ yếu được sử dụng để tách lympho T, nhưng cũng sử dụng để tách tế bào có CD34 Những tế bào có CD34 là một quần thể

tế bào đồng nhất, được phân tách và sử dụng để thực nghiệm tái tạo quần thể

tế bào, hoặc thử nghiệm mở rộng ex vivo

3.2 Xử lý loại bỏ tế bào ung thư sử dụng cho ghép tự thân

Là quá trình làm sạch hay loại bỏ, loại trừ những tế bào ung thư bị lẫn khi tiến hành ghép tự thân Với những bệnh nhân bệnh máu hoặc bệnh ác tính thường có xâm lấn tuỷ xương (như u lympho ), tồn lưu bệnh tối thiểu (MRD: minimal residual disease) là nguyên nhân gây tái phát Mặc dù tỷ lệ nhiễm tế

bào ung thư trong chế phẩm tế bào gốc tách từ máu ngoại vi là rất thấp, thấp hơn nhiều so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ xương, tuy vậy vẫn có thể lẫn nhiều tế bào ung thư Một số nghiên cứu cho thấy có thể tế bào ung thư cũng

được huy động từ tuỷ ra máu trong quá trình huy động tế bào gốc (45)

Tuy vậy, biện pháp này cũng vẫn còn đang được bàn luận, vì có thể những phương pháp loại trừ sẽ gây tổn thương tế bào gốc Khi tiến hành loại tế bào u, khả năng giảm mức độ tồn lưu hoặc tái phát bệnh cũng kèm theo việc gia tăng nguy cơ không mọc ghép, tăng tỷ lệ chết do suy tuỷ kéo dài (45)

Có nhiều kỹ thuật hiện nay được áp dụng để loại bỏ, phá huỷ dòng tế bào ung thư, đồng thời bảo tồn tế bào định hướng tạo máu sử dụng cho phép

* Kỹ thuật dược lý học (Pharmacologic technique): Trong cơ thể, tác dụng của hoá trị liệu chủ yếu tác động trên tế bào ung thư, vì những tế bào này nhạy cảm với hoá chất hơn tế bào bình thường In vitro, kỹ thuật này cũng sử dụng nguyên lý đó, với liều hoá chất cao hơn mà không lo ngại sẽ ảnh hưởng

đến các tế bào bình thường, đồng thời liều hóa chất sử dụng cũng không được gây độc khi truyền lại chế phẩm sau khi xử lý vào cơ thể người bệnh Mafosfamid (oxazaphosphorine hoạt hoá) và một số thuốc khác hiện đang

được thử nghiệm theo hướng này Hiệu quả của việc ứng dụng những thuốc này nhằm làm sạch tế bào ung thư đối với những bệnh nhân ghép tuỷ tự thân làm kéo thời gian suy tuỷ và tỷ lệ tế bào định hướng GM – CSF chỉ còn lại dưới 1%

* Kỹ thuật vật lý (Physical techniques): Là kỹ thuật tách dựa vào kích thước và tỷ trọng của tế bào Kỹ thuật này cũng không đủ hiệu quả để tách tế bào ung thư, tuy nhiên sử dụng kết hợp cùng với kỹ thuật miễn dịch học sẽ

đem lại hiệu quả cao hơn

* Kỹ thuật miễn dịch học (Immunologic techniques): kỹ thuật này sử dụng để tách các tế bào ung thư bằng phức hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên khối u kết hợp bổ thể có gắn tác nhân gây độc hoặc gắn hạt từ Việc lựa chọn kháng thế và tính bộc lộ kháng nguyên đồng nhất trên màng tế bào sẽ quyết định hiệu quả quá trình loại bỏ tế bào ung thư Nhiều tác giả sử

dụng hỗn hợp kháng thể để nâng cao hiệu quả tách, và sử dụng kháng thể có gắn bổ thể trong trường hợp kháng thể được sử dụng là IgM hoặc mật độ kháng nguyên dày đặc trên bề mặt tế bào Kỹ thuật tách miễn dịch gắn từ tính

để tách tế bào, trực tiếp hoặc gián tiếp, sử dụng kháng thể gắn hạt từ Một nghiên cứu đã công bố kết quả loại bỏ được 5 – log tế bào ung thư sau hai chu

kỳ tách gián tiếp ở bệnh nhân u lympho không Hodgkin tế bào B, nhưng lại làm giảm 20% các tế bào cụm GM – CFU - GEMM – CFU.( )

3.3 Vấn đề loại tế bào T lympho trong dịch tế bào gốc

Nhằm loại hoặc làm giảm biến chứng GVHD Đây là biến chứng chủ yếu khi tiến hành ghép đồng loại do các T lympho từ người cho phản ứng chống lại cơ thể người bệnh[13] Khi tiến hành loại bỏ T lympho trong quá trình ghép sẽ có hai khả năng xảy ra liên quan đến hiện tượng mọc ghép hay tái phát bệnh Hầu hết các tình trạng thải ghép xảy ra trừ miễn dịch Còn ở những bệnh nhân có hiện tượng ghép chống vật chủ thì tỷ lệ tái phát thấp hơn Qua hiện tượng đó, các tác giả đã nghiên cứu chứng minh tác dụng ghép chống leukemia (GVL) Với mục đích hạn chế bệnh ghép chống chủ, đồng thời phát huy tác dụng của ghép chống leukemia, các nghiên cứu đã tập trung vào việc xác định mức tế bào T lympho phù hợp Tuy nhiên đây vẫn là vấn đề đang

được tiếp tục nghiên cứu Đồng thời một số nghiên cứu khác đã đi sâu vào từng quần thể tế bào lympho, vai trò của các cytoknines trong GVL Gần đây nhiều tài liệu đã công bố, loại T lympho sẽ gây suy giảm miễn dịch, tăng khẳ năng thải ghép, giảm khả năng ghép chống Leukemia[] Vì vậy vấn đề loại T lympho của dịch tế bào gốc hiện nay không được quan tâm nhiều như vấn đề chọn lựa HLA trong ghép Ngoài ra số lượng T lympho ở máu cuống rốn rất thấp, chức năng chưa hoàn thiện[1,17]

3.4.Vấn đề loại hồng cầu trong dịch tế bào gốc:

Đây cũng là một vấn đề được nhiều nhà nghiên cứu đề cập Loại hồng cầu giúp giảm thể tích túi tế bào gốc do đó rút ngắn thời gian đông lạnh cũng như tan

đông, giảm sử dụng các hoá chất bảo quản, giảm thiểu các yếu tố bất lợi cho người nhận ghép cũng như giảm tỷ lệ tế bào gốc bị chết do bảo quản [64,82]

4 Bảo quản lâu dài tế bào gốc tạo máu

4.1 Giảm thể tích bảo quản tế bào gốc

Đây là khâu quan trọng của xây dựng ngân hàng tế bào gốc Và mặc dù

được tiến hành dễ dàng ở nhiều trung tâm ghép, nhưng quá trình làm lạnh và bảo quản tế bào gốc cũng có những nguy cơ mất tế bào gốc Việc truyền tế bào bảo quản lạnh cũng gây một số nguy cơ cho người nhận, một số trong các nguy cơ đó có thể đe doạ tính mạng họ, và một số khác chưa được hiểu cặn

kẽ Hiện tượng mất tế bào gốc trong quá trình bảo quản lạnh và ảnh hưởng của hiện tượng này đến tốc độ mọc ghép vẫn chưa được lượng giá chính xác Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của quá trình bảo quản lạnh, mỗi yếu tố

có ảnh hưởng riêng đối với quá trình hồi phục của tế bào gốc qua từng bước của quá trình bảo quản và vì vậy, quá trình này cần được kiểm soát một cách chặt chẽ Hướng nghiên cứu hiện nay tìm ra những dung dịch, những quy trình

kỹ thuật đơn giản hơn mà lại đạt kết quả bảo quản tốt hơn, rẻ hơn, dễ thực hiện hơn, ít độc hơn cho người nhận và cho tế bào bảo quản Xuất phát từ mục tiêu này gần đây nhiều nhà nghiên cứu bảo quản TBG nêu ra 1 số chú ý sau:

- Thể tích bảo quản mỗi túi đông lạnh (túi đặt trong cassette), dịch tế bào dàn đều, đảm bảo độ mỏng, khi đông lạnh sẽ lạnh nhanh và đều, khi tan đông cũng nhanh và đều Trước đây bảo quản trong lọ 3ml nên khi gây đông ngoài

vỏ đông trước, còn khi tan đông ngoài vỏ tan truớc nên tỷ lệ tế bào chết cao (>10%) Thể tích này còn thuận lợi cho truyền cho bệnh nhân

- Loại bớt hồng cầu, tiểu cầu tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển tế bào gốc Vì khi tan đông hồng cầu vỡ giải phóng HST tự do khá cao bất lợi cho phát triển ghép và bệnh nhân

- Dung dịch bảo quản DMSO 10%và HES 6% là thích hợp và không độc cho cơ thể và không cần loại DMSO trước khi truyền cho bệnh nhân (68), huyết tương tự thân, albumin- làm tăng độ nhớt của dịch bảo quản giúp màng

tế bào không bị tổn thương ở nhiệt độ lạnh sâu hoặc khi tan đông

- Nồng độ tế bào có nhân từ 1-2.5 108/ml dịch bảo quản thuận lợi cho bảo quản và truyền cho bệnh nhân

- Tốc độ làm lạnh: để đạt được -1960C cần tiến hành qua nhiều bước, nhanh quá hoặc chậm quá đều ảnh hưởng đến chất lượng của bảo quản

- Tan đông: lấy ra nhanh, bỏ cassette, ngâm túi đựng tế bào gốc trong nước ấm 370C, khi tan gần hoàn toàn có thể truyền ngay cho bệnh nhân, hay lấy tế bào từ túi sử dụng cho nghiên cứu đánh giá kết quả bảo quản

Tế bào gốc được bảo quản diễn ra trong 3 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu bảo quản ở 40C có thể giữ ở 24-72h sau đó truyền cho bệnh nhân Phương pháp này thường áp dụng cho ghép tế bào gốc tự thân, kết quả rất khả quan [19] Tuy nhiên 1 số tác giả nghiên cứu nuôi cấy cụm tế bào cho thấy nếu để ở 40C hoặc 250C quá 9h sau xử lý thì số lượng colony giảm tác giả cho rằng thời gian thích hợp cho chuẩn bị trước đông lạnh là 9-24 h[57]

- Giai đoạn đông lạnh: từ 40C xuống - 450C với tốc độ -10C/ phút Từ -

450C đến – 135 0C với tốc độ - 5C0 / phút sau đó chuyển vào bình Nitơ lỏng

-1960C, duy trì dài ngày ở nhiệt độ này Hàng tuần Nitơ lỏng được bổ sung để cho túi tế bào gốc được ngập sâu trong Nitơ [64]

- Giai đoạn tan đông và sử dụng: nhiều tác giả thống nhất phải tiến hành nhanh, túi tế bào gốc được ngâm trong chậu nước ấm 370C khi tan hết thì truyền cho bệnh nhân Túi tế bào gốc được bảo quản trong DMSO (10%) và HES (6%) do đó không cần phải loại bỏ DMSO và HES trước khi truyền [5]

4.3 Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc sau bảo quản

4.3.1 Đếm số lượng tế bào có nhân

Mọi chế phẩm tế bào gốc cần được phân tích và xác định tổng số tế bào,

số lượng tế bào đơn nhân để tính toán lượng tế bào được truyền /kg thể trọng người nhận hoặc liều tế bào của từng chế phẩm Số lượng này, kết hợp với những xét nghiệm khác, xác định số lần thu hoạch cần thiết để có đủ lượng tế bào đảm bảo mọc ghép Ngoài ra, các thông số này cũng giúp tính toán tỷ lệ tế bào còn lại và cung cấp các dữ kiện cho quá trình kiểm soát chất lượng của các bước xử lý và bảo quản chế phẩm

Nói chung các máy đếm tế bào tự động có thể giúp đếm các tế bào nhanh

và chính xác Tuy nhiên, các đám tiểu cầu/ tế bào ngưng kết trong HPC – A

hoặc các hạt mỡ trong HPC – M có thể gây những sai số nhất định Trong những trường hợp này, nên tiến hành đếm thủ công, và không bao giờ nên ước

đoán số lượng tế bào, vì đây là thông số quan trọng đánh giá thời gian mọc ghép hoặc ghép thất bại

4.3.2 Đếm tỷ lệ tế bào sống/chết

Bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch xanh trypan cho kết quả tương đối chính xác, nhanh, đáp ứng nhu cầu lâm sàng

4.3.3 Nuôi cấy cụm

Cho biết khả năng hoạt đông của tế bào gốc sau xử lý và bảo quản cả về chất lượng (khả năng sinh sản và biệt hoá) và số lượng Tuy nhiên có một số nhược điểm là thời gian nuôi cấy dài ngày (10-14 ngày), không đáp ứng kịp thời cho lâm sàng, xác định số lượng “cụm” khó chính xác, dung dịch nuôi cấy đắt tiền

4.3.4 Xác định tế bào u

Kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện tại là các kháng thể đơn dòng gắn đặc hiệu các kháng nguyên ung thư Có thể đếm bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy, miễn dịch huỳnh quang, hoặc nhuộm hoá mô miễn dịch Độ nhạy

từ 0,1% đến 0.0004% tuỳ theo kỹ thuật Kết quả các nghiên cứu đã công bố

đều cho thấy rằng tồn lưu các tế bào u trong chế phẩm ghép có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm của bệnh nhân ( )

4.3.5 Sự phục hồi và hoạt động của tế bào gốc sau ghép:

Dựa vào diễn biến của bệnh nhân trên lâm sàng và diễn biến xét nghiệm

5 Vấn đề ngân hàng tế bào gốc và sử dụng:

Đây là vấn đề có tính toàn cầu, nếu có nhiều ngân hàng với nguồn cung cấp tế bào gốc máu cuống rốn dồi dào, các mẫu phẩm đạt tiêu chuẩn thống nhất quốc tế lại có thể trao đổi giữa các ngân hàng thì tương lai của ghép tế bào gốc rất lớn, đặc biệt các sản phẩm xung quanh máu cuống rốn như cuống rốn, màng rau Tất cả các sản phẩm này đều là sản phẩm bỏ đi, nay thu lại và

sử dụng thì thật là hữu ích Giá trị khoa học của các sản phẩm này rất lớn Nhiều tác giả đã chứng minh rằng, chất lượng của tế bào có nhân và tế bào

gốc CD 34 gấp 10 lần tế bào gốc tuỷ và > 10 lần máu ngoại vi với các đặc

điểm sau (31,32,42,47):

- Khả năng tạo Colony rất lớn, khả năng sinh sản và biệt hoá rất lớn, khả năng tự tái sinh lớn hơn tế bào gốc tuỷ và máu ngoại vi 100ml máu rốn có giá trị tương đương 1000ml dịch hút tuỷ xương (32, 47)

- Khả năng đậu ghép đồng loài của tế bào gốc máu cuống rốn nhiều hơn ghép tế bào gốc tuỷ và máu huy động

- Bệnh ghép chống chủ trong ghép tế bào gốc máu cuống rốn ít hơn và mức độ cũng nhẹ hơn các tế bào gốc khác, ở giai đoạn II và IV (chỉ gặp 3% - 18%), giai đoạn III và IV ( 0 – 5% ) (Nếu có HLA tương đồng 6/6 hoặc 5/6 thì kết quả rất mỹ mãn)

- Vấn đề liều tế bào gốc ghép cho người lớn đã được nghiên cứu và

đang mở ra triển vọng lớn, đó là:

+ Hỗn hợp (pool) nhiều đơn vị tế bào gốc máu cuống rốn có HLA tương

đồng (Multiunit cord blood cells ), điều này có thể thực hiện được khi có hợp quốc tế lớn (49, 53)

+ Nuôi cấy nhân lên ngoài có thể (Ex Vivo expansion) đạt được lượng tế bào gốc đủ liều cho bệnh nhân người lớn từ 1 đơn vị máu cuống rốn tương

Với các hiểu biết và tiến bộ mới hiện nay, cho thấy việc xây dựng Ngân hàng máu cuống rốn, lưu trữ được nhiều mẫu phẩm để lựa chọn là điều kiện tiên quyết cho phát triển ghép tế bào gốc trong tương lai

ở Việt Nam đã có ngân hàng máu cuống rốn ở thành phố Hồ Chí Minh, hiện nay ở Hà Nội cần xây dựng Ngân hàng máu cuống rốn đạt tiêu chuẩn quốc tế để hoà chung vào mạng lưới tế bào gốc khu vực và thế giới

Chương 2

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi huy động và không huy động

- 9 đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại vi không huy động của 3 người cho khoẻ mạnh, nam giới, từ 24 đến 27 tuổi, tình nguyện tham gia nghiên cứu

- 10 đơn vị tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi có huy động bằng Filgrastime của 5 người cho khoẻ mạnh, nam giới, từ 24 đến 32 tuổi, tình nguyện tham gia nghiên cứu

- Tất cả những người cho tình nguyện được tư vấn, khám tuyển và xét nghiệm sàng lọc trước khi tham gia nghiên cứu theo tiêu chuẩn người cho máu theo quy định của Pháp lệnh an toàn truyền máu 1992

2.1.2 Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tuỷ xương

- 15 mẫu dịch hút tế bào tuỷ xương được tiến hành thu gom từ 15 người cho tình nguyện, khoẻ mạnh, tuổi từ 22 đến 41

- Tất cả những người cho tình nguyện được tư vấn, khám tuyển và xét nghiệm sàng lọc trước khi tham gia cho tuỷ theo quy định của Pháp lệnh an toàn truyền máu 1992

2.1.3 Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu cuống rốn

- 112 mẫu máu cuống rốn của các sản phụ đẻ thường tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội, sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình thu gom máu cuống rốn đạt hiệu quả cao

- 34 mẫu máu cuống rốn có thể tích ≥ 90ml, sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình loại hồng cầu bằng phương pháp ly tâm

- 20 mẫu máu cuống rốn có thể tích ≥ 90 ml, dùng cho nghiên cứu các chỉ số tế bào huyết học, tế bào miễn dịch, tế bào gốc CD34 trước và sau khi loại xử lý

a) Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng thu hoạch máu cuống rốn đạt hiệu quả cao

+ Mẹ: tuổi ≥ 18, trọng lượng trên 50kg, thai một

+ Con: tuổi thai ≥ 37 tuần, trọng lượng ước tính > 2500 gam

b) Tiêu chuẩn loại trừ

- 10 mẫu tế bào gốc máu ngoại vi huy động đã làm giảm thể tích huyết tương

- 10 mẫu dịch tuỷ xương đã làm giảm hồng cầu và thể tích huyết tương

- 20 mẫu máu cuống rốn đã làm giảm hồng cầu và thể tích huyết tương Cả 3 đối tượng trên được sử dụng cho nghiên cứu bảo quản -1960C

2.2 Sinh phẩm, hoá chất, trang bị

2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất

- Kít tách tế bào gốc cho máy Cobe – Pectra (GAMBO- Mỹ)

- Dung dịch HES (Hydroxyethyl starch) 6%

- Dung dịch Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 10%

2.2.2 Trang bị, dụng cụ

- Bộ dụng cụ làm HLA- A, B, DR theo phương pháp vi độc tế bào (micro-cytotoxicyty)

- Bộ dụng cụ dùng cho tách lympho T và B (định tube HLA lớp I và II)

- Kính hiển vi huỳnh quang Nikon (Nhật)

- Máy tách tế bào tự động COBE – Spectra (Nhật), dùng tách tế bào từ

CD34 từ máu

- Hệ thống máy FACS Callibur (Mỹ), dùng đếm số lượng tế bào gốc CD34

- Máy đếm tế bào máu tự động XT – 2000i (Nhật)

- Máy đông máu tự động ACL 200 (Italia)

- Máy hoá sinh tự động HITACHI 902 (Nhật Bản)

- Hệ thống máy đông lạnh có kiểm soát tự động, hãng Planer (Anh quốc), bình bảo quản bằng ni tơ lỏng – 1960C (bệnh viện TW quân đội 108)

- Túi lấy máu 250ml có chất chống đông CPD – A1 (Terumo)

- Các xét nghiệm khác được tiến hành theo các quy trình thường quy tại các LABO của Viện Huyết học – Truyền máu TW và tại các khoa Huyết học, Truyền máu của bệnh viện Trung ương Quân đội 108

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu gom tế bào gốc

2.3.1.1 Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi có huy động và không huy

- Định nhóm máu hệ ABO, Rh và nhóm kháng nguyên bạch cầu HLA

• Bước 3: Huy đông và thu tế bào bằng máy tách tế bào tự động COBE – Spectra

- 9 đơn vị từ 3 người cho không huy động (mỗi ngươì thu 3 lần trong vòng 2 tuần)

- 10 đơn vị từ 5 người cho có huy động tế bào CD34 bằng G – CSF (Leukokine), tiêm dưới da bụng với liều 10mg/kg/ngày và thường trong 5 ngày liên tục, tiêm 1 lần vào buổi sáng Đếm số lượng tế bào CD34 hàng ngày và tiến hành thu tế bào vào ngày thứ 5 và thứ 6 kể từ ngày bắt đầu huy

động, khi số lượng tế bào CD34 đạt ≥ 10 tế bào /1ml máu trước khi thu hoạch

- Theo dõi biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm của người cho trong suốt quá trình nghiên cứu: trước và trong khi huy động, trước và sau tách 1 tuần và theo dõi sức khoẻ trong 1 tháng kể từ lần cho cuối cùng

2.3.1.2 Thu gom tế bào gốc từ tuỷ xương

Bước 1: Chọn lựa người cho tuỷ: tình nguyện, khoẻ mạnh và được chọn

lựa, sàng lọc tương tự người cho tế bào gốc từ máu ngoại vi

Bước 2: Thu gom tế bào tuỷ xương

- Chọc hút tuỷ ở gai chậu sau trên theo quy trình kỹ thuật thường quy tại Việc Huyết học truyền máu TW

- Sử dụng bơm tiêm loại 10ml có tráng heparin để hút, thể tích hút 3ml/ lần và mỗi lần hút ở một hướng khác nhau tại cùng vị trí chọc tuỷ

- Dịch tế bào tuỷ thu gom được (≈ 20 ml) bảo quản trong ống nghiệm Falcon vô trùng loại 50ml

- Đếm số lượng tế bào CD34 sử dụng máy đếm tế bào theo dòng chảy bằng máy FACS – Callibur

- Đếm số lượng tế bào miễn dịch (CD3, 4, 8, 18/56, 20) dùng kháng thể

đơn dòng gắn huyùnh quang (anti CD34, 4, 8,19,16/56, ) của hãng Becton – Dickinson (Mỹ) và đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Nikon (Nhật)

- Đếm số lượng tế bào máu bằng máy đếm tế bào tự động XT-2000i (Nhật)

- Định nhóm máu hệ ABO, Rh và nhóm kháng nguyên bạch cầu HLA bằng phương pháp vi độc tế bào (micro-cytotoxicity) của Terasaki[70 ] Tế bào T và B lympho dùng cho phản ứng này đựoc phân lập bằng phương pháp thấm lọc qua bông thuỷ tinh (phụ lục )

2.3.1.3 Thu gom tế bào gốc từ máu cuống rốn

+ Ngay sau khi đẻ thai 6 – 10 giây dùng 2 panh kẹp đoạn rốn ở khoảng cách 5 – 6 cm tính từ thai, cắt dây rốn ở giữa 2 panh đã kẹp , luồn kim của túi lấy máu vào tĩnh mạch rốn, máu cuống rốn sẽ chảy vào túi theo trọng lực + Sau khi rau bong máu không còn chảy vào túi nữa, tiến hành đỡ rau, treo rau lên giá đỡ , sát trùng lại dây rốn và tiếp tục thu gom máu còn lại

+ Lắc đều túi máu, cho vào hộp bảo quản chuyển về phòng xét nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành xử lý trong vòng 24 h sau khi thu gom + Các thông tin về tuổi mẹ, cân nặng của mẹ lúc sinh, lần sinh, tuổi thai, giới, cân nặng thai… cũng được thu thập cùng với túi máu

+ Lựa chọn các túi máu cuống rốn có thể tích ≥ 90ml (đã trừ chất chống

đông) sử dụng cho nghiên cứu

- Đếm số lượng tế bào CD34 sử dụng máy đếm tế bào theo dòng chảy FACS – Callibur

- Định nhóm máu hệ ABO, Rh và nhóm kháng nguyên bạch cầu HLA bằng phương pháp vi độc tế bào (micro-cytotoxicyty) của Terasaki[ ] Sử dụng T lympho cho định nhóm HLA lớp I( HLA-A, B) và B lympho cho HLA lớp II (HLA- DR) (phụ lục )

- Đếm số lượng tế bào miễn dịch (CD3, 4, 8, 16/56, 19) dùng kháng thể

đơn dòng gắn huynh quang (anti CD3, 4,8,19,16/56, ) của hãng Becton – Dickinson (Mỹ) và đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Nikon (Nhật)

- Đếm số lượng tế bào máu bằng máy đếm tế bào tự động XT-2000i (Nhật)

2.3.2 Xử lý tế bào gốc (loại hồng cầu và giảm thể tích dịch tế bào):

2.3.2.1 Chuẩn hoá qui trình xử lý tế bào gốc: ly tâm giảm hồng cầu và giảm thể tích đơn vị máu máu cuống rốn:

Để chuẩn bị dụng dịch tế bào cho bảo quản và sử dụng cho điều trị sau này, bước này cần đạt 3 chỉ tiêu:

- Giảm khối lượng hồng cầu >50% (tế bào gốc dịch hút tuỷ xương và MCR)

- Tế bào gốc CD34 mất < 15%

- Giảm thể tích huyết tương, sao cho đậm đặc tế bào có nhân đạt 2.5*108/ml, tổng thể tích cho 1 đơn vị máu cuống rốn sau xử lý là 25 – 30ml

Có thể nói đây là bứơc rất quan trọng nhằm làm giảm thể tích bảo quản, giảm hồng cầu trong dung dịch bảo quản, tạo thuận lợi cho bảo quản tế bào gốc Để đạt đựơc mục tiêu này chúng tôi đã tiến hành:

Xác định quy trình giảm hồng cầu bằng phương pháp ly tâm đạt kết quả tối ưu nhằm tìm lực và thời gian ly tâm thích hợp mà ở đó số lượng hồng cầu mất đi tối đa và tế bào CD34 mất đi tối thiểu Để xác định lực ly tâm thích hợp chúng tôi tiến hành: Cố định thời gian là 5 phút thay đổi lực ly tâm từ 100g

đến 600g và tìm được lực ly tâm thích hợp là 500g Để tìm thời gian ly tâm thích hợp chúng tôi cố định lực ly tâm(500g) thay đổi thời gian từ 3-7 phút và tìm được thời gian thích hợp là 5 phút Sau nhiều lần điều chỉnh kết quả cho thấy quy trình ly tâm đạt 500g trong 5 phút kết quả tối ưu Quy trình này được ứng dụng loại hồng cầu trong dịch tuỷ xương và máu cuống rốn

2.3.2.2.ứng dụng quy trình ly tâm ở trên, ly tâm các mẫu nghiệm, kết quả thu được 3 lớp: dưới cùng là khối hồng cầu, giữa là lớp huyết tương giàu

bạch cầu, trên cùng là huyết tương giàu tiểu cầu.Khối hồng cầu bị loại bỏ, 2 lớp còn lại đựơc thu hồi gọi chung là huyết tương giàu bạch cầu

2.3.2.3 Giảm thể tích dịch tế bào

Huyết tương giàu bạch cầu được cô đặc bằng ly tâm lần 2 (1000g/10’) và loại bỏ 1 phần huyết tương chuẩn bị dịch tế bào có nhân với nồng độ tế bào là (> 50%) 2.5 x 108/ml Sản phẩm này đã đựoc thu nhỏ về thể tích (còn khoảng 30%), hồng cầu đã giảm bớt, thích hợp cho bảo quản và sử dụng cho điều trị

2.3.3 Bảo quản tế bào gốc ở nhiệt độ -196 0 C

2.3.3.1.Chuẩn bị dịch tế bào có nhân: 3 nhóm tế bào có nhân:

- Tế bào có nhân máu ngoai vi huy động: gồm 5 mẫu thu hoạch bằng máy tách tế bào tự động, số lượng HC rất ít, nhưng khối lượng huyết tương lớn (>500ml) nên cần ly tâm (1000g/10’) để loại bớt huyết tương, cô đặc tế bào

Từ cặn tế bào này chuẩn bị dịch tế bào có nồng độ 2.5 x108/ml huyết tương tự thân dùng cho bảo quản

- Tế bào tuỷ : gồm 15 mẫu pha loãng gấp đôi(20 ml dịch tuỷ xuơng+ 20 NaCl), ly tâm loại bớt hồng cầu như ở trên, chuẩn bị dịch tế bào có nồng độ 2.5 x108/ml

- Tế bào gốc máu cuống rốn: gồm 20 mẫu cũng được chuẩn bị như trên

2.3.3.2 Chuẩn bị dung dịch bảo quản

- Huyền dịch tế bào được trộn với hỗn hợp chất bảo quản gồm: dung dịch Dimethyl Sulfoxide (DMSO) với nồng độ cuối cùng là 5% thể tích[61], phối hợp với dung dịch HES 6% và huyết tương tự thân, sao cho độ đậm đặc tế bào trong nghiên cứu này độ đậm đặc tế bào có nhân cuối cùng là 1.97 x 108/ml Dịch tế bào đựoc bảo quản trong túi plastic chuyên dùng của hãng Terumo(30ml), túi được đặt trong hộp inox, nhằm cố định độ mỏngvà dàn đều của dịch bảo quản, tạo diều kện thuận lợi cho đông lạnh và tan đông

2.3.3.3 Quy trình đông lạnh: có kiểm soát nhiệt độ

Thực hành trên máu Planer (Anh Quốc)

- Các mẫu máu được làm lạnh trong máy hạ nhiệt độ với tốc độ -10 C/1 phút cho tới – 450 C sau đó là - 50 C/1 phút cho tới - 1450 C

- Sau khi đạt được nhiệt độ - 1450 C tiến hành bảo quản dài ngày ở -

1960C trong nitơ lỏng [5, 63, 64]

- Thời gian bảo quản: 3 tháng, Nitơ lỏng đựoc bổ sung hàng tuần để duy trì nhiệt độ(vì thời gian có hạn nên không thể kéo dài thêm)

- Kiểm soát nhiệt độ hàng nagỳ: sáng, chiều

2.3.3.4 Thu hoạch tế bào sau bảo quản

Đây là bước rất nhạy cảm, tế bào rất dễ bị tổn thương, nếu không thao tác nhanh gọn, kéo dài thời gian phá đông Phá đông đựoc tiến hành trong Bain –marrie 370C, lắc nhẹ túi chứa tế bào dông lạnhkhi thấy tan đều, lấy ra và xác

định tỷ lệ tê boà sống bằng cách nhuộm với dung dịnh xanh Trypan (Trypan Blue) 1%, xác định tỷ lệ tế bào chết ở các thời điểm: ngay phút đầu, 5’, 10’, 15’, 30’, 45’, 60’ dưói KHV quang học(tế bào chết trương to bắt màu xanh)

2.3.4 ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy cụm (colony) nghiên cứu khả năng sinh sản và biệt hoá của TBG tuỷ, máu huy động, MCR

- Phân lập TBCN

- Nuôi cấy trong môi trường Methyl cellnlose + Cytokin

- Xác định số lượng và định loại các cụm (Colonies) theo phương pháp Broxmyer (32)

2.3.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu

2.3.4.1 Các chỉ tiêu thu hoạch tế bào gốc máu ngoại vi

- Xác định sự thay đổi số lượng tế bào CD34 ở máu ngoại vi không huy

động và trong quá trình huy động bằng G – CSF sử dụng máy đếm tế bào theo dòng chảy FACS – Callibur

- Biểu hiện lâm sàng trong quá trình huy động bằng G – CSF và quá trình tách tế bào và sau khi kết thúc lần tách cuối cùng 6 tháng

- Các chỉ số huyết học và hoá sinh được xét nghiệm trước và trong quá trình huy động, trước và ngay sau mỗi lần tách tế bào và cho đến hết 15 ngày

kể từ khi huy động

- Các chỉ số huyết học, miễn dịch và số lượng tế bào CD34 thu được trong mẫu nghiên cứu

- Định nhóm máu hệ ABO, Rh và nhóm kháng nguyên bạch cầu HLA

2.3.4.2 Các chỉ tiêu thu hoạch tế bào gốc từ tuỷ xương

- Đặc điểm sức khoẻ người cho tuỷ: cân nặng > 55 kg, không có các bệnh truyền nhiễm(HIV, HBV, HCV, giang mai, sốt rét và các bệnh khác) không có các bệnh di truyền hoặc đột biến gen

- Các chỉ số huyết học, miễn dịch , hoá sinh trước khi lấy tuỷ

- Số lượng tế bào CD34/ ml dịch tuỷ xưong

2.3.4.3 Các chỉ tiêu thu hoạch tế bào gốc từ máu cuống rốn

- Tiêu chuẩn người cho (mẹ và con)

- Thể tích máu thu được

- Các chỉ số huyết học, miễn dịch (Các CD 3, 4, 8, 19; HLA- A, B, DR)

- Số lượng tế bào gốc CD34/ml máu cuống rốn

2.3.4.4 Các chỉ tiêu nghiên cứu xử lý tế bào gốc cho bảo quản dài ngày

- Các chỉ tiêu nghiên cứu loại bớt khối hồng cầu:chỉ tiêu loại > 50% + Xác định quy trình ly tâm thích hợp

+ Chọn qui trình mà ở đó số lượng hồng cầu bị loại tối đa (>50%), tế bào CD34 mất tối thiểu (<15%)

- Chỉ tiêu loại bớt huyết tương, sao cho dịch tế bào còn lại có độ đậm đặc

là 2.5 x108/ml huyết tương tự thân, chỉ tiêu huyết tương còn lại < 30%

+ Chỉ tiêu tế bào sống đạt > 95%

2.3.4.5.Các chỉ tiêu nghiên cứu bảo quản lạnh sâu - 196 0 C tế bào gốc

từ máu ngoại vi, tuỷ xương, máu cuống rốn

+ Tỷ lệ tế bào sống ngay sau khi tan đông hoàn toàn đạt> 90%

+ Tỷ lệ tế bào sống sau khi tan đông hoàn toàn, theo dõi ở nhiệt độ phòng sau 15’ đạt > 80%

2.3.4.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu khả năng sinh sản và biệt hoá tế bào gốc:

- Số lượng cụm (Colonies)

- Định loại các colony

2.3.6 Các kỹ thuật sử dụng cho nghiên cứu:

• Định nhóm máu hệ ABO, Rh bằng huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu tại viện Huyết học – Truyền máu TW nhóm kháng nguyên bạch cầu HLA bằng phương pháp vi độc tế bào (micro-cytotoxicyty) của Terasaki[70]

• Kỹ thuật phân lập T lympho cho định nhóm HLA lớp I( HLA-A, B) và

B lympho cho HLA lớp II (HLA- DR) bằng bông nilon(phụ lục 1)

• Kỹ thuật xác định số lượng tế bào máu bằng máy đếm tế bào tự động XT-2000i (Nhật), tại viện Huyết học – Truyền máu TW

• Kỹ thuật xác định dấu ấn màng tế bào CD34 bằng kháng thể đơn dòng của hãng Becton- Dickinson trên máy đếm tế bào theo dòng chảy FACS – Callibur (Nhật) tại BV TW quân đội 108

• Kỹ thuật xác định các dấu ấn tế bào T (CD 3, 4, 8) tế bào B (CD19): bằng kháng thể đơn dòng của hãng Becton- Dickinson tại viện HH-TM TW

• Kỹ thuật xác định các virus lây truyền qua đường truyền máu: kỹ thuật ELISA thế hệ 3 (Mix test) phát hiện anti-HIV 1và 2, ELISA thế hệ 3 (Mix test) phát hiện anti HCV, HBsAg, giang mai, sốt rét tại viện HH-TM TW (14)

• Kỹ thuật đông lạnh tế bào ở - 1960C tại BV TW quân đội 108 (64, 5)

• Kỹ thuật nuôi cấy đơn dòng hỗn hợp (Mix colony culture): sử dụng môi trường methylcellulose với các chất kích thích tổng hợp gồm: GF, IL-3, IL-6, Il-

1, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, erythropoietin, thrombopoietin[32] được thành từ một tế bào gốc trong môi trường nuôi cấy bán lỏng và được coi là colony khi có

từ 20 tế bào trở lên(32) bao gồm: các colony đa dòng: CFU- GEMM, CFU - GM, các colony đơn dòng: CFU - E, CFU - G, CFU - M, CFU - Meg (hình 3)

Hình 3: Các dạng colony nuôi cấy Invitro (trang sau)

B

Hình ảnh tạo cụm (colony) của tế bào gốc a dòng tuỷ

Hình ảnh tạo cụm tế bào gốc ầu dòng hồng cầu

đ đ

(A) (B)

Theo tµi liÖu cña Broxmeyer (32)

H.3a:

Hình ảnh tạo cụm (colony) của tế bào gốc đầu dòng hồng cầu H.3b:

Hình ảnh tạo cụm (colony) của tế bào gốc

ầu dòng bạch cầu hạt/ mono (CFU-GM)

Tế bào phân tán diện rộng đ

Theo tµi liÖu cña Broxmeyer (32)

H.3c:

Hình ảnh tạo cụm (colony) của tế bào gốc mẫu tiểu cầu

Theo tµi liÖu cña Broxmeyer (32)

H.3d:

2.2.7 Xử lý số liệu

- Các số liệu thu thập được xử lý bằng toán thống kê y sinh học để tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn Sử dụng các thuật toán để so sánh các giá trị trung bình và tính toán các mối tương quan

- Sử dụng các phần mềm thống kê y học: EPI - INF0 6.04 , SPSS 13, Excel

2.2.8 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2003 đến tháng 12/2007 tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bộ môn Huyết học - Truyền máu trường

Đại học Y học Hà Nội, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Khoa Sản bệnh viện Bạch mai và bệnh viện Phụ sản Hà Nội

2.2.9 Khía cạnh đạo đức của đề tài

Tiến hành nghiên cứu này chúng tôi cam kết thực hiện với tinh thần trung thực, áp dụng các nguyên lý về nghiên cứu và đạo đức nghiên cưú Chúng tôi cam kết chỉ thực hiện thu thập mẫu nghiên cứu khi được sự đồng ý của những người cho và sản phụ tình nguyện, sau khi đã giải thích rõ mục đích, các bước tiến hành và những tác dụng không mong muốn có thể xảy ra Việc thu thập mẫu không ảnh hưởng đến sức khoẻ của người cho, của sản phụ cũng như trẻ sơ sinh Các thông tin về mẫu nghiên cứu được đảm bảo bí mật Và trên hết chúng tôi tiến hành nghiên cứu mục đích cung cấp những thông tin hữu ích,

đầy đủ hơn để tiến hành tới cung cấp nguồn tế bào gốc an toàn, hiệu quả cao phục vụ cho nhu cầu ghép tế bào gốc điều trị nhằm đem lại hạnh phúc cho nhiều bệnh nhân hơn nữa

Chương 3

Kết quả nghiên cứu

3.1 Kết quả thu gom TBG tạo máu từ các nguồn khác nhau

3.1.1 Kết quả thu gom từ máu ngoại vi

3.1.1.1 Thu gom tế bào CD34 không huy động

Tiến hành thu gom 9 đơn vị tế bào từ máu ngoại vi người trưởng thành khoẻ mạnh không huy động, sử dụng quy trình chuẩn của máy tách tế bào tự

động COBE – Spectra, với thể tích mỗi lần tách từ 10 – 12 lít máu người cho, chúng tôi tiến hành khảo sát các chỉ số tế bào CD34, các chỉ số tế bào máu và các chỉ số tế bào miễn dịch trong các sản phẩm Kết quả thu được trình bày lần lượt từ bảng 1 đến bảng 3

Bảng 1 Số lượng bạch cầu và CD34 của đơn vị tế bào gốc

thu gom từ máu ngoại vi không huy động

Số lượng bạch cầu 109/1 78.99 ± 13.09 58.8 – 96.2 Tổng số bạch cầu trong đơn vị 109 16.7 ± 2.3 12.9 – 19.6

Tỷ lệ tế bào CD34 % 0.074 ± 0.028 0.03 – 0.14

Số lượng tế bào CD34 106 /ml 0.05 ± 0.03 0.02 – 0.09 Tổng số tế bào CD34 trong đơn vị 106 12.17 ± 3.67 8.56 – 18.80

Nhận xét:

- Số lượng bạch cầu trung bình thu được khá cao (78.99 ± 13.09 x

109) và tổng số bạch cầu trong đơn vị tế bào thu được đạt 16.7 ± 2.3 (G/l) Nhưng do tỷ lệ tế bào CD34 lưu hành ở máu ngoại vi trong điều kiện bình thường rất thấp nên kết quả số lượng tế bào CD34 chúng tôi thu được rất thấp, trung bình là 12.17 ±3.67 x 106/ đơn vị, từ khoảng 8.54 đến 18.8 x

106 đối vơí từng lần tách

- Tỷ lệ tế bào CD34 trong sản phẩm thu được là: 0.074 ± 0.028% và tương đương với số lượng là 0.06 ±0.025 x 106/ml sản phẩm