Nghiên cứu vắc xin cúm a-h1n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào MDCK

Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Kiểm tra chủng virút cúm A/H1N1 gốc MSV và chủng vir

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ Bé Y tÕ

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN TẾ BÀO THẬN KHỈ TIÊN PHÁT VÀ TẾ BÀO MDCK

Mã số ĐTĐL.2009G/53

Chủ nhiệm đề tài : TS ĐỖ THỦY NGÂN

Cơ quan chủ trì : CÔNG TY VẮCXIN VÀ SINH PHẨM SỐ 1

9156

Hµ Néi - 2011

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ Bé Y tÕ

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN TẾ BÀO THẬN KHỈ TIÊN PHÁT VÀ TẾ BÀO MDCK

Mã số ĐTĐL.2009G/53

Hµ Néi - 2011

Chủ nhiệm đề tài

TS Đỗ Thủy Ngân

Cơ quan chủ trì đề tài

GS TSKH Nguyễn Thu Vân

Bộ Khoa học và Công nghệ

CÔNG TY VẮCXIN VÀ SINH PHẨM SỐ 1

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên: ĐỖ THỦY NGÂN

Ngày, tháng, năm sinh: 07- 07 - 1959 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Chức vụ: Trưởng phòng Điện thoại:

Tổ chức: (04) 39720132 Nhà riêng: (04)38220100 Mobile: 0912396133 Fax: (04) 39717711 E-mail: dtngan@vabiotech.com.vn

Tên tổ chức đang công tác: Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1

Địa chỉ tổ chức: 1 Yersin, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 32 Nguyễn Thượng Hiền, Hà Nội

Website: http://www.vabiotech.com.vn

Địa chỉ: 1 Yersin, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Thu Vân

Số tài khoản: 311.11.002381

Ngân hàng: TMCP Sài Gòn Thương Tín

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 10/ năm 2009 đến tháng 11/ năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 10/ năm 2009 đến tháng 05/ năm 2011

- Được gia hạn (nếu có):

- Lần 1 từ tháng 12 năm 2010 đến tháng 05 năm 2010

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2.000 triệu đồng, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1.200 triệu đồng

+ Kinh phí từ các nguồn khác: 800 triệu đồng

+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): …………

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

2

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

- Lý do thay đổi (nếu có):

1 Khoản chi công lao động để Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế trong thực tế thấp hơn giá xây dựng trong kế hoạch

2 Khoản chi nguyên, vật liệu và năng lượng trong thực tế thấp hơn so với giá xây dựng trong kế hoạch

3 Khoản chi khác: Chi phí đăng ký bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ thấp hơn giá xây dựng trong kế hoạch

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

Ghi chú

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Viện Vệ sinh Dịch

tễ Trung ương Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Kiểm tra chủng virút cúm A/H1N1

gốc (MSV) và chủng virút cúm A/H1N1 sản xuất (WSV) cho cả 2 dòng tế bào PMKc

và MDCK

- Thử nghiệm thử thách hiệu lực của vắcxin cúm A/H1N1 với chủng hoang dại trên chuột nhắt trắng

- Chủng virút cúm A/H1N1 gốc và chủng virút cúm A/H1N1 sản xuất trên cả 2 dòng tế bào PMKc và MDCK

- Bản báo cáo khả năng bảo vệ của vắcxin cúm A/H1N1 trên chuột nhắt trắng

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 TS Đỗ Thủy Ngân TS Đỗ Thủy Ngân Thực hiện các

phương pháp kiểm tra chất lượng và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở., đánh, Đánh giá tính an toàn và hiệu lực vắcxin trên động vật thí nghiệm

- Quy trình sản xuất

- Các loạt sản xuất vắcxin thử nghiệm

- Tiêu chuẩn cơ sở

- Báo cáo về tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên động vật thí nghiệm

sở

- Quy trình sản xuất

- Các loạt sản xuất vắcxin thử nghiệm

- Phương pháp kiểm tra chất lượng

- Tiêu chuẩn cơ sở

3 TS Đỗ Tuấn Đạt TS Đỗ Tuấn Đạt Xây dựng qui trình

sản xuất, sản xuất thử nghiệm các loạt vắcxin

- Quy trình sản xuất

- Các loạt vắcxin sản xuất thử nghiệm

4 Ths Trịnh Tuấn

Việt

Ths Trịnh Tuấn Việt

Xây dựng quy trình sản xuất, sản xuất thử nghiệm các loạt vắcxin, kiểm tra chất lượng vắcxin

- Quy trình sản xuất

- Các loạt vắcxin sản xuất thử nghiệm

Thẩm định các kết quả và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở

8 Ths Đoàn Văn

Lưu Ths Đoàn Văn Lưu Xây dựng quy trình nuôi cấy và chuẩn bị

tế bào PMKc, sản xuất thử nghiệm các loạt vắcxin

- Quy trình nuôi cấy

và chuẩn bị tế bào PMKc, các loạt vắcxin thử nghiệm

9 TS Lê Thị Quỳnh

Mai TS Lê Thị Quỳnh Mai Kiểm tra hệ thống chủng, tiến hành thử

nghiệm thử thách

Bộ hồ sơ chủng virút, báo cáo khả năng bảo

vệ của vắcxin trên chuột nhắt

10 Ths Hoàng Vũ

Mai Phương

Ths Hoàng Vũ Mai Phương

Kiểm tra hệ thống chủng, tiến hành thử nghiệm thử thách

Bộ hồ sơ chủng virút, báo cáo khả năng bảo

vệ của vắcxin trên chuột nhắt

- Lý do thay đổi ( nếu có): Cn Vũ Hồng Nga không tham gia tiếp vào Đề tài

do chuyển công tác sang cơ quan khác

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số

lượng người tham gia )

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1 Nội dung : Hội thảo nghiên cứu sản

xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế bào

thận khỉ tiên phát hoặc MDCK

Thời gian : 2010

Kinh phí : 20,000 triệu đồng

Địa điểm : VABIOTECH

Nội dung : Hội thảo nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát hoặc MDCK Thời gian : tháng 8/2010 Kinh phí : 20,000 triệu đồng Địa điểm : VABIOTECH

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 Xây dựng quy trình công nghệ

sản xuất vắcxin cúm A/H1N1

trên tế bào thận khỉ tiên phát

10-12/2009

10/2009-02/2010

Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Tuấn Đạt, Trịnh Tuấn Việt, Đinh Thị Thúy Vân, Đoàn Văn Lưu

(VABIOTECH)

2 Xây dựng quy trình công nghệ

sản xuất vắcxin cúm A/H1N1

trên tế bào MDCK

10-12/2009

10/2009-03/2010 Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Tuấn Đạt,

Trịnh Tuấn Việt, Đinh Thị Thúy Vân, Đoàn Văn Lưu

(VABIOTECH)

3 Sản xuất 10.000 liều vắcxin cúm

A/H1N1 đạt tiêu chuẩn thử

nghiệm lâm sàng

01-08/2010 04/2010

-01/2011 Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn Quế Anh, Đỗ Tuấn Đạt,

Trịnh Tuấn Việt, Đoàn Văn Lưu, Nguyễn Thu Vân (VABIOTECH)

4 Đánh giá tính an toàn và hiệu lực

của vắcxin cúm A/H1N1 trên

động vật thí nghiệm

09-10/2009 02-05/2011 Đỗ Thủy Ngân,

(VABIOTECH), Lê Thị Quỳnh Mai, Hoàng Vũ Mai Phương (Viện VSDTTƯ)

5 Báo cáo tổng kết và đánh giá

nghiệm thu

10/2010 04-05/2011 Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn

Thu Vân, Đỗ Tuấn Đạt, Trịnh Tuấn Việt

(VABIOTECH)

- Lý do thay đổi (nếu có): Đề tài gặp một số khó khăn do hiện chưa có các sinh phẩm chuẩn cho chuẩn độ hiệu giá vắcxin cúm sản xuất trên nuôi cấy tế bào nên nhóm nghiên cứu của Đề tài phải đầu tư thêm thời gian để tự nghiên cứu và xây dựng lên các hệ thống sinh phẩm chuẩn này

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

7 Vắcxin cúm A/H1N1 trên

nuôi cấy tế bào PMKc hoặc

MDCK

liều 03 loạt liên tiếp

(10.000 liều vắcxin cúm A/H1N1)

03 loạt liên tiếp (10.167 liều vắcxin cúm A/H1N1 trên nuôi tế bào PMKc)

- Lý do thay đổi (nếu có):

1 Đề cương đề tài Theo đúng các hướng dẫn

của Bộ Khoa học và Công nghệ

Theo đúng các hướng dẫn của Bộ Khoa học và Công nghệ

2 Bộ hồ sơ chủng giống

gốc và chủng sản xuất

vắcxin cúm A/H1N1

Theo đúng các hướng dẫn của Viện Quốc gia kiểm định vắcxin và sinh phẩm

y học và của TCYTTG

Theo đúng các hướng dẫn của Viện Quốc gia kiểm định vắcxin và sinh phẩm

y học và của TCYTTG

3 Quy trình công nghệ sản

xuất vắcxin cúm A/H1N1

trên tế bào thận khỉ hoặc

tế bào MDCK

Quy trình ổn định các thông số và đảm bảo chất lượng của các sản phẩm sản xuất theo quy trình này

Quy trình ổn định các thông số và đảm bảo chất lượng của các sản phẩm sản xuất theo quy trình này

4 Bảng Tiêu chuẩn cơ sở

cho vắcxin cúm A/H1N1 Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Quốc gia và

quốc tế

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Quốc gia và quốc tế

5 Các phương pháp đánh

giá tính an toàn và hiệu

lực của vắcxin trên động

vật thực nghiệm

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Tổ chức y

tế thế giới

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Tổ chức y

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Quốc gia và quốc tế

7 Bản báo cáo khả năng

bảo vệ của vắcxin trên

chuột nhắt

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Quốc gia và quốc tế

Theo đúng các hướng dẫn hiện hành của Quốc gia và quốc tế

Theo đúng các nội dung

và mục tiêu đã đăng ký trong đề cương nghiên cứu

- Lý do thay đổi (nếu có):

y dược và thể lệ gửi bài đăng báo do cơ quan công bố đề ra

Theo đúng yêu cầu khoa học của một bài báo nghiên cứu y dược và thể lệ gửi bài đăng báo do tạp chí Y học dự phòng đề ra

01 bài, Tạp chí Y học Dự phòng, số 2, năm 2011

y dược và thể lệ gửi bài đăng báo do cơ quan công bố đề ra

Theo đúng yêu cầu khoa học của một bài báo nghiên cứu y dược và thể lệ gửi bài đăng báo do tạp chí Y học thực hành đề ra

01 bài, Tạp chí Y học Thực hành, số

5, năm 2011

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Thạc sỹ

2 Tiến sỹ

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Quy trình sản xuất vắcxin

cúm trên tế bào thận khỉ tiên

phát PMKc

Đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp

Đang viết bản mô tả để nộp đơn yêu cầu cấp bằng độc quyền sáng chế

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công

nghệ so với khu vực và thế giới…)

Thừa hưởng, phát huy những kết quả nghiên cứu của đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm” mã số ĐTĐL-2006/02G, tham khảo các quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm trên thế giới, nhóm nghiên cứu đã tiến hành một số thay đổi, cải tiến trong các công đoạn của quy trình để xây dựng một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 hoàn chỉnh ở quy mô phòng thí nghiệm có chất lượng, mang tính thực tiễn cao Các nhà khoa học của Đề tài đã hoàn toàn làm chủ được quy trình công nghệ sản xuất tiên tiến này và đã cho ra đời những loạt sản phẩm đầu tiên ở quy mô phòng thí nghiệm đạt các yêu cầu về tiêu chuẩn chất lượng tại cơ sở

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Giá thành của vắcxin cúm A/H1N1 theo dự tính có thể rẻ hơn một nửa

so với các vắcxin nhập ngoại trên thị trường Từ thành công của việc sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 này có thể hướng đến việc sản xuất vắcxin cúm mùa trong tương lai để phục vụ trong chương trình tiêm chủng mở rộng cũng như khi có đại dịch cúm xảy ra

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo định kỳ lần 1 30/03/2010 - Đề cương chi tiết

- Các chủng virút cúm A/H1N1 giống gốc và giông sản xuất trên tế bào PMKc

- Các chủng virút cúm A/H1N1 giống gốc và giống sản xuất trên tế bào MDCK

- Tế bào MDCK giống gốc và giống sản xuất

- Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế bào PMKc

- Đang sản xuất các loạt vắcxin thử nghiệm

II Kiểm tra định kỳ lần 1 01/04/2010 - Hoàn thiện bản báo cáo định kỳ

- Đảm bảo tiến độ nội dung công việc

- Quy trình sản xuất vắcxin cần đánh, thẩm định bởi các chuyên gia

- Khẩn trương hoàn thiện mua sắm nguyên vật liệu

- Cố gắng thúc đẩy tiến độ để hoàn thành trước thời hạn

- Người chủ trì: TS Lê Minh Sắt

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

BÁO CÁO T ỔNG HỢP KẾT QUẢ CỦA đề tài

1.1.6 Sinh bệnh học 14

1.1.8 Đặc điểm dịch tễ học 15

1.4 Đặc điểm dịch tễ học dịch cúm A/H1N1 và tình hình nghiên cứu và

CHƯƠNG 2- XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VẮCXIN CÚM A/H1N1 TRÊN TẾ BÀO THẬN KHỈ TIÊN PHÁT

(PMKc) 28 2.1 Thích ứng chủng cúm A/H1N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát PMKc

29 2.2 Sản xuất, kiểm tra chủng gốc (MSV) và chủng sản xuất (WSV) để

2.2.3 Các phương pháp kiểm tra chủng giống virút cúm A/H1N1 332.2.4 Kết quả xây dựng hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin cúm

2.3 Quy trình nuôi cấy và chuẩn bị tế bào PMKc 37

2.3.2 Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu 42

2.4 Quy trình gây nhiễm virút cúm A/H1N1 vào tế bào PMKc 44 2.5 Quy trình gặt và tinh sạch hỗn dịch virút nuôi cấy trên PMKc 46 2.6 Quy trình bất hoạt virút trên nuôi tế bào PMKc 48

2.6.1 Các thử nghiệm kiểm tra hiệu quả bất hoạt 482.6.2 Kết quả bất hoạt virút cúm theo các điều kiện khác nhau 52

2.7 Quy trình cô đặc thẩm tích hỗn dịch virút trên nuôi tế bào PMKc 55

2.7.1 Phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng

CHƯƠNG 3- XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

3.1 Sản xuất ngân hàng tế bào MDCK gốc (MCB) và ngân hàng tế bào

3.2 Sản xuất, kiểm tra chủng virút cúm A/H1N1 gốc (MSV) và chủng

virút cúm A/H1N1 sản xuất (WSV) trên dòng tế bào MDCK 70

3.2.2 Sản xuất, kiểm tra chủng virút gốc trên dòng tế bào MDCK 713.2.3 Sản xuất, kiểm tra chủng virút sản xuất trên dòng tế bào MDCK 723.2.4 Kết quả xây dựng hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin cúm

3.4 Quy trình gây nhiễm virút cúm A/H1N1 vào tế bào MDCK 75 3.5 Quy trình gặt và tinh sạch hỗn dịch virút nuôi cấy trên MDCK 77 3.6 Quy trình bất hoạt hỗn dịch virút trên nuôi tế bào MDCK 77 3.7 Quy trình cô đặc thẩm tích hỗn dịch virút trên nuôi tế bào MDCK 77 3.8 Quy trình tinh chế virút cúm trên nuôi tế bào MDCK 78

3.8.1 Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào MDCK tồn dư trong các sản

phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phương pháp lai điểm

783.8.2 Kết quả quá trình tinh chế virút cúm trên nuôi tế bào MDCK 82

CHƯƠNG 4- SẢN XUẤT 10.000 LIỀU VẮC XIN CÚM A/H1N1 ĐẠT

4.2 Kết quả gây nhiễm và nuôi cấy virút cúm A/H1N1 vào tế bào PMKc 86

4.5 Kết quả cô đặc, thẩm tích tinh khiết hỗn dịch virút 88

4.7 Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm 89 4.8 Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở 89

4.8.1 Các phương pháp kiểm tra sinh học 90

4.8.3 Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin cúm A/H1N1 thành phẩm tại

cơ sở 113

4.9 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin cúm A/H1N1 trên nuôi tế bào

PMKc 114 CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA

VẮCXIN CÚM A/H1N1 TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 116 5.1 Các phương pháp đánh giá tính an toàn và hiệu lực vắcxin trên động

vật thí nghiệm 116

5.1.1 Các phương pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin cúm A/H1N1

trên động vật thí nghiệm 1165.1.2 Phương pháp đánh giá hiệu lực của vắcxin cúm A/H1N1 117

5.2 Kết quả đánh giá tính an toàn và hiệu lực vắcxin cúm A/H1N1 trên

động vật thí nghiệm

124

5.2.1 Tính an toàn của vắcxin cúm A/H1N1 trên động vật thực nghiệm

1245.2.2 Hiệu lực của vắcxin cúm A/H1N1 trên động vật thực nghiệm 125

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axít desoxyribonucleic (Desoxyribonucleic acid)

ARN Axít ribonucleic (Ribonucleic acid)

CCID50 Liều gây nhiễm 50% tế bào (Cell Culture Infectious Dose 50) CDC Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ

(Centers fỏ Disease Control and Prevention) CPE Tác động gây hủy hoại tế bào (Cytopathic effect)

ED50 Liều gây miễn dịch 50% (Effective dose 50)

HA Ngưng kết hồng cầu (Haemaglutinin)

HI Ức chế ngưng kết hồng cầu (Heamaglutinin Inhibition)

LD50 Liều gây chết 50% (Lethal Dose 50)

MCB Ngân hàng tế bào giống gốc (Master Cell Bank)

MDCK Tế bào thận chó thường trực (Madin-Darby Canine Kidney) MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium)

MSV Chủng virus giống gốc (Master seed virus)

MWCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Manufacturing Working Cell Bank)NIBSC Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vương

quốc Anh (National Institute for Biological Standards and Control) PMKc Tế bào thận khỉ tiên phát (Primary Monkey Kidney cell)

SDS-PAGE Điện di trên gel acrylamide

(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) SRID Miễn dịch khuyêch tán vòng trong đơn

(Single Radial Immuno Diffusion)

SPF Không có các tác nhân gây bệnh đặc biệt

(Specific Pathogens Free) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

VABIOTECH Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1

WSV Chủng virus giống sản xuất (Working seed virus)

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Kết quả thích ứng các chủng virút cúm trên tế bào PMKc 302.2 Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế

1:4000 532.8 Kết quả bất hoạt virút cúm A/H1N1 ở nồng độ formaldehyde

1:2000 542.9 Kết quả gây miễn dịch trên các động vật thực nghiệm 622.10 Kết quả so sánh tính gây miễn dịch của vắcxin có và không có

chất hấp phụ 633.1 Kết quả thích ứng chủng virút cúm A/H1N1 trên tế bào MDCK 713.2 Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế

3.7 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm quá trình tinh chế 844.1 Kết quả nuôi cấy và chuẩn bị tế bào PMKc của các loạt sản xuất

thử nghiệm 864.2 Kết quả gây nhiễm virút cúm của các loạt sản xuất thử nghiệm 864.3 Kết quả gặt và tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử

nghiệm 874.4 Kết quả bất hoạt hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

4.5 Kết quả cô đặc thẩm tích hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử

nghiệm 884.6 Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng các loạt sản xuất thử

nghiệm 894.7 Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử

nghiệm 894.8 Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các

loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin cúm A/H1N1 (PANFLUVAX)

5.3 So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin cúm A/H1N1 trên nuôi tế

5.4 Khả năng bảo vệ của vắcxin cúm PANFLUVAX trong thử nghiệm

thử thách bằng chủng virút cúm A/H1N1 hoang dại 127

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2.1 Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1

2.2 Quy trình sản xuất hệ chủng cúm A/H1N1 giống gốc 312.3 Quy trình sản xuất hệ chủng cúm A/H1N1 giống sản xuất 32

2.6 Kết quả siêu ly tâm trong một nồng độ đường sucrose 592.7 Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE sản phẩm sau khi

2.9 Quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên nuôi tế bào PMKc 653.1 Quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên tế bào MDCK 693.2 Quy trình sản xuất chủng virút cúm A/H1N1 giống gốc trên

MỞ ĐẦU

Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 đầu tiên, ngay sau đó bệnh dịch đã lây lan một cách nhanh chóng buộc Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) phải thông báo dịch ở cấp độ 4 và ngày 30/4 nâng lên mức cấp độ 5 do dịch duy trì tại cộng đồng nhiều quốc gia

ở châu Âu, Canada, Hoa kỳ và một số nước châu Á Đến ngày 11/6/2009, TCYTTG đã công bố dịch cúm A/H1N1 thành đại dịch trên toàn cầu và đồng thời cũng công bố không có biện pháp nào có thể ngăn chặn được sự lây lan của dịch

Ngày 17/4/2009, Hoa Kỳ báo cáo có 2 trường hợp tại bang California bị nhiễm cúm A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn Theo thông báo số 67 của (TCYTTG), đến ngày 20/9/2009, toàn thế giới đã ghi nhận 318.925 trường hợp dương tính với cúm A(H1N1), trong đó có 3.917 trường hợp tử vong, tại

191 quốc gia Tại khu vực nam bán cầu, một số nước ghi nhận số ca tử vong cao như Australia (178), Chi Lê (132), Argentina (538), Brazil (899), Peru (143) Tại khu vực Đông Á và Đông Nam Á, tình hình dịch tiếp tục diễn biến phức tạp: Ấn Độ đã ghi nhận 302 trường hợp tử vong do cúm A(H1N1); Nhật Bản (tử vong: 18); Hàn Quốc (tử vong: 11); Philippine (tử vong: 28); Singapore (tử vong: 18); Malaysia (tử vong: 77); Indonesia (tử vong: 10) Thái Lan (tử vong: 160) Việt Nam là nước thứ 54 thông báo các trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 Tính đến 17h00 ngày 30/9/2009, Việt Nam đã ghi nhận

9058 trường hợp dương tính, 16 trường hợp tử vong

Biện pháp phòng bệnh chủ động và hữu hiệu nhất vẫn là vắcxin, chính vì vậy ngay sau khi công bố đại dịch, Bà Margaret Chan -Tổng giám đốc TCYTTG cùng Ông Ban Ki Moon -Tổng thư ký LHQ đã tổ chức một

cuộc họp khẩn cấp gồm 30 nhà sản xuất vắcxin hàng đầu trên thế giới, trong

đó có Việt Nam để triển khai kế hoạch sản xuất vắcxin phòng đại dịch cúm A/H1N1 trên toàn cầu Các phòng thí nghiệm chuẩn thức về cúm của TCYTTG tại CDC (Hoa Kỳ), TGA (Australia) và NIBSC (Anh Quốc) đã bắt tay vào việc nghiên cứu điều chế chủng sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp di truyền ngược như đã được sử dụng để điều chế chủng sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 trước đây nhằm cung cấp cho các nhà sản xuất trên toàn thế giới Sau khoảng 04 tháng nghiên cứu, các chủng virut vắcxin đã sẵn sàng để cung cấp cho những nơi có nhu cầu

Ngay từ những trường hợp bệnh nhân mắc cúm A/H1N1/09 đại dịch ở Việt Nam đầu tiên được phát hiện, các nghiên cứu về virut học đã được triển khai tại Viện VSDTTƯ Kết quả phân tích bước đầu về các chủng virut cúm A/H1N1/09 phân lập từ các bệnh nhân nhập cảnh từ Mỹ, Úc, Canada cho thấy gene HA của 4 virut trên có độ tương đồng cao với toàn bộ các chủng virut A/H1N1 mới đang lưu hành trên thế giới từ 99%-100% Với các kết quả phân tích này cho thấy Việt Nam có thể sử dụng các chủng virut cúm của quốc tế cung cấp để sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 để phòng chống đại dịch này

Trong năm 2004, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1 đã hợp tác với một số phòng thí nghiệm trường Đại học Quốc gia Tokyo, Nhật Bản nhận tiếp thu chuyển nhượng kỹ thuật di truyền ngược trong việc tạo ra một chủng vắcxin cúm rg H5N1 để sử dụng cho việc phát triển một vắcxin phòng cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam 06 loạt vắcxin cúm A/H5N1 liên tiếp đã được tiến hành sản xuất thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm và kiểm tra chất lượng về các tiêu chuẩn yêu cầu cho việc phát triển một vắcxin cúm A/H5N1 của TCYTTG Kết quả cho thấy tất cả các loạt đều đạt các tiêu chuẩn cho một vắcxin cúm về các mặt an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang, công hiệu (SRID), trên gà, chuột

nhắt, khỉ, thành phần hóa học, chí nhiệt tố Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn

I, II đã hoàn thành và chuẩn bị tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III trong thời gian sắp tới Với kết quả thu được trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I và II cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 cho kết quả an toàn trên những người tình nguyện, không có các phản ứng không mong muốn trầm trọng, chủ yếu chỉ là đau tại chỗ tiêm thoảng qua và tự khỏi sau 24 giờ mà không cần điều trị, cũng như các triệu chứng tại chỗ và toàn thân khác Các chỉ số sinh hóa học ở những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường Vắcxin cúm A/H5N1 sản xuất trên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt phù hợp với tiêu chuẩn của châu Âu ở tất các các đối tượng được tiêm từ liều 7,5 mcg trở lên

Dựa trên các kết quả nghiên cứu này cho thấy qui trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát là ổn định, an toàn và đáp ứng miễn dịch tốt, nhóm nghiên cứu sẽ áp dụng công nghệ này để sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 Tuy nhiên, sản xuất vắcxin cúm trên tế bào thận khỉ tiên phát là đảm bảo chất lượng, nhưng để phòng chống đại dịch thì lượng khỉ cung cấp để sản xuất số lượng lớn có thể sẽ gặp khó khăn vì vậy trong

đề tài này cũng đặt ra một hướng nghiên cứu mới là nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên cả dòng tế bào thận chó thường trực (MDCK) để chủ động về nguồn nguyên liệu đầu cung cấp cho sản xuất và đây cũng là xu hướng phát triển trong tương lai trên toàn thế giới

Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài:

1 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 trên

tế bào thận khỉ tiên phát hoặc tế bào MDCK

2 Sản xuất 10.000 liều vắcxin cúm A/H1N1 đạt tiêu chuẩn thử nghiệm lâm sàng

3 Đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin cúm A/H1N1 trên động vật thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH CÚM

1.1.1 Đặc điểm chung của virút cúm

Các virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ

gen dạng sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lượt mã hoá cho các protein

PA, PB1, PB2, NS, M, NP, HA, NA của virút (cúm A, B) Họ

Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, và

Thogovirút Virút cúm B và C thường chỉ gây nhiễm cho người trong khi phần lớn virút cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây nhiễm cho người và các động vật khác như lợn, ngựa Virút cúm A, B và C khác nhau về tính kháng nguyên của nucleocapsit (NP) và protein Matrix (M) Trong đó virút cúm A lại được chia thành các phân týp dựa theo cấu trúc kháng nguyên của hemagglutinin (HA) và neuramidaza (NA) glycoprotein Chủng virút cúm được đặt tên theo nguồn gốc phân lập, vùng địa lý phân lập,

số chủng, năm phân lập Đồng thời tên chủng virút cũng nói lên phân týp kháng nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidaza (NA) của chủng đó (ví

dụ A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Có 16 phân týp HA và 9 phân týp NA; các phân týp khác nhau ít nhất 30% trình tự axít amin Từ năm 1983 đến nay, không có thêm phân týp mới nào được phát hiện, điều này cho thấy có một số giới hạn về sự biến chủng của virút cúm A [1]

1.1.2 Cấu trúc virion

Thành phần của các virút trong họ Orthomyxoviridae bao gồm 1%

ARN, 70% protein, 20% lipit và 5 đến 8% carbonhydrat [2] Lớp màng lipit của virút cúm được tạo thành từ màng bào tương của tế bào chủ nơi virút nhân lên [2].Virút cúm A và B có cấu trúc giống nhau trong khi virút cúm C

có cấu trúc khác biệt với các gai glycoprotein sắp xếp theo hình 6 cạnh Virút

cúm A và B nuôi cấy trên tế bào hoặc trứng có hình dạng thông thường đường kính 80-120 nm Ngược lại, virút cúm phân lập từ người và động vật sau đó được cấy truyền một lần trên tế bào thường có hình thái khác biệt và đa dạng Hình thái virút cúm A là một kiểu gen riêng biệt [3] nhưng phụ thuộc rất nhiều vào loại tế bào chủ khi virút nhân lên [4]

Đặc điểm hình thái nổi bật của virion cúm A là lớp bao gồm 500 gai (10-14 nm) xòe ra phía ngoài lớp lipit Có 2 loại gai khác nhau: Gai hình gậy

là kháng nguyên HA và gai hình nấm là kháng nguyên NA Tỷ lệ HA:NA thường dao động nhưng thông thường từ 4:1 cho đến 5:1 Protein matrix M1 được cho là nằm dưới lớp lipit kép và liên kết với Ribonucleoprotein (RNP) lõi của virút M1 là protein có nhiều nhất trong virion

Bằng phương pháp cắt lớp mỏng tiêu bản có các hạt virút hoặc phá vỡ hạt, cấu trúc RNP có thể được chia thành nhiều lớp có kích thước khác nhau và chứa 8 đoạn gen của ARN đơn [5]

Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN NP là protein tiểu đơn vị nổi trội của nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu đơn vị NP Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc – ARN bao gồm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30 bản sao trong một virion [6,7] Các polymeraza protein chịu trách nhiệm gắn mũ, endonucleaza, tổng hợp ARN, polyadenyl hóa [6, 7, 8, 9, 10] (Hình 1.1)

Protein NS2 là protein thứ hai do đoạn ARN 8 mã hóa, có khoảng

130-200 phân tử trong 1 virion và tạo thành phức hợp với protein M1 [11,12] là mối liên kết cần thiết trong chu trình sống của virút để giải phóng phức hợp RNP từ nhân [13]

Hình 1.1 Cấu trúc hạt virút cúm A/H1N1

1.1.3 Cấu trúc hệ gen virút cúm và các protein mã hóa

Hệ gen của virút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi virút cúm C có 7 đoạn gen (không có gen NA) Cấu trúc hệ gen của virút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN virút trên gen polyacrylamit [14,

15, 16, 17, 18, 19, 20] Cấu trúc gen của virút cúm như sau: Đoạn gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn 2 cho PB1, đoạn 3 cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho

NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2 Trình tự nucleotit của ARN virút cúm PR8/34 và rất nhiều phân týp khác đã được công

bố từ năm 1982 [21].Virút cúm PR8/34 có 13.588 nucleotit

Polymerase của gia cầm

Polymerase gia cầm

(Gắn với thụ thể trên

Polymerase gia cầm Nguồn gốc từ người hoặc lợn Nguồn gốc

từ lợn Nguồn gốc từ người hoặc lợn Nguồn gốc

từ lợn

Bảng 1.1 Hệ gen virút cúm A và các protein mã hóa

Đoạn gen Chiều dài

(nucleotit)

Polypeptit

mã hóa

Chiều dài chuỗi polypeptit (axit amin)

Trọng lượng phân

tử ước tính (dalton)

Số phân tử trên 1 virion

Đoạn ARN đơn của virút cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutinin-esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa màng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở virút cúm A và B những hoạt tính này do các đoạn gen riêng biệt mã hóa Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã hóa được liệt kê trong bảng 1 Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5’ và 9-

12 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại virút cúm A, B và C [22, 23, 24]

Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2 và PA của virút A [25] và virút cúm B, C [26] Đoạn gen 1 và 2 đều dài 2,341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1 757 axit

amin Đoạn gen 3 dài 2.233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin

NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành RNP NP còn là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút cúm A, B

và C NP được đoạn ARN 5 dài 1.565 nucleotit mã hóa [27] NP chứa 498 axit amin và có trọng lượng phân tử 56.101 dalton NP của virút cúm B chứa

560 axit amin và tương đồng 47% so với virút cúm A trong khi NP của virút cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tương đồng với virút cúm A và B [28]

Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng ngưng kết hồng cầu của virút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép virút:

1 HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành

sư gắn kết giữa virút và tế bào

2 HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của virút vào tế bào bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa màng endocytosed của virút và màng nội bào làm cho nucleocapsit virút giải phóng vào trong bào tương

3 HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch cúm đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên

Đoạn ARN 4 có chiều dài từ 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho

562 đến 566 axit amin HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp trên ribosom gắn màng và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như là polypeptit đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton) Phụ thuộc vào phân týp virút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả hai dạng: Dạng tiền thân không phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 có trọng lượng 47,000 dalton và HA2 - 29.000 dalton) Qúa trình phân tách là điều kiện quyết định để virút có khả năng gây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [29] HA

chính là đoạn gen đầu tiên của virút cúm được xác định trình tự [30] HA1 có

từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221 đến 222 axit amin Tùy thuộc vào các phân týp HA, số lượng các axit amin bị phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6 HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion virút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị Tuy nhiên,

xử lý virút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên

và cấu trúc 3 chiều, có khả năng hòa tan trong nước và chứa toàn bộ HA1

cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA2 [31, 32] Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân tử Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân týp (Tyr -98, Trp - 153, His -183, Glu 190, Leu – 194) [33, 34, 35] Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau giữa khí quản người (ỏ 2, 6), hệ tiêu hóa gia cầm (ỏ 2, 3) và khí quản lợn (ỏ 2, 3 và ỏ 2, 6), số lượng các phân tử HA có thể chuyển từ loài này sang loài khác có thể bị giới hạn [36] Sự phân tách HAo thành HA1 và

HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối với hoạt tính gây nhiễm của virút [37, 38] Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K/R-R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của mạng trans-Golgi [39, 40] Đoạn HA chỉ có arginine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ

bị phân tách bởi trypsin ngoại sinh Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA

có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách có thể do yếu tố proteaza giống Xa [41] Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí phân tách có liên quan đến độc tính virút và chủng virút độc lực có chứa kiểu nhận biết furin trong khi chủng virút không độc lực chỉ chứa arginine đơn [42, 43, 44, 45] Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết furin Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí phân tách, điều

này có thể ảnh hưởng tới hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [46, 47]

Trong các chủng virút cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấy trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN [48, 49]

NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân týp của virút cúm A, B

NA do đoạn gen ARN thứ 6 mã hóa NA là một homotetramer NA quan trọng do cả hoạt tính sinh học loại bỏ axit sialic từ glycoprotein và là quyết định nguyên chính ảnh hưởng đến sự thay đổi tính kháng nguyên NA có thể cho phép vận chuyển virút qua màng mucin ở trên đường hô hấp, giúp hỗ trợ virút tấn công tế bào biểu mô đích Đoạn gen ARN 6 của A/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin

Đoạn ARN thứ bẩy mã hóa cho 2 protein M1 và M2 Đoạn có 1027 nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton [50, 51, 52] M1 là kháng nguyên đặc hiệu týp của virút cúm và có tính ổn định giữa các phân týp [53] Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng virút cúm amantadin Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của virút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc kháng amantadin [54]

Đoạn ARN 8 của virút cúm A, B và đoạn ARN 7 của virút cúm C mã hóa cho 2 loại protein NS1 và NS2 NS1 protein có trọng lượng phân tử 26.000 dalton NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của virút cúm NS2 protein có trọng lượng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-200 phân tử)

và tạo thành phức hợp với M1

1.1.4 Sự tái tổ hợp của virút cúm

Virút cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên cùng týp nhưng không xẩy ra giữa các týp khác nhau Sự xuất hiện của chủng đại dịch là hậu quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có NA hoặc

HA khác hẳn với chủng lưu hành trước đó Trong thế kỷ 20 có sự xuất hiện của cúm “Tây Ban Nha” năm 1918-1919 có HA liên quan đến chủng virút của lợn và phân týp H1 Virút này lưu hành đến năm 1957 cho đến khi được thay thế bởi phân týp H2N2 (chủng châu Á) Chủng H2N2 lưu hành trong 11 năm

và được thay thế bởi phân týp H3 mới (chủng Hồng Kông) trong đại dịch tiếp theo năm 1968 [55] Năm 1976 chủng H1N1 lưu hành trở lại và năm 1997-

1998 đã xuất hiện chủng cúm gia cầm độc lực H5 lây truyền từ chim sang người tại Hồng Kông Sự đột biến trong gen HA và NA có thể gây ra các thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên

Virút cúm B khác với virút cúm A là không có ổ chứa động vật Mặc

dù virút cúm B nguyên thủy thích ứng trên người dễ dàng hơn virút cúm A nhưng tỷ lệ đột biến và thay đổi chỉ bằng một nửa virút cúm A [56, 57, 58]

Có nhiều bằng chứng cho rằng virút cúm trong loài thủy cầm lây truyền cho lợn, ngựa, gia cầm và động vật có vú ở biển; gây nên những vụ dịch nghiêm trọng [59] Năm 1989 đã có một vụ dịch lớn xẩy ra trên đàn ngựa của tỉnh Jilin và Heilongjiang, Trung Quốc do virút cúm H3N8 có cấu trúc kháng nguyên giống virút H3 của gia cầm Có những bằng chứng cho rằng các vụ đại dịch cúm trên người ở thế kỷ này có nguồn gốc từ gia cầm và lây truyền qua lợn sang người sau khi tái tổ hợp với chủng cúm người đang lưu hành

Cả hai chủng đại dịch Asian/57 (H2N2) và Hong Kong/68 (H3N2) đều được tạo thành do tái tổ hợp Chủng đại dịch 1957 có 3 gen (PB1, HA và NA)

từ hỗn hợp gen cúm gia cầm do tái tổ hợp tạo thành trên vịt trời và giữ nguyên 5 gen khác từ chủng cúm người đang lưu hành [60] Sau khi chủng

Asian xuất hiện, chủng H1N1 biến mất trên người Năm 1968 chủng đại dịch Hồng Kông có 2 gen (PB1 và HA) từ vịt do tái tổ hợp và giữ 6 gen từ chủng cúm người đang lưu hành

Virút cúm gia cầm không lan truyền trên quần thể người và ngược lại, virút của người không lây truyền sang quần thể chim Do đó, hàng rào loài giữa chim và người rất chặt chẽ Tuy nhiên, nhiều bằng chứng cho thấy loài lợn có thể cảm nhiễm dễ dàng với cả hai loại virút cúm người hoặc gia cầm [61, 62] và hàng rào loài giữa lợn và gia cầm hoặc giữa lợn và người lỏng lẻo hơn nhiều Do vậy, lợn có thể đóng vai trò như là vật chủ trung gian để tạo ra giống virút cúm mới trên người [63, 64, 65] Virút cúm H3N2 đã được phân lập trên lợn ở khắp thế giới Những virút này có đặc tính kháng nguyên và gen giống như những chủng đã lưu hành trên người trước khi phân lập ở lợn [66] Năm 1992, hai chủng H1N1 đã được phân lập từ lợn ở phía Bắc Nhật Bản có chứa gen glycoprotein liên quan đến chủng H1N1 của người lưu hành giữa năm 1990-1992 [67] Sự tái tổ hợp của đoạn ARN virút trong khi nhiễm trùng kép với hai chủng cúm người và gia cầm là cơ chế để tạo ra chủng mới Quần thể người không có kháng thể trung hòa với kháng nguyên bề mặt của virút mới tạo ra do đó không được bảo vệ Virút mới có thể lan truyền dễ dàng gây đại dịch Yếu tố nguy cơ cao lợn sống gần người ở những vùng như Đông Nam Á và có thể chia sẻ nguồn nước là giả thuyết tại sao đại dịch thường bắt nguồn từ những vùng này trong thời gian gần đây

Áp lực chọn lọc ảnh hưởng đến sự biến đổi của virút cúm giống như các virút khác Để đảm bảo khả năng tồn tại lâu dài, bất cứ virút nào cũng phải giữ khả năng lan truyền sang vật chủ mới để cạnh tranh với các virút khác Cấu trúc độc đáo và khả năng thích ứng của virút cúm là cơ chế để tạo nên khả năng sống sót lâu dài hoặc ngắn trên các vật chủ khác nhau cũng như các trạng thái bệnh, hình thái lan truyền khác nhau

1.1.5 Sự phát triển của virút trên tế bào

Virút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi Sau này, các virút cúm có thể được nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm trên thế giới Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên phát hay thận chó Madin-Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập virút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người Tế bào MDCK có độ nhậy 100% trong phân lập virút cúm A trong khi đó độ nhậy của Vero chỉ là 71,4% và MRC-5 là 57,1% [68]

Sự phát triển của virút trên nuôi cấy tế bào gây ra sự huỷ hoại tế bào và tạo các đám hoại tử trong một số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà Ngoài ra, nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để hoạt hoá các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của virút

1.1.6 Sinh bệnh học

Các nghiên cứu đã đưa ra những bằng chứng chứng minh rằng sinh bệnh học của virút cúm là tính trạng đa gen Điều này có nghĩa là sản phẩm của tất cả các gen của virút đều tham gia vào quá trình nhận dạng tế bào vật chủ và gây độc tính trong quá trình xâm nhập phá vỡ tế bào Trong đó gen

HA đóng vai trò trung tâm về tính độc của virút gồm 2 phân týp H5, H7 có độc tính mạnh nên gây tỷ lệ chết cao Protein HA của các virút này khác các

HA của các phân týp khác là có một trình tự nhiều axit amin ở đầu carboxyl

của HA1 (multiple basic amino acid) Điều này cho phép các enzyme

proteaza của tế bào nhận biết trình tự đó để cắt HA thành HA1 và HA2, là giai đoạn cần thiết cho virút xâm nhập tế bào và phát triển lan ra Đây cũng là

cơ sở giải thích tính gây độc của virút cúm ở người

1.1.7 Chẩn đoán virút cúm

Chẩn đoán cúm có ý nghĩa rất quan trọng trong y tế cộng đồng để kiểm soát dịch bệnh Có rất nhiều các thử nghiệm chẩn đoán khác nhau: Phát hiện kháng nguyên virút, axit nucleic virút, tế bào bị nhiễm virút hoặc hạt virút gây nhiễm trong dịch tiết đường tiêu hóa Virút cúm có khả năng nhân lên trên nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào tiên phát, lưỡng bội và dòng tế bào thường trực Sự phát triển nhanh chóng của chủng cúm ngựa và cúm gia cầm trên trứng phôi gà khi so sánh với nuôi cấy tế bào cho thấy trứng gà có phôi là

hệ thống được lựa chọn cho việc chẩn đoán trong thú y Với việc sử dụng kháng thể đơn dòng, sự phát hiện virút trong nuôi cấy tế bào bằng phương pháp miễn dịch 1-3 ngày sau khi gây nhiễm và trước khi có xuất hiện CPE có ứng dụng rất lớn trong chẩn đoán sớm

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu và hấp phụ hồng cầu được sử dụng trong chẩn đoán virút cúm từ hơn 50 năm nay Hồng cầu gà, người hoặc chuột lang

đã được sử dụng cho kỹ thuật này Thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu dược sử dụng để định týp virút cúm nhờ sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu trên chồn sương, cừu hoặc gà Miễn dịch huỳnh quang và thử nghiệm miễn dịch gắn men đã được sử dụng để để xác định trực tiếp virút cúm trên mẫu bệnh phẩm hô hấp Thử nghiệm RT-PCR đã được sử dụng để phát hiện ARN của virút và định týp

1.1.8 Đặc điểm dịch tễ học

Các đại diện của virút cúm A được phân lập từ các loài chim trên khắp thế giới, ở cả các vật nuôi và các loài hoang dã, đặc biệt là các chủng virút được phân lập từ gia cầm Dấu hiệu bệnh liên quan đến virút cúm A ở các loài gia cầm khác nhau một cách đáng kể tuỳ thuộc vào chủng virút Hầu hết các chủng virút cúm khi gây nhiễm không biểu hiện các triệu chứng về bệnh Tuy nhiên, một số chủng gây ra những dịch cúm kèm theo những bệnh liên quan đến hệ thần kinh trung ương, và gây chết chỉ trong vòng một tuần Đó là các

chủng thuộc phân týp H5 và H7 như A/FPV/Dutch (H7N7) và A/Tern/South Africa/1/61 (H5N3) Những vấn đề nghiêm trọng nhất liên quan đến các phân týp khác (từ H1 đến H15) là gây viêm phổi mạn tính ở gà tây Các nhà nghiên cứu cho rằng sự nhiễm virút cúm ở gà tây bắt nguồn từ chủng virút ở vịt di

cư Sở dĩ gà nuôi bị nhiễm với tần suất thấp hơn nhiều là do chúng được nuôi trong nhà Tuy nhiên, năm 1997, virút cúm H5N1 ở Hồng Kông đã gây ra tỷ

lệ tử vong cao lây lan sang cả gia cầm và người

Ở vịt, các virút cúm chủ yếu nhân lên ở phổi và các tế bào thuộc hệ hô hấp Bản chất độc lực của virút cúm gây nhiễm cho vịt có thể là kết quả quá trình thích ứng của virút với vật chủ này qua nhiều thế kỷ, tạo nên một sự ổn định đảm bảo cho sự tồn tại của virút

Ngoài ra, virút cúm A còn được phân lập từ nhiều loài khác như lợn, ngựa, chó biển, cá voi Các nhà nghiên cứu đã sử dụng chuột, chồn sương và linh trưởng để thực hiện các nghiên cứu về cúm Trong đó chồn sương được chứng minh là loài rất mẫn cảm với tất cả virút cúm A, B và chồn sương được

sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về virút cúm Virút cúm A ở người lần đầu tiên được phân lập trên loài chồn sương Những con chồn sương mắc bệnh viêm mũi và sốt sau khi bị gây nhiễm bởi dịch họng của người có triệu chứng cúm

Đặc điểm dịch tễ của cúm A và B giống nhau là đều gây tỷ lệ mắc và chết cao mặc dù cúm B không gây đại dịch vì tính ổn định kháng nguyên Cúm A/H1N1 có mức độ dễ dàng lây truyền trong cộng đồng nhất rồi đến cúm A/H3N2 và cuối cùng là cúm B Tại vùng khí hậu Bắc và Nam, bệnh cúm có xu hướng phát triển theo mùa, thường xẩy ra vào mùa lạnh nhất trong năm Một số yếu tố ảnh hưởng đến tính cảm nhiễm cũng đã được xác định như tình trạng miễn dịch, bệnh mạn tính, tuổi, hút thuốc lá…

Đại dịch được mô tả như là vụ dịch có phạm vi lớn khắp thế giới với tỷ

lệ mắc và chết cao, là hậu quả của sự biến đổi kháng nguyên – sự thay thế của