Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS CHU HOÀNG HÀ

2 GS TS CHU HOÀNG MẬU

THÁI NGUYÊN - 2013

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra

từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Việt Nam và Indonesia

là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao nhất so với các quốc gia trên thế giới Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra

Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm

A luôn biến đổi Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy

cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người Hiện nay, ngoài vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, các loại vaccine này có nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp Do vậy, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Vaccine thực vật có hoạt tính

tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt Vaccine thực vật có một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế

Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người Sự biểu hiện thành công

gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để

sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh

và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên

cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus

cúm A/H5N1

Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và

biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1

3.2 Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào

vi khuẩn A tumefaciens Lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào

mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1;

3.3 Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương;

3.4 Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84;

3.5 Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0;

3.6 Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai

Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương

4 Những đóng góp mới của luận án

4.1 Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm

A/H5N1

4.2 Giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus

Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84

4.3 Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T0 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1

4.4 Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen

HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật Biểu hiện thành công gen gus ở hạt

Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương Với việc lây

nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương,

tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của virus H5N1 trong hạt đậu tương

Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt

đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được ở thực vật

Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của

gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38] Đây

là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]

Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những năm 1996-2008 [106] Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên người và gây chết người bệnh [142] Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu

Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực , loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên-miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những biến chủng H5N1 trước đây Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25]

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã

có tới 622 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trường hợp đã tử vong, chiếm 59,65% Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam Kết quả điều tra dịch tễ học cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người đều có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển, mua bán gia cầm

Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua bốn đợt dịch Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gần đây nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]

Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm Mặc dù số

ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém,

do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7]

1.1.2 Virus cúm A/H5N1

1.1.2.1 Đặc tính của virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các tia phóng xạ Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9 Trong điều kiện quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm Virus A/H5N1 bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100oC hoặc 30

phút ở 60oC, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và hàng năm ở -70 oC Trong phủ tạng gia cầm (40oC) tồn tại được 25-30 ngày, nhưng trong cơ thể người (37oC) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30oC tồn tại được 4 ngày [24] [26] [75]

Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau Các phân type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9) Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 (H16), được tìm thấy năm 2005 từ con mòng biển đầu đen Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32] Các phân type gây nhiễm cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài người, các loài lông

vũ (gà, thủy cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi Chúng thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và người [140] Do đặc tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ động vật sang người Virus A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất đối với các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2 trên lợn [77]

Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35] [25] Ví dụ: virus cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, phân type

là H5N1

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1) loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza) Cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [30] HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi

gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29] LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này

có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155]

1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1

Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34] Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là:

Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme PB2, là tiểu đơn vị

thành phần trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus PB2 có khối lượng phân tử 87.103 Da [38] Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng với nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở virus thích nghi trên người là Lys

- thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37oC) [63]

Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc

tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu

trách nhiệm gắn mũ RNA [38] Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) [38]

Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp

protein enzyme PA có khối lượng phân tử là 96.103 Da PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus [8]

Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, cụ thể như sau:

Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm

A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8 ] Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không được glycosyl hóa) và 77.103 Da (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da

và HA2 là 29.103 Da) [29]

Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có kích thước

thay đổi theo từng chủng virus cúm A Đây là gen mã hóa tổng hợp protein

NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử là 50 - 60.103 Da Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau [ 93] Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide [42]

Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,

cụ thể:

Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần

của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.103

Da (trên thực tế là 50 - 60.103 Da) [38]

Phân đoạn 7 (gen M) mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của

virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng

3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia

vào quá trình “nảy chồi” của virus [38] Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có

khối lượng phân tử là 15.103 Da, là protein chuyển màng - kênh ion (ion

channel) cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo”

virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non

structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus [42] Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 [24 ], trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc lực [25] NS1 có khối lượng phân tử là 25.103 Da,

chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt

và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 nucleotit và 336 nucleotit) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử là 12x103 Da, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [42]

Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA Do vậy, trong thực

tế dễ xuất hiện các đột biến điểm trong mỗi phân đoạn gen và trong hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus mới [29]

Hình 1.1 Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein

của virus cúm A/H5N1

A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba tiểu phầndưới đơn vị phức hợp enzyme

polymerase của virus) C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein (RNP) (Nguồn: ©

Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Nucleic acid và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung quanh một trục tạo nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu (đường kính 89 – 120 nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài μm) của virion Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1, phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu trúc của virus Lớp vỏ ngoài của virus còn có các glycoprotein (protein đã được glycosyl hoá) Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã được chuyên hoá để gắn protein màng của virus vào, gồm protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA)

1.1.2.3 Đặc trưng của kháng nguyên HA và NA

HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [38]

Protein HA (Hemagglutinin)

Gen HA có kích thước thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm Gen

HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cầu có độ dài 568-569 amino acid Gen HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha, chủng H5N1 (1996) ở Quảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy [42 ] Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003 là các biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao Hệ gen của virus biến đổi nhanh, trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra nhiều và sử dụng chính sự biến đổi này để phân định nhóm kháng nguyên, phân type và phân tích mối quan hệ tiến hóa của các chủng H5N1 Các chủng phân lập trong giai đoạn từ 1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các chủng thu được trong giai đoạn từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên của A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C, D) trước 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3,

Y, Z và Z+) Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều

thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhưng phân thành 2 nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam thuộc nhóm tiến hóa (clade) 1 Năm 2007 đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc kiến thuộc clade 2.3.4 [4] Gen HA được phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang)

có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng khác phân lập ở Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới dòng Quảng Đông và clade 1 [7]

Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định

tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A Protein HA

là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng

kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có

thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn cản ngưng kết

hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory andibody) Có 16 phân type HA đã

được phát hiện (H1-H16), ba phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [102] Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ [9] [7] Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer), mỗi chuỗi polypeptid được tạo thành từ HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) và các chuỗi polypeptid liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các chuỗi polypeptid sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là chuỗi HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào cảm nhiễm 150 Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không

gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [133] Vị trí amino acid 226 của chuỗi HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm

hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đường

hô hấp của chim và cúm gia cầm Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác như glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ [142] Đặc biệt, một số chủng cường độc A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng được coi là chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên

HA [ 130] Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm

A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type

HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định độc lực của virus, là đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, đây chính là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [105]

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin

A: Rải biểu đồ protein bề mặt Hemagglutin của virus cúm A/H5N1 giới hạn bởi kháng thể F10 (màu đỏ) Hai chuỗi của HA là HA1 (màu vàng) và HA2 (màu xanh); B: Protein Hemagglutinin đại diện từ 1918 virus cúm Vị trí bám receptor là nơi

protein của virus cúm tấn công vào phổi con người

Hemagglutinin là polypeptide gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 (Hình 1.2) nối với nhau bằng một đoạn peptid ngắn, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trưng cho các subtype H (H1-H16) trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [133]) Chuỗi nối này cũng chính là điểm cắt của protease tạo nên 2 phân đoạn HA rời nhau Motif của chuỗi nối peptid chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtype H,

và sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới [133]

Để minh chứng cho điều đó, gần đây các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo vaccine tái tổ hợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng

nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1

và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với gà thực nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60% [146]

Protein NA (Neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [29] Có 9 phân type (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người [32]

Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt virus Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần

kị nước gắn vào vỏ capsid

Protein NA có vai trò là enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào Mặt

khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy

nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [135] Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của

NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không

đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ

cơ thể [154]

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [150] Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [5]

1.1.2.4 Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 vào tế bào chủ

Virus cúm A khi xâm nhập vào tế bào động vật hay người qua đường

hô hấp trên hoặc hệ tiêu hóa, ngay lập tức virus sẽ bám vào lớp màng nhày niêm mạc vật chủ Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà bản chất là glycoprotein chứa acid sialic, sau đó virus qua màng tế bào nhờ loại enzym đặc biệt để vào nguyên sinh chất và nhân tế bào (Hình 1.3) Tại đây, protein HA bề mặt của virus gắn vào thụ thể chứa neuraminic acid của tế bào chủ và tiến hành nhập bào tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”) Tiếp theo là quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của virus với màng endosome, điều này thực hiện được nhờ gai HA chồi lên khi pH trong endosome thấp Sau khi dung hợp, ribonucleoprotein (RNP) và RNA-polymerase vào

Hình 1.3 Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ

1 Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà bản chất là glycoprotein chứa acid sialic; 2 Sau đó virus qua màng tế bào nhờ loại enzym đặc biệt để vào nguyên sinh chất tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”); 3 Sợi RNA (-) xâm nhập vào nhân tế bào; 4 RNA (-) làm khuôn tổng hợp sợi RNA (+) (mRNP (+);

5 Sợi mRNP (+) dịch mã tổng hợp protein; 6 Sợi cRNP (+) ;(sợi bổ sung làm khuôn tổng hợp sợi âm); 7 Sợi cRNP (+) làm khuôn tổng hợp vRNP (-); 8 Các loại protein của virus H5N1 được tổng hợp; 9 vRNP (-) kết hợp với các loại protein tạo thành virus và ra ngoài

Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 phân đoạn RNA từ hệ gen sợi âm của virus là tạo ra 10 phân tử protein Sáu phân đoạn (từ 1 đến 6) RNA thông tin (mRNA) được tạo ra và chịu trách nhiệm tổng hợp thành 6 loại protein:

HA, NA, NP, PB1, PB2, PA, còn phân đoạn 7 và phân đoạn 8 do có hai khung đọc trên mỗi phân đoạn, nên có hai mRNA tạo ra cho mỗi phân đoạn

để tổng hợp các protein M1, M2 và NS1, NS2

7

Sau khi hợp nhất màng đã được thực hiện trong “khoang ẩm bào”, nucleocapsid của virus được chuyển vào trong nhân tế bào để thực hiện quá trình tổng hợp RNA nguyên liệu hệ gen cho các virus mới Hệ thống enzym sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các RNA thông tin

Đối với virus cúm, để tổng hợp RNA thông tin, các phân đoạn RNA hệ gen được mũ hoá ở 10 -13 nucleotide ở đầu 5’ với nguyên liệu mũ hoá lấy từ RNA tế bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 (polymerase basic protein 2) của virus RNA sợi đơn âm được chuyển thành RNA sợi đơn dương theo cơ chế

bổ sung, và sợi dương này lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA đơn âm mới nhờ RNA polymerase Các sợi RNA được tạo ra là một sợi hoàn chỉnh, không được mũ hóa ở đầu 5' và không được adenyl hóa ở đầu 3', chúng sẽ được bao gói lại để hình thành nên ribonucleocapsid Sau khi được bao gói, ribonucleocapsid được vận chuyển đến màng tế bào mà ở đó các gai

HA, NA, M2 đã được gắn sẵn nhờ hệ thống Golgi chuyển ra và hạt virus mới được hình thành, lúc này NA sẽ cắt thụ thể sialic acid giải phóng virus khỏi

tế bào chủ, bắt đầu một quá trình lây nhiễm mới

Quá trình phiên mã, sao chép của virus cúm đặc biệt khác với các RNA virus khác là quá trình này chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị nhiễm Thời gian xâm nhiễm và giải phóng hạt virus mới của virus cúm kéo dài trong vài giờ, các hạt virus mới được tạo thành không làm tan tế bào bị nhiễm, nhưng các tế bào này dường như không còn khả năng sống sót do rối loạn ở hệ thống tổng hợp các đại phân tử sinh học

1.2 VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1

1.2.1 Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [4] Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm

được bệnh ở gia cầm mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Nhiều công trình nghiên cứu về gen của virus A/ H5N1

và phát triển công nghệ vaccine gây miễn dịch cho gia cầm được xúc tiến mạnh mẽ Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay phôi gà (nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi Vì vậy loại bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine

Các loại vaccine sử dụng phòng chống bệnh cúm A/H5N1 bao gồm vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen, vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo, vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine)

(1) Vaccine truyền thống

Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng [113]

(2) Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen là loại vaccine được sản xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu

và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: (i) vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền, sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp mang gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1 [59]; (ii) vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine [92] [123]

(3) Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo

Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen [92] Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) [95]

(4) Vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine)

Do hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng các vi sinh vật mới, ngoài vaccine tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới vaccine đường miệng (oral vaccine) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này [61] Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới trong công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và nghiên cứu cây trồng chuyển gen [71]

Vaccine thực vật (vaccine ăn được ở thực vật) là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn Chúng tác động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Vaccine thực vật bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy [4] Sản xuất vaccine thực vật có thể thực hiện theo quy trình sau đây:

(1) Lựa chọn gen cần biểu hiện và đưa vào vector thích hợp;

(2) Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;

(3) Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau;

(4) Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật;

(5) Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật; (6) Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới dạng thức ăn đã chế biến [135]

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật trong định hướng nghiên cứu vaccine thực vật đã thu được một số thành tựu như nghiên cứu vaccine virus viêm gan

B biểu hiện trong chuối, vaccine chống bệnh đường ruột [69], vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật [69], vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa.Tuy nhiên nghiên cứu vaccine thực vật phòng chống bệnh cúm A/H5N1 còn ít được công bố

1.2.2 Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1

Đồng thời với các biện pháp phòng bệnh thì việc sử dụng vaccine được xem như là một biện pháp hỗ trợ tích cực và chủ động trong việc phòng và hạn chế bệnh cúm gia cầm Vaccine virus cúm có hai thành phần kháng nguyên chính có vai trò kích thích sản sinh kháng thể tạo miễn dịch chủ động

là HA và NA, trong đó kháng thể kháng HA có vai trò chủ đạo trong đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm Còn kháng thể kháng NA có ý nghĩa trong việc phát hiện giữa gia cầm được tiêm vaccine với những gia cầm nhiễm virus trên thực địa [143]

Nghiên cứu gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch

cũng đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Thú y quốc gia, Trung tâm chẩn

đoán thú y trung ương tiến hành, đó là việc thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam ở các năm và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường độc đương nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới [4] Nhận định hỗn hợp virus gây bệnh và phân hoá kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã được xác nhận qua phân tích hàng chục chủng thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước Điều này ảnh hưởng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên cũng như vai trò miễn dịch của các chủng cổ điển đang sử dụng làm vaccine tại Việt Nam và thế giới (vaccine H5N1, chủng gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Turkey-ENG-N28(73)(H5N2), vaccine TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-IRE1378(83)(H5N8)), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-232(94)(H5N2) Giống NIBRG-14 từ chủng gốc A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) đã được Việt Nam nghiên cứu công nghệ sản xuất vaccine cho gia cầm và người [9]

Để có thể đáp ứng nhanh nhu cầu về vaccine cúm gia cầm, ngoài việc tiếp tục những nghiên cứu về vaccine tái tổ hợp trên cơ sở các tiểu đơn vị và vaccine DNA, ngày 3 tháng 11 năm 2005 Viện Công nghệ sinh học đã hoàn tất các thủ tục và tiến hành tiếp nhận chủng virus sản xuất vaccine NIBRG-14

từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học, Vương Quốc Anh Đây là chủng virus được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược, tái tổ hợp trên cơ

sở các gen của chủng gốc PR8/34 với các gen HA (đã bị đột biến mất 4 amino acid RRRL và đột biến thay thế 3 amino acid tại vùng gây độc) và NA có nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004) Chủng NIBRG-14 này đã được Tổ chức Y tế thế giới công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các chủng dùng cho sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay Hiện nay các chủng này cũng có được

nhiều nước như Trung Quốc, Hungary, Brazil sử dụng để sản xuất vaccine cho gia cầm Một số nước đã có kế hoạch sử dụng chủng này để sản xuất vaccine cho người [9]

Theo sự khuyến cáo của WHO, Viện Công nghệ sinh học đã sử dụng chủng NIBRG-14 đã tiến hành nhân virus trên phôi gà và kiểm tra các chỉ tiêu

cơ bản của một giống virus [7] Viện cũng đã phối hợp với Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn và một số cơ quan xây dựng và triển khai đề án sản xuất vaccine cúm gia cầm A/H5N1 bằng chủng virus vaccine NIBRG-14 Ngoài ra, một số đề tài khác như nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus Đặc biệt, việc nghiên cứu các gen HA và các biến chủng H5N1 làm cơ sở để chế tạo vaccine được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu ở nước ta và trên thế giới [9] Năm 2004 viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương và Công ty Vaccine và Sinh phẩm số 1 đã bắt đầu nghiên cứu sản xuất vaccine H5N1 Hiện nay, giai đoạn thử nghiệm thứ ba trên người và cũng là giai đoạn thử nghiệm cuối cùng của quy trình nghiên cứu vaccine được triển khai với khoảng 1200 người tham gia thử nghiệm Sau giai đoạn thử nghiệm cuối cùng này thành công, công ty sẽ

đề xuất Bộ Y tế cấp phép lưu hành vaccine và sản xuất hàng loạt vào năm

2013 để phục vụ việc phòng chống dịch cúm A/H5N1 trong cộng đồng Đặc biệt để chuẩn bị cho việc chính thức đưa vaccine ngừa cúm A/H5N1 trên người do Việt Nam sản xuất vào sử dụng rộng rãi, một dây chuyền công nghệ sản xuất vaccine cúm hiện đại đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới đã được công ty đầu tư hoàn chỉnh, có thể sản xuất khoảng 2-5 triệu liều vaccine cúm A/H5N1/năm, với giá thành chỉ bằng một nửa so với vaccine cùng loại nhập ngoại

Mặc dù đã có một số vaccine khác nhau được sản xuất, nhưng các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có

tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản và phân phối hơn, an toàn và hiệu quả hơn [127] Bề mặt viêm mạc là vị trí xâm nhập quan trọng nhất đối với nguồn bệnh, nhất là đối với vi khuẩn và virus, việc cung cấp kháng nguyên qua đường miệng là một hướng nghiên cứu có nhiều hứa hẹn Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật là nguồn vaccine có khả năng sản xuất lượng lớn, đáp ứng được cho hàng trăm triệu con gà vịt và sẽ đem lại nhiều hứa hẹn, đặc biệt cho ngành thú y

Bản chất của vaccine thực vật là một loại vaccine dưới đơn vị hay protein tái tổ hợp, nhưng khác với các loại vaccine khác là vaccine được đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá, sản xuất trong hệ thống thực vật Vaccine thực vật có khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể hiệu quả hơn các loại vaccine tiêm Vì vaccine thực vật qua đường miệng sẽ cảm ứng hệ thống miễn dịch, sản xuất các kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh, do đây là nơi tập trung các

mô có khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất của cơ thể [129]

Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác

là vaccine được thực vật tổng hợp trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt Vaccin này có một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác là:

i) Nếu vaccine qua đường miệng dùng ở dạng tinh sạch, không được bao gói, sẽ dễ dàng bị dịch tiêu hoá của đường ruột phân hủy Trái lại, vaccine thực vật được chính mô và thành tế bào thực vật bao bọc, hạn chế được sự phá hủy đó và ổn định, bền vững trong cơ thể Bởi vậy vaccine này có thể ăn tươi hoặc nấu chín

ii) Dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên

iii) Tính ổn định cao, dễ bảo quản, sử dụng và kinh tế Các vaccine được tạo ra trong tế bào thực vật có độ bền ngay ở nhiệt độ phòng, không cần nhiệt

độ lạnh do chúng được bao bọc bởi các cơ quan tử của tế bào như: thành tế

bào, mạng lưới nội chất, thể golgi Bởi vậy có thể vận chuyển dễ dàng không cần các điều kiện bảo quản lạnh như những vaccine khác

iv) Có độ an toàn cao Do bản chất của vaccine thực vật là loại vaccine dưới đơn vị do gen mã hoá cho một phần của protein virus gây bệnh, nó không phải là chính tác nhân gây bệnh đã bất hoạt hoặc chết Hơn nữa vaccine thực vật được sản xuất từ thực vật, do đó không bị tạp nhiễm các nhân tố gây bệnh ở động vật trong quá trình sản xuất

v) Hạt cây trồng dễ dàng cung cấp dạng thức ăn cho vật nuôi và thú hoang dã Hiện nay cây chuyển gen đã được công nhận là nguồn hợp pháp để sản xuất các hợp chất sinh học dùng làm dược phẩm và các dự án nghiên cứu

và phát triển đi theo hướng này Đã có những bằng chứng về tạo phản ứng miễn dịch khi sử dụng những sản phẩm này ở động vật và người Cho đến nay

đã có hơn 30 loại vaccine khác nhau được sản xuất trong 10 loại cây trồng đã được công bố, một số trong đó đã được thử nghiệm lâm sàng

Năm 1990, Curtiss và Cardineau là hai tác giả đầu tiên thành công trong việc tạo ra cây thuốc lá chuyển gen có khả năng tạo vaccine kháng Streptococcus mutans Hiện nay, trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra các giống cây có khả năng sản xuất vaccine như khoai tây, cà chua, thuốc lá, rau diếp, lúa mỳ, đậu đũa

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, thế hệ thứ hai của loại vaccine thực vật đã ra đời đó là vaccine đa thành phần Vaccine đa thành phần được tạo thành gồm nhiều dưới đơn vị (epitope) của các tác nhân gây bệnh khác nhau Do vậy vaccine đa thành phần được sản xuất từ thực vật có khả năng kích thích cơ thể kháng lại với nhiều loại bệnh cùng một lúc

Tháng 8-2002, Yusibov và đtg đã thành công trong việc tạo ra loại spinach có khả năng tạo ra loại vaccine dại Nhóm tác giả đã thiết kế vector chuyển gen vào thực vật có chứa đồng thời 2 chuỗi peptide quyết định kháng

nguyên là G và N protein Đây cũng chính là vaccine dưới đơn vị có khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể cao nhất Tiến hành thử nghiệm ở người thấy rằng khi ăn rau spinach được chuyển gen cơ thể xuất hiện kháng thể chống lại virus dại giống như việc tiêm phòng truyền thống

Như vậy, sản xuất vaccine thực vật là một chiến lược kết hợp sự đổi mới của y học và công nghệ sinh học ở cây trồng Dùng thực vật để sản xuất vaccine là một giải pháp kinh tế và có nhiều triển vọng Để tiến tới sản xuất được vaccine thực vật phục vụ cho việc phòng chống bệnh dịch như dịch cúm gia cầm hiện nay thì cần phải có một chiến lược nghiên cứu để đưa ra quy trình công nghệ sản xuất Trong những năm gần đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ tế bào thực vật nói riêng, ở Việt Nam đã thành công tạo ra một số cây trồng chuyển gen như lúa kháng sâu, chịu hạn, khoai lang kháng bọ hà, bông kháng sâu, Đây là những thành công mang tính đột phá trong lĩnh vực tạo cây chuyển gen, mở ra những ứng dụng mới theo hướng nghiên cứu tạo cây chuyển gen phục vụ cho hướng nghiên cứu vaccine thực vật

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào… Trong các hệ thống trên, thực vật có nhiều lợi thế trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với

chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào, cho nên giá thành thấp

Nhiều phương pháp chuyển gen đã được ứng dụng để tạo cây chuyển gen, nhưng phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển trực tiếp được ứng dụng và thu được những kết quả khả quan

Phương pháp chuyển gen trực tiếp là phương pháp chuyển DNA

thông qua xử lý polyethylene glycol (PEG) Đây là phương pháp chuyển gen cho hiệu quả cao Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ Theo phương pháp này, gen được chuyển trực tiếp và tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là (i) Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, (ii) Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm, (iii) Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, (iv) Chuyển gen nhờ súng bắn gen và (v) Chuyển gen nhờ silicon carbide

Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào nhờ súng bắn gen Ưu điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, biến nạp gen vào được nhiều tế bào, nguyên liệu đa dạng, như hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh Phôi soma đầu tiên được sử dụng như vật liệu đích đối

với kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens và sau này nhiều tác giả

cho thấy phôi soma có thể sử dụng tốt cho kỹ thuật sử dụng súng bắn gen 73

101 và phôi chuyển gen thường được tạo ra sau 7 tuần kể từ khi sử dụng súng bắn gen để biến nạp gen chuyển vào phôi 56, các khối mô đồng nhất đã chuyển gen có thể tạo ra sự biệt hóa Vì vậy phôi soma đã được sử dụng để đánh giá đặc tính của hạt chuyển gen trước khi tạo cây hoàn chỉnh, và sau đó là quá trình chọn lọc các dòng cây chuyển gen tái sinh được thực hiện 7951

Cây đậu tương đầu tiên được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen sử dụng súng bắn gen vào thân mầm hạt đậu tương từ năm 1988 , đến nay phương pháp chuyển gen này đã được cải tiến, phát triển và áp dụng cho hầu hết đối với các giống đậu tương để tạo cây đậu tương chuyển gen Gần đây, hàng loạt công bố về biến nạp thành công trên lúa, đu đủ, mía, bông,…đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp bắn gen 149 Tuy nhiên nhược điểm của nó là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm Quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen đã được cải thiện và sử dụng rộng rãi mặc dù vần còn những hạn chế 56587811 150

Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương pháp chuyển gen gián tiếp được thông qua vi khuẩn đã được sử dụng có hiệu quả đối với cây đậu tương Những vi khuẩn thực hiện quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên 156 Quy trình chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước chính như sau: (1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính trạng quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thể biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen

Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen

thông qua loài vi khuẩn đất A tumefaciens

1.3.1.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Vi khuẩn A tumefaciens

Agrobacterium là loài vi khuẩn đất gram (-) gây bệnh ung thư ở thực

vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật khác 16 Agrobacterium có thể gây bệnh khối u (A tumefaciens)

và gây bệnh rễ tơ (A.rhizogenes) phổ biến ở nhiều loài thực vật  11

Trong tự nhiên, ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm thường gặp một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức (Hình 1.4) Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật

Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u

di truyền và khối u cảm ứng Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt

khi lai các loài khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica

Hình 1.4 Khối u thực vật do A tumefaciens

Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi

khuẩn A tumefaciens gây nên [20] A tumefaciens là chi vi khuẩn gram âm (-),

bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất A tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào vật

chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới

dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng A tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực

vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [21]

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật

[80] A tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A awamori, A fumigatus, Penecillium digitatums [66]

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình

cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A tumefaciens gây ra ở thực vật Trước

hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương Các tế bào bị

thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ

chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và

sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi

khuẩn A tumefaciens [20]

Ti- plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb – 200 kb (Hình 1.5) Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ Đó là đoạn T–DNA [65] T–DNA được xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [21]

mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường Gen tổng hợp opine cần

thiết để tổng hợp opine Hợp chất này không được tổng hợp trong A tumefaciens mà chỉ được tổng hợp trong tế bào chủ vì gen điều khiển sự biểu

hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [1]

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và hệ gen sinh tổng hợp opine Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen

độc khác nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [21] Khi xâm

nhiễm vào tế bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T –

DNA sang tế bào chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [20], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u Tỷ lệ auxin so

với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u Bên cạnh

những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [20]

Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A tumefaciens

A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương Thực

vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động

Khi vi khuẩn tiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt

và tổng hợp các sợi cellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để

cảm ứng gen vir Một hệ thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG được hoạt hóa nhờ sự có mặt của AS Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm tăng mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide AS kích thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG VirG bị kích thích sẽ tương tác với các yếu

tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều khiển khung đọc (operon)

của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm tăng mức độ biểu

hiện [21]

Hình 1.6 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens

(1) Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2) Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG

của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trưng;(3) Sự hoạt hoá của vùng gen vir; (4) T- ADN được tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD 1 /D 2; (5) Sự tạo thành phức hợp VirD 2 - ADN (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6) Sự kết hợp của VirE 2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua nguyên sinh chất

tế bào chủ; (7) Phức hợp-T thành thục chủ động đi vào nhân tế bào chủ; (8) T- ADN

bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9) T- ADN tách khỏi các protein bảo vệ; (10) T- ADN hợp nhất vào hệ gen chủ

VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với

biên phải của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid Ngay lập

tức trình tự này liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã

được bao bọc bởi T – DNA dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [20]

Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là

nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên, cho đến nay

người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này Trong

tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa

nhập vào hệ gen của tế bào chủ Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình

tự gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ Tuy nhiên, nếu những đoạn gen

mà có độ tương cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen

có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [21]

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng

cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir

và phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen Loại vector này đang được

sử dụng rất hiệu quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào chủ [72]

Để chuyển được các gen mong muốn vào thực vật thông qua

A.tumefaciens trước hết cần phải thay đổi cấu trúc của Ti – plasmid Do Ti –

plasmid có kích thước lớn, chứa các gen gây khối u và có nhiều vị trí cắt của enzym giới hạn nên không thể dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen Để giải quyết vấn đề này người ta tiến hành thiết kế các hệ thống vector dùng cho biến nạp Trong quá trình này các vùng gen gây ra khối u ở thực vật

sẽ được cắt bỏ, thay thế vào đó là các gen quan tâm có gắn thêm gen chỉ thị cho chọn lọc

1.3.1.2 Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn A

tumefaciens

Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A tumefaciens

là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể

Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn Điều

này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào

chủ Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh) Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại

bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A tumefaciens

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng

của một vector thông thường khác của E coli, và thường gồm những phần

sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of

interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E coli và A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E coli, không hoạt động ở A tumefaciens Như vậy,

vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1] [20]

Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại

biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng

vận chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A tumefaciens, loại vector nhị thể

được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn

khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E coli và A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc

hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển

(như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A tumefaciens,

không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [72] [21 ] [111]

1.3.1.3 Chuyển gen ở đậu tương nhờ vi khuẩn A.tumefaciens lây nhiễm

qua nách lá mầm tổn thương

Vi khuẩn A.tumefaciens là một vector sinh học được sử dụng để chuyển

các gen mong muốn vào cây đậu tương [31] [52] 53 [49] Tuy nhiên, vi khuẩn không xâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u Ưu điểm của phương pháp chuyển gen gián

tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens là đơn giản, dễ sử dụng và chỉ yêu

cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ

cần số bản copy thấp [50] Chuyển gen thông qua A tumefaciens ở đậu tương

trong môi trường đồng nuôi cấy được tiến hành trên lá mầm chưa trưởng thành [87] 88, hoặc hỗn hợp nuôi cấy phôi thực vật [128] Khởi nguồn

phương pháp này dựa vào kiểu gen đậu tương mẫm cảm với sự lây nhiễm A tumefaciens và khả năng tái sinh cây [19] [40] [86] Tuy nhiên, tiến bộ trong

những năm gần đây đã khắc phục được những hạn chế đối với kỹ thuật chuyển gen gián tiếp ở đậu tương [41] [83] [103]

Sự thành công và đưa vào sản xuất cây đậu tương chuyển gen là nhờ sự

lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp thông qua việc gây tổn thương nách lá

mầm hạt chín [43] [85 ] [90] [153] Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm và

thân chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường nuôi cấy chứa cytokinin Việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy các chất khử như L-systeine và thiolsex làm tăng hiệu quả chuyển gen từ nách

lá mầm đậu tương [82][84] và cây chuyển gen có khả năng sinh sản [85] Các thành phần bổ sung dường như làm ức chế các phản ứng giữa vết thương và

vi khuẩn, vì thế làm tăng khả năng biến nạp gen của vi khuẩn A tumefaciens

[82] Sự kết hợp của các chất khử, vector nhị phân và acetosyringone đã làm tăng cường hiệu quả chuyển gen và khả năng tiếp nhận gen của các kiểu gen đậu tương 36 64 100 Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên mang

cấu trúc gen npII đã sử dụng kháng sinh kanamycin làm chất chọn lọc và đến

nay các dòng tế bào chuyển gen đã sử dụng các chất chọn lọc bởi sự kết hợp gen bar và glufosinate [152] 153 Nồng độ chất chọn lọc có ảnh hưởng lớn đối với tần suất chuyển gen [152], vì thế phương pháp lựa chọn chất chọn lọc

là khác nhau giữa các kiểu gen đậu tương Các phương pháp cải tiến nói trên

đã được áp dụng rộng rãi ở một số giống đậu tương Nhật Bản, như: Kariyutaka, Kinusayaka, Tamahomare, và Suzuyutaka [100] Giống Kariyutaka là kiểu gen chín sớm đã tạo ra số lượng ít các hạt T1 trong khoảng

5 tháng sau khi đồng nuôi cấy với A tumefaciens [100] Các giống có thời gian sinh trưởng ngắn có thể sử dụng để phát triển các dòng đậu tương chuyển gen Hiệu suất chuyển gen đạt từ 0,2% đến khoảng 10% [83 ] [ 89] [152], kết quả này cho thấy hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kỹ thuật và đặc điểm

kiểu gen đậu tương Hiệu suất chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens thấp hơn so với phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen qua

phôi soma [44 ] [149]