Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thuộc chi Bách Bộ (Stemona) mọc ở Lào

Trang 1

VONGANATHA KHAMKO

NGHIÊN CƢ́U THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BA LOÀI

THUỘC CHI BÁCH BỘ (STEMONA) MỌC Ở LÀO

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Trang 2

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Vonganatha Khamko

Trang 3

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai người thầy PGS.TS Phạm Hữu Điển và PGS.TS Đặng Ngọc Quang đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này Tôi xin cảm ơn các em Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Nhàn – học viên cao học

K20- cùng em Nguyễn Thị Thu Trang, sinh viên K59 đã giúp đỡ tôi rất nhiệt

tình trong quá trình làm luận án

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong tổ Bộ môn Hóa Hữu cơ, các thầy cô trong khoa Hóa học, Ban giám hiệu cùng các Phòng, Ban của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã đóng góp ý kiến đóng góp quý báu

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Lãnh đạo các cấp của hai Chính phủ: nước Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam và nước CHDCND Lào, đã cho tôi học bổng và kinh phí trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể yên tâm hoàn thành luận án tiến sĩ này

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2013

Vong Antha Khamko

Trang 4

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục hình và sơ đồ

Danh mục bảng

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về họ Bách Bộ Stemonaceae 2

1.1.1 Phân loại Bách Bộ 2

1.1.2 Giới thiệu chi Stemona 3

1.1.3 Công dụng 11

1.2 Thành phần hóa học của cây Bách Bộ 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Lào 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.2.3.1 Ancaloit 14

1.2.3.2 Stilbenoit 21

1.2.3.3 Stemanthren 23

1.2.3.4 Stemofuran 24

1.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây Bách bộ 25

Kết luận chương 1: 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng và các phương pháp nghiên cứu 27

2.1.1 Mẫu thực vật 27

2.1.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu 28

Trang 5

2.1.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 30

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 33

3.1 Củ Bách Bộ thân đứng (S cochinchinensis) 33

3.1.1 Chiết mẫu thực vật 33

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ cặn n-hexan 34

3.1.3 Phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc 35

3.1.4 Các đặc trưng vật lý và phổ của các chất phân lập 37

3.2 Củ Bách Bộ lá nhỏ (Stemona pierrei) 43

3.2.2 Phân lập các chất từ cặn n-hexan 43

3.2.3 Phân lập các chất từ cặn EtOAc 44

3.3 Củ Bách Bộ thân leo S tuberosa 48

3.3.2 Phân lập các chất từ cặn n-hexan 48

3.4 Thử hoạt tính sinh học 52

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

4.1 Đối tượng nghiên cứu 53

4.2 Các hợp chất phân lập từ cây Bách Bộ S.cochinchinensis 53

4.2.1 Chiết tách mẫu thực vật 53

4.2.2 Cấu trúc các hợp chất 53

4.3 Các hợp chất từ cây Bách Bộ lá nhỏ S.pierrei 87

4.3.1 Chiết tách mẫu thực vật 87

4.3.2 Các hợp chất phân lập từ cặn n-hexan 87

Trang 6

4.4.1 Các hợp chất trong cặn n-hexan 103

4.5 Hoạt tính sinh học của hợp chất tinh sạch 122 KẾT LUẬN 129 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO … 132

Trang 7

CC : (Column Chromatography): Sắc kí cột

OD : (Optical Density): Mật độ quang

IC50 : (Inhibitory Concentration 50%)

Nồng độ ức chế 50% số vi khuẩn và nấm prep HPLC : (Preparative High Performance Liquid Chromatography)

Sắc kí lỏng điều chế

IR : (Infrared Spectroscopy): Phổ hồng ngoại

UV-Vis : (Utraviolet-Visible Spectroscopy): Phổ tử ngoại khả kiến

MS : (Mass Spectroscopy): Phổ khối lượng

FT-ICR-MS : (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry)

Phổ khối lượng phân giải cao NMR : (Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry)

HSQC : Phổ hai chiều, tương tác trực tiếp C – H

HMBC : Phổ hai chiều, tương tác xa C – H

n:E : n-hexan: etyl axetat

C:M : clorofom: metanol

CKS : Chất kháng sinh

VSV : Vi sinh vật

Trang 8

Hình 2.1: Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis 27

Hình 2.2: Bách Bộ lá nhỏ Stemona pierrei 28

Hình 2.3: Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa 28

Hình 4.1: Phổ 1 H NMR của chất K1 trong CDCl 3 54

Hình 4.2: Phổ IR của chất K2 trong KBr 55

Hình 4 4: Phổ 13 C NMR của chất K2 trong CDCl 3 56

Hình 4.6: Phổ 1 H NMR của chất K3 trong CDCl 3 và DMSO 58

Hình 4.7: Phổ 13 C NMR của chất K3 trong CDCl 3 và DMSO 59

Hình 4.10: Phổ 13 C NMR của chất K4 trong CDCl 3 62

Hình 4.11: Phổ 1 H NMR của chất K5 trong KBr 62

Trang 9

Hình 4.33: Phổ 1 H NMR của chất K12 CDCl 3 85

Hình 4.43: Phổ IR của chất K15 trong CDCl 3 96

Hình 4.46: Phổ 1 H NMR của hợp chất K17 trong CDCl 3 99

Hình 4.47: Phổ 13 C NMR của hợp chất K17 trong CDCl 3 100

Trang 10

Hình 4.54: Phổ IR của hợp chất K20 trong KBr 107

2 SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 3.1 Qui trình chiết tách cao tổng từ cây Bách Bộ thân đứng 33

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn n-hexan của S cochinchinensis 35

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn EtOAc của S cochinchinensis 36

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ cặn n-hexan của S.pierrei 44

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ phân lập các chất trong cặn EtOAc cây Bách Bộ S pierrei 45

Sơ đồ 3.6 Sơ đồ phân lập các chất từ củ Bách Bộ S tuberosa 49

Trang 11

Bảng 1.1: Bảng phân loài Thực vật chi Croomia WCSP (Word Checklist

of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011 2

Bảng 1.2: Bảng phân loài thực vật chi Stichoneuron Hook F theo WCSP (Word Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011 2

Bảng 1.3: Bảng phân loài thực vật chi Pentastemona theo WCSP (Word Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011 3

Bảng 1.4: Bảng phân loài thực vật chi Stemona.Lour theo WCSP (Word Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011 3

Bảng 3.1: Kết quả phân tích định tính các chất có trong cặn n-hexan từ củ Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis 34

Bảng 3.2: Kết quả phân tích định tính các chất trong cặn EtOAc từ củ Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis 35

Bảng 4.1: Bảng giá trị phổ NMR của hợp chất K2 56

Bảng 4.2: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất K3 và K4 60

Bảng 4.3: Bảng các giá trị phổ NMR của hợp chất K5 và K6 64

Bảng 4.4: Bảng giá trị phổ NMR của K7 và Stemanthren C 70

Bảng 4.8: Các giá trị phổ NMR của K11 so sánh với của Maistemonin 82

Bảng 4.9: Bảng các giá trị phổ NMR của hợp chất K12 so với của isomaistemonin 86

Bảng 4.10 Phổ 1 H NMR và 13 C NMR của chất K13 90

Bảng 4.11: Bảng so sánh phổ NMR của K14 và Stemanthren B 93

Trang 12

Bảng 4.13: Bảng giá trị phổ 1 H NMR, 13 C NMR của K16 99

Bảng 4.14: Bảng giá trị phổ 1 H NMR, 13 C NMR của K17 100

Bảng 4.15 Bảng quy kết phổ 1 H và 13 C NMR của chất K18 103

Bảng 4.17: Bảng các giá trị phổ NMR của hợp chất K20 109

Bảng 4.22: Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các chất 123

Bảng 4.23: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ 123 Bảng 4.24: Tổng hợp kết quả phân lập các chất từ ba loài Bách Bộ của Lào 125

Trang 13

MỞ ĐẦU

Khoa học kĩ thuật càng phát triển, đời sống con người ngày càng được cải thiện Tuy nhiên sự phát triển quá nóng đã dẫn đến sự ô nhiễm môi trường; nhiều chứng bệnh nan y mới phát sinh, nhiều loài vi khuẩn mới, nhờn thuốc xuất hiện nguy cơ gây ra những đại dịch đe dọa toàn cầu Các dược phẩm chữa trị bệnh nan y hiện nay còn rất hạn chế về chủng loại, giá thành cao và thường có các tác động phụ không mong muốn, gây tổn hại cho các tế bào lành Điều này thôi thúc các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm

ra các dược phẩm mới, hiệu quả hơn, an toàn hơn, trong đó ưu tiên nghiên cứu các hoạt chất từ tự nhiên

Lào là một trong số ít những quốc gia còn nhiều rừng nguyên sinh với các thảm thực vật đa dạng, phong phú Theo kinh nghiệm dân gian, nhiều loài thực vật đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho nhân dân Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý một cách khoa học, toàn diện để có thể qui hoạch, bảo tồn các loài cây thuốc quí hiếm đang gặp nhiều khó khăn Những năm vừa qua, do việc quản lý, khai thác các nguồn tài nguyên thiên nhiên

có nhiều điều còn bất cập khiến cho một lượng lớn các nguồn dược liệu của Lào

bị tàn phá nặng nề, nhiều nguồn gen cây thuốc quý hiếm bị tuyệt chủng

Cây Bách Bộ thuộc loại cây bụi, mọc hoang ở các vùng đồng bằng Nam Bộ Việt Nam, Lào, Đông Bắc Thái Lan, là một loài cây thuốc quí Theo kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ Lào, người ta đã sử dụng phần củ của cây Bách Bộ để làm thuốc chữa nhiều loại bệnh có hiệu quả như: các bệnh về da, ung thư gan… ngoài ra củ Bách Bộ còn có khả năng làm thuốc diệt sâu bọ, mối mọt… Việc nghiên cứu về cây Bách Bộ ở Lào còn rất hạn chế: phần lớn chỉ dùng ở mức nghiên cứu phân loài thực vật mà thôi; chưa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cây Bách

bộ Lào Vì những lý do trên đây, trong khuôn khổ Luận án tiến sĩ hóa học

này, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của ba loài thuộc chi Bách Bộ (Stemona) mọc ở Lào”

Trang 14

30 loài, chi Pentastemona có thể là một chi thuộc họ Bách Bộ hoặc có thể xếp

thành một họ riêng [7,9] Các loài Bách Bộ phân bố rải rác khắp các châu lục, nhưng chủ yếu là ở các vùng trung du, miền núi các vùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm như Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan … [16,24] Dưới đây là một số khóa phân loại thực vật của họ Bách Bộ đã được công bố

Bảng 1.1: Bảng phân loài Thực vật chi Croomia WCSP (Word Checklist of

Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Croomia heterosepala (Baker) Okuyama

2 Croomia Japonica Miq

3 Croomia pauciflora (Nutt.) Torr

Bảng 1.2: Bảng phân loài thực vật chi Stichoneuron Hook F theo WCSP

(Word Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Stichoneuron caudatum Ridl

2 Stichoneuron membranaceum Hook.f

Trang 15

Bảng 1.3: Bảng phân loài thực vật chi Pentastemona theo WCSP (Word

Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Pentastemona egregia (Schott) Steenis

2 Pentastemona sumatrana Steenis

Bảng 1.4: Bảng phân loài thực vật chi Stemona.Lour theo WCSP (Word

Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Stemona angusta I.R.H.Telford 2 Stemona aphylla Craib

3 Stemona australiana (Benth.) C.H.Wright 4 Stemona burkillii Prain

5 Stemona cochinchinensis Gagnep 6 Stemona collinsiae Craib

7 Stemona curtisii Hook.f 8 Stemona griffithiana Kurz

9 Stemona hutanguriana Chuakul 10 Stemona Japonica (blume) Miq

11 Stemona Javanica (Kunth) Engl 12 Stemona kerrii Prain

13 Stemona kurzii Prain 14 Stemona lucida (R.Br.) DuyfJes

15 Stemona mairei (H.Lév.) K.Krause 16 Stemona parviflora C.H.Wright

17 Stemona phyllantha Gagnep 18 Stemona pierrei Gagnep

19 Stemona prostrata I.R.H.Telford 20 Stemona sessilifolia (Miq.) Miq

21 Stemona squamigera Gagnep 22 Stemona tuberosa Lour

23 Stemona tuberosa var moluccana

1.1.2 Giới thiệu chi Stemona

Như đã giới thiệu, chi Stemona là chi lớn nhất trong họ Bách Bộ với

khoảng trên 30 loài Ở Việt Nam, theo tài liệu [1,6] số lượng loài Bách Bộ

trong chi Stemona được tìm thấy là 6 loài Đó là các loài Stemona

cochinchinensis Gagnep (Bách Bộ Nam Bộ), Stemona collinsiae Craib

Trang 16

(Bách Bộ hoa tím), Stemona pierrei Gagnep (Bách Bộ lá nhỏ), Stemona

phyllantha Gagnep (Bách Bộ hoa trên lá), Stemona saxorum Gagnep (Bách

Bộ đứng, Bách Bộ đá) và Stemona tuberosa Lour (Bách Bộ thân leo)

[55,71,75]

Theo các tài liệu [23,24,62] tại Lào hiện có 11 loài thuộc chi Stemona là:

S tuberosa., S phyllantha Gagnep., S squamigera Gagnep., S cochinchinensis Gagnep., S pierrei Gagnep., S saxorum Gagnep., S collinsae Craib., S aphylla Craib., S burkillii Prain., S griffithiana Kurz và S kerrii Craib Các loài này phân bố rải rác ở vùng núi miền bắc, đồng bằng

miền trung và miền nam nước Lào

Thực vật thuộc chi Stemona còn có các tên riêng như cây ba mươi (Việt

Nam), Gốc Samzip, Gốc Mư nang, Gốc Ì nhạng (Lào và Thái Lan) Đặc điểm

chung của thực vật chi Stemona: có thân đứng hoặc dây leo nhỏ, ưa khí hậu

nóng ẩm, phổ biến trong các khu rừng nhiệt đới, các vùng cao nguyên và núi

đá vôi, đặc biệt tập trung ở các nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Lào,

Campuchia, Thái Lan… Mỗi loài thuộc chi Stemona lại có những đặc điểm

phân bố riêng biệt như sau [38,54,68,82]:

 Dạng thân đứng phổ biến ở các vùng khí hậu nóng ẩm, đồng bằng, đất ẩm, các khu vực rừng ven sông, suối và các hồ nước suốt năm

 Dạng dây leo phân bố rải rác ở vùng rừng rậm, các khu vực cao nguyên, các rừng nhiệt đới

Cây có dạng thân leo quấn, dài 1,5m, lóng có khía; lá dạng phiến, mọc đối, có 7 gân chính, lồi ở mặt dưới, gân tam cấp thành sọc ngang mảnh; Hoa chùm 2-3 bông, màu đỏ đậm, có 4 tiểu nhụy, nang dài 1,5cm, 1 hột, mầu nâu, dài 13 mm có sọc

Trang 17

Dưới đây là hình ảnh của một số loài Bách Bộ chi Stemona thường gặp

Cấu trúc hoa Stemona:

Trang 18

Stemona aphylla Craib:

C front view of stamen; D side view of stamen; E ovary;

E-F.Nhụy

G Tử phòng

H Quả

I Hạt

Trang 19

G Tử phòng

H Hạt

Trang 20

Stemona collinsiae Craib:

A Cây B-C Hoa

Trang 21

Stemona pierrei Gagnep.:

A Cây

B Bộ thụ phấn

C Quả; D Hạt non

E Hạt già F-G Nhụy

G Tử phòng

H Quả; I Hạt

Stemona tuberosa Lour.:

A Cụm hoa; B Cánh hoa ngoài

C Cánh hoa trong; D-E Nhụy F.Tử phòng

G Quả;

H Hạt

Trang 22

H Tử phòng I.Quả

Trang 23

Hình 1.1: Hình ảnh và mô tả các loài Bách Bộ chi Stemona [63]

1.1.3 Công dụng

Theo y học cổ truyền [2,5,65], Bách Bộ có vị hơi đắng ngọt, tính ôn Thuốc có khả năng trị ho do hư lao, thường dùng trong trị lao phổi, khí quản viêm mãn tính, ho gà, nhuận phế, sát trùng, trị giun đũa, giun kim Theo kinh nghiệm dân gian, nhân dân các bộ tộc Lào đã sử dụng toàn bộ cây Bách Bộ làm thuốc giảm sốt, chữa bệnh bại liệt, tê và bệnh sẩy thai cho gia súc, làm tê liệt giun rất có hiểu quả Ngoài ra còn sử dụng làm thuốc diệt côn trùng để bảo vệ mùa màng, cây trồng

E Tử phòng

F Quả

G Hạt

Trang 24

 Một số đơn thuốc kinh nghiệm từ cây Bách Bộ

- Trị ho dữ dội: dùng rễ Bách Bộ, Gừng sống, giã lấy nước, 2 vị bằng nhau, sắc uống 2 chén [8]

- Trị ho nhiều: dùng Bách Bộ (cả dây lẫn rễ), giã vắt lấy nước cốt, trộn với mật ong, lượng bằng nhau, nấu thành cao, ngậm nước nuốt từ từ [21]

- Trị trẻ nhỏ ho do hàn: Bách Bộ sao, Ma hoàng khử mắt, mỗi thứ 30g, tán bột Hạnh nhân bỏ vỏ, bỏ đầu nhọn sao vàng, bỏ vào nước thật sôi, vớt ra, nghiền bột, cho mật vào nặn viên bằng hạt Bồ kết Mỗi lần uống 23 viên với nước nóng [22]

- Trị các chứng ho: Bách Bộ, Tang căn bạch bì, Thiên môn đông, Mạch môn đông, Bối mẫu, Tỳ bà diệp, Ngũ vị tử, Tử uyển, sắc uống [31]

- Trị ho do cảm mạo, ngứa họng, đờm ít: Bách bộ 16g, Kinh giới 12g, Bạch tiền 12g, Cát cánh 12g, Sắc uống [33]

- Trị lao phổi có hang: Bách bộ 20g, Hoàng cầm 10g, Đơn bì 10g, Đào nhân 10g, Sắc đặc còn 60ml, uống ngày 1 thang, liên tục 2-3 tháng [34]

- Trị lao phổi: Viên Bách Bộ trị lao phổi: dùng gà con, bỏ ruột và đầu, chân, theo tỉ lệ 1 cân gà - 1 cân thuốc Cho gà và nước vừa đủ nấu trong 4 giờ,

đổ nước gà ra, cho thêm nước khác nấu trong 45 lần, mỗi lần 2 giờ Các lần sắc nước, trộn đều cho thuốc vào khuấy đều (cứ 1 cân thuốc cần 480g nước hầm gà) Làm thành viên nhỏ, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 10g Một liệu trình là 20-30 ngày Nếu có kết quả, tiếp tục uống thêm 23 thang rồi sau đó uống thêm 23 thang để củng cố kết quả Đa số bệnh nhân đều lên cân, triệu chứng lâm sàng được cải thiện [53]

- Trị ho do lao phổi, do phế nhiệt: Bách Bộ 640g, Sa sâm 640g, đổ 10 cân nước sắc bỏ bã, trộn với 640g mật ong, nấu nhỏ lửa cho thành cao Ngày uống 2 lần, mỗi lần 8ml

Trang 25

- Trị ho, suyễn, khí quản viêm mãn tính: Bách Bộ 20g, Miên hoa căn 5 cái, Ma hoàng 8g, Đại toán 1 củ, sắc uống

- Trị ho gà: Bách bộ 1220g, sắc uống với đường cát

Ngoài tác dụng trị ho, cây Bách Bộ còn được sử dụng để trị côn trùng, trị giun và một số bệnh khác như bệnh vàng da, mề đay Cây Bách Bộ còn được sử dụng trong thú y dùng để chữa ghẻ lở cho trâu, bò, lợn chó bằng cách

giã củ Bách Bộ tươi lấy nước tắm [12,13,15]

1.2 Thành phần hóa học của cây Bách Bộ

Phần lớn các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách Bộ đều tập trung ở phần củ Bách Bộ do phần này chiếm tỷ trọng lớn nhất so với toàn

bộ cây và các hoạt chất chính đều tập trung tại đây Các nghiên cứu trong nước và quốc tế đều chỉ ra rằng, hoạt chất chính trong củ Bách Bộ là các stilbenoit, stemanthren, stemofuran và các ancaloit [32,58,59,67] Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách Bộ không thể tách khỏi việc nghiên cứu đến các hợp chất này

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Lào

Lào là một trong số những quốc gia có thảm thực vật tự nhiên đa dạng phong phú, có nhiều loài cây thuốc quí Do còn nhiều khó khăn về kinh tế, sự đầu tư vào nghiên cứu khoa học và công nghệ còn hạn chế, nên kết quả nghiên cứu các cây thuốc nói chung, cây Bách Bộ nói riêng còn rất khiêm tốn Với cây Bách bộ, hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức đánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết, chưa có tài liệu khoa học nào công bố về thành phần hóa học của cây Bách Bộ mọc ở Lào

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam năm 1996 TS Vũ Ngọc Kim là người đầu tiên nghiên cứu

thành phần hóa học của 3 loài S tuberosa, S saxorum, S peirrei và đã chiết

Trang 26

tách, xác định cấu trúc của một alcaloit có công thức cấu phân tử là

C22H33NO4 và đặt tên chất này là Tuberostemonine L-G [3]

Trong những năm 2000, PGS.TS Phạm Hữu Điển và các cộng sự đã tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của 4 loài Bách Bộ của Việt Nam:

S.tuberosa, S.collinsae, S.saxorum và S.cochinchinensis và đã phân lập được

trên 30 ancaloit, [47,49,51,60,62,79] Trong đó, từ loài S.cochinchinensis, các

tác giả đã phân lập được một ancaloit có cấu trúc khung mới, đặt tên là

Furuya bắt đầu nghiên cứu chiết xuất ancaloit trong rễ cây Stemona

sessilifolia Miquel Năm 1934, ông đã chiết được một hợp chất đầu tiên, đặt

tên Hodorine có công thức phân tử là C19H31O5N, nhiệt độ nóng chảy 244oC Năm 1934 Lobstein và Grumbach phân lập được một ancaloit, đặt tên là stemonine [37,88,89]

Trang 27

Cho đến nay, ngoài một số hợp chất tự nhiên khác như gluxit (chiếm 2,3% trọng lượng khô), lipit (0,83%), protit (9%), các axit hữu cơ [17,39,61]

từ củ Bách Bộ người ta đã phân lập và xác định được cấu trúc của trên 100 ancaloit [26, 45,46] Các ancaloit từ Bách Bộ thường rất đa dạng về cấu trúc

là do tính đa dạng về loài, phần khác – do điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu ảnh hưởng rất lớn đến sự đa dạng về cấu trúc khung Nhìn chung, các ancaloit này

có thể được chia thành 5 loại khung cơ bản sau:

N O

O

N O

O V

IV

III

II I

I Stenine; II Stemoamit; III Tuberostemospironine; IV Stemonamine

(maistemonin); V Parvistemoline

a Hợp chất chứa khung stenine

Các ancaloit khung stenine được các nhà khoa học nghiên cứu chiết xuất

từ rất sớm từ các loài Stemona tuberosa, Stemona japonica… Nhiều ancaloit tiêu

biểu đã được phân lập, chẳng hạn như: stenine, oxotuberostemonine, neotuberostemonine, tuberostemonine… [72,94]

Năm 1994 Ye Yang đã chiết xuất được 4 ancaloit mới từ cây Stemona

japonica [87] thu hái tại tỉnh ZheJiang (Trung Quốc), bao gồm: neostemonine, bis-đihiđroneostemonine, bis-đihiđroprotostemonine và isoprotostemonine

Trang 28

N O

O

H

H H

H

stenine (1)

N O

O

H

H O

O H

N O

O

H H

O

H H

neotuberostemonine (5)

N O

O

H

H H

Vào năm 2000 Yang Ye và các cộng sự đã phân lập được hai ancaloit

mới, chứa khung stenine từ cây Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa [89] Đó

là các chất neotuberostemonol và neotuberostemoninol Gần đây nhất, năm

2013, Dong Hai Lai và các cộng sự đã phân lập được 2 ancaloit mới là

Stenine (A-B) chứa khung này từ cây Stemona sessilifolia [26]

b Các hợp chất chứa khung Stemoamit

Hợp chất ancaloit khung stemoamit hiếm gặp hơn so với hợp chất chứa khung stenine Theo các tài liệu [18,41,86], các ancaloit khung stemoamit có

nhiều trong cây Bách Bộ lá nhỏ Stemona sessilifolia Năm 2003, Daichi Kakuta

và các cộng sự đã chiết tách được 9 hợp chất ancaloit mới cũng từ loài Stemona

Trang 29

H H H

stemocochinin (8)

N

O

O O

H H

stemoninoamide (10)

N

O H

stemoamide (13)

Năm 1994, Lin W.H và các cộng sự đã phân lập được 2 ancaloit có hàm

lượng lớn từ cây Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa là tuberostemoninol và

stemoninoamit [44, 83]

Vào năm 2007, Wang P và các cộng sự đã phân lập 4 hợp chất ancaloit

có khung stemoamit từ cây Stemona sessilifolia bao gồm các sessilistemonamine

Trang 30

c Các hợp chất chứa khung tuberostemospironine

Các hợp chất chứa khung tuberostemospironine thường rất hiếm gặp, lần đầu tiên được Lin Gen và các cộng sự phân lập được từ củ Bách Bộ thân

leo Stemona tuberosa [45,46]

O

Me H

H H

O

OH O

6-hydroxycroomine (16)

N O

OH

Tuberostemospironine (17) stemotinine (18)

O N

O

H

O H

Năm 2006, Lin L.G và các cộng sự đã phân lập được 5 ancaloit từ củ

Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa, gồm: bisđehyđrostemoninine,

isobisđehyđrostemoninine, bisđehyđroneostemoninine và bisđehyđrostemoninines A-B [47,48]

Trang 31

d Các hợp chất chứa khung stemonamine

Hợp chất chứa khung stemonamine được đặc trưng bởi maistemonin và

isomaistemonin là hai ancaloit đã phân lập từ cây Stemona mairie do Lin Wen

và cộng sự phân lập vào năm 1991 [11,98]

5

18

19 20

21

9 9a

12 11

10

13

14 15

16

17

22

Maistemonin (21) Isomaistemonin (22)

e Các hợp chất chứa khung parvistemoline

Các hợp chất chứa khung này chủ yếu phân lập từ cây Stemona parviflora,

Stemona sessilifolia Chẳng hạn năm 2006, tại Nhật Bản, Yukio Hitotsuyanagi và

các cộng sự [40,99] đã phát hiện thêm 6 ancaloit mới, trong đó có parvistemonine (23), parvistemoline (24), điđehyđroparrvistemonine (25) trong củ Bách Bộ lá nhỏ

Stemona sessilifolia Tại Hồng Kông, năm 2005, Ren Wang Jiang và các cộng sự

phân lập được 2 hợp chất (15) và (16) Từ đây, dựa vào các thực nghiệm, so sánh

đối chiếu cấu trúc, các tác giả đã khẳng định mối quan hệ gần gũi giữa 2 chi

Stemona và Croomine [82,89]

N OO

O

H H

H

H H

H

O H

O

parvistemonine (23)

N O

H

H O

O

pervistemoline (24)

Parvistemoline (24)

Parvistemonine (23)

Trang 32

N O

Ngoài 5 khung cơ bản đã nêu ở trên còn một số khung khác đã phân

lập từ các loài cây khác nhau như: Stemona tuberosa, Stemona sessilifolia và

O O

O

H

H H

O O

O

H

H H

HO

O

N O

O O

O

R

H OMe

stemofoline (R = H) (26) oxystemofoline (R = OH) (27) methoxystemofoline (R = OMe) (28)

Điđehyđroparvistemonine (25)

Stemofoline (R=H) (28) Oxystemofoline (R=OH) (29) Metoxystemofoline (R=OMe) (30) Tuberostemonone (26) Sessilifoliamit (27)

Trang 33

Cũng trong năm 2007, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thành phần của các loài Bách Bộ từ các vùng miền khác nhau để cố gắng đưa

ra sự phân loại Bách Bộ dựa theo thành phần hóa học của chúng [65,93] Mới nhất là đầu năm 2013, Dong Hai Lai đã phân lập được 3 ancaloit

mới stenine A-B, parvistemololin từ cây Stemona sessifolia và Stemona

parviflola, thu hái ở đảo Hainan (Trung Quốc) [26]

1.2.3.2 Stilbenoit

Bên cạnh ancaloit, các hợp chất stilbenoit cũng là một trong những lớp hợp chất quan trọng trong cây Bách Bộ

Năm 2001, Xin Zhuo Yang và các cộng sự [84,85,88] đã phân lập được

4 stilbenoit mới trong cây Stemona japonica Tiến hành nghiêm cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Staphylococus aureus, Staphylococus

epidermidis, Escherichia coli và nấm Candida albicans các tác giả nhận thấy

3 trong 4 chất có khả năng kháng S aureus và S epidermidis rất mạnh mà trước đó chỉ thu được trong cặn chiết ethanol của S tuberosa và cặn chiết clorofom của S collinsae [42]

OH Me

Quốc (Stemona sessilifolia) [84, 88]

Trang 34

OMe Me

Năm 2008, mười hai đihiđrostilbenot mới và năm chất cũ đã được các

tác giả tìm thấy trong rễ của cây S.tuberosa [91] Trong đó có hợp chất 3– hyđroxy–2–metyl–5–metoxybibenzyl có khả năng ức chế Bacillus pumilus

(MIC 12,5–25,0 µg/ml)

OMe MeO

MeO

OH

Me

1 3 5

1'

3' 5'

3 hydroxy, 2 metyl, 5,2’,4’-trimetoxy bibenzyl (37)

Cũng trong năm 2008, các tác giả [28] đã chiết tách được ba

đihyđrostilbenenoit mới và một số hợp chất cũ khác từ rễ của cây Stemona

japonica Hai hợp chất có khả năng ức chế nấm Candia albican là các hợp

chất 3,5–đihyđroxy–20–metoxybibenzyl và 3, 3’–đihyđroxy–2, 5’–đimetoxy bibenzyl [97,101]

Trang 35

OH OMe

OMe OH

3,3’ dihydroxy, 2,5’ dimetoxy bibenzyl (38)

1.2.3.3 Stemanthren

Năm 2003, tại Thái Lan, Katharina và các cộng sự đã phân lập được

3 stemanthren mới và tiến hành thử hoạt tính chống nấm Sau khi kiểm tra, các tác giả thấy rằng nếu vòng A được giữ nguyên, không thay thế các nhóm chức khác thì các hợp chất này đều có khả năng chống nấm khá tốt [32,73]

OH

Me MeO

MeO

HO

OMe

Me HO

MeO

HO

OH

Me MeO

Theo tài liệu [56], Xin Zhou Yang và các cộng sự đã phân lập một hợp

chất Stemanthren mới từ rễ của cây Stemona japonica và hợp chất này có khả năng ức chế hai loại vi khuẩn đó là S.aureus và S.epidermidis

Trang 36

Vào năm 2006, tại Trung Quốc, Ya Zhang Zhang và các cộng sự đã

phân lập được một stemanthren mới từ rễ cây Stemona japonica, đặt tên là hợp chất stemanthren G [26]

Từ cây Stemona tuberosa, năm 2008, Li Gen Lin đã phân lập tiếp được thêm một stemanthren đặt tên là stemanthraquinone [77]

OMe HO

Vào năm 2010, nhóm nghiên cứu của Sastraruji đã phân lập từ củ Bách

Bộ Thái Lan Stemona aphylla 5 hợp chất stemofuran (46-50) và đem năm hợp

chất này thử hoạt tính sinh học Kết quả nghiên cứu cho thấy ba trong năm chất đó có khả năng ức chế vi khuẩn MRSA (Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus, vi khuẩn làm suy yếu hệ miễn dịch và kháng

lại các loại thuốc kháng sinh thông dụng) [53,73,97]

Ngoài ra, năm 2004, nhóm nghiên cứu của Brigitte Brem tìm ra 4 hợp chất đehyđrotocopherol trong rễ củ của một số loài Bách Bộ khác nhau và

chúng đều có khả năng chống oxy hóa các gốc tự do DPPH [17]

Trang 37

Stemofuran D (46) Stemofuran G (47) Stemofuran K(48)

O

OMe OH

1' 3' 5'

MeO OH

OH

OMe

OH Me

Me

OMe

O

OMe OH

OMe HO

1.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây Bách bộ

Theo các tài liệu [16,38,73,94] dịch chiết etanol của củ Bách Bộ

Stemona tuberosa có tác dụng ức chế phát triển một số loài nấm và vi khuẩn

kiểm định Một số dẫn xuất của bibenzyl (3,5-đihyđroxy-4-metylbibenzyl), có khả năng ức chế sử phát triển của tế bào ung thư máu P338 và gan của chuột

Ở Việt Nam, TS.Vũ Ngọc Kim đã tiến hành thử nghiệm tác dụng sinh

học dịch chiết củ S.tuberosa, ancaloit toàn phần, tuberostemonine L-G Kết

quả thử nghiệm cho thấy cao chiết và các chất có tác dụng làm liệt cơ giun đũa, giảm ho và long đờm trên chuột Ngoài ra tuberostemonine L-G còn có

tác dụng ức chế một số vi khuẩn thử nghiệm như: Bacillus subtillis, Bacillus

pumilius, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Klebsiella Kết quả nghiên

cứu khả năng gây độc tế bào của các dịch chiết thô từ ba loài như: S

tuberosa, S saxorum, S cochinchinensis, cho thấy: dịch chiết thô từ S.cochinchinensis có hoạt tính kháng cả bốn dòng tế bào ung thư: ung thư

gan, ung thư màng tử cung, ung thư màng tim và ung thư thận người Chỉ sau

khi được làm giàu theo định hướng các dẫn chất bibenzyl, các mẫu S

tuberosa và S saxorum mới xuất hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với ba

dòng tế bào ung thư trên [4,92]

Trang 38

Kết luận chương 1:

Bách Bộ là cây thuốc quí, có giá trị sử dụng cao, được nhân dân nhiều nước khai thác sử dụng, được các khoa học quan tâm nghiên cứu Cây Bách

Bộ của Lào được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để làm thuốc chữa một

số bệnh thông thường, song cho đến nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào đề cập đến Vì vậy, trong khuôn khổ đề tài luận án tiến sĩ hóa học này, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của ba loài Bách Bộ chi Stemona mọc hoang ở Lào, không trùng lặp

với bất kì công trình nào đã công bố từ trước tới nay

Trang 39

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và các phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Tên khoa học của các mẫu thực vật được Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giúp xác định Các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội

Mẫu cây Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis được thu hái tại

tỉnh Savannakhet (CHDCND Lào) vào tháng 10 năm 2010, số tiêu bản là KPN-01.2010

Hình 2.1: Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis

Mẫu cây Bách Bộ lá nhỏ Stemona pierrei được thu hái tại tỉnh

Savannakhet, CHDCND Lào vào tháng 6 năm 2011, mẫu tiêu bản số 02.2011 Tên khoa học của mẫu cây được Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định

Trang 40

KPN-Hình 2.2: Bách Bộ lá nhỏ Stemona pierrei

Mẫu cây Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa được thu hái tại tỉnh

Attapu, CHDCND Lào vào tháng 7 năm 2011, mẫu tiêu bản số 03.2011 (tên khoa học của mẫu cây được TS Sinh học Nguyễn Thị Liên Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Việt Nam giúp định tên)

KPN-Hình 2.3: Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa

2.1.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Các mẫu thực vật sau khi thu hái đều được xử lý theo các qui trình chung như sau:

Tiêu đề	Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thuộc chi Bách Bộ (Stemona) mọc ở Lào
Tác giả	Vonganatha Khamko
Người hướng dẫn	PGS.TS. Phạm Hữu Điển, PGS.TS. Đặng Ngọc Quang
Trường học	Trường đại học Sư phạm Hà Nội
Chuyên ngành	Hóa học hữu cơ
Thể loại	Luận án tiến sĩ
Năm xuất bản	2013
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	168
Dung lượng	4,74 MB