Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6

HOÀNG THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hoàng Thị Lan Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN

DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2013

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS TS Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS TS Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS Nguyễn Thị Hương-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, TS Đoàn Lan Phương- Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo không bão hoà

Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS Hoàng Thị Minh Hiền, ThS Ngô Thị Hoài Thu, ThS Đinh Thị Ngọc Mai, KS Lê Thị Thơm, KS Nguyễn Cẩm

Hà, KTV Đỗ Thị Là, ThS Đinh Đức Hoàng, ThS Bùi Đình Lãm, ThS Hoàng Sỹ Nam, ThS Nguyễn Đình Hưng Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá và khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) và đề

tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam

và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản” 2010) thuộc chương trình công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ NN và PTNT do PGS

(2008-TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh

MỤC LỤC

Trang

1.1 Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi

1.2 Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA) 8

1.3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit và -3

PUFA ở Schizochytrium

14

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn C và N 14

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 16

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17

1.4 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng nói chung và chi

Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA

23

1.4.1 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA 23

1.5. Những ứng dụng sinh khối của chi Schizochytrium 27

2.5.2 Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) 40

2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp. 41

2.5.3.2 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 41

2.5.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng

Schizochytrium spp.

45

2.5.7 Phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối

Schizochytrium spp.

46

2.5.10.1 Nghiên cứu độc tính cấp của Algal Omega -3 47

2.5.10.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 47

2.5.11.1 Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ 49

2.5.11.2 Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện 49

2.5.11.3 Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh 51

2.5.12 Nghiên cứu sử dụng sinh khối tảo S mangrovei PQ6 làm giàu luân

trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia

51

2.5.12.1 Xác định lượng tảo và thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng và

Artemia

51

2.5.12.2 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, khô và chất

cường hoá Golden Power trong việc làm giàu Artemia

52

2.5.12.3 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì

và vi tảo biển quang tự dưỡng

52

2.5.12.4 Sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn

cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)

53

2.5.12.5 Nghiên cứu sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia

làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)

56

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58

3.1 Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển

3.1.2 Tuyển chọn một số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm năng cho

việc sản xuất DHA

59

3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng thuộc chi

Schizochytrium tiềm năng

61

3.1.3.1 Một số đặc điểm hình thái điển hình 61

3.1.3.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng 63

3.1.3.3 Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm

năng

68

3.1.3.4 Bảo quản giống 70

3.1.4.1 So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một số

loài đại diện thuộc chi Schizochytrium

72

3.1.4.2 Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 18S rRNA 74

3.2. Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ

thống lên men

79

3.2.2 Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít tự tạo 83

3.2.3 Xây dựng quy trình nuôi trồng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít

tự tạo

87

3.2.4 Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu được 89

3.3 Bước đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực

phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản

90

3.3.1 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối khô chủng PQ6 90

3.3.1.1 Quy trình tạo viên Algal Omega-3 90

3.3.1.2 Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của viên Algal Omega-3 (AO-3) 93

3.3.2 Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 trong nuôi trồng thủy sản 102

3.3.2.1 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng

(Brachionus plicatilis)

102

3.3.2.2 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức

ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)

117

3.3.2.3 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng và

Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer

Bloch, 1790)

119

4.1 Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập 121

4.2 Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men 127

4.3 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng

thủy sản

135

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AA Arachidonic acid (C20:4-6) Axít arachidonic

ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase

AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase

ASTM American Society for Testing and

DHA Docosahexaenoic acid (C22:6-3) Axít docosahexaenoic

DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic

DPA Docosapentaeoic acid (C22:5-6) Axít docosapentaeoic

E.coli Escherichia coli Vi khuẩn E.coli

EPA Eicosapentaenoic acid (C20:5-3) Axít eicosapentaenoic

FAME Fatty acid methyl ester Các axít béo dạng methyl ester GPYc Glucose-Polypepton- Yeast

extract- chloramphenicol

Môi trường phân lập Schizochytrium

gồm glucose-polypepton- cao nấm men- chloramphenicol

IPTG isopropylthio-β-galactoside isopropylthio-β-galactoside

KLT Khối lượng tươi Khối lượng tươi

LB

LCPUFA

Lauria Betani Long Chain Polyunsaturated Fatty Acid

Môi trường LB Axít béo không bão hòa mạch dài đa nối đôi

nghiệm

MUFA Mono-unsaturated fatty acid Axít béo không bão hòa một nối đôi

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PUFA Polyunsaturated fatty acid Axít béo không bão hòa đa nối đôi rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom

SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét

VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng Vi tảo biển dị dưỡng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi

Bảng 2.3 Sự tương quan giữa mật độ (cá thể/ml) với thức ăn A1 DHA Selco 54

Bảng 3.2 Sinh trưởng và hàm lượng lipít tổng số của các chủng thuộc chi

Schizochytrium đã phân lập

60

Bảng 3.3 Hàm lượng lipit, thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh

khối của 4 chủng Schizochytrium spp tiềm năng

69

Bảng 3.4 So sánh một số đặc điểm sinh học của 4 chủng tiềm năng với hai loài

đại diện của chi Schizochytrium

73

Bảng 3.5 Các loài thuộc chi Schizochytrium có trình tự đoạn gen 18S rRNA đã

công bố trên GenBank được sử dụng để phân loại các chủng tiềm năng

76

Bảng 3.6 Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipit và DHA trong sinh khối chủng

PQ6 nuôi ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít ở thời điểm 96 giờ

82

Bảng 3.7 Sự thay đổi thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối

chủng PQ6 nuôi trong bình lên men 30 lít thu tại các thời điểm khác nhau

85

Bảng 3.8 Thành phần dinh dưỡng, và kim loại nặng trong sinh khối chủng

PQ6 (% KLK)

89

Bảng 3.9 Thành phần dinh dưỡng của viên Algal Omega-3 (% KLK) 91 Bảng 3.10 Các chỉ tiêu lý hoá, vi sinh và kim loại nặng của viên Algal Omega-3 92 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của AO- 3 lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa máu

Bảng 3.15 Kết quả đo đáp ứng phản xạ trên mô hình tránh shock chủ động có

điều kiện ở chuột cống trắng

101

Bảng 3.16 Thời gian đáp ứng phản xạ của chuột nhắt trắng non trong thử

nghiệm nhảy khỏi phiến nóng

101

Bảng 3.17 Hàm lượng lipit và axít béo ở Artemia sau khi làm giàu bằng sinh

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau

104

Bảng 3.18 Hàm lượng lipit và axít béo ở luân trùng sau khi làm giàu bằng sinh

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau

107

Bảng 3.19 Thành phần axit béo của Artemia ở các lô thí nghiệm làm giàu bằng

Golden Power và sinh khối chủng PQ6 sau 15 giờ

111

Bảng 3.20 Mật độ luân trùng khi nuôi bằng vi tảo biển quang tự dưỡng và men

bánh mì sau 7 ngày

113

Bảng 3.21 Hàm lượng lipit và thành phần axít béo trong sinh khối luân trùng

sau quá trình nuôi và làm giàu khác nhau

115

Bảng 3.22 So sánh kích thước của ấu trùng Zoea ở các lô thí nghiệm 119

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.4 Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi

Schizochytrium

22

Hình 3.1 Khuẩn lạc nuôi cấy trên đĩa thạch (A) và chụp dưới kính hiển vi

quang học (B, độ phóng đại 100 X) của chủng Schizochytrium sp

PQ6, PQ7, TH16 và TB17

59

Hình 3.2A Hình thái tế bào chụp dưới kính hiển vi điện tử quét- SEM (A) và

kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (B)

62

Hình 3.2B Một số giai đoạn trong chu trình sống của chủng PQ6 62

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng 65

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng 67

Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR nhân một phần gen 18S

rRNA của 4 chủng tiềm năng

Hình 3.13 Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 5 lít

80

Hình 3.14 Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 10 lít

81

Hình 3.15 Hình thái tế bào chủng PQ6 trong bình lên men 5 lít (A), 10 lít (B) ở

các giai đoạn nuôi cấy khác nhau

82

Hình 3.16 Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

còn lại trong môi trường nuôi trong bình lên men 30 lít

83

Hình 3.17 Ảnh chụp tế bào chủng PQ6 nuôi ở bình 30 lít tự tạo ở các thời điểm

khác nhau dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang (B) sau khi nhuộm Nile Red

84

Hình 3.18 Sơ đồ quy trình nuôi theo mẻ chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít 87 Hình 3.19 Quy trình tạo viên Algal Omega-3 từ sinh khối chủng PQ6 91 Hình 3.20 Ảnh hưởng của AO-3 lên sự tăng khối lượng cơ thể thỏ 94 Hình 3.21 Ảnh chụp hình thái của gan, lách, thận thỏ trước và sau khi uống AO-

3 dưới kính hiển vi huỳnh quang

98

Hình 3.22 Tỷ lệ sống (%) (A) và thời gian chuyển giai đoạn (B) của ấu trùng cua

xanh ở các giai đoạn khi ăn Artemia được và không được làm giàu

bằng sinh khối tươi chủng PQ6

118

Hình 3.23 Tỷ lệ sống của cá Chẽm giai đoạn 1 tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng

và Artemia được làm giàu bằng sinh khối chủng PQ6 và A1 DHA

Selco

120

Hình 3.24 Tăng trưởng về chiều dài của cá Chẽm giai đoạn 3 ngày tuổi đến 1

tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng và Artemia làm giàu bằng sinh khối

chủng PQ6 và A1 DHA Selco

120

Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh

thái biển và rừng ngập mặn Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên Loại vi tảo này có khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic (EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3) Những tác động tích cực cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm… Hiện nay, loại vi tảo này được coi là ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá Việc nuôi cấy chúng có thể được thực hiện ở quy mô lớn bằng những hệ thống lên men thông thường với hiệu quả cao Nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ loại vi tảo này dành cho con người, và động vật đã

có mặt trên thị trường quốc tế và dần trở nên quen thuộc với người tiêu dùng ở khắp nơi trên thế giới

Việt Nam đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng về thành phần loài/chủng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể dùng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo Vi tảo biển quang tự dưỡng là một trong những đối tượng truyền thống đã được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm cho nhiều mục đích khác nhau trong đó có nuôi trồng thuỷ sản

(Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros…) Tuy nhiên, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi Schizochytrium

vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con

người Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh

học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

 Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân

lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Việt Nam và sàng lọc các chủng tiềm năng cho việc sản xuất -3 PUFA

 Lựa chọn được một chủng tiềm năng để nuôi thu sinh khối tạo viên thực phẩm chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Phân lập các chủng Schizochytrium spp từ các mẫu lá cây thu thập ở ven bờ

biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam;

 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân lập;

 Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác

nhau (5, 10 và 30 lít);

 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6,

đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực nghiệm;

 Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

 Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các

chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam;

 Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập;

 Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei

PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản

Chương I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium 1.1.1 Hệ thống phân loại

Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào bộ

Saprolegniales thuộc ngành Oomycota do có nhiều nét tương đồng với nấm động bào tử Tuy nhiên, ngày nay với những bằng chứng về siêu cấu trúc và trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA thu được, các nhà khoa học đã xếp chúng vào

một giới riêng - giới Chromista Chi Schizochytrium được xếp vào ngành

Labyrinthulomycota, lớp Labyrinthulea, bộ Labyrinthulida, họ Thraustochytriidae

(Porter, 1990; Cavalier- Smith, 1998) Sơ đồ phân loại chi Schizochytrium được chỉ

ra trên hình 1.1

Chi Schizochytrium được đặc trưng bởi tế bào hình cầu, mạng lưới ngoại

chất rất phát triển, khuẩn lạc sinh dưỡng lớn, động bào tử có dạng ovan hoặc dạng trứng, sinh trưởng bằng hình thức tế bào sinh dưỡng phân đôi liên tiếp tạo thành 4,

8 hoặc một cụm tế bào (có thể lên tới 100 tế bào) Cũng như nhiều chi thuộc ngành Heterokontophyta, trong chu trình sống của tế bào có giai đoạn hình thành động bào

Hình 1.1 Vị trí phân loại chi Schizochytrium (Porter, 1990)

tử có hai roi lệch Hình 1.2 là hình mô tả chu trình sống của một số chi đại diện (Porter, 1990)

Hình 1.2 Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota

(Porter, 1990)

Chú thích: chi Schizochytrium: tế bào non với mạng lưới ngoại chất (a) phân chia liên tiếp tạo thành 4 tế bào (b) và tạo thành một khối các tế bào (c); Mỗi tế bào phát triển thành túi động bào tử (d) và giải phóng động bào tử (e), động bào tử biệt hóa thành tế bào non

Thành tế bào có chứa sulphate polysacharide với thành phần chủ yếu là galactose hoặc fructose và protein (Chamberlain, 1980) Hệ thống mạng lưới ngoại chất (EN) được sinh ra từ một hoặc nhiều điểm trên thành tế bào EN hình thành nên một mạng lưới nhánh của màng sinh chất kéo dài, liên quan đến một bào quan gọi là bothrosome hoặc sagenogenetosome (sagenogen) ở phía bề mặt ngoài tế bào (Porter, 1990) EN góp phần làm tăng vùng bề mặt tế bào, có chứa enzyme thủy

phân gắn trên bề mặt hoặc nằm chìm trong môi trường xung quanh đã giúp cho việc tiêu hóa dễ dàng các vật liệu hữu cơ EN cũng gắn tế bào với môi trường và tiến hành phân hủy các cơ chất hữu cơ Tế bào hầu như không sản xuất EN khi phát triển trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng, đặc biệt là trong điều kiện nuôi lắc (Raghukumar, 2008)

Hiện có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S

mangrovei Raghukumar, S aggretatum Goldstein & Belsky, S octosporum

Raghukumar, S minutum Gaertner và S limacinum Honda & Yokochi

(Raghukumar, 1988; Honda và cs, 1998) Trong cả một thời gian dài sự phân loại

của chi Schizochytrium nói riêng và lớp Labyrinthulea nói chung chỉ dựa vào duy

nhất các đặc điểm hình thái và hình thức giải phóng động bào tử Khóa phân loại chi tiết của các họ và chi thuộc lớp Labyrinthulea dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng tế bào, mạng lưới ngoại chất, tế bào amip), sự hình thành động bào tử và tổng hợp sắc tố (chủ yếu là beta-caroten) đã được Yokoyama và cộng sự đưa ra năm

2007 (Yokohama và cs., 2007; Jones & Pang, 2012) Ngày nay, các công cụ sinh học phân tử hiện đại đã hỗ trợ đắc lực trong việc phân loại chính xác hơn các loài thuộc các chi khác nhau Mặc dù còn là lĩnh vực khá non trẻ, hệ gen của các sinh vật đơn bào ở biển giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn về sinh vật nhân chuẩn (Worden & Allen, 2010) Hệ gen này có thể là những công cụ vô giá cho việc khai thác mối quan hệ tiến hóa, chức năng gen, trao đổi chất và sự phát triển của các đặc điểm phức tạp giữa các nhóm vi sinh vật (McGrath & Katz, 2004) và sẽ tiếp tục làm sáng tỏ những điểm còn đang tranh cãi Nhìn chung, các sinh vật biển đơn bào có

độ đa dạng cao do chúng là kết quả của các hiện tượng nội cộng sinh khác nhau diễn ra từ xa xưa (Worden & Allen, 2010)

Yokoyama và cộng sự đã đề xuất bổ sung thêm 5 chi mới nâng tổng số lên

12 chi thuộc họ Thraustochytriidae (Yokoyama & Honda, 2007; Yokoyama và cs, 2007) Điều này dẫn đến sự sắp xếp lại một số loài trong đó có 4 loài thuộc chi

Schizochytrium (bảng 1.1) Tuy nhiên, đây vẫn còn là vấn đề đang gây tranh cãi đối

với các nhà khoa học

Bảng 1.1 Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi

Schizochytrium (Jones & Pang, 2012)

Aurantiochytrium limacinum (D Honda và

Yokochi) R Yokoyama và D Honda

thuộc họ Thraustochytriidae nói chung và chi Schizochytrium nói riêng (Bremer,

2000; Burja và cs, 2006; Jakobsen và cs, 2007) Các hạt phấn thông được khử trùng được rải trên bề mặt mẫu nước biển có chứa kháng sinh, chất kháng nấm và được ủ 1–2 tuần Khi quan sát thấy các tế bào phát triển trên bề mặt phấn thông, chúng sẽ được trải trên đĩa thạch để thu nhận các khuẩn lạc đặc trưng trước khi đưa vào môi trường lỏng nuôi cấy nhằm thu chủng sạch (Wilkens & Maas, 2012)

Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên quá trình phân lập thành công hay không vì khi tiến hành phân lập ở 18-30oC cũng là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của cả các vi sinh vật tạp nhiễm như nấm và vi khuẩn Các chất kháng sinh như penicillin

và streptomycin (Burja và cs, 2006; Quilodran và cs, 2010), rifampicin và các thuốc kháng nấm như nystatin (Jakobsen và cs, 2007; Wilkens & Maas, 2012) và amphotericin B (Taoka và cs, 2010) đã được bổ sung vào môi trường thạch và lỏng

để hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và các khuẩn lạc sợi nấm

1.1.2.2 Các kĩ thuật định tên

* Kĩ thuật hóa sinh

Kĩ thuật nhuộm huỳnh quang đã được phát triển nhằm xác định số lượng tế bào nhờ phản ứng giữa fluorochrome (acriflavine), thành tế bào và nhân Khi đó, thành tế bào bắt màu đỏ, nhân bắt màu xanh Tuy nhiên, kĩ thuật này trong một số

trường hợp không thể phát hiện được các tế bào Schizochytrium ở giai đoạn động

bào tử (do hầu hết các loài không có thành tế bào) hoặc khi các tế bào có thành mỏng (Gupta và cs, 2012) Một phương pháp đặc hiệu để phát hiện họ Thraustochytriidae là lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) đã được thiết lập với việc sử dụng một đầu dò ThrFL1 đối với rRNA đích đã cho phép giải quyết được những hạn chế nêu trên (Takao và cs, 2007) Trong kĩ thuật FISH có quá trình lai giữa đầu

dò ThrFL1 với rRNA sẽ cho phép phát hiện các động bào tử và các tế bào sinh dưỡng còn non Phương pháp nhuộm bằng Sudan Black cũng đã được sử dụng để phát hiện ra các tế bào thuộc họ Thraustochytriidae nói chung (Wong và cs, 2008; Gupta và cs, 2012)

* Định tên bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Kĩ thuật định tên bằng sinh học phân tử dựa trên việc đọc và phân tích trình

tự của gen hoặc đoạn gen 18S rRNA đã được sử dụng để xác định mối quan hệ di truyền của các chủng phân lập chưa biết và những chủng đã được biết thuộc họ Thraustochytriidae Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 18S rRNA cần một cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã biết của các chủng nghiên cứu Sau đó việc so sánh và phân tích mối quan hệ di truyền sẽ được tiến hành để tìm ra loài mới (Mo và cs, 2002; Yokoyama & Honda, 2007) Đây là công cụ tương đối chính xác cho phép xác định hoặc thiết lập các mối quan hệ giữa các loài thuộc

họ Thraustochytriidae

* Phân tích siêu cấu trúc

Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đã cho phép phát hiện nhiều thể lipit trong phần tế bào chất của tế bào thuộc họ Thraustochytriidae Các thể lipit này sau đó được xác định lại bằng phương pháp nhuộm với Sudan Black B

(Subramaniam & Chaubal, 1990) Nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào bằng TEM đã cho phép dựng nên những nét chung về cấu tạo tế bào thraustochytrid với kích thước rất khác nhau, đường kính xấp xỉ 6–21 μm, phần tế bào chất dạng hạt có chứa các hạt dầu hình cầu Dưới kính hiển vi TEM có thể quan sát thấy một thể lipit liên kết với các cấu trúc mảnh, rỗng có chứa các băng sáng, tối Dạng cấu trúc mảnh này

đã được mô tả như là tỷ lệ của các axít béo bão hòa, không bão hòa một nối đôi trên các axít béo không bão hòa đa nối đôi (Wong và cs, 2008) Người ta cũng đã quan sát thấy có một mối liên hệ giữa sự hình thành thể lipit và mạng lưới nội chất (ER)

ở S limacinum SR21 (Morita và cs, 2006) Các thể lipit bao quanh bởi ER đã được nghiên cứu rộng rãi ở nấm Mortierella ramanniana (Kamisaka và cs, 1999) trong

khi những nghiên cứu tương tự thì chưa được thực hiện đối với họ Thraustochytriidae

1.2 Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)

1.2.1 Giới thiệu chung về -3 PUFA

Trong những thập niên gần đây, các axít béo không bão hoà đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFA) đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong dinh dưỡng và dược phẩm PUFA là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cácbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết cácbon đôi Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên được tính từ đầu methyl Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon, người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hay “ω” Hiện PUFA được phân thành hai nhóm chính là -3 (liên kết đôi đầu tiên tại vị trí cácbon thứ 3) và -6 (liên kết đôi đầu tiên tại vị trí cácbon thứ 6) Các liên kết đôi trong PUFA có thể cũng được tính từ nhóm carboxyl và khi đó được ký hiệu là “Δ” Axít docosahexaenoic (DHA, 22:6 Δ 4,7,10,13,16,19) và axít eicosapentaenoic (EPA, 20:5 Δ 5,8,11,14,17) là hai thành viên thuộc họ ω-3 PUFA được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò đặc biệt quan trọng của chúng đối với con người

và động vật Cấu trúc hoá học của hai ω-3 PUFA này được chỉ ra trên hình 1.3 (Sijtsma & de Swaaf, 2004)

1.2.2 Vai trò của -3 PUFA đối với sức khoẻ con người

Các PUFA có ba vai trò sinh học chủ yếu Đầu tiên phải kể tới việc tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipít, vận chuyển và hướng tới các mô Ví dụ các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol ở gan bởi các

-3 PUFA Bên cạnh đó, các PUFA còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử thông tin thứ hai như diacylglycerol, phosphatidic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate, ceramide

và AA (axít arachidonic) - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt động tín hiệu của màng tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh tương ứng các phản ứng đáp lại; và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá tiểu cầu Ngoài

ra, một số PUFA còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt tính sinh học như prostaglandin (PG), thromboxan (TX) và leukotrien (LT) (Calder, 2003)

Trong thập niên 80, những hiểu biết của con người về PUFA nói chung đã được mở rộng, đặc biệt là các -3 PUFA Con người không tự tổng hợp được -3

và -6 PUFA do thiếu enzyme delta-12 và delta-15 desaturase và vì vậy, chúng phải được lấy từ ngoài vào thông qua chế độ ăn (Calder, 2003) Việc tiêu thụ EPA

và DHA đã được chứng minh là có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch, hệ thần kinh và tình trạng viêm Do liên quan đến sức khỏe tim mạch nên nếu thường xuyên tiêu thụ

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của DHA và EPA (Sijtsma & de Swaaf, 2004)

-3 PUFA có thể sẽ giúp giảm nguy cơ huyết áp cao, nghẽn mạch, nhồi máu cơ tim

và rối loạn nhịp tim Điều này là do các -3 PUFA đã có tác dụng làm tăng tỷ lệ lipoprotein tỷ trọng cao/lipoprotein tỷ trọng thấp (HDL/LDL) và giảm tỷ lệ cholesterol tổng số/HDL (Adarme-Vega và cs, 2012) DHA và EPA cũng ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu vì vậy, góp phần phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch (Horrocks & Yeo, 1999) Li và cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng việc thu nhận đầy đủ -3 PUFA trong đó có DHA ở giai đoạn trẻ nhỏ sẽ giúp ngăn ngừa nguy cơ tăng huyết áp khi về già

Ngoài những lợi ích đối với tim mạch, -3 PUFA cũng được chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến chức năng của não và hệ thần kinh Sự tích lũy DHA trong màng tế bào thần kinh là một chỉ số quan trọng cho sự phát triển của não và khả năng chịu đựng (Kim, 2008) EPA và DHA có khả năng điều chỉnh một cách hiệu quả hàm lượng cholesterol trong huyết thanh Do đó, nó góp phần ngăn chặn sự rối loạn về tâm thần (Narayan và cs, 2006) Vai trò của EPA và DHA trong việc làm giảm nguy cơ rối loạn tâm thần có thể là do chúng có tác động đến thụ thể dẫn truyền thần kinh và G-protein thông qua sự tác động lên các tính chất sinh lý của màng tế bào, các tín hiệu thứ cấp và trên các protein kinase

Ở phụ nữ mang thai, người mẹ được hấp thụ đủ lượng EPA và DHA có vai trò rất quan trọng cho sự phát triển khỏe mạnh não bộ của thai nhi Ở trẻ sơ sinh, arachidonic acid (ARA) - một loại -6 PUFA và DHA cũng cần cho sinh trưởng và phát triển các chức năng bình thường của cơ thể (Adarme-Vega và cs, 2012) Cơ thể trẻ không thể tổng hợp DHA đủ nhanh để đáp ứng cho sự phát triển nhanh chóng của não nên axít béo này phải được nhận từ khẩu phần ăn hàng ngày Nhìn chung, nuôi con bằng sữa mẹ sẽ đáp ứng và cung cấp đầy đủ nhu cầu nguồn PUFA cho trẻ nhỏ Mặc dù từ lâu đã có những khuyến cáo là nên bổ sung DHA vào tất cả các công thức dinh dưỡng cho trẻ, nhưng thực tế DHA chỉ mới được bổ sung trong một

số công thức dinh dưỡng cho trẻ mới gần đây (Birch và cs, 2007; Innis, 2008) Các thử nghiệm lâm sàng với chế độ ăn giàu DHA có thể cải thiện khả năng học tập của trẻ em trong độ tuổi đến trường (Richardson & Montgomery, 2005) Tác động tích

cực về chức năng thị giác và kỹ năng vận động đã được quan sát thấy ở trẻ bị bệnh phenylketo niệu (rối loạn di truyền gây mất chức năng chuyển hóa phenylalanin) khi chế độ ăn uống được bổ sung DHA (Ryan và cs, 2010) Chế độ ăn thiếu DHA trong quá trình giai đoạn phôi thai và thời thơ ấu có thể dẫn đến ức chế sự phát triển của não (Innis, 2008)

Hiệu quả đáp ứng miễn dịch đã được quan sát thấy khi ω-3 PUFA được sử dụng để điều trị tình trạng viêm nhiễm như viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn, viêm loét đại tràng, bệnh vẩy nến, bệnh suyễn, bệnh lupus và xơ nang Trẻ em ăn dầu cá nhiều hơn một lần trên tuần có xác suất bị hen suyễn thấp hơn Tăng hàm lượng DHA và EPA ở những bệnh nhân viêm khớp dạng thấp và viêm loét đại tràng cũng cho thấy có tác dụng giảm đau và cải thiện tình trạng bệnh, mặc dù cách thức hoạt động cho đến thời điểm này vẫn chưa rõ ràng (Adarme-Vega và cs, 2012)

So với bệnh cao huyết áp, bệnh học của ung thư rất phức tạp và có nhiều dạng DHA và EPA ức chế cyclocoxygenase, do đó nó làm giảm hàm lượng prostaglandin và làm tăng hoạt tính của lipoxygenase Điều này làm tăng sản xuất hydroxyeicosatrienoic acid (HETE) và leukotrien B4 (LTB4) Chính HETE và LTB4 lại có tác dụng làm chậm quá trình ung thư tế bào phát triển thành ung thư

mô (Liu và cs, 2001) Hiệu quả của chế độ ăn có các ω-3 PUFA lên các tế bào ung thư ruột kết cũng là một tín hiệu tích cực để làm giảm sự gia tăng của các loại bệnh ung thư chết người (Kato và cs, 2002) DHA cũng kích thích quá trình “tự chết” (apoptosis) của các tế bào ung thư (Siddiqui và cs, 2008)

Sự tiêu thụ các PUFA được khuyến cáo ở mức trung bình khoảng 6% tổng năng lượng, không vượt quá 10% Trong đó nên giảm hàm lượng các axít béo bão hoà và chỉ nên duy trì ở mức 8–10% tổng năng lượng hấp thụ Để giảm nguy cơ các bệnh kinh niên thì hàm lượng các PUFA mạch dài (DHA/EPA/DPA) nên dùng là

610 mg/ngày đối với đàn ông và 430 mg/ngày đối với phụ nữ Và tỷ lệ ω-6 với ω-3 PUFA nằm giữa 5:1 và 3:1 là tối ưu cho người (Simopoulos, 2008; Gupta và cs, 2012)

1.2.3 Sản xuất ω-3 PUFA từ vi tảo

Nguồn sản xuất ω-3 PUFA trong công nghiệp thực phẩm là dầu cá Tuy nhiên, nguồn cung cấp này thường không ổn định về thành phần và chất lượng Dầu

cá cũng dễ bị tạp nhiễm các chất hoá học hữu cơ tan trong mỡ - những chất ngày nay tồn tại ở khắp nơi trong hệ sinh thái biển Các hợp chất halogen như polychlorinated biphenyl (PCB), polybrominated diphenyl ether (PBDE)… là những chất độc có độ bền cao Chúng được tích lũy dần trong phân đoạn lipit của các mô động vật và do con người là mắt xích cuối cùng trong chuỗi thức ăn nên các chất này sẽ chuyển vào cơ thể (Braune và cs, 2005; Muir và cs, 2005) Ảnh hưởng tiêu cực của các PCB lên sức khoẻ con người đã được chứng minh (Gupta và cs, 2012) Bên cạnh sự tạp nhiễm, việc sử dụng dầu cá thường không phổ biến bởi mùi

vị không mong muốn, tính ổn định oxi hoá thấp và việc tinh sạch rất đắt Việc sản

xuất các ω-3 PUFA bởi các con đường thay thế, có thể tránh các yếu tố tạp nhiễm là

một lĩnh vực mới đang dần được khám phá

Vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) hoặc nấm biển có thể thay thế dầu cá trong việc cung cấp các ω-3 PUFA Việc sản xuất ω-3 PUFA từ tảo có những thuận lợi như có thể duy trì các điều kiện nuôi trồng tối ưu và giảm tạp nhiễm; quá trình sản xuất có thể tiến hành quanh năm, không phụ thuộc mùa hay khí hậu; có thể dễ dàng kiểm soát được điều kiện nuôi trồng, đảm bảo được chất lượng sản phẩm theo mong muốn; mật độ tế bào tảo đạt cao, có thể trên 100 g khối lượng khô-KLK/l; và có thể

sử dụng các kĩ thuật lên men hiện đang được sử dụng rộng rãi cho việc nuôi trồng các VTBDD (de Swaaf và cs, 2003b) Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của một số loài vi tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng được trình bày ở bảng 1.2

Mặc dù vậy, sản xuất ω-3 PUFA từ VTBDD cũng có một số thách thức như: chỉ một số ít các loài VTBDD tích lũy ω - 3 PUFA có hàm lượng cao; do môi trường nuôi rất giàu dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của tảo tương đối thấp nên dễ

bị tạp nhiễm; cần phải cân đối chi phí sản xuất với giá thị trường Ngày nay, DHA

được sản xuất thương mại từ loài tảo biển hai roi Crypthecodiniun cohnii và một số loài thuộc chi Schizochytrium (Raghukumar, 2008)

Vi tảo

Lipit (%

18:2 (ω -6)

18:3 (ω -3)

18:3 (ω -6)

20:4 (ω -6)

20:5 (ω -3)

22:6 (ω -3) Prokaryota

1.3 Đặc điểm sinh học của chi Schizochytrium

1.3.1 Đặc điểm sinh thái

Các loài thuộc chi Schizochytrium là những sinh vật có kiểu sống dị dưỡng

và được phân lập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau: vùng cửa sông, đáy biển sâu hoặc những nơi nước đọng Chúng thường tập trung nhiều trên các xác của thực vật bản địa hoặc trên tảo lớn, lá cây đước bị chìm trôi dạt bờ (Goldstein, 1973; Moss,

1986; Poster, 1990; Raghukumar, 2002) Chi Schizochytrium cũng có loài ưa lạnh Ulken (1968) đã thông báo một chủng thuộc loài S aggregatum có thể phát triển tốt

nhất ở khoảng 5-10oC

Chi Schizochytrium cũng như một số chi khác thuộc họ Thraustochytriidae

khác có các enzyme cho phép chúng sử dụng nhiều loại polysaccharide như dextran, laminarin, mannan và tinh bột (Bahnweg, 1979) Các yếu tố của mạng lưới ngoại chất của chúng có thể xuyên thủng lớp sporopollenin của phấn thông mặc dù đây là một dạng polymer khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (Perkins, 1973; Chamberlain &

Moss 1988) Các thử nghiệm với S mangrovei trên mảnh vụn lá cây đước cho thấy

rằng loài này có thể sản xuất ra enzyme xenlulose, amylase, xylanase, protease và

pectinase (Raghukumar, 2002) Ngoài vai trò quan trọng như các sinh vật phân hủy nhờ tác dụng của việc sản xuất ra các enzyme ngoại bào thì chi Schizochytrium có

thể đóng vai trò rất quan trọng trong việc khoáng hóa các mảnh vụn hữu cơ ở đáy đại dương

Nhiều bằng chứng thực nghiệm đã cho thấy chi Schizochytrium phát triển rất

ít trên bề mặt của tảo và những thực vật bậc cao còn sống bởi các thực vật này có thể chứa các hợp chất fenola, hoặc kháng sinh… có hoạt tính ức chế sự phát triển của chúng cũng như sự bám dính của vi khuẩn (Raghukumar, 2002)

1.3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit và -3 PUFA ở Schizochytrium

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn C và N

Đối với một chủng mới được phân lập, điều kiện về dinh dưỡng luôn cần được tối ưu nhằm đạt giá trị cao nhất về sinh trưởng, hàm lượng lipit và PUFA

(Shene và cs, 2010) Ảnh hưởng của các nguồn C lên sinh trưởng, tích lũy lipit và

các PUFA ở chi Schizochytrium đã được nghiên cứu khá kĩ Nhiều loài thuộc họ Thraustochytriidae trong đó chi Schizochytrium có khả năng sử dụng nhiều nguồn C

và N khác nhau Mặc dù một số chủng có thể sử dụng maltose và tinh bột nhưng glucose vẫn là nguồn C ưa thích (Raghukumar, 2008) Glucose là nguồn C được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy vi sinh vật vì đây là nguồn C tương đối rẻ tiền và dễ

sử dụng (Singh và cs, 1996; Puri và cs, 2011) Ở S mangrovei SR21, Sk-2 và S

aureum, các loại đường đơn như glucose và fructose cho sinh trưởng và sản lượng

DHA cao trong khi đó sinh trưởng của các loài thuộc chi Schizochytrium trên các

loại đường đôi hoặc polysaccharide lại rất thấp (Yokochi và cs, 1998; Unagul và cs, 2005)

Glycerol thải từ quá trình sản xuất diesel sinh học hoặc được thu hồi từ các

nhà máy sản xuất xà phòng có thể được sử dụng cho nuôi trồng Schizochytrium spp

(Ethier và cs, 2011; Wang và cs, 2001) Vai trò quan trọng của glycerol trong ngành

vi sinh công nghiệp đã được thảo luận rất kĩ (da Silva và cs, 2009) Nhiều nghiên cứu cũng đã sử dụng glycerol (Chi và cs, 2007; Pyle và cs, 2008; Ethier và cs, 2011)

để nuôi cấy S limacinum SR21 cho sản xuất DHA (Liang và cs, 2010) Mặc dù

glycerol có thể cho hàm lượng DHA cao hơn so với nguồn C khác nhưng do tốc độ hấp thu glycerol chậm dẫn đến sản lượng DHA tính trên đơn vị thể tích sẽ thấp Đây

là một bất lợi chính đối với quá trình sản xuất thương mại khi sử dụng nguồn C này (Sijtsma & de Swaaf, 2004)

Nghiên cứu của Yokochi và cộng sự (1998) cho thấy S limacinum SR21

cũng có thể sinh trưởng tốt khi bổ sung axít oleic hoặc dầu hạt lanh vào môi trường nuôi nhưng sản lượng DHA trong trường hợp này thấp hơn nhiều so với khi sử dụng glucose Các nguồn C này dường như không phải là tiền chất phù hợp để tổng hợp DHA (Yokochi và cs, 1998)

Nguồn N tốt nhất cho sản xuất sinh khối Schizochytrium là các loại peptone

Ngoài ra, Yokochi và cộng sự (1998) đã sử dụng cao ngô (corn steep liquor) để nuôi

cấy S limacinum SR21 Kết quả cho thấy, hàm lượng lipit, axít béo tổng số và DHA

đạt được cao nhất So với cao nấm men, hàm lượng lipit tích lũy ở chủng này khi nuôi cấy bằng cao ngô đạt cao hơn Điều này có thể là do hàm lượng nitơ (5,5%), dịch chiết nấm men (10%) trong cao nấm men thấp hơn so với hàm lượng các chất này ở cao ngô (Yokochi và cs, 1998) Bên cạnh nguồn N hữu cơ, một số ít chủng có thể sử dụng nitơ vô cơ như amoni, nitrat rất hiệu quả còn lại hầu hết các nguồn N vô

cơ khác đều không cho kết quả tốt So với các nguồn N hữu cơ thì N vô cơ rẻ hơn rất nhiều Do vậy, nếu chọn được chủng có khả năng sinh trưởng trên nguồn N vô

cơ thì có thể giảm giá thành khi nuôi trồng trên quy mô lớn (Raghukumar, 2008)

Tỷ lệ C/N thích hợp là yếu tố cần thiết để tạo sản lượng sinh khối cực đại, lượng nitơ thấp sẽ dẫn đến giảm sinh khối (Yokochi và cs, 1998) Tỷ lệ C/N khoảng

10,4 là tối ưu để Schizochytrium sinh trưởng (Raghukumar, 2008) Ngược lại, tích lũy lipit và DHA trong họ Thraustochytriidae nói chung đòi hỏi một tỷ lệ C/N cao

Khi hàm lượng nitơ giảm, các tế bào không thể tiếp tục phân chia, các quá trình tổng hợp axit nucleic, protein và khi môi trường nuôi có hàm lượng nitơ bị hạn chế thì quá trình chuyển hóa các nguồn C vào lipit dự trữ sẽ được tăng cường (Yokochi

và cs, 1998; Bowles và cs, 1999; Ratledge, 2004; Burja và cs, 2006) Tuy nhiên, một số chủng có thể bị ức chế khi lượng đường cao Nồng độ glucose vào khoảng 6-10% dẫn đến sự tổng hợp DHA cao hơn trong khi nếu nồng độ này lớn hơn 10% lại làm chậm quá trình sinh trưởng của các chủng nghiên cứu (Yokochi và cs, 1998; Gupta và cs, 2012)

1.3.2.2 Ảnh hưởng của độ mặn

Chi Schizochytrium được phân lập từ môi trường biển nên yêu cầu đối với

Na+ là bắt buộc Hầu hết các thí nghiệm nuôi trồng được tiến hành trong môi trường muối biển nhân tạo với các thành phần tương tự với nước biển tự nhiên Trong đó hàm lượng NaCl chiếm khoảng 90% Độ mặn tối ưu và mức độ chịu đựng về độ mặn ở các chủng là rất khác nhau, một số có thể sinh trưởng ở nơi có độ mặn thấp thậm chí tới 0% Các chủng được phân lập từ các môi trường rừng ngập mặn có độ mặn dao động rất lớn sẽ có khả năng chịu đựng độ mặn rộng hơn (Unagul và cs,

2006; Raghukumar, 2008) Nhìn chung, chi Schizochytrium sinh trưởng tốt trong

khoảng 15–30 g muối biển/l (15–30 psu) cũng đã quan sát được ở rất nhiều

loài/chủng thuộc loài S mangrovei, S limacinum (Bowles, 1997; Yokochi và cs,

1998; Fan và cs, 2002)

Do muối clorua có thể ăn mòn kim loại, do đó, nồng độ muối biển cần giảm

ở mức tối thiểu Điều này sẽ mang lại những lợi ích kinh tế như giảm giá thành môi trường nuôi cũng như việc xử lý nước thải sau này (Unagul và cs, 2006) Do đó, việc tìm kiếm các nguồn natri thay thế rất được quan tâm Tuy nhiên, Unagul và cộng sự (2005) cũng đã tiến hành thay thế muối biển bằng muối NaCl hoặc các muối natri khác đã nhận thấy sinh khối tảo bị giảm đáng kể Tác giả nêu trên đã cho rằng ngoài natri thì các thành phần khác có trong nước biển cũng có thể ảnh hưởng đáng kể trong việc sản xuất sinh khối

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ được xem như là một yếu tố quan trọng đối với quá trình tổng hợp PUFA Do PUFA tham gia vào các thành phần cấu trúc như màng tế bào, nên hàm lượng PUFA sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm vì khi đó chúng giúp cho việc duy trì tính linh động của màng (Cossins và cs, 2002)

Nhìn chung, nhiệt độ từ 25-30oC là tối ưu cho sự sinh trưởng và tổng hợp

DHA ở chi Schizochytrium (Yokochi và cs, 1998; Unagul và cs, 2005; Raghukumar

2008) Nhiệt độ thấp kích thích tổng hợp DHA nhưng lại không tốt cho sự phát triển

Kết quả là sản lượng DHA tổng thể lại thấp Các chủng Schizochytrium spp ban

đầu có thể được nuôi ở nhiệt độ cao hơn để kích thích sinh trưởng và sau đó được đưa vào điều kiện nhiệt độ thấp nhằm nâng cao sản lượng DHA (Singh và cs, 1996; Sakata và cs, 2000) Jain và cộng sự đã giữ sinh khối thu hoạch ở 10oC trong 24-48 giờ để làm tăng hàm lượng DHA Hàm lượng DHA cũng được tăng lên khi làm tăng nhẹ độ nhớt của môi trường bằng việc sử dụng polyvinyl pyrrolidone Sản lượng DHA tăng cao trong các trường hợp này có thể do hàm lượng lipit cao trong khi phần trăm DHA trên TFA có thể vẫn không đổi hoặc ngược lại (Jain và cs, 2004) Hàm lượng cao PUFA khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấp có thể được giải thích là

do PUFA tham gia vào thành phần cấu trúc màng tế bào Vì ở nhiệt độ thấp, tế bào

cần phải tổng hợp nhiều PUFA để giúp cho việc duy trì tính linh động của màng (Cossins và cs, 2002)

Giới hạn trên về nhiệt độ cho sinh trưởng của chi Schizochytrium chưa được

xác định rõ ràng Leano và cộng sự (2003) đã quan sát thấy ở nhiều chủng

Schizochytrium spp khác nhau, sinh trưởng và tổng hợp PUFA xảy ra khá tốt ở

35oC Ngược lại Yokochi và cộng sự lại nhận thấy lượng sinh khối giảm tới 80%

khi tăng nhiệt độ nuôi cấy S limacinum SR21 từ 30 lên 35o

trọng ảnh hưởng đến nuôi trồng dị dưỡng vi tảo Chi Schizochytrium có thể sinh

trưởng tốt trong khoảng pH 5-8 Khi nuôi trồng trong các bể lên men có sự thông khí và khuấy đảo môi trường liên tục sẽ giúp cho sinh trưởng của loài vi tảo này đạt tối ưu Bảng 1.3 và 1.4 là bảng tóm tắt một số điều kiện quan trọng cho sự tổng hợp DHA cũng như một số nguồn C, N đã được sử dụng để sản xuất -3 PUFA ở chi

Schizochytrium

Bảng 1.3 Tóm tắt một số điều kiện quan trọng cho sự tổng hợp DHA ở

Schizochytrium (Raghukumar, 2008)

, các cation và anion khác trong nước biển, KH2PO4

Tỷ lệ C/N Tỷ lệ thấp cho sinh trưởng và tỷ lệ cao cho tích luỹ lipit

C cho tích luỹ lipit

Hàm lượng oxy hoà tan >4% đối với sinh trưởng và <3% đối với quá trình tổng hợp DHA

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp DHA ở chi Schizochytrium

Con đường sinh tổng hợp DHA ở họ Thraustochytriidae hiện đang tập trung nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu nhằm tạo ra thực vật hoặc nấm men tái tổ hợp có thể sản xuất ra PUFA (Wallis và cs, 2002; Damude & Kinney, 2007) Cho đến nay, có hai con đường tổng hợp PUFA ở họ Thraustochytriidae đã được nghiên

cứu Một là ở Thraustochytrium sp ATCC 26185 theo con đường sinh tổng hợp

axít béo điển hình gần giống với động vật có vú (FAS-fatty acid synthesis) Đây là con đường hiếu khí bao gồm một loạt các bước kéo dài chuỗi và khử bão hòa luân phiên nhau của chuỗi axít béo mạch ngắn Các thực vật sản xuất axít linoleic (18:2-6) và axít linolenic (18:3-3) sử dụng hoạt tính của enzyme Δ12 và -3 desaturase (hình 1.4) Động vật có vú thiếu hoạt tính của enzyme Δ12 và -3 desaturase do vậy chúng phải lấy 18:2-6 và 18:3-3 từ thức ăn Các axít béo khác tiếp tục được tổng hợp nhờ hàng loạt các phản ứng khử bão hòa và kéo dài chuỗi từ axít linoleic và linolenic diễn ra trong mạng lưới nội chất Tổng hợp 22:6-3 ngày nay được biết bắt đầu từ sinh tổng hợp 24:6-3 ở mạng lưới nội chất sau đó, quá trình cắt ngắn chuỗi sẽ được thực hiện ở chu trình β-oxi hóa trong peroxisome Con đường này đòi hỏi phải có oxy phân tử cho quá trình khử bão hòa (hình 1.4) Mặc

dù cả động vật có vú và chi Thraustochytrium đều sử dụng con đường hiếu khí để

tổng hợp DHA nhưng phần cuối của con đường đã được chia thành hai nhánh Ở động vật có vú, tổng hợp DHA xảy ra sau quá trình tổng hợp EPA là quá trình chuyển hoá ngược độc lập với việc khử bão hoà 4 Trong khi đó, ở chi

Thraustochytrium, tổng hợp DHA sau EPA diễn ra theo một con đường đơn giản

hơn- quá trình khử bão hoà 4 Gen 4 desaturase từ Thraustochytrium sp đã được tách dòng trong nấm men Saccharomyces cerevisiae và thực vật đột biến, Brassica

juncea (Qiu và cs, 2001)

Cho đến gần đây, con đường sinh tổng hợp DHA được xúc tác bởi enzyme

polyketide synthase ở chi Schizochytrium mới được tìm thấy Con đường này khác

với con đường FAS ở chỗ nó không đòi hỏi quá trình khử bão hoà hiếu khí để đưa các liên kết đôi vào chuỗi acyl Thay vào đó, các liên kết đôi được chèn vào trong

quá trình tổng hợp axít béo Vì vậy, nó cũng được gọi là con đường tổng hợp DHA

kị khí Tuy nhiên, cũng cần lưu ý rằng mặc dù con đường này là kị khí nhưng nó cũng có thể xảy ra dưới điều kiện hiếu khí Tên gọi này bắt nguồn từ việc không cần oxy phân tử tham gia trong các phản ứng theo con đường này (Qui, 2003) Polyketide là tên chỉ một nhóm các chất trao đổi thứ cấp được xây dựng nên từ rất nhiều nhóm ketide (–CH2–CO–) Chúng được tổng hợp bởi enzyme polyketide synthase (PKS) - một hệ thống enzyme tương tự như các fatty acid synthase ở vi khuẩn Giống với sự tổng hợp các axít béo, chúng sử dụng các protein mang nhóm acyl- ACP ( acyl carrier protein) như là một vật gắn đồng hoá trị để tổng hợp chuỗi,

và cứ như thế các chu trình được lặp lại Một chu trình sinh tổng hợp hoàn chỉnh bao gồm bước trùng ngưng của một acyl- ACP và một malonyl- ACP để tạo ra một ketoacyl-ACP; bước khử keto để chuyển ketoacyl-ACP thành hydroxyacyl-ACP; khử nước để loại một phân tử nước ở hydroxyacyl-ACP để tạo thành enoyl-ACP không bão hoà, và quá trình khử enoyl-ACP thành chuỗi acyl bão hoà (hình 1.4) Tuy nhiên, không giống như con đường FAS, con đường tổng hợp polyketide thường bỏ qua các bước như là loại nước và khử Vì vậy, mà các sản phẩm của con đường này thường rất khác nhau về cấu trúc và thường chứa nhóm keto, nhóm OH

và các liên kết đôi Con đường polyketide thường rất phổ biến trong tự nhiên Ở vi khuẩn và nấm, nó tham gia vào quá trình tổng hợp rất nhiều các hợp chất kháng sinh và kháng kí sinh trùng như tetracycline và erythromycin Gần đây, sự tham gia của con đường này vào quá trình sinh tổng hợp PUFA như DHA cũng đã được công

bố Các bằng chứng bao gồm: (1) Việc phân tích trình tự gen của Shewanella sp và

cơ sở dữ liệu EST (expressed sequence tags) của chi Schizochytrium đã cho thấy

các khung đọc mở liên quan đến polyketide synthase hơn là fatty acid synthase; (2)

Sự biểu hiện phần lớn trình tự hệ gen của Shewanella sp ở E coli dưới các điều

kiện hiếu khí đã dẫn đến sản xuất được EPA trong các tế bào chuyển gen; (3) Việc

đánh dấu không thành công in vivo với [1-14C] acetate đã chứng minh sự có mặt rất

ít các axít béo trung gian C18, 20 và 22 Những chất này thường cho thấy mối quan

hệ giữa tiền chất- sản phẩm trong con đường khử bão hoà/ kéo dài chuỗi; (4) 8500

trình tự EST của chi Schizochytrium không đủ để chứng minh con số mà người ta

mong đợi về các loại enzyme desaturase khác nhau tham gia trong con đường hiếu khí, trong khi đó các trình tự tương đồng polyketide synthase lại được thể hiện rất

rõ

Hình 1.4 Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi

Schizochytrium (Wallis và cs, 2002; Qui, 2003)

Chú thích: ACP: Protein mang gốc acyl; KS: ketoacyl-ACP synthase; KR:

3-hydroxyacyl-ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl-ACP reductase

Mặc dù, cơ chế cụ thể về quá trình sinh tổng hợp DHA theo con đường mới vẫn cần phải xác định cho rõ ràng, nhưng cơ bản vẫn là các bước ngưng tụ và đồng phân hoá Ketosynthase, một enzyme chìa khoá của con đường này, có thể xúc tác cho quá trình trùng ngưng của rất nhiều cơ chất bao gồm các axít béo không bão hoà Vì vậy, trùng ngưng có chọn lọc của enoyl -ACP với malonyl -ACP sẽ tạo

3-Ketoacyl-ACP KS

CO 2

ACP-SH

Schizochytrium

thành một axít béo có các liên kết đôi Hoạt động của isomerase, một yếu tố chìa khoá khác cho sinh tổng hợp DHA, có thể kết hợp hoặc tách riêng với dehydratase

để đảm bảo vị trí và cấu hình không gian chính xác các liên kết đôi trong phân tử PUFA (Qui, 2003)

1.4 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng nói chung và chi Schizochytrium

nói riêng cho sản xuất -3 PUFA

1.4.1 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA

Sản xuất -3 PUFA để thương mại từ vi tảo biển dị dưỡng đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển (Barclay, 1991) Nuôi trồng vi tảo theo lối dị dưỡng có một số thuận lợi chính như sau: có thể duy trì các điều kiện nuôi trồng tối ưu và giảm tạp nhiễm (Chen, 1996); sản xuất dầu có thể tiến hành quanh năm, không phụ thuộc mùa hay khí hậu; quá trình nuôi trồng có thể kiểm soát và đảm bảo được chất lượng sản phẩm theo mong muốn; đạt mật độ tế bào cao, năng suất có thể lên trên

100 g khô/l (de Swaaf và cs, 2003a) và có thể sử dụng các kĩ thuật lên men hiện đang được sử dụng rộng rãi cho việc nuôi trồng Mặc dù vậy, hệ thống nuôi vi tảo dị dưỡng cũng còn một số thách thức cần giải quyết như: hiện tại, chỉ một số ít các loài tảo dị dưỡng có tích lũy - 3 PUFA mong muốn; do môi trường nuôi rất giàu dinh dưỡng nên khả năng lây nhiễm là rất cao; và chi phí sản xuất phải cân đối được với giá thị trường

Ở Nhật Bản, 50% sinh khối tảo Chlorella được sản xuất thương mại được

nuôi dị dưỡng trong các bể lên men (Lee, 1997) Ngoài ra, nuôi trồng vi tảo dị dưỡng làm nguyên liệu cho các sản phẩm dinh dưỡng và dược phẩm như PUFA và carotenoit cũng đã được tiến hành triển khai trên quy mô lớn đầy tiềm năng và hứa hẹn (Harel và cs, 2002; Wen & Chen, 2003; Ip & Chen, 2005)

Các phương pháp nuôi tảo dị dưỡng bao gồm:

- Nuôi theo mẻ: Nuôi theo mẻ là kĩ thuật phổ biến để tăng số lượng tế bào,

được đặc biệt áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm Cách thức nuôi trồng này tương đối đơn giản, chi phí rẻ, thường được sử dụng trong các nghiên cứu sơ bộ ban đầu

để tìm hiểu tác dụng của các thành phần và yếu tố môi trường lên sinh khối tảo và

năng suất sản phẩm được tạo ra (Yokochi và cs, 1998; de Swaaf và cs, 1999) Wen

& Chen (2001b) báo cáo tối ưu điều kiện sản xuất EPA bởi Nitzschia laevis trong

nuôi dị dưỡng theo mẻ dựa trên phương pháp đáp ứng bề mặt (response surface methodology) Nồng độ NaCl, CaCl2, pH và nhiệt độ đã được xác định là các yếu tố giới hạn trong mô hình tổ hợp trung tâm (central composite design) Năng suất EPA đạt 280 mg/l trong điều kiện nuôi lắc, cao gấp 1,6 lần so với phương pháp tối ưu trước đây (Wen & Chen, 2001a,b)

- Nuôi theo kiểu “fed-batch”: Về bản chất đây là phương pháp nuôi theo mẻ

có bổ sung các chất dinh dưỡng (liên tục hoặc không liên tục) trong quá trình nuôi

Kiểu nuôi này được áp dụng với tảo N laevis để sản xuất EPA đã cho phép thu

được mật độ tế bào tảo cao và giảm tối đa sự ức chế của cơ chất (Chen, 1996; Wen

& Chen, 2002 a, b) Hỗn hợp glucose, nitrate, tryptone và cao nấm men ở tỷ lệ tối

ưu là 32: 1: 2,58: 1,29 (w/w) đã được bổ sung liên tục vào bể lên men Năng suất sinh khối tảo và sản lượng EPA đạt được là 22,1g/l và 695 mg/l, tương ứng, cao hơn nhiều so với nuôi theo mẻ Kiểu nuôi này cũng sử dụng thành công để nuôi dị

dưỡng các loài vi tảo khác như Chlorella protothecoides (sản xuất lutein),

Crypthecodium cohnii (sản xuất DHA) và Galdieria sulphuraria (sản xuất

phycocyanin) (de Swaaf và cs, 2003 a, b; Schmidt và cs, 2005) Đối với tảo C

cohnii, năng suất DHA đạt được 11,7 g/l với nguồn cácbon là ethanol (de Swaaf và

cs, 2003a)

- Nuôi liên tục: là phương pháp cơ bản để kéo dài pha sinh trưởng của vi sinh

vật trong nuôi theo mẻ nhưng cần liên tục cung cấp các chất dinh dưỡng mới và đồng thời loại bỏ môi trường đã được sử dụng cùng với sinh khối tế bào tảo từ hệ thống nuôi Trong nuôi liên tục, sự phát triển của tảo cũng như các yếu tố môi trường nuôi luôn được giữ ổn định Đây là một hệ thống tốt cho phép nuôi các vi sinh vật dị dưỡng đạt mật độ cao cũng như được áp dụng trong các nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng và phát triển, các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các vi sinh vật Quá trình nuôi cấy liên tục cũng đã được áp dụng và phát triển để sản xuất EPA

từ tảo N laevis trong điều kiện tối với năng suất EPA đạt cao nhất là 73 mg/l trong

điều kiện khi glucose có nồng độ 20 g/l và tỷ lệ pha loãng là 0,5 ngày (Wen & Chen, 2002b) Nuôi cấy liên tục cũng được sử dụng rất thành công trong nuôi trồng

một số loài thuộc tảo lục quan trọng như Chlamydomonas reinhardtii trong điều

kiện sử dụng acetate như là nguồn cácbon và nguồn năng lượng chính cho tảo Tuy nhiên, vì acetate lại là một chất ức chế sự phát triển của tảo khi tảo có ở mật độ cao,

do vậy, mật độ tế bào tảo cao nhất trong điều kiện nuôi nêu trên chỉ đạt được là 1,5 g/l ở nồng độ acetate được bổ sung là 3,4 g/l (Chen & Johns, 1996)

- Nuôi theo kiểu “perfusion”: đây là phương pháp nuôi liên tục nhưng tế bào

được giữ lại Phương pháp này thường ít được áp dụng cho nuôi vi tảo dị dưỡng (Wen & Chen, 2003) Ngược lại với nuôi liên tục (trạng thái nuôi ổn định được duy trì bằng cách pha loãng liên tiếp trong qua trình nuôi), trong quá trình nuôi

“perfusion” các tế bào được giữ lại theo quy luật tự nhiên trong bình nuôi Mật độ tế bào có thể tăng liên tục cho đến khi đạt được mật độ tế bào cao Kỹ thuật nuôi này

đã chứng tỏ là cách nuôi trồng có hiệu quả để tăng mật độ tế bào và năng suất của các sản phẩm định hướng, có giá trị Phương pháp này đã được áp dụng thành công

trong nuôi dị dưỡng tảo N laevis để sản xuất EPA Trong điều kiện nuôi này, sinh

khối khô của tế bào tảo và năng suất EPA đạt rất cao là 40 g/l và 1112 mg/l, tương ứng (Wen & Chen, 2002a)

1.4.2 Sản xuất DHA ở quy mô lớn ở chi Schizochytrium

Các điều kiện lên men được nghiên cứu thay đổi nhằm tăng cường quá trình

tổng hợp DHA ở Schizochytrium Trong quá trình thử nghiệm để tối ưu sản lượng

DHA, các thông số hoá học (nồng độ khác nhau của nguồn cácbon và nitơ) và các thông số vật lý (pH ban đầu, nhiệt độ, thời gian nuôi, tốc độ và hình dạng cánh khuấy trong bể lên men) cần phải điều chỉnh cho thích hợp (Gupta và cs, 2012; Raghukumar và cs, 2008)

Quá trình tích luỹ lipit phụ thuộc vào sinh trưởng của tảo đã đạt được nhờ việc đưa nguồn nitơ dưới dạng amoni (300-400 mg/l) vào môi trường nuôi ở hệ

thống nuôi “fed batch” đối với chủng Schizochytrium sp G13/2S Dưới điều kiện

nuôi trồng nêu trên tốc độ sinh trưởng của chủng đạt cao nhất nhưng khả năng tích