Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ––––––––––––––––––

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ––––––––––––––––––

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS LÊ TRẦN BÌNH

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác với các tác giả khác Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc đăng trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, trong Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học và trên GenBank, với sự đồng ý cho phép của các đồng tác giả Phần kết quả còn lại chƣa đƣợc ai công bố

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án

Tôi xin được trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt là PGS.TS Chu Hoàng

Hà, TS Lê Văn Sơn, ThS Hoàng Hà và ThS Lê Hoàng Đức thuộc Phòng Công nghệ

tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất, hướng dẫn kỹ thuật thí nghiệm và góp ý chuyên môn để tôi hoàn thành được đề tài này Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng tác giả

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên, cùng các cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện, động viên tôi trong học tập và hoàn thiện luận án, đặc biệt là sự giúp đỡ của các Thầy, Cô trong Bộ môn Di truyền- SHHĐ như GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phòng thí nghiệm Hóa Sinh), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền & Công nghệ gen)

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cùng các cán bộ của Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phượng- Hà Nội đã tạo điều kiện cung cấp các giống ngô nếp địa phương và những thông tin cơ bản về giống

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã đồng hành, chia sẻ cùng tôi, khuyến khích tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ này

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014

Nghiên cứu sinh

Phạm Thị Thanh Nhàn

Trang

Mục lục i

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cây ngô 5

1.1.1 Sơ lược về cây ngô 5

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô 7

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam …… 8

1.2 Phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn 10

1.2.1 Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa 10 1.2.1.1 Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa 10

1.2.1.2 Các dạng oxy hoạt hóa 12

1.2.1.3 Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa 13

1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô 14 1.2.2.1 Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn 14

1.2.2.2 Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô 17

1.3 Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa 20

1.3.1 Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn 20

1.3.2 Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô … 27

1.3.2.1 Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen 27

1.3.2.2 Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin 30

sinh tổng hợp anthocyanin 34

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Vật liệu nghiên cứu 40

2.2 Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 41

2.3.1 Nhóm phương pháp hoá sinh 41

2.3.2 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phương 45

2.3.3 Nhóm phương pháp sinh học phân tử ……… 47

2.3.3.1 Phương pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen) 47

2.3.3.2 Phương pháp RT- PCR ……… 47

2.3.3.3 Tạo vector tái tổ hơp ……… 49

2.3.3.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 49

2.3.3.5 Kiểm tra sản phẩm chọn dòng ……… 49

2.3.3.6 Tách plasmid ……… 49

2.3.3.7 Xác định trình tự gen ……… 51

2.3.3.8 Phương pháp real- time PCR 51

2.3.4 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 53

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 54

3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương 54

3.1.1 Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương giai đoạn hạt nảy mầm 54

3.1.1.1 Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng đường và hoạt độ - amylase 54

3.1.1.2 Ảnh hưởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease 57

3.1.2 Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá 58

3.1.2.1 Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn ……… 58

3.1.2.2 Chỉ số chịu hạn tương đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo 61

3.1.3 Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn 63

3.2 Ảnh hưởng của hạn nhân tạo đến lượng anthocyanin ở cây ngô nếp

3.2.1 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các

ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 65

3.2.2 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 67

3.2.3 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 70

3.2.4 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng 73

3.3 Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1 78

3.3.1 Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1 78

3.3.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1 85

3.3.3 Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô 91

3.4 Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real- time PCR 93

3.4.1 Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con 93

3.4.2 Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con 97

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103

Kết luận ……… 103

Đề nghị……… 103

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 105

PHỤ LỤC 1 127

PHỤ LỤC 2 128

PHỤ LỤC 3 131

PHỤ LỤC 4 132

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ANR Anthocyanidin reductase Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol ANS Anthocyanidin synthase Enzyme chuyển hóa tạo

anthocyanidin APX Ascorbate peroxidase Enzyme chuyển hoá H2O2 thành

H2O bHLH Binding helix- loop- helix Protein họ bHLH

cDNA Complementary DNA DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ

mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc CHI Chalcon isomerase Enzyme chuyển hóa chalcon

CHS Chalcone synthase Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon

DEPC Diethyl pyrocarbonate Chất ức chế enzyme phân hủy RNA DFR Dihydroflavonol 4 reductase Enzyme chuyển hóa tạo

leucoanthocyanidin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic (ADN)

DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân liên kết

photphodieste của phân tử DNA DRE Dehydration responsive

element

Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa

F3‟H Flavonoid 3‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin F3‟5‟H Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B

HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C

flavan-3-LEA Late embryo abundant protein trong giai đoạn muộn của

quá trình hình thành phôi

MW Molecular weight Khối lƣợng phân tử

NADP Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

Coenzym đƣợc sử dụng trong phản ứng đồng hóa

NADPH Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate-oxidase

Chất đƣợc tạo nên khi khƣ ̉ NADP

PAL Phenylalanine ammonialyase Enzyme chuyển hóa L- phenylalanine

Pr1 Red aleurone 1 Protein chuyên trách tổng hợp

pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic (ARN)

polymerase chain reaction mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt hóa

SOD Superoxide dismutase Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ

superoxide SNP Single nucleotide

polymorphism

Đa hình nucleotit đơn

TFs Transcription factors Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố

phiên mã

glucosyltransferase

Enzyme xúc tác phản ứng tạo flavonol 3-O-beta-D-glucoside

UFGT flavonoid 3-O-

glucosyltransferase

Enzyme xúc tác phản ứng O- glycosyl hóa

Trang

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô, lúa mì, lúa nước thế giới

1961-2010/11 8

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1961 đến 2012/13 9

Bảng 1.3 Các nhóm nhân tố phiên mã 29

Bảng 2.1 Các giống ngô nếp địa phương sử dụng trong nghiên cứu 40

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 48

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch tách plasmid 51

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng real- time RT- PCR 52

Bảng 3.1 Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô nếp bị xử lý bởi hạn nhân tạo 59

Bảng 3.2 Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây non 3 lá của 10 giống ngô nghiên cứu ……… 62

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng về mức phản ứng của các giống trước hạn … 63

Bảng 3.4 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô 66

Bảng 3.5 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô 69

Bảng 3.6 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô 70

Bảng 3.7 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá qua các ngưỡng xử lý bởi hạn so với đối chứng 74

Bảng 3.8 Mối tương quan giữa sự biến động hàm lượng anthocyanin và tỷ lệ thiệt hại 76

Bảng 3.9 Chu kỳ ngưỡng của gen Act và B ở giống ngô NH và BS1 qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 94

Bảng 3.10 Chu kỳ ngưỡng của gen Act và Lc ở giống ngô NH và BS1 qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 98

Bảng 1.1 (Phụ lục 1) Hình thái và kích thước hạt của 10 giống ngô nếp địa phương 127

Bảng 1.2 (Phụ lục 1) Chất lượng hạt của 10 giống ngô 127 Bảng 2.1 (Phụ lục 2) Hoạt độ amylase qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

Bảng 2.2 (Phụ lục 2) Hàm lượng đường qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

sorbitol 5% (% KLT) 129 Bảng 2.3 (Phụ lục 2) Hoạt độ protease qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg) … 130

Bảng 3.1(Phụ lục 3) Tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotit của đoạn gen B ở

giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH 131

Bảng 3.2 (Phụ lục 3) Tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở

giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH 131

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc aglucon của anthocyanin 21

Hình 1.2 Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin 26

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc chuỗi axit amin của một TFs 28

Hình 1.4 Mô hình hoạt động của các nhân tố phiên mã 30

Hình 1.5 Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô theo Hartmann và cộng sự (2005) 31

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của SYBR I 35

Hình 1.7 Biểu đồ chảy (a) và Biểu đồ đỉnh chảy (b) 36

Hình 3.1 Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ  - amylase của các giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 55

Hình 3.2 Biểu đồ mô tả sự biến động hàm lượng đường của các giống ngô quaa các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 56

Hình 3.3 Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ protease của các giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 58

Hình 3.4 Đồ thị mô tả tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô trong quá trình xử lý hạn 60

Hình 3.5 Sơ đồ hình cây thể hiện sự giống nhau về khả năng phản ứng với hạn của 10 giống ngô nếp địa phương 64

Hình 3.6 Đường biểu diễn quang phổ hấp thụ của anthocyanin trong các bộ phận cây ngô khi bị hạn 73

Hình 3.7 Màu sắc thân và lá của cây ngô sau 7 ngày hạn ……… 77

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen B (A) và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH 79

Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen B ở giống NH và BS1 82

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen B của hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH 83 Hình 3.11 So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein B ở giống NH

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen Lc (A) và kiểm

tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH 85

Hình 3.13 So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở giống NH và BS1 88

Hình 3.14 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen Lc của

hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH 89 Hình 3.15 So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein Lc ở giống NH

và BS1 90 Hình 3.16 Các vùng chức năng của nhân tố bHLH 92

Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở giống

ngô NH và BS1 95

Hình 3.18 Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act ở hai

giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn 96

Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở giống

ngô NH và BS1 99

Hình 3.20 Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen Act và Lc ở hai

giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn 100

Hình 4.1 (Phụ lục 4) So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Act của giống NH

với trình tự trên GenBank 132

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp

lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lương thực- thực phẩm- dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung

du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là

48200 ha, ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400

ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha, ngô là

39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là 33700 ha [22] Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm Trong những năm gần đây, hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến Các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt

và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống

Trước đây, công tác chọn giống truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian

và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện môi trường Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là phương tiện hữu

hiệu để khắc phục những vấn đề khó khăn đó Sự hiểu biết về phân tử DNA, RNA, protein, hay các hợp chất thứ cấp có liên quan đến các đặc tính, tính trạng giúp cho người nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động vào chúng nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn Chọn giống nhờ

sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular Assisted Selection- MAS) đang ngày càng được quan tâm vì phương pháp này có thể rút ngắn được thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn lọc sớm ở giai đoạn cây non Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó Hiện nay, định hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang được quan tâm, trong đó

có chỉ thị sắc tố anthocyanin

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được mối tương quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

Xác định và phân lập được một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương

Đánh giá được mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin của ngô nếp địa phương trong điều kiện hạn

Những mục tiêu trên nhằm định hướng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo tồn giống ngô nếp có chất lượng và khả năng chịu hạn cao

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lượng đường, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tương đối ) Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn

- Xác định mối tương quan giữa sự biến đổi hàm lượng anthocyanin và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phương ở giai đoạn cây con

- Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã

hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn

- Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ biểu

hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu

hạn tốt và kém trong điều kiện hạn

4 Những đóng góp mới của luận án

- Xác định được mức độ tương quan giữa hàm lượng anthocyanin với khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương, và hàm lượng anthocyanin được coi là một trong những chỉ thị sinh hóa hóa phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn

- Phân lập được 02 đoạn gen B và Lc mã hóa cho protein là nhân tố phiên mã

điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin

- Bước đầu xác định được mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là một trong

các chỉ thị ở mức độ phân tử cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai

trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phương bị hạn

- Cung cấp thông tin về hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc thuộc

họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương bị hạn

- Tìm hiểu được cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây ngô nếp địa phương thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin

Ý nghĩa thực tiễn

- Kết đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương giai đoạn hạt nảy mầm và cây non được sử dụng làm cơ sở để đánh giá khả năng chịu hạn ở cây trồng Trong đó, anthocyanin được xem là chất chỉ thị phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn

- Sử dụng gen Lc của ngô như một gen chỉ thị mạnh mẽ để tăng tổng hợp

anthocyanin nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho người sản xuất, và vừa có lợi cho

sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây ngô

1.1.1 Sơ lược về cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales) Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội

nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa

Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [11]

Cây ngô là một loại cây lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ

và sau đó mở rộng ra khắp châu Mỹ, và trên toàn thế giới vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16 [186] Tuy nhiên dạng ngô dại hiện không còn tồn tại nên có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền của cây ngô Song điều quan trọng nhất là hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [11]

Thân cây ngô trông tương tự như thân cây của các loài hòa thảo Ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm

và rộng 5-10 cm; thân cây thẳng, thông thường cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa

ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn Dưới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp Khi còn non chúng dài ra khoảng 3 cm mỗi ngày Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một

số rễ [11] Thân cây ngô non tích lũy một chất kháng sinh mạnh là DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on) DIMBOA là thành viên của nhóm các axít hydroxamic (còn gọi là benzoxazinoit) có khả năng phòng chống

tự nhiên đối với một loạt các loài gây hại như côn trùng, nấm và vi khuẩn gây

bệnh Giống ngô đột biến (bx) thiếu DIMBOA rất dễ bị các loài rệp và nấm gây bệnh Khi ngô trở nên già hơn thì hàm lượng DIMBOA cũng như khả năng đề kháng sâu bệnh cũng giảm đi [179], [187]

Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp

lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô Râu ngô

là các núm nhụy thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục

và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thường ở họ Hòa thảo Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200-

400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [11]

Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10) Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể"- các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [185] Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa

Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô Bộ gen ngô có 50000–

60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [186]

Ngô nếp (Zea mays L subsp Ceratina Kulesh), là một trong những loài phụ chính của Zea mays L Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng

bóng hơn Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô tẻ,

có tính chất quang học giống như lớp sáp Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi khác

là ngô sáp Ngô nếp là dạng ngô tẻ do biến đổi tinh bột mà thành Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chỉ chứa 75%

amylopectin và 25% amylose [11] Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của

ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [135]

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp

Ngô nếp được sử dụng làm lương thực và thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thụ hơn so với tinh bột của ngô tẻ [189] Một trong những nguyên nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các axit amin không thay thế như lyzin và triptophan cao Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt

Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống Lợi dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng, khả năng chịu hạn [187]

Ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua hay lấy hạt làm lương thực Hạt ngô có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chuyển hóa thành chất dẻo hay vải sợi; thủy phân hay xử lý bằng enzyme để sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, đôi khi được lên men để chưng cất một số dạng rượu Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như

là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học") Trong nhiều nền văn hóa người ta sử dụng các món cháo ngô, bánh ngô Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh Đối với mục đích này, các dạng với lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài được sử dụng [187]

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô nếp trên thế giới và ở Việt Nam

Ngô nếp được trồng nhiều nhất ở Mỹ, diện tích hàng năm khoảng 290000 ha Hầu hết diện tích này được trồng là nếp vàng [189] Theo Peter Thompson (2005), năng suất của ngô có hàm lượng amylose cao biến động tuỳ thuộc vào đất trồng, trung bình đạt từ 65- 75% so với ngô tẻ thường Ngô nếp có thể cho năng suất thấp hơn ở điều kiện thời tiết bất thuận [135] Theo thông báo của trường Đại học Illinois, gần đây đã có một số giống nếp lai điển hình cho năng suất cao hơn những giống ngô lai thông thường [190]

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô, lúa mì, lúa nước trên thế giới 1961-2011

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

N.suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

N.suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Nguồn Niên giám thống kê Thế giới, 6/2013 [183]

Theo thông tin từ Hội nghị ngô châu Á lần thứ 9 tại Bắc Kinh (2005), Trung Quốc đã tạo ra khá nhiều giống ngô nếp lai cho năng suất cao và chất lượng tốt Ví dụ: giống lai đơn màu trắng JYF 101 cho năng suất trung bình 150 tạ bắp tươi/ha; giống lai đơn màu tím Jingkenou 218 cho năng suất khoảng 120 tạ bắp tươi/ha; giống nếp trắng Jingkenou 2000 năng suất trung bình trên 130 tạ bắp tươi/ha; giống lai đơn tím trắng Jingtianzihuanuo và giống lai đơn Yahejin 2006 cho năng suất tới

200 tạ bắp tươi/ha [188] Ở Hàn Quốc, một số tỉnh trồng ngô nếp bán bắp tươi thu được 7925 USD/ha, sau đó trồng bắp cải, tổng thu nhập trên 16228 USD/ha

Ở Việt Nam, ngô nếp được phân bố ở khắp các vùng, miền trong cả nước với nhiều dạng mày hạt khác nhau: Trắng, vàng, tím, nâu, đỏ Hiện nay, Viện nghiên cứu ngô đã thu thập và lưu giữ 148 mẫu ngô nếp địa phương, trong đó có: 111 nguồn nếp trắng, 15 nguồn nếp vàng và 22 nguồn nếp tím, nâu đỏ Theo điều tra của Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương, trong 2 năm 2003 và

2004, diện tích ngô nếp ở nước ta chiếm gần 10% diện tích trồng ngô [17] Diện tích trồng ngô nếp không ngừng tăng nhanh trong thời gian qua, đặc biệt là ở vùng đồng bằng ven đô thị Nguyên nhân chính trước hết do các giống ngô nếp đáp ứng được nhu cầu luân canh tăng vụ trong cơ cấu nông nghiệp hiện nay, nhưng quan trọng hơn là do nhu cầu của xã hội ngày một tăng đối với sản phẩm này Ở các vùng núi cao và vùng sâu, ngô nếp được người dân sử dụng làm lương thực chính, dưới dạng xôi ngô hoặc dùng tươi dưới dạng nướng, luộc

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1990 đến 2012/13 Năm 1990 2000 2005 2007 2009 2011 2012/13

Diện tích (1000ha) 432,0 730,2 1052,6 1096,1 1089,2 1121,3 1118,3

Sản lượng (1000 tấn) 671,0 2005,9 3787,1 4303,2 4573,1 4835,6 4803,6

Năng suất (tạ/ha) 15,5 27,5 36,0 39,3 40,1 43,1 43,0

Nguồn Niên giám thống kê, 8/2013 [22]

Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào ngô tẻ Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ có một số ít công trình được công bố Tác giả Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thị Lưu (1990) đã chọn tạo thành công giống ngô nếp trắng từ vốn gen gồm các dòng thuần nếp trắng (làm nền) được bổ sung 12 nguồn gen từ các giống nếp địa phương [20] Nguyễn Thế Hùng và cộng sự (2010) đã tuyển chọn được 22 nguồn ưu tú trong tổng

số 64 nguồn vật liệu ngô nếp có nguồn gốc từ các vùng địa lý khác nhau (miền Bắc Việt Nam, Lào) Thông qua đánh giá đa dạng di truyền phân nhóm ưu thế lai và các

tổ hợp lai, các tác giả đã chọn được ba tổ hợp lai cho năng suất cao và chất lượng tốt (W1 x W16, W1 x W9, W1 x W2) [7]

Thời gian gần đây, các nhà tạo giống Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang hướng tạo giống nếp lai và đã tạo được một vài giống nếp lai không quy ước có triển vọng như các giống lai VN2, MX2, MX4, Bạch ngọc Trong khi đó, các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương

là hết sức cần thiết cho công tác giống, và bảo tồn nguồn gen quý

1.2 Phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn

1.2.1 Mối liên quan giữa hạn và tính chống chịu stress oxy hóa

1.2.1.1 Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi

là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn

Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39- 42oC) và độ ẩm thấp

<62% Hạn không khí thường gây nên hiện tượng héo tạm thời vì rễ cây không hút đủ nước mà quá trình thoát hơi nước quá nhanh do nhiệt độ môi trường cao Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước nhưng

do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế bào và môi trường bên ngoài nên rễ cây không có khả năng hút nước

Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây Hiện tượng này gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu hiện thích ứng toàn cơ thể Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo, không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước Chọn giống theo hướng phun râu đồng thời (không bị chậm) là phương pháp hữu hiệu để chọn được giống chịu hạn ở ngô ở các vùng Mỹ, Canada [10]

Hạn không khí, nhiệt độ thường xảy ra ở những vùng gió nóng, nhiệt độ cao Hạn không khí tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa Phản ứng của cây theo chiều hướng giảm cường độ thoát hơi nước và như vậy sẽ làm tăng nhiệt độ cơ thể Đồng thời với tăng nhiệt độ không khí, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình hình thành hạt phấn và thụ phấn của ngô Cần phải nhấn mạnh rằng trong quá trình phát triển của cây có những giai đoạn bị khủng hoảng: bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan sinh sản, kết thúc vào lúc thụ phấn hoàn toàn Đây là thời kỳ cây cần nước nhất và kém chịu đựng nhất Hạn xảy ra trong thời gian này làm giảm năng suất một cách đáng kể

Nước tồn tại ở dạng liên kết trong tế bào Màng tế bào là nơi bị tổn thương đầu tiên khi xảy ra mất nước Thiếu nước nhẹ chỉ làm thay đổi một phần cấu trúc của protein, lipit trên màng tế bào Lớp lipit cấu trúc chuyển từ trạng thái hoạt hoá tinh thể lỏng sang dạng gel không còn linh hoạt, và kém nhất là chuyển sang trạng thái lục lăng ngược Trong trạng thái cuối cùng màng lipit kép bị gián đoạn, các phức enzyme bị phá tung, dịch tế bào có thể dò rỉ ra ngoài Tiếp sau đó các

hệ thống màng khác trong tế bào như màng lưới nội chất, màng lục lạp, màng ty thể cũng bị thiếu nước và không còn khả năng trao đổi chất [10]

Hiện tượng nóng hạn còn tạo ra các gốc tự do của hydroxyl, superoxide oxy hoá các đại phân tử và làm mất hoạt tính của chúng Ngoài ra, các sản phẩm

phân hủy của các đại phân tử và nồng độ ion cao khi mất nước gây độc cho tế bào Khi bắt đầu mất nước sự tổng hợp protein được tăng cường, nhưng hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thủy phân protein Stress oxy hóa xảy ra trong điều kiện tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS) gây tổn thương, thậm chí làm chết tế bào [115] Những yếu tố môi trường gây stress oxy hóa có thể kể đến là: nồng độ ôzon hoặc SO2 quá cao, chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng, lạnh, tổn thương cơ học, UV, chiếu sáng liên tục, sự xâm nhập của mầm bệnh, sự lão hóa Ở những điều kiện này, thúc đẩy hiện tượng ức chế quang hợp [66]

1.2.1.2 Các dạng oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS)

ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2); oxy dạng đơn (singlet oxy), superoxide anion (O2-), hydro peroxide tự do (OH*), hydro peroxide (H2O2), pehydroxyl tự do (O2H*), ozon (O3) Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc lục lạp Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa như superoxide anion (O2-

), H2O2 cần cho

sự hóa gỗ (sự hóa lignin) và thực hiện chức năng như tín hiệu phản ứng bảo vệ đối với hiện tượng nhiễm bệnh [35]

ROS đặc biệt là OH* tác động lên lipit không no làm đứt gãy chuỗi tạo một

loạt các sản phẩm như lipit hydroperoxide mà tiếp sau đó có thể tạo thành các gốc tự do khác dưới tác động của ion Fe: R*, RO*, ROO*, aldehyde Những sản phẩm này có thể tương tác tạo thành oxygen gốc tự do [43]

ROS tác động lên protein làm biến đổi những điểm đặc biệt, ngắt đoạn

chuỗi peptid, thay đổi điện tích và cuối cùng làm tăng khả năng nhậy cảm đối với các protease [43]

ROS tác động và gây tổn thương lên DNA Hậu quả có thể là gây đột biến

DNA như mất đoạn hoặc những hiêụ ứng di truyền có hại khác ROS có thể tác động lên gốc đường hoặc gốc base ở những vị trí mẫm cảm Tuy nhiên không phải

lúc nào ROS cũng có hại Ví dụ như trường hợp cây bị nhiễm bệnh, thụ thể nhận tín hiệu bên ngoài hoạt hóa peroxidase, NAD(P)H oxidase, O2-

và H2O2 được tạo

ra để diệt mầm bệnh, đồng thời kích hoạt hệ thống bảo vệ của tế bào [43]

1.2.1.3 Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa

Phản ứng của cây trồng còn biểu hiện như đóng khí khổng để ozon không xâm nhập được vào mô lá đồng thời hoạt hoá các hệ chống ôxy hoá Hệ thống bảo vệ cây trồng bao gồm các enzyme và hợp chất không phải enzyme Những hợp chất đó là:

Superoxide dismutase - SOD: H2O, O2 là những yếu tố cần thiết để duy trì

sự sống trong cơ thể Nhưng dưới sự tác động của môi trường bất lợi, trong các

hệ thống chuyển năng lượng và electron của tế bào thường tạo ra các gốc tự do

Sự có mặt của SOD sẽ xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide [115]

Catalasse là enzyme có chứa nhân hem, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá

H2O2 thành H2O và O2 Tất cả các isozym của enzyme này đều là tetramer có MW= 220000Da Sự đa dạng của enzyme cũng được nêu lên trong nhiều loại thực vật khác nhau [115] Ví dụ: catalase từ ngô có 3 isozym cat-1, cat-2, cat-3 Gen mã hoá cho chúng nằm trên các vị trí khác nhau nhiễm sắc thể và không phụ thuộc vào nhau Cat-1 và cat-2 có trong peroxisome và dịch tế bào, cat-3 thấy trong ty thể [153]

Các enzyme chuyển hoá ascorbate: ascorbate loại bỏ gốc tự do theo các

hướng khác nhau Trong lục lạp, H2O2 chuyển hoá thành H2O dưới tác dụng của ascorbate peroxidase, ascorbate tạo ra monodehydroascorbate radical Chất này chuyển hoá về ascorbate nhờ monodehydroascorbate reductase và năng lượng của NADP Bằng cách khác, monodehydroascorbate radical chuyển hoá thành dehydroascorbate, chất này dưới tác dụng của dehydroascorbate reductase phản ứng với glutathion tạo thành ascorbate và oxidized glutathione (GSSG) GSSG chuyển về dạng GSH nhờ glutathione reductase và năng lượng của NADP [115]

Glutathion (GSH) là tripeptid (Glu-Cys-Gly), tính chống oxi hóa nhờ gốc

SH của Cys Một số legume có chứa một dạng đồng dạng khác: Glu-Cys-Ala GSH thực hiện chức năng bằng nhiều cách: phản ứng thẳng với oxygen, superoxide, hydroxyl radical, loại bỏ các dạng acyl peroxide được hình thành khi lipit bị oxy hóa bởi peroxide [128]

Glutathion reductase (GR) khử GSSG thành GSH Đây là enzyme tương

đối bảo thủ Nếu như ở động vật chỉ có một dạng, thì ở thực vật phát hiện ra nhiều isozym trên điện di hai chiều và có thể là sản phẩm của các gen khác nhau GR có trong lục lạp, nhưng hoạt tính cao ở trong dịch tế bào, ở trong ty thể ít hơn [115]

Ngoài các hợp chất có bản chất enzyme trên, các chất khác không có hoạt tính xúc tác sinh học cũng tham gia trực tiếp chuyển hóa các gốc tự do như: vitamin E, vitamin C, carotenoid, polyamin, zeaxanthin và flavonoid Chúng tương tác với các gốc carbocyl tự do, hạn chế sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác Carotenoid và flavonoid còn nhận năng lượng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra trong quá trình quang hợp

1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô

1.2.2.1 Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn

Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và liên quan đến các gen chịu hạn Hiện nay có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm được chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu

Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút được nước

ở những vùng sâu, vùng xa [29] Môi trường hạn gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn sẽ biểu hiện toàn bộ cơ

thể Trong trường hợp có mặt axit abscisis quá trình đóng mở lỗ khí được điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nước [172]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu được các phân tử nước hiếm hoi có trong đất nhờ vậy cây ngô có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ [120] Khi tế bào mất nước, các chất hoà tan sẽ được tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nước, tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipit hoặc protein trong màng ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein Các chất hoà tan có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao bao gồm các ion K+, proline, axit hữu cơ, các loại đường Khi bắt đầu mất nước, hàm lượng proline và ABA tăng, tăng tổng hợp protein, nhưng nếu hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thuỷ phân protein [147], [161] Quá trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [184]

Hạn là yếu tố phổ biến làm giảm năng suất cây trồng nói chung Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan tới sự sinh trưởng và phát triển của bộ

rễ Trong môi trường bị hạn rễ thường phát triển theo chiều sâu và số lượng rễ tăng lên [84] Việc đánh giá các giống thí nghiệm trong điều kiện khô hạn trên đồng ruộng cho thấy những giống có khối lượng rễ lớn thì có khả năng chịu hạn tốt hơn

Tốc độ vươn dài của lá phụ thuộc vào sự thay đổi về thế nước của lá và khả năng cung cấp nước của đất Đây cũng là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô Ở điều kiện bình thường, cây thực hiện các chức năng sống của mình thông qua các quá trình sinh lí và sinh hoá Khi gặp điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ cao, các tính chất lí hoá của keo nguyên sinh thay đổi ví dụ như:

tính đàn hồi và độ nhớt bị giảm, đồng thời trao đổi chất cũng giảm, tế bào bị mất nước Kết quả tế bào sẽ bị chết do mất tính bán thấm, không có hiện tượng co nguyên sinh chất [10] Đặc điểm này là cơ sở xây dựng các phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng của cây: phân tích protein, axit amin, ABA Axit abscicis có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu hạn ở ngô Kết quả nghiên cứu của các tác giả Hu và cộng sự (2012), Jiang và cộng sự (2013) chứng minh vai trò trung tâm trong việc điều khiển sự đóng mở khí khổng duy trì cân bằng nước của cây ngô bị hạn Sự xuất hiện ABA trong điều kiện hạn có liên quan đến các gen đặc hiệu [80], [85]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nước do lạnh, muối hoặc nóng hạn Những thực vật tồn tại trên môi trường mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại được điều kiện khắc nghiệt đó Tồn tại 2 cơ chế khắc phục sự bất lợi này: (1) Khả năng thích nghi đặc biệt của cấu trúc và hình thái rễ, lá để tránh cho tế bào khỏi mất nước; (2) Khả năng chịu mất nước dựa trên sự thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hoà tan, protein, axit amin đặc hiệu

Proline có vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu trong tế bào, đồng thời nó còn là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tương tác với protein màng và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác [106] Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn, cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp proline Sự thay đổi về một số axit amin, đặc biệt là proline có liên quan đến tính chịu hạn của ngô Kết quả nghiên cứu của Yamada và cộng sự (2005) cho thấy hàm lượng proline tăng lên ở điều kiện mất nước cực đoan [177]

Sucrose tăng lên một lượng lớn trong tế bào khi gặp yếu tố cực đoan Chúng

tương tác với màng tế bào, hình thành cầu nối hydro giữa gốc hydroxyl của sucrose với nhóm phospholipit Bằng cách này chúng thay thế vị trí nước trong màng tế bào Sự có mặt của chúng trong nguyên sinh chất còn có khả năng bảo

vệ các phức enzyme khác Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự thay đổi

và tăng cường áp suất thẩm thấu, ổn định pH cho tế bào [154]

Fructant là phân tử polyfructose có ở nhiều loại thực vật Chúng được tổng hợp từ sucrose và trữ trong các không bào ở dạng hòa tan Những giống có tích luỹ fructant cao đều có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện cực đoan như hạn và lạnh Đó chính là khả năng chuyển hoá một cách nhanh chóng fructant thành các sản phẩm có độ polimer hoá thấp hơn Mức độ polimer hoá trung bình của fructant suy yếu dần với sự mất nước và giảm nhiệt độ [63]

1.2.2.2 Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô

Tính chịu nóng hạn của cây trồng được hình thành trong quá trình tiến hoá

tự nhiên, do một hệ đa gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển

khác nhau của cây [41] Kết quả phân tích microarray ở đối tượng Arabidopsis

khi sử dụng 1300 cDNA cho thấy có khoảng 44 gen Ngày nay vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn [150] Các gen chịu hạn của những cây hạn sinh lý vẫn là vấn đề nghiên cứu lý thú đối với các nhà khoa học

Yếu tố ARE (Antioxidant Responsive Element) có trong vùng promoter của các gen glutathion stransferase, Mn- Superoxide dismutase (Mn-SOD) Vai trò của ARE là kích hoạt các gen này biểu hiện thành sản phẩm protein trong điều kiện cực đoan oxy hoá Những yếu tố này cũng tìm thấy trong vùng promoter của

các gen chống oxy hoá ở thực vật (cat của ngô) Vai trò của các yếu tố này là

hoạt hoá các gen chống oxy hoá và các gen chống chịu trong các điều kiện hạn,

lạnh Vùng promoter của 3 gen cat được nghiên cứu rất kỹ Chúng có những

yếu tố hoạt hóa phiên mã như ARE, AP-1, NF- KB [153]

Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập được 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm dehydrin ở những cây trồng khác nhau Một số gen mã hoá protein dehydrin ở ngô (chủ yếu là giống ngô lai) đã được công bố trên ngân

hàng trình tự gen quốc tế Nghiên cứu về gen dehydrin dhn1 ở 2 giống ngô chịu hạn (DF1 và DF2) từ DNA hệ gen của Trần Thị Phương Liên (2005) cho thấy

gen này có trình tự 628bp, trình tự axit amin suy diễn dài 169 axit amin có cấu trúc Y2SK2 [9]

Một trong những cơ chế để nâng cao khả năng chịu hạn và chịu muối là điều chỉnh áp suất thẩm thấu và loại bỏ các gốc tự do Những thử nghiệm đầu tiên về hướng này đã được thực hiện Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) đã

chuyển gen P5CS mã hóa enzyme tham gia tổng hợp proline vào cây thuốc lá

Sau khi gây hạn nhân tạo, hàm lượng proline tăng rất mạnh so với trước gây hạn

ở tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen Sau 9 ngày gây hạn, proline ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206,8 %, trong khi ở cây chuyển gen tăng từ 259,5- 451,8% [8]

Hướng tiếp theo để nghiên cứu sử dụng công nghệ gen tăng cường tính chống chịu sẽ là: điều khiển sự biểu hiện và hoạt tính của các hệ vận chuyển K+(qua hoạt tính của protein tạo kênh chuyển- aquaporin); tăng cường sự thoát các ion Na+ của tế bào rễ, tonoplast; tăng cường điều chỉnh áp suất thẩm thấu; tăng cường cơ chế bảo vệ tế bào bằng các phản ứng trao đổi chất đặc hiệu trong tế bào nhờ có protease, protein sốc nhiệt, loại bỏ các gốc tự do [10]

Nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chống chịu theo hướng khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan là nghiên cứu vai trò của nhóm protein sốc nhiệt, trong đó có các chất MGPT- Moleculer chaperone, ubiquitin, protease, amylase, protein LEA

Nhóm 1: nhóm có chức năng chịu hạn bao gồm MGPT, protein LEA,

protein kênh chuyển nước qua màng, đường, proline, transporters detoxification

enzyme, protein antifreeze, Protein LEA, MGPT và mRNA binding protein đã được nghiên cứu về mặt hóa sinh, và chỉ ra rằng chúng tham gia bảo vệ các cấu trúc đại phân tử như các enzyme, lipit và mRNA khỏi bị mất nước Proline, glycine, betaine và đường thực hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu [41], [191]

Nhóm 2: các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có

chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng hạn như protein kinase, nhân

tố phiên mã và các enzyme trong chuyển hoá phospholipit Gen mã hoá cho nhân tố phiên mã có chứa DNA binding motif Chúng có vai trò điều hoà các gen chức năng dưới tác động của điều kiện cực đoan Protein kinase hoặc phosphatase có thể tham gia cải biến (hoặc sửa đổi) những protein chức năng hoặc protein điều hoà tham gia vào chu trình truyền tín hiệu khi gặp điều kiện cực đoan[88]

Theo Boston (1996), chức năng chính của MGPT ở thực vật là: tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới tổng hợp từ bước đầu tiên đến cuối cùng; duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein; ngăn chặn sự huỷ hoại protein chưa tạo cấu trúc đúng; khởi đầu cho sự phân huỷ protein bị biến tính Như vậy MGPT có chức năng rất quan trọng khi các tế bào gặp điều kiện cực đoan, nhất

là sốc nhiệt [90]

Protein LEA đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt Protein LEA rất khác nhau giữa cây Một lá mầm và Hai lá mầm Chúng thay thế vị trí nước trong tế bào, và thực hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, huỷ protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu Protein LEA

có trong dịch bào, ty thể, không bào, lục lạp, và vùng lân cận màng tế bào Các nhà khoa học nhận thấy rằng một số intron nhất định trong gen có thể thúc đẩy

sự biểu hiện gen ở cây tăng lên nhiều lần, đặc biệt được nghiên cứu kỹ ở ngô [10] Protein LEA được chia thành các nhóm: 1- D19, 2- D11, 3-D7, 4- D113, 5-

D29, 6- D95 [191]

Phần lớn các gen chịu cảm ứng điều hiện khô hạn đều cảm ứng với điều kiện mặn Một trong số gen này còn chịu cảm ứng điều kiện lạnh, phụ thuộc vào phản ứng với ABA Những đường dẫn truyền tín hiệu này chia thành 2 loại: (1) Phụ thuộc vào ABA: đòi hỏi tổng hợp protein MYC, MYB hoặc không cần; (2) Không phụ thuộc vào ABA: yếu tố phản ứng với mất nước DRE tham gia vào việc điều hòa biểu hiện gen

DRE được đặt tên cho trình tự 9 bp TACCGACAT Yếu tố protein gắn với trình tự DRE (DREBS) ở vùng promoter Những protein này chứa các các vùng bảo thủ như các protein EREBP (tham gia biểu hiện ethylene responsive gene), AP2 (tham gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực vật có hoa) Các gen

rd19, rd21 mã hóa cho thiol protease; erd1 mã hóa cho tiểu phần điều hòa của

protease CLP, là những gen chỉ cảm ứng bởi hạn, mà không cảm ứng bởi ABA hay điều kiện lạnh [10]

Từ những năm 90 của thế kỷ XX đến nay, đã có nhiều công trình trong nước quan tâm nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô Đó là các kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [18]; đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [13], [24]; phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA hệ gen [9]; nghiên cứu chọn tạo dòng thuần ngô bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn [5], [21]; nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô [19] Hiện nay trên thế giới cũng đã và đang tiến hành một hướng nghiên cứu về sắc tố anthocyanin liên quan đến hạn ở một số đối tượng thực vật Ở Việt Nam, còn ít công trình đề cập đến sắc tố chỉ thị này, đặc biệt đối với các giống ngô nếp địa phương

1.3 Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa

1.3.1 Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn

Hiện nay có nhiều giả thuyết khác nhau giải thích về đặc tính chịu hạn của

thực vật và cây ngô Các cơ chế này tập trung theo hai hướng cơ bản: hướng

chống hạn và hướng chịu hạn Theo hướng thứ nhất, thực vật có sự biến đổi hình

thái cơ thể để hạn chế sự mất nước Hướng thứ hai diễn ra nhiều cơ chế: sự điều

chỉnh áp suất thẩm thấu, sự đóng bớt khí khổng, tăng hàm lượng các chất hoà

tan, tăng kích thước bộ rễ, tăng tổng hợp các chất chỉ thị (anthocyanin,

polyamine)

Các sắc tố hấp thụ năng lượng ánh sáng cần thiết cho quang hợp Chúng có

mặt trong các lục lạp của thực vật hoặc phân tán trong tế bào của sinh vật nhân

sơ Chúng bao gồm: sắc tố lục (chlorophyll), sắc tố vàng (carotenoid), sắc tố của

thực vật bậc thấp (phicobilin) và sắc tố dịch bào (anthocyanin) Trên cơ sở số

liệu về hàm lượng các dạng sắc tố trong lá, người ta có thể đánh giá khả năng

quang hợp của thực vật và xếp thực vật thuộc nhóm ưa sáng hay ưa bóng, thực

vật C3 hay C4 [67]

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin [3]

Anthocyanin là những glucozit, thuộc họ flavonoid, do gốc đường glucose,

glactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin) Aglucon của chúng

có cấu trúc cơ bản được mô tả trong Hình 1.1 Các gốc đường thường được gắn

vào vị trí 3 và 5, ít gắn vào vị trí 7 Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3

gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit Các aglucon của

anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là

H, OH hoặc OCH3 [3]

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh, phụ thuộc nhất vào pH môi trường, sau đó là các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác Khi pH < 7 các anthocyanin thường có màu đỏ, khi pH> 7 thì

có màu xanh Ở pH 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4- 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH 7- 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh [3]

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510- 540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin, chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [67]

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng rất an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như khả năng chống oxy hóa cao nên được

sử dụng để chống lão hóa, chống oxy hóa thực phẩm; hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; làm bền thành mạch; chống viêm; hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ [40], [158] Anthocyanin làm tăng khả năng giữ nước của tế bào khi bị hạn và gió khô [184]

Anthocyanin được tìm thấy trong không bào của tế bào biểu bì, mô mạch dẫn Chúng xuất hiện trong rễ (cả rễ nằm sâu dưới đất và trên mặt đất), trụ dưới lá mầm, bao lá mầm, thân (cuống), củ, thân rễ, thân bò, thân hành, lá [36], [145], [78] Những bộ phận mầu đỏ trong các quần xã đều thể hiện sự đa dạng về màu của anthocyanin Ở lá, anthocyanin tạo màu cho cả bề mặt lá, mép lá, viền sọc, các vết đốm Một số lá chuyển màu đỏ trước khi bị cắt, hay khi phát triển và tồn tại suốt thời gian sống Ở nhiều loài, anthocyanin chỉ được tổng hợp khi chúng không khoẻ hay phản ứng với điều kiện bất lợi của môi trường [173]

Mặc dù áp lực của chọn lọc tự nhiên dẫn đến sự tiến hoá của anthocyanin ở nhiều cấu trúc soma chưa rõ ràng, các nhà khoa học về sinh lý thực vật đã có những đóng góp ý nghĩa để đưa ra các kết luận về chức năng của anthocyanin trong 10 năm qua Chức năng của anthocyanin trong các bộ phận khác nhau của thực vật bao gồm: (1) bảo vệ lục lạp khỏi tác động bất lợi của ánh sáng; (2) hạn chế bức xạ của tia UV-B; (3) hoạt tính chống oxi hoá Sinh tổng hợp anthocyanin ở lá được tăng cường để đáp ứng với điều kiện cực đoan của môi trường: ánh sáng mạnh, UV-B, nhiệt độ cao, hạn, ozone, thiếu nitơ và P, nhiễm nấm và vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm [89] Do vậy, anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động bất lợi do điều kiện đó gây ra

Mặc dù quang hợp cần có ánh sáng nhưng các lượng tử của pha sáng có thể ảnh hưởng tới các thành phần của hệ thống quang hợp và có thể dẫn đến quá trình sửa chữa hay phá huỷ thứ cấp trên màng thylakoid [25] Anthocyanin ở lá chủ yếu hấp thụ bước sóng ánh sáng xanh và vàng Mô giậu của những lá đỏ có thể tiếp nhận ánh sáng màu xanh kém hơn mô giậu ở lá màu xanh, và lá màu đỏ

có thể phát triển đặc điểm hình thái và sinh lý của lá cây ưa bóng [108] Anthocyanin có khả năng lọc ánh sáng để làm giảm mức độ nghiêm trọng do sự

ức chế quang hoá (photoinhibition) gây ra và phục hồi quang tổng hợp ở lá [67] Thực nghiệm cho thấy, anthocyanin bảo vệ quang hoá khi có mặt ở cả lá già và cây rụng lá, cây trưởng thành, lá già qua đông của cây thường xanh, hay lá non [45], [77], [81]

Khi gặp điều kiện cực đoan của môi trường, tế bào xảy ra sự hấp thụ một lượng lượng tử và tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa, hay còn gọi là các gốc

tự do (ROS), gây tổn thương, thậm chí làm chết tế bào Những yếu tố môi trường gây ra stress ôxy hóa có thể kể đến là: ô nhiễm môi trường do nồng độ ozone hoặc SO2 quá cao, do chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng,

lạnh, tổn thương cơ học, UV, điều kiện chiếu sáng cao liên tục ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2), singlet oxy, superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (OH*), pehydroxyl radical (O2H*), ozon Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc lục lạp Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa như superoxide anion (O2-) hay H2O2 cần cho sự hóa gỗ (sự lignin hóa) và thực hiện chức năng như tín hiệu phản ứng bảo vệ đối với hiện tượng nhiễm bệnh Lignin được hình thành từ coniferyl alcohol, dưới tác động của các ROS tạo thành các gốc tự do của coniferyl alcohol Các gốc tự do này tiếp theo tạo thành dimer và polymer lignin Hệ thống bảo vệ cây trồng nhằm loại bỏ các hợp chất này được thực hiện nhờ các chất chống oxy hóa có ở một số bào quan [89] Các chất này bao gồm các enzyme và hợp chất khác không phải enzyme những hợp chất này không có mặt ở tất cả mọi nơi, mà phụ thuộc vào các hệ thống khác nhau giữa các loài khác nhau, chúng có thể biểu hiện ở những bào quan nhất định Những hợp chất chống oxy hoá chính là ascorbate (vitamin C), reduce glutathione (GSH), vitamin E và carotenoid (các chất này gọi còn gọi là LMWA, low molecular weight antioxidants) Ngoài ra polyamine và flavonoid cũng chống lại sự tổn thương do oxy hoá của những gốc tự do [89], [144]

Trong tế bào thực vật, ty thể và lạp thể là hai nguồn tạo ra ROS thông qua các phản ứng của quang hợp và hô hấp Nguồn enzyme của ROS gồm NADPH oxidase trên màng, oxilate oxidase và amine oxidase trong apoplasm, peroxidase trên thành tế bào [65], [87] Các tác nhân bất lợi của môi trường có thể làm tăng hàm lượng ROS gấp 3 lần so với bình thường [137] Anthocyanin là loại sắc tố phổ biến có khả năng chuyển hoá ROS gấp 4 lần so với vitamin E, C Hiệu quả này bắt nguồn từ độ phản ứng cao như là chất cho proton và điện tử Nghiên cứu

In vitro cho thấy các flavonoid làm vô hiệu hoá hầu hết các ROS và các gốc nitơ

quan trọng Thí nghiệm in vivo đã thuyết phục được chức năng loại bỏ ROS của

flavonoid [174] Agati và cộng sự (2007) tiến hành ngâm lá Phillyrea latifolia

trong DanePy, fluorochrome Kết quả kiểm tra lát cắt ngang của lá dưới kính hiển vi khẳng định rằng O2- đã bị loại bỏ khi chiếu ánh sáng với cường độ mạnh,

và chức năng này chủ yếu là do sự có mặt của flavonoid ở lục lạp và tế bào thịt

lá [26] Hoạt tính chống oxi hoá có thể giải thích bằng sự có mặt của anthocyanin hay không? Có hai cơ chế anthocyanin có thể làm giảm oxi hoá ở

lá Cơ chế thứ nhất, anthocyanin có thể hạn chế hay điều hoà phản ứng pha sáng, pha tạo ra ROS, bằng cách làm giảm một lượng các lượng tử cao năng liên quan đến các tế bào tham gia quang hợp [81], [114], [123] Neill SO và Gould (2003) cho rằng lục lạp không thực hiện được chức năng trong dung dịch có lượng nhỏ gốc O2

-, và ít bị tẩy màu khi chiếu sáng ánh sáng đơn sắc đỏ so với ánh sáng trắng [124] Thứ hai, anthocyanin có thể loại ROS trực tiếp Anthocyanin thường không màu hay xanh da trời ở pH tế bào chất, chúng chuyến sang đỏ khi được chuyển vào không bào qua nang vận chuyển [139] Các enzyme chuyển hoá ROS (SOD và APX) trong lục lạp là kết quả của sự ức chế quang hợp và quang oxi hoá Những enzyme này chuyển hoá O2, và H2O2 rất hiệu quả Tuy nhiên, ánh sáng mạnh kèm theo tress lạnh làm bất hoạt của APX, SOD dẫn đến tăng nồng độ H2O2 Anthocyanin có thể bảo vệ các enzyme chống oxi hoá bằng cách hạn chế lượng ánh sáng vào tế bào quang hợp, do đó giảm sự phát sinh ROS [164] Một thực nghiệm khác cũng cho thấy, khi cây bị chiếu sáng mạnh, lục lạp không thực hiện được chức năng và sản sinh ra các gốc O2-, gốc này được dạng không màu và màu đỏ của cyanidin glycosides loại bỏ Như vậy, anthocyanin được cho là có chức năng bảo vệ quang hoá và phục hồi quang tổng hợp ở lá [36], [78] Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, anthocyanin loại cyanindin-3- O -glucose chloride có tác dụng lớn trong việc bảo vệ chống lại sự phân hủy vitamin C, E, beta carotene (Hình 1.2) [158]