Nghiên cứu quy trình chiết tách ent kauran dipecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm bắc bộ (croton tonkinensis gagnep , euphorbiaceae (giai đoạn 2 phụ lục)

2 Nghiên cứu quy trình xử lý các mẫu thực vật bao gồm lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ Đã nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu thực vật để có bột nguyên liệu thực vật khô cho ng

Đề tài độc lập cấp nhà nước

báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài

nghiên cứu quy trình chiết tách

ent-kauran Ditecpenoit có tác dụng

chống ung thư Và chống viêm từ cây

khổ sâm Bắc Bộ (croton tonkinensis

gagnep., euphorbiaceae) - Giai đoạn 2

Mã số: ĐTĐL.2009G/03

Phụ lục

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội

Chủ nhiệm : GS TSKH Phan Tống Sơn

9072-1

Hà Nội – 6/2011

NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY

CỦA HOẠT CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT

TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ

(CROTON TONKINENSIS GAGNEP., EUPHORBIACEAE)

Chủ nhiệm Đề tài nhánh: PGS TS Phan Minh Giang

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Nội dung nghiên cứu của Đề tài nhánh này là nghiên cứu động thái tích lũy

của hoạt chất ent- kauran ditecpenoit trong cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton

tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) theo thời gian ở một số vùng nguyên

liệu

1 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ và Thu thập

các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu

1.1 Lựa chọn các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ

Trong số các địa phương đã lâu năm trồng cây nguyên liệu khổ sâm

Bắc Bộ để dùng làm thuốc có thể kể đến Mỹ Đức, Quốc Oai (Hà Tây cũ),

Ngọc Trục thuộc Từ Liêm, Gia Lâm và Hòa Bình

1.2 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ

Đã tổ chức khảo sát thực địa các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm

Bắc Bộ bao gồm Mỹ Đức, Quốc Oai (Hà Tây cũ), Ngọc Trục , Gia Lâm và

Hòa Bình (vùng Kỳ Sơn)

Bảo quản các cây cung cấp nguyên liệu để có thể thu thập mẫu cho 3 thời

điểm trong năm (xem Bảng 1: Danh sách mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cho

nghiên cứu) Các thời điểm thu thập mẫu và bộ phận cây cần thu hái được lựa

về thời gian thu thập nguyên liệu của các cây thuốc cổ truyền [1,2]

Hình 1: Lá và hoa một cây khổ sâm Bắc Bộ (Ngọc Trục)

1.3 Thu thập các mẫu thực vật

Các mẫu thực vật bao gồm các bộ phận có khả năng chứa hàm lượng

cao các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit là lá và cành con được thu thập tại

các thời điểm trong năm Các thời điểm được lựa chọn là tháng 4, tháng 9 và tháng 1 dương lịch

Bảng 1: Danh sách các mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu

Hai chữ đầu là ký hiệu của vùng nguyên liệu (ví dụ, NT = Ngọc

Trục); L hoặc T là bộ phận nguyên liệu (L = lá và T = cành con);

các ký hiệu 1, 2 hoặc 3 được dùng để chỉ các thời điểm thu thập mẫu

tương ứng với tháng 4, tháng 9 và tháng 1 dương lịch

Tài liệu tham khảo

1) Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Thành phố

học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1997

2 Nghiên cứu quy trình xử lý các mẫu thực vật (bao gồm lá và cành con

của cây khổ sâm Bắc Bộ)

Đã nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu thực vật để có bột nguyên liệu thực vật khô cho nghiên cứu phân tích

2.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật là cành lá (nhánh cây) tươi của cây khổ sâm Bắc Bộ

(Croton tonkinensis Gagnep.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) được thu

thập thực địa tại một số thời điểm theo vụ thu hoạch trong năm tại một số vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ quan trọng, như đã nêu ở Bảng

1

2.2 Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật

Các khảo sát của nhóm nghiên cứu chúng tôi đã cho thấy các nguyên liệu thực vật khô từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ có thể chứa một hàm lượng khá

cao các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit Một điều thuận lợi cho các quá trình

xử lý mẫu trong trường hợp nghiên cứu các hoạt chất từ cây khổ sâm Bắc Bộ

là các hoạt chất ditecpenoit này thường có độ ổn định hóa học khá cao và được thu nhận ở trạng thái rắn không dễ bị bay hơi Tuy nhiên để giảm các ảnh hưởng đến các hoạt chất việc xử lý mẫu đòi hỏi một quá trình làm khô mẫu chậm và tránh các tác động mạnh của nhiệt độ và độ ẩm Do đó trước khi tiến hành các nghiên cứu chiết xuất các mẫu thực vật đã được xử lý để ổn định mẫu theo một quy trình chung gồm năm bước sau (xem Sơ đồ 1)

1 Các mẫu thực vật (cành lá tươi) của cây khổ sâm Bắc Bộ được lưu giữ trong các túi lưới có kích thước 60 cm x 80 cm (rộng x dài) trong bóng râm ở điều kiện nhiệt độ phòng thoáng, mát cho bước xử lý tiếp theo ngay sau đó Các túi nguyên liệu này đều được gắn nhãn có ghi tên mẫu, địa điểm thu thập mẫu, thời gian thu thập mẫu và người trực tiếp thu thập mẫu

2 Sau đó các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ được hong khô trong bóng râm trong điều kiện có quạt thông gió trong khoảng thời gian năm ngày Các mẫu thực vật này sau khi đã được lấy ra một phần để dùng cho các nghiên cứu chiết tách đều đuợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong điều kiện

thoáng, mát nhằm hạn chế các ảnh hưởng đến các hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit có ở trong các mẫu

3 Các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ, sau khi đã được hong khô trong bóng râm, được xử lý tách riêng phần lá và phần cành con (được xác định là phần gắn liền với lá có đường kính khoảng từ 1-1,5 mm) cho bước nghiên cứu chiết xuất Đây là các bộ phận của cây được sử dụng theo kinh nghiệm trong

Y học cổ truyền và có hàm lượng hoạt chất ent-kauran ditecpenoit cao

4 Mẫu thực vật (lá hoặc cành con, để riêng) của cây khổ sâm Bắc Bộ sau đó được sấy trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ 40 oC trong 48 giờ

Các mẫu nguyên liệu thực vật (tức lá khô hoặc cành con khô, để riêng) của cây khổ sâm Bắc Bộ bây giờ đã được ổn định cho các nghiên cứu chiết xuất

5 Để cho dung môi hữu cơ có thể thẩm thấu vào các cấu trúc tế bào của các

mô thực vật trong quá trình chiết xuất, các nguyên liệu thực vật (lá khô hoặc cành con khô) của cây khổ sâm Bắc Bộ cần được xay thành bột mịn Cho các nghiên cứu chiết xuất ở quy mô phân tích, các nguyên liệu thực vật này được xay thành bột trong máy xay cỡ nhỏ (Philips, Hà Lan) Để giảm nhiệt sinh ra

gian 30 giõy

Sơ đồ 1: Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ Phõn tớch sắc ký lớp mỏng (TLC) định tớnh để kiểm tra sự cú mặt của cỏc

hoạt chất ent-kauran ditecpenoit trong cỏc mẫu sau xử lý:

Quy trỡnh phõn tớch TLC chung

1) Ngõm chiết 1 g mẫu sau xử lý với MeOH khan trong bỡnh Erlenmeyer (1 ngày)

2) Cất loại kiệt dung mụi MeOH dưới ỏp suất giảm

3) Chuẩn bị mẫu dung dịch phõn tớch TLC (10 mg phần chiết MeOH/1 ml MeOH)

4) Phõn tớch TLC định tớnh : sử dụng bỡnh triển khai TLC Sigma-Aldrich, bản mỏng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F (Merck, Germany),

CH2Cl2), đưa mẫu lên bản mỏng: 20 µl cho mẫu phần chiết MeOH (10 mg/1

ml MeOH) và 5 µl cho mẫu chuẩn, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v), nhiệt độ triển khai TLC: nhiệt độ phòng, thuốc thử hiện màu: Dragendorff-Munier (hiện màu da cam) và vanilin/H2SO4 đặc 1% (hiện màu tím), phương

pháp phân tích TLC định tính: so sánh và co-TLC

2.3 Áp dụng quy trình xử lý mẫu chung

Quy trình xử lý mẫu chung nêu trên đã được áp dụng để xử lý 30 mẫu nguyên liệu tươi của cây khổ sâm Bắc Bộ bao gồm 15 mẫu lá và 15 mẫu cành con Các nguyên liệu sau khi xử lý đều đạt yêu cầu sử dụng; phân tích TLC đã

cho thấy sự có mặt các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit mục tiêu trong các

nguyên liệu này

2.4 Kết luận

1) Đối với các mẫu thực vật (lá và cành con) từ cây khổ sâm Bắc Bộ đã khảo sát và xác định các điều kiện thích hợp để xử lý ổn định mẫu thực vật tươi mà

không làm ảnh hưởng đến các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit: thời gian

hong khô ngoài không khí, nhiệt độ sấy (40 oC) và thời gian sấy mẫu, để thu được các mẫu nguyên liệu thực vật khô ổn định

2) Đã áp dụng phương pháp TLC để kiểm tra định tính các thành phần, kết

quả cho thấy sự có mặt của các thành phần hoạt chất ent-kauran ditecpenoit

cần thu nhận ở tất cả các mẫu sau xử lý

3) Quy trình chung đã được áp dụng để xử lý 30 mẫu nguyên liệu tươi của cây khổ sâm Bắc Bộ được thu thập tại các vùng trồng cây khổ sâm Bắc Bộ khác nhau tại ba thời điểm trong năm

Theo quy trình của chúng tôi, các nghiên cứu phân tích được thực hiện trên các phần chiết MeOH Theo sự đánh giá của chúng tôi metanol có một số giá trị ưu việt: metanol là dung môi được sử dụng phổ biến trong sản xuất do

có giá thành thấp, độ chiết các ent-kauran ditecpenoit có hoạt tính sinh học

đạt cao, có tính phù hợp với các quy trình cần loại bỏ các chất màu gây cản trở trong quá trình sản xuất

Quy trình điều chế phần chiết metanol toàn phần cho phân tích từ lá và

từ cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ

3.1 Nguyên liệu thực vật

Nguyên liệu thực vật (lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ, Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) được xử lý ổn định theo một quy trình

chung (xem Mục 2, Phần 2.2) Các mẫu nguyên liệu khô đều được xay thành

bột mịn để dùng cho các nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit

3.2 Quy trình chung điều chế các phần chiết metanol toàn phần Chiết

xuất các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ

Trong bước chuẩn bị chiết xuất, các tế bào thực vật đã được chuẩn bị cho sự tiếp xúc với dung môi hữu cơ sau khi nguyên liệu khô (lá hoặc cành con) đã được chuyển thành dạng bột mịn Do độ phân cực của các hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit cũng như để hạn chế sự giải phóng các chất màu, chất

dễ bay hơi và sáp (dễ tan trong các dung môi ít phân cực) vào dịch chiết, và

do tính chất hóa học tương đối trơ của MeOH đối với các hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit mục tiêu ở điều kiện chiết xuất được lựa chọn (ngâm chiết ở nhiệt

độ phòng) và giá thành phù hợp cho các mục đích sản xuất lượng lớn, MeOH

đã được lựa chọn làm dung môi chiết Quá trình chiết rắn - lỏng các hoạt chất

thực hiện theo Sơ đồ 2 qua các bước sau

Quy trình chung chiết các mẫu thực vật từ cây khổ sâm Bắc Bộ

1 Ngâm chiết bột nguyên liệu khô (lá hoặc cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ) trong MeOH khan trong các bình Erlenmeyer 250 ml ở nhiệt độ phòng Khối lượng nguyên liệu được sử dụng cho mỗi lần ngâm chiết mẫu phân tích

là 50 g lá hoặc 10 g cành con

2 Sau khi ngâm chiết ba ngày, các dịch chiết MeOH được lọc hút chân không bằng phễu lọc Büchner

Lặp lại quy trình ngâm chiết và gộp các dịch chiết MeOH lại

Dùng MeOH tráng kỹ bã nguyên liệu sau mỗi lần ngâm chiết

3 Cất loại kiệt nhanh MeOH bằng thiết bị quay cô chân không dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 50 oC, thu được các phần chiết MeOH

4 Tiếp tục loại hết dung môi ở các phần chiết MeOH này bằng áp suất giảm trong 30 phút

Sơ đồ 2: Quy trình điều chế các phần chiết MeOH từ cây khổ sâm Bắc Bộ

bét nguyªn liÖu l¸ (cµnh con)

MeOH

dÞch chiÕt MeOH

2 lÇn (x 3 ngµy)

cÊt lo¹i MeOH

phÇn chiÕt MeOH

hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ các nguyên liệu thực vật khô

Quy trình phân tích TLC chung

1) Chuẩn bị dung dịch mẫu phân tích TLC (10 mg phần chiết MeOH /1 ml MeOH)

2) Phân tích TLC định tính: sử dụng bình triển khai TLC Sigma-Aldrich, bản mỏng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F254 (Merck, Germany),

chất chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (1 mg/1 ml

CH2Cl2), đưa mẫu lên bản mỏng: 20 µl cho mẫu phần chiết MeOH (10 mg/1

ml MeOH) và 5 µl cho mẫu chuẩn, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v), nhiệt độ triển khai TLC: nhiệt độ phòng, thuốc thử hiện màu: Dragendorff-Munier và vanilin/H2SO4 đặc 1%, phương pháp phân tích TLC định tính: so

sánh và co-TLC

3.3 Áp dụng quy trình ngâm chiết mẫu chung

Quy trình ngâm chiết mẫu chung nêu ở trên đã được áp dụng để chiết

30 mẫu nguyên liệu khô của cây khổ sâm Bắc Bộ bao gồm 15 mẫu lá và 15 mẫu cành con Các phần chiết đạt yêu cầu sử dụng cho phân tích; phân tích

TLC cho thấy các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit mục tiêu được chiết ra tốt

từ các nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ

3.4 Kết luận

1) Đã xây dựng được quy trình chiết thích hợp ở quy mô chiết mẫu phân tích với lượng mẫu thực vật thích hợp được lựa chọn là 50 g bột lá khô hoặc 10 g bột cành con khô của cây khổ sâm Bắc Bộ

2) Theo quy trình, mẫu thực vật được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở nhiệt độ phòng, mỗi lần trong ba ngày Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v) đã được áp dụng để

4 Chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-7

β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat và các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác từ lá

cây khổ sâm Bắc Bộ

Mục 4 có nhiệm vụ xây dựng quy trình thực nghiệm áp dụng cho lượng

nhỏ chất để chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn

7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) và các hoạt chất kauran ditecpenoit phụ khác

ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1α,7β

-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3) từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Các quy trình điều chế các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit đều bao

gồm các bước cơ bản sau:

1) Chuẩn bị nguyên liệu (phần chiết MeOH) cho sự phân bố hai pha lỏng;

2) Phân bố hai pha lỏng lần lượt giữa nước với các dung môi hữu cơ n-hexan

và diclometan: điều chế các phần chiết hữu cơ giàu các ent-kauran

ditecpenoit;

3) Sắc ký điều chế lượng nhỏ các ent-kauran ditecpenoit thô;

4) Sắc ký tinh chế các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit;

5) Kiểm tra các sản phẩm nhận được (TLC phân tích, HPLC phân tích, phổ

1H- NMR và phổ 13C-NMR)

Nguyên liệu thực vật là lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae) Lá cây được hong khô trong bóng râm rồi sấy ở

40oC, sau đó được xay thành bột mịn

4.2 Các quy trình chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-kauran

ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Yêu cầu đặt ra cho nhiệm vụ này là nghiên cứu quy trình phân lập các

hợp chất chuẩn cho phân tích bao gồm

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1), ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và

ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3)

Các quy trình này đều bao gồm các bước chung sau:

1 Ngâm chiết nguyên liệu bột lá khô của cây khổ sâm Bắc Bộ trong MeOH

khan ở nhiệt độ phòng (2 lần, mỗi lần trong ba ngày)

2 Sau mỗi lần ngâm chiết lọc tách lấy các dịch chiết MeOH Gộp các dịch chiết MeOH lại và cất loại kiệt nhanh MeOH bằng thiết bị quay cô chân không dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 50 oC để thu phần chiết MeOH

3 Phần chiết MeOH được hoà với nước cất rồi lần lượt chiết với các dung

môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan và diclometan) Cất loại kiệt dung môi

của các dịch chiết tương ứng dưới áp suất giảm bằng thiết bị quay cô chân

không, thu được các phần chiết n-hexan và diclometan

4 Gộp chung các phần chiết n-hexan và diclometan Tiến hành sắc ký cột

phần chiết gộp này trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa

giải gradient với n-hexan và các hệ dung môi EtOAc hoặc

n-hexan-axeton Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica

gel, n-hexan-EtOAc 3:1 hoặc n-hexan-axeton 3:1, v/v; thuốc hiện:

vanilin/H2SO4 đặc 1% hoặc Dragendorff-Munier) Các phân đoạn rửa giải

được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng thiết bị quay cô chân không ở nhiệt độ < 50 oC

Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô nhận được từ phân đoạn được rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 3:1 hoặc n-hexan-axeton

3:1, v/v

Các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác (ent-1α,14α-diaxetoxy-7β

-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1α,7β-diaxetoxy-14α

-hydroxykaur-16-en-15-on (3)) nhận được dưới dạng thô từ phân đoạn được rửa giải với hệ

dung môi n-hexan-EtOAc 1:1 hoặc n-hexan-axeton 1:1, v/v

Tiếp theo bước này các giai đoạn tinh chế sản phẩm có thể được thực hiện theo các quy trình A, B và C sau đây Điểm khác biệt giữa các quy trình tinh chế này là ở việc sử dụng các chất hấp phụ (silica gel, silica gel pha đảo (silica gel RP) và Sephadex LH-20) và do đó có các điều kiện sắc ký khác nhau

Qui trình A: Tinh chế trên chất hấp phụ silica gel

5 Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp

bằng sắc ký cột trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa giải

với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 3:1 (v/v), sau đó được kết tinh chậm trong cùng hệ dung môi cho ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) tinh

khiết ở dạng tinh thể hình kim không màu (phân tích TLC, HPLC và phổ 1NMR) Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica

H-gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v)

6 Các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác ở dạng thô được tinh chế

tiếp bằng sắc ký cột trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa

giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1 và 2:1 (v/v), sau đó được kết tinh

ditecpenoit phụ chuẩn khác

(ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-(ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (3)) ở dạng

bột vô định hình màu trắng (phân tích TLC, HPLC và phổ 1H-NMR) Kiểm

soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica gel,

n-hexan-EtOAc 3:1, v/v)

Do trong các yêu cầu phân tích hai hợp chất ent-kauran ditecpenoit 2 và

3 thường cần được phát hiện đồng thời nên cũng có thể sử dụng hỗn hợp của

hai chất này làm chất chuẩn mà không cần phải phân lập tinh khiết từng hợp chất riêng biệt

Quy trình B: Tinh chế trên chất hấp phụ Sephadex® LH-20

5 Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp

bằng sắc ký cột trên Sephadex® LH-20 (Pharmacia, Sweden), rửa giải với dung môi MeOH khan, sau đó được kết tinh chậm trong cùng hệ dung môi

cho ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat tinh khiết (phân tích TLC,

HPLC và phổ 1H-NMR) Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng

(TLC) (silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v)

Quy trình C: Tinh chế trên chất hấp phụ đảo pha silica gel RP-18 (ODS)

5 Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp

bằng sắc ký cột pha đảo trên ODS (octadecyl silica gel, YMC, Japan) hoặc silica gel RP-18 (Merck, Germany), rửa giải với hệ dung môi gradient MeOH-H2O 3:1 và 4:1, v/v, sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm

bằng thiết bị quay cô chân không cho

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat tinh khiết (phân tích TLC, HPLC và phổ 1H-NMR) Kiểm soát quá

trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1,

Sử dụng các phương pháp TLC, HPLC và 1H-NMR

1) Phân tích TLC (với dãy 5 nồng độ áp dụng khác nhau, ví dụ 5 µl, 10 µl,

15 µl, 20 µl và 25 µl - nồng độ hoà tan mẫu đầu 1 mg/ml), dùng các hệ dung

môi triển khai khác nhau như n-hexan-EtOAc 3:1 và n-hexan-axeton 3:1, v/v,

hiện màu với các thuốc hiện Dragendorff-Munier và vanilin/H2SO4 đặc 1%,

và soi đèn UV λ 254 nm

Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1): R f 0,36 (TLC, silica

gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v) và (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v),

hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff-Munier và màu tím hồng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%

Các chất 1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và

ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3): Rf 0,36 (TLC, EtOAc 3:1, v/v) và (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v), hiện màu trắng

n-hexan-với thuốc thử Dragendorff-Munier và màu xám n-hexan-với thuốc thử vanilin/H2SO4

đặc 1% (Chú ý: các chất 2 và 3 không phân giải được trên TLC và xuất hiện

ở dạng một vệt có chung giá trị Rf)

2) Phân tích HPLC với detectơ PDA (cột phân tích ODS 250 × 4.6 i.d mm,

cỡ hạt 5 µm, gradient, 20%-100% MeOH-H2O v/v (25 phút), MeOH (5 phút),

UV ở λ 210 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, nồng độ mẫu 10 mg/ml, thể tích bơm mẫu 10 µl) Các chất chuẩn 1, 2 và 3 đều có các chromophore giống nhau của nhóm cacbonyl và do đó có thể được phát hiện bằng detectơ UV được đặt ở các bước sóng λ 210 nm, 240 nm và 254 nm

Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) có thời gian lưu

khoảng 23,907 phút, HPLC-UV: 240 nm

khoảng 20,112 phút, HPLC-UV: 240 nm

Chất ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3) có thời gian lưu

khoảng 20,692 phút, HPLC-UV: 240 nm

Như vậy HPLC với chương trình gradient trên cho sự phân giải tốt của cả ba

hợp chất 1, 2 và 3, các pic đều có sự đối xứng Độ tinh khiết của các chất này

cũng có thể được kiểm tra bằng detectơ PDA

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1):

1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm) 0,84 (3H, s, H3-19), 1,14 (3H, d, J = 1,19 Hz,

H3-20), 3,10 (1H, m, H-13), 2,10 (3H, s, 18-OAc), 3,66 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18a), 3,87 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18b), 4,05 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,4 Hz, H-7), 5,29 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17a), 5,97 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17b)

O OH

H

1 2 3

7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17

18 19 20

1

(q, C-20), 27,7 (t, C-6), 27,9 (t, C-14), 32,8 (t, C-12), 35,4 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 37,6 (d, C-13), 38,9 (t, C-1), 39,6 (s, C-10), 46,3 (d, C-5), 51,8 (d, C-9), 58,3 (s, C-8), 70,8 (d, C-7), 72,3 (t, C-18), 115,0 (t, C-17), 149,2 (s, C-16), 171,2 (s)/21,1 (q) (18-OAc), 209,7 (s, C-15)

ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2):

1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm) 0,90 (3H, s, H3-19), 0,95 (3H, s, H3-18), 1,27 (3H, s, H3-20), 1,97 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 3,08 (1H, br s, H-13), 4,19 (1H, dt, J = 11,9 Hz, 4,6 Hz, H-7), 4,86 (1H, br s, H-1), 5,41 (1H, s, H-17a), 6,01 (1H, s, H-14), 6,18 (1H, s, H-17b)

13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm) 16,6 (t, C-11), 18,6 (q, C-20), 21,4 (q, C-19), 22,7 (t, C-2), 27,3 (t, C-6), 32,3 (t, C-12), 32,9 (s, C-4), 33,2 (q, C-18), 35,0 (t, C-3), 44,2 (d, C-13), 43,0 (s, C-10), 47,6 (d, C-5), 48,1 (d, C-9), 61,6 (s, C-8), 72,7 (t, C-1), 72,9 (d, C-7), 76,1 (d, C-14), 117,7 (t, C-17), 146,0 (s, C-16),

170,1 (s)/21,2 (q) (1-OAc), 170,6 (s)/21,4 (q) (14-OAc), 206,5 (s, C-15)

ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3):

O OH H

H

1 2 3

4 5 6 7

8 9 10

1112 13 14 15

16 17

18 19 20

2

OAc

OAc

O OAc H

H

1 2 3

7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 20

OAc

OH

(3H, s, H3-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,02 (3H, s, 7-OAc), 3,12 (1H, br s, 13), 4,86 (1H, br s, H-1), 4,89 (1H, s, H-14), 5,42 (1H, s, H-17a), 5,45 (1H,

H-dd, J = 12,4 Hz, 3,9 Hz, H-7β), 6,17 (1H, s, H-17b)

13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm) 16,6 (t, C-11), 18,5 (q, C-20), 21,2 (q, C-19), 22,6 (t, C-2), 25,0 (t, C-6), 31,0 (t, C-12), 32,9 (q, C-18), 33,0 (s, C-4), 34,9 (t, C-3), 42,3 (s, C-10), 45,7 (d, C-13), 46,9 (d, C-5), 46,99 (d, C-9), 60,9 (s, C-8), 72,7 (d, C-1), 74,3 (d, C-14), 75,9 (d, C-7), 118,3 (t, C-17), 146,7 (s, C-

16), 170,1(s)/21,2 (q) (1-OAc), 168,1 (s)/21,2 (q) (7-OAc), 205,0 (s, C-15)

4.3 Kết luận

1) Qua các thí nghiệm đã xây dựng được quy trình chiết tách và tinh chế thích

hợp các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ Các điều kiện thí nghiệm để phân lập lượng nhỏ các mẫu chuẩn ent-kauran

ditecpenoit từ nguyên liệu lá cây khổ sâm Bắc Bộ đã được xác định

2) Các điều kiện phân tích để xác định các hợp chất này như TLC phân tích, HPLC phân tích trên pha đảo và phổ NMR đã được đưa ra Độ sạch của chất

chuẩn 1 đạt > 98% (HPLC, NMR) Hỗn hợp của 2 và 3 nhận được với tỷ lệ 1:1 đạt độ sạch theo 2 và 3 là 100% (NMR)

5 Phân tích định tính và định lượng ent-7

β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat và xác định các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác

trong các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ bằng các phương pháp phân tích

Yêu cầu của phần này là nghiên cứu các phương pháp phân tích các

hoạt chất ent-kauran ditecpenoit có trong các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ Ngoài hoạt chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)

ra các ent-kauran ditecpenoit khác từ cây khổ sâm Bắc Bộ cần được phân tích

diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3) Sự có mặt của các ent-kauran

ditecpenoit này trong các hỗn hợp với chất 1 có thể được phân tích thuận lợi

bằng phổ 1H-NMR và bằng phương pháp HPLC; bên cạnh đó phương pháp TLC dễ thực hiện và cũng cho những thông tin hữu ích

5.1 Nghiên cứu phân tích định tính phần chiết metanol toàn phần bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) cho phép phân tích định tính nhanh các thành phần đặc trưng của một thuốc hoặc của một chế phẩm Các thông tin đảm bảo cho độ lặp lại của việc phân tích này là nguồn gốc thuốc, điều kiện chiết, điều kiện phân tích TLC, hệ dung môi sắc ký, nồng độ chất,

và phương pháp phát hiện [1, 2] Chất chuẩn được triển khai đồng thời với mẫu phân tích để nhận dạng hợp chất này trong mẫu phân tích

5.1.1 Dụng cụ phân tích TLC

1) Bình triển khai sắc ký lớp mỏng (Sigma-Aldrich)

2) Bản mỏng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F254 (Merck, Germany), 20 × 20 cm, 25 sheets, layer thickness: 200 µm

3) Bản mỏng phân giải cao HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany), 10 × 10 cm, 25 plates, layer thickness: 200 µm

4) Syringe Hamilton và plastic capillary để đưa mẫu lên bản mỏng

5) Dung môi phân tích khan: n-hexan, axeton, etyl axetat

6) Đèn UV (λ = 254 nm) (phương pháp hiện màu không phá hủy mẫu)

7) Bình phun thuốc hiện (CHLB Đức) và các thuốc hiện màu hoá học Dragendorff-Munier hoặc vanilin/H2SO4 đặc 1% (phương pháp hiện màu phá huỷ mẫu)

2) Kích thước bản mỏng hoạt động là 10 cm × 10 cm Vạch xuất phát cách mép dưới 1 cm và tuyến dung môi cách mép trên 0,3 cm Các vệt chất xuất phát cách nhau 1 cm

3) Chuẩn bị mẫu phân tích: Ngâm chiết 1 g bột mẫu khô (lá hoặc cành con

của cây khổ sâm Bắc Bộ) trong ba ngày trong MeOH ở nhiệt độ phòng Lọc dịch chiết nhận được và cất loại kiệt MeOH dưới áp suất giảm Hoà tan phần chiết MeOH (1 mg) trong MeOH khan (1 ml) Mẫu chất chuẩn được sử dụng

ở nồng độ 0,5 mg/ml

4) Tối ưu hoá hệ dung môi triển khai TLC (các hệ dung môi và tỷ lệ)

Dùng hệ dung môi triển khai: n-hexan-axeton 3:1 (hoặc n-hexan-EtOAc

3:1), v/v

5) Bão hoà dung môi ở nhiệt độ phòng (dung môi sắc ký được để trong bình

30 phút trước khi bắt đầu tiến hành sắc ký), và không bão hoà dung môi (dung môi sắc ký được đưa vào bình triển khai, xoáy mạnh đều xung quanh trong vài giây, sau đó để yên bình để cho sắc ký bắt đầu)

6) Đưa mẫu lên bản TLC: 5, 10 và 20 µl dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn (5 µl) được đưa lên bản TLC cách nhau từng khoảng 1 cm và cách mép dưới bản TLC 1 cm

7) Điều kiện triển khai:

nhiệt độ phòng

Sau đó để bản mỏng ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi và hiện màu với các thuốc hiện khác nhau

8) Hiện màu bản mỏng:

a) Phun thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1%

Điều chế thuốc hiện: pha 1 g vanilin trong 100 ml H2SO4 đặc (98%), phun

o

b) Phun thuốc hiện Dragendorff-Munier

Điều chế thuốc hiện: pha chế dung dịch gốc từ các dung dịch sau:

- dung dịch A: 17 g Bi(NO3)2 và 200 g axit tactric trong 800 ml nước cất

- dung dịch B: 160 g KI trong 400 ml nước cất

Trộn hai dung dịch A và B với nhau, thu được dung dịch gốc có màu da cam Dung dịch gốc này cần được bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng và

để lạnh Pha dung dịch gốc thành dung dịch thuốc thử để sử dụng như sau: 50

ml dung dịch gốc và 200 g axit tactric trong 400 ml nước cất (ghi màu sắc của vệt hiện trên sắc ký đồ TLC);

c) Soi đèn tử ngoại ở bước sóng λ 254 nm

9) Mô tả sắc ký đồ TLC:

Mô tả các giá trị Rf, màu sắc của các vệt chất và của chất chuẩn (TLC phân tích)

5.1.3 Các ví dụ phân tích TLC định tính các ent-kauran ditecpenoit từ lá

và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ

1) Phân tích TLC phần chiết MeOH từ lá và cành con

Thực hiện quy trình phân tích TLC nêu trên với 30 mẫu phân tích (15 mẫu phần chiết MeOH từ lá và 15 mẫu từ cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ được thu thập ở năm địa phương vào ba thời điểm trong năm, xem Bảng 1)

Phân tích TLC (xem Bảng 2) dễ dàng phát hiện sự có mặt của hoạt chất 1 trong các phần chiết MeOH do 1 cho màu đặc trưng với các thuốc hiện

Dragendorff-Munier (da cam) và vanilin/H2SO4 đặc 1% (tím hồng) Các hoạt

chất 2 và 3 có Rf trùng với của 1 và không có các màu đặc trưng với các thuốc

hiện Dragendorff-Munier (trắng) và vanilin/H2SO4 đặc 1% (xám), do đó khó phát hiện trực tiếp trong các mẫu phần chiết MeOH bằng các phân tích TLC

STT Ký hiệu mẫu Phát hiện các hoạt chất

29 MD-T2 1

Dưới đây là các sắc ký đồ được hiện màu với các thuốc hiện Dragendorff-Munier (Hình 2) và vanilin/H2SO4 đặc 1% (Hình 3) của một số mẫu phần chiết MeOH từ lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ Như đã nêu ở trên, do có màu đặc trưng với các thuốc hiện này nên sự có mặt của hợp

chất 1 trong các phần chiết MeOH dễ được phát hiện bằng phân tích TLC, trong khi các chất 2 và 3 trong các phần chiết này khó có thể được nhận biết bằng TLC Các vệt chất 1 được phát hiện tại Rf × 100 = 36 Cần lưu ý đến sự khác biệt giữa TLC profile của các mẫu phần chiết MeOH từ lá với của các mẫu phần chiết từ cành con

Hình 2: Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,

U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn

S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện Dragendorff-Munier,

chuẩn S1 hiện màu da cam, các chuẩn S2 và S3 hiện màu trắng)

Hình 3: Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,

U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn

S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện vanilin/H2 SO 4 đặc

1%, chuẩn S1 hiện màu tím, các chuẩn S2 và S3 hiện màu xám)

Sự so sánh các sắc ký đồ TLC ở Hình 2 với Hình 3 cho thấy thuốc hiện

Dragendorff-Munier là sự lựa chọn thích hợp để nhận biết hợp chất 1 trong

các phần chiết metanol từ các nguyên liệu thực vật Các tecpenoit nói chung nhạy với thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1%, do đó sắc ký đồ trở nên khó nhận dạng hơn; tuy nhiên sự vắng mặt các dải màu tím ở phía trên và phía dưới của

vệt chất 1 cũng đã cho phép ta nhận dạng hợp chất này

Các chất 1, 2 và 3 không hiện đèn UV ở bước sóng λ 254 nm (Hình 4)

Các sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH từ lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ được nêu tổng quát trong Bảng 3

Hình 4: Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,

U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn

S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng đèn UV ở λ 254 nm, các vệt

chất của S1, S2 và S3 không hiện màu với đèn UV)

Bảng 3: Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH từ lá và cành con

của cây khổ sâm Bắc Bộ

STT Rf × 100

Munier

Dragendorff-Vanilin/H 2 SO 4 đặc 1% Dragendorff-Munier

với MeOH và được cô kiệt dung môi dưới áp suất giảm Phần cặn nhận được được sử dụng cho phân tích TLC theo quy trình được nêu ở Mục 5.1.2 (xem

Hình 5)

Quy trình chung chiết pha rắn phần chiết MeOH:

1) Ổn định cartridge RP-18 bằng 1 ml H2O,

2) Chuẩn bị dung dịch mẫu trong 1 ml 20% MeOH-H2O,

3) Nạp dung dịch mẫu phân tích,

4) Rửa với 20% MeOH-H2O,

5) Rửa với 40% MeOH-H2O,

6) Rửa với 100% MeOH

Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH-SPE từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ được nêu tổng quát trong Bảng 4 Sắc ký đồ TLC này về cơ bản tương tự sắc ký đồ của phần chiết MeOH từ lá được nêu trong Bảng 3; tuy nhiên bớt được một số vệt chất phụ

Hình 5: Phân tích TLC các phần chiết MeOH-SPE và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L, U-L,

GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn S1 (1), S2 (2)

và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện Dragendorff-Munier, chuẩn S1 hiện màu

da cam, các chuẩn S2 và S3 hiện màu trắng)

Bảng 4: Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH-SPE

từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ STT Rf × 100 Dragendorff-Munier

MeOH của lá và cành con

Trong một thử nghiệm khác các ent-kauran ditecpenoit được làm giàu trong các phần chiết n-hexan và diclometan nhận được qua sự phân bố hai

pha lỏng phần chiết MeOH của lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ theo quy trình được nêu ở Mục 4.2 Với quy trình này các hợp chất phân cực sẽ được loại bỏ vào pha nước Mặc dù quy trình này không loại bỏ được

chlorophyll và sáp, các hệ dung môi chạy TLC hexaaxeton 3:1 hoặc

n-hexan-EtOAc 3:1 tạo được sự phân giải cao và phân tách tốt các hợp chất

lipoid khác ra khỏi hoạt chất 1, khiến cho hợp chất này có thể được nhận biết

dễ dàng bằng các thuốc hiện Dragendorff-Munier (Hình 6 và Hình 7) và vanilin/H2SO4 đặc 1% (Hình 8 và Hình 9) Sự có mặt của chlorophyll đã được

xác định là không gây cản trở cho việc phân tích TLC hoạt chất 1

Hình 6: Phân tích TLC phần chiết n-hexan và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L,

QO-L, U-QO-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất

chuẩn S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện

Dragendorff-Munier, chuẩn S1 hiện màu da cam, các chuẩn S2 và S3

hiện màu trắng)

Điểm đặc biệt là hoạt chất 1 cũng có thể được phát hiện dễ dàng trong

các phần chiết này bằng thuốc hiện vanilin/H2SO4 đặc 1% (xem Hình 8 và Hình 9)

Hình 7: Phân tích TLC phần chiết CH2Cl2 và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L,

QO-L, U-QO-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất

chuẩn S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện

Dragendorff-Munier, chuẩn S1 hiện màu da cam, các chuẩn S2 và S3

hiện màu trắng)

Hình 8: Phân tích TLC phần chiết n-hexan và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,

U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn

S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện vanilin/H2 SO 4 đặc

1%, chuẩn S1 hiện màu tím, các chuẩn S2 và S3 hiện màu xám)

Hình 9: Phân tích TLC phần chiết CH2Cl2 và các chất chuẩn

(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,

U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn

S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện vanilin/H2 SO 4 đặc

1%, chuẩn S1 hiện màu tím, các chuẩn S2 và S3 hiện màu xám)

Các sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết n-hexan từ lá và cành con của

cây khổ sâm Bắc Bộ được nêu tổng quát trong Bảng 5

Bảng 5: Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết n-hexan

từ lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ

từ lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ

STT Rf × 100

Dragendorff-Munier

Vanilin/H 2 SO 4 đặc 1%

Munier

1) Đã thực hiện việc chuẩn bị mẫu phân tích và tiến hành phân tích TLC với

30 mẫu phân tích bao gồm 15 mẫu phần chiết MeOH từ lá và 15 mẫu từ cành

con của cây khổ sâm Bắc Bộ được thu thập từ năm địa phương vào ba thời

điểm trong năm Phương pháp TLC phát hiện được tốt hoạt chất

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) và tỏ rõ tính đơn giản, hữu ích,

nhanh và chi phí thấp trong kiểm nghiệm thực tế Kết quả nghiên cứu cũng

cho thấy khả năng phân tích định tính hoạt chất 1 vẫn được đảm bảo khi sử

dụng chiều cao bản TLC hoạt động 10 cm hoặc 5 cm Thể tích đưa mẫu lên

bản mỏng là 20 µl cho mẫu phân tích (nồng độ: 1 mg phần chiết MeOH/1 ml

MeOH khan) và 5 µl cho mẫu chuẩn (nồng độ: 0,5 mg/ml) Thuốc thử thích

hợp để phát hiện hoạt chất 1 là Dragendorff-Munier (da cam) và

vanilin/H2SO4 đặc 1% (tím) Các thuốc hiện này cho các màu tương ứng là

trắng (Dragendorff-Munier) và xám (vanilin/H2SO4 đặc 1%) với các

ent-kauran ditecpenoit 2 và 3 Hệ dung môi axeton 3:1 hoặc

n-hexan-EtOAc 3:1 cho độ phân giải tốt và cho phép phát hiện trực tiếp hợp chất 1

trong phần chiết MeOH của nguyên liệu thực vật cũng như trong các phần

phần chiết MeOH đã được loại các hợp chất phân cực

2) Các thử nghiệm phân tích TLC so sánh được tiến hành với các phần chiết

n-hexan và diclometan nhận được từ phần chiết MeOH toàn phần của các

mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cũng như với phần chiết MeOH toàn phần đã được

xử lý bằng phương pháp chiết rắn pha đảo (RP-SPE) và với phần chiết MeOH toàn phần (không qua xử lý) đã cho thấy phần chiết MeOH toàn phần cũng đảm bảo tương đối đầy đủ các thông tin và độ phân giải cho phân tích định tính Thuốc hiện Dragendorff-Munier là thuốc thử ưu tiên cho phân tích

TLC định tính hợp chất 1

3) Sự hạn chế của quy trình phân tích TLC là khả năng phát hiện trực tiếp các

hợp chất ditecpenoit 2 và 3 thấp do sự chồng chập vệt chất với hợp chất 1

Tài liệu tham khảo

1 H Wagner, S Bladt, E M Zgainski, Plant drug analysis A thin layer chromatography atlas, Springer-Verlag, Berlin (1984)

2 X Q Liu, L L Du, W W Li, H F Guan, F Liu, Simutaneous qualitative

and quantitative analysis of commercial Bistorta rhizomes and its

differentiation from closely related herbs using TLC and HPLC-DAD

fingerprinting, Chem Pharm Bull., 56, 75-78 (2008)

3 K Ravikanth, M Thakur, B Singh, M Saxena, TLC based method for

standadization of Pongamia pinnata (Karanj) using Karanjin as marker,

Chromatographia, 69, 597-599 (2009)

toàn phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC là một phương pháp rất hữu ích trong phân tích định tính và định lượng thành phần hoạt chất của dược liệu [1], [2], [3], [4]

Dưới các điều kiện thực nghiệm được nghiên cứu chuẩn hóa, các ent-kauran

ditecpenoit trong cây khổ sâm Bắc bộ được phân tích thuận lợi bằng phương pháp HPLC

5.2.1 Thiết bị HPLC phân tích

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 series HPLC-DAD (Agilent Technology, USA) bao gồm bơm G1311A, đetectơ G1315B Diode Array Detector (DAD), manual sampler 7725i và loop mẫu 20

µl Phân tích được thực hiện trên cột sắc ký Lichrospher RP-18 (cỡ hạt 5 µm, 4,0 mm × 250 mm) (Agilent Technology) và cột bảo vệ C18 (cỡ hạt 5 µm, 4,6

mm × 7,5 mm) (Agilent Technology) DAD được đặt ở các bước sóng λ 210

nm, 240 nm, 254 nm và 360 nm Kiểm soát hệ thống sắc ký và xử lý số liệu được thực hiện với phần mềm Chemstations

Dung môi MeOH (HPLC, Merck, Germany), nước cất hai lần

5.2.2 Điều kiện phân tích HPLC

Chế độ chạy HPLC gradient:

Pha động chạy gradient từ 20% đến 100% MeOH trong 25 phút, sau đó 100% MeOH trong 10 phút Pha động đã được lựa chọn tối ưu qua thử nghiệm phân tích các tỷ lệ khác nhau của hệ dung môi MeOH-H2O với chất

chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) và dịch chiết lá

MeOH của cây khổ sâm Bắc Bộ; hệ gradient 20-100% MeOH-H2O cho đường nền ổn định, sự phân giải tốt và tính đối xứng của các pic

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Nồng độ mẫu đo: 10 mg/ml với các mẫu phần chiết MeOH

- Nồng độ mẫu chuẩn (1): 1 mg/ml (MeOH)

- Lọc các dung dịch mẫu phân tích qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm mẫu vào cột sắc ký

a) Khảo sát độ lặp lại trong ngày

Phần trăm diện tích pic HPLC và thời gian lưu cho dung dịch mẫu

chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (20 µg/ml) được

tiêm lặp lại 6 lần trong cùng một ngày

Lập Bảng 7 về kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày của hệ thống và tính các độ lệch chuẩn tương đối (RSD) cho thời gian lưu và diện tích pic (λ

Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày cho thấy hệ thống sắc ký có RSD của thời gian lưu (0,205) và diện tích pic (1,877) < 2% đáp ứng yêu cầu phân tích

Các sắc ký đồ HPLC khảo sát độ lặp lại trong ngày được đưa ra trong phần Phụ lục (Phụ lục 1: Khảo sát độ lặp lại trong ngày của hệ thống sắc ký)

b) Khảo sát độ lặp lại khác ngày

Phần trăm diện tích pic HPLC và thời gian lưu cho dung dịch mẫu

chuẩn 1 (20 µg/ml) được tiêm lặp lại 2 lần trong cùng một ngày và quy trình

phân tích được lặp lại trong 3 ngày liên tiếp

Lập Bảng 8 về kết quả khảo sát độ lặp lại khác ngày của hệ thống và tính các độ lệch chuẩn tương đối (RSD) cho thời gian lưu và diện tích pic (λ

của thời gian lưu (0,052) và diện tích pic (0,809) < 2% đáp ứng yêu cầu phân tích

Các sắc ký đồ HPLC khảo sát độ lặp lại khác ngày được đưa ra trong phần Phụ lục (Phụ lục 2: Khảo sát độ lặp lại khác ngày của hệ thống sắc ký)

5.2.4 Đánh giá sự phù hợp của phương pháp định lượng

a) Khảo sát độ tuyến tính

Độ tuyến tính được xác định giữa nồng độ và diện tích pic với các dung

dịch mẫu chuẩn 1 ở các nồng độ 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml và 500 µg/ml (Bảng 9: Khảo sát độ tuyến tính) Mỗi nồng độ mẫu chất 1 được bơm

hai lần và diện tích pic được lấy giá trị trung bình

Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic (λ 210 nm) đã được xác định bằng phương trình hồi quy: y = mx + b, trong đó: y là diện tích

pic, x là nồng độ của mẫu chuẩn 1 theo µg/ml, m = 70,30449 và b =

806,63608

Giá trị hệ số tương quan r2 = 0,998 cho thấy sự tuyến tính của nồng độ

và diện tích pic trong khoảng nồng độ 50 đến 500 µg/ml

Bảng 9: Khảo sát độ tuyến tính STT Nồng độ mẫu chuẩn 1 Diện tích pic

của mẫu chuẩn 1 được xây dựng trên Hình 10

Hình 10: Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của mẫu chuẩn 1

Các sắc ký đồ HPLC của việc khảo sát độ tuyến tính được đưa ra trong phần Phụ lục (Phụ lục 3: Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng)

b) Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được xác định dựa trên dãy

các nồng độ pha loãng của dung dịch mẫu chuẩn 1 thấp nhất (10 µg/ml) Giới

hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định là lượng

hợp chất cần thiết để tạo ra một tín hiệu (S) ít nhất lớn gấp ba lần (S/N = 3) hoặc mười lần (S/N = 10) tín hiệu nhiễu nền (N) Các giá trị LOD và LOQ đã

được xác định là 8,79 µg/ml và 29,01 µg/ml cho mẫu chuẩn 1

Các sắc ký đồ HPLC của việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được đưa ra trong phần Phụ lục (Phụ lục 4: Xác định các giới hạn định lượng LOD và LOQ)

Amount [ug/ml]

Area

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

1 2 3

4

PTS, DAD1 A

Correlation: 0.99777 Rel Res% (1): -7.424

Area = 70.3044937*Amt +806.63608

Điều chế phần chiết metanol:

Cân một lượng m g (khoảng 3 g) mẫu bột lá khô của cây khổ sâm Bắc

Bộ vào bình định mức 50 ml Thêm 50 ml metanol HPLC khan và chiết bột lá

trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Lọc tách lấy phần dịch lọc và phần bã được

chiết tiếp với 50 ml metanol HPLC khan trong 24 giờ Gộp các dịch lọc

metanol (lần 1 và lần 2), làm bay hơi dung môi đến mức còn 10 ml và lọc

dịch chiết qua màng lọc HPLC 0,45 µm (Agilent) cho phân tích HPLC

Quy trình được lặp lại cho 3 mẫu lá (M i , i = 1, 2 và 3)

Chuẩn bị dung dịch phân tích:

Đưa dung dịch lọc chính xác về mức 10 ml bằng metanol HPLC để tạo

dung dịch phân tích (dung dịch M) Thực hiện thí nghiệm với 3 mẫu ngâm

chiết (M1, M2 và M3)

Phân tích định lượng:

Phân tích HPLC 3 lần cho một mẫu ngâm chiết (M i) ở bước sóng phát

hiện λ 210 nm Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính để xác định nồng độ