Nghiên cứu virus cúm a h5n1 ở việt nam và thái lan dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống

Virus cúm A/H5N1 là một phân type chủng trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, loại hình phân type kháng nguyên Hemagglutinin HA là H5 và Neuraminidase NA là N1 trên bề mặt ca

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam

và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán

và vaccine phòng chống

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Thanh Hòa

ThS NCS Đoàn Thị Thanh Hương

9191

Hà Nội, 2011

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam

và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán

và vaccine phòng chống

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Thanh Hòa

ThS NCS Đoàn Thị Thanh Hương

Hà Nội, 2011

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:

ƒ Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí thực hiện

ƒ Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Kế hoạch tài chính - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ̣

ƒ Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học

ƒ Phòng virus học - Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan (BIOTEC)

ƒ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học

ƒ Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ sinh học

ƒ Trại sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế - Viện Công nghệ sinh học

ƒ Các đơn vị trong Viện Công nghệ sinh học đã hợp tác, giúp đỡ để hoàn thành đề tài

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Lê Thanh Hòa

TS Đoàn Thị Thanh Hương

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký

ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate

HI Hemagglutination Inhibition Phản ứng ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao

LB Luria-Bertani medium Môi trường LB

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Phân tích di truyền tiến hoá phân tử

NEP Nuclear Export Protein Nuclear Export Protein

NS Non-structural protein Protein không cấu trúc

PA Polymerase acidic protein Protein PA

PB1 Polymerase basic protein 1 Protein PB1

PB2 Polymerase basic protein 2 Protein PB2

Số tháng làm việc

Và một số người khác

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn……… i

Danh mục các từ viết tắt……… ii

Danh sách cán bộ tham gia thực hiện đề tài……… iv

Mục lục……… v

Danh mục bảng……… viii

Danh mục hình……… ix

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Bệnh cúm và virus cúm A/H5N1……… 4

1.2 Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam……… 7

1.2.1.Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam……… 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu virus H5N1 và biện pháp phòng chống………… 8

1.3 Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao 9

1.4 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 12

1.5 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) 13

1.6 Sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 14

1.7 Vaccine và biện pháp phòng chống dịch cúm A/H5N1 16

1.8 Tổng quan về virus Newcastle……… 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 19

2.1 Nguyên liệu……… 19

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 20

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 20

2.2.2 Hóa chất……… 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 21

2 3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1………… 21

2.3.1.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 21

2.3.1.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR……… 23

2.3.1.3 Phương pháp chuyển đổi cDNA……… 23

2.3.1.4 Phương pháp thôi gen và tinh sạh sản phẩm thôi gen……… 24

2.3.1.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen……… 25

2.3.1.6 Phương pháp giải trình trình tự ……… 26

2.3.1.7 Phương pháp xử lý số liệu……… 27

2.3.2 Phương pháp tạo kháng nguyên HA1 tái tổ hợp sử dụng cho chẩn đoán 27 2.3.2.1 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ……… 28

2.3.2.2 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp……… 28

2.3.2.3 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 29 2.3.2.4 Phương pháp tinh chế HA 1……… 29

2.3.2.5 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên ……… 30

2.3.2.6 Phương pháp kiểm tra độ sạch của protein HA 1 ……… 31

2.3.3 Phương pháp tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 ……… 31

2.3.3.1 Phương pháp thu nhận hệ gen virus Newcastle chủng LaSoTa……… 32

2.3.3.2 Phương pháp thiết kế plasmid vector ……… 32

2.3.3.3 Phương pháp gắn gen H5 (cúm A/H5N1) vào plasmid vector 33

2.3.3.4 Phương pháp nuôi cấy giống vaccine LaSoTa tái tổ hợp 33

2.3.3.5 Phương pháp kiểm tra đáp ứng miễn dịch với 34

2.3.3.6 Phương pháp thực hiện phản ứng HA và HI 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 37

3.1 Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1……… 37

3.1.1 Kết quả thu nhận gen H5 và N1 37

3.1.2 Kết quả lưu giữ gen H5 vào plasmid……… 39

3.1.3 Kết quả lưu giữ gen N1 vào plasmid……… 41

3.1.4 Kết quả giải mã hệ gen đại diện virus cúm A/H5N1 ……… 42

3.1.5 Kết quả phân tích gen H5 và so sánh với các chủng của thế giới……… 42

3.1.6 Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc ……… 51

3.2.1 Kết quả thu nhận gen HA1 và dòng hóa vào vector pET22trx………… 56

3.2.2 Kết quả biểu hiện gen HA1 trong tế bào E Coli……… 59

3.2.3 Kết quả tinh chế TrxHa1 và nghiên cứu khả năng nhận biết TrxHA1 …. 61 3.2.4 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên……… 62

3.2.5 Kết quả tạo kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) …… 62

3.2.4.1 Kết quả tạo kit ELISA……… 62

3.2.5.2 Thử nghiệm kit ELISA 65

3.3 Kết quả nghiên cứu sản xuất vaccine LaSoTa TTH gắn gen H5… 68 3.3.1 Kết quả thiết kế plasmid vector chứa hệ gen virus LaSoTa (pLST)…… 68

3.3.1 1 Nguyên liệu và phương pháp tạo plasmid vector LaSoTa……… 68

3.3.1.2 Kết quả thu nhận phân đoạn gen F1 và chuyển nạp vào vector……… 69

3.3.1.3 Kết quả thu nhận đoạn gen F2 và chuyển nạp vào vector tách dòng…. 71 3.3.1.4 Kết quả thu nhận plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ hệ gen chủng virus vaccine LaSoTa……… 71

3.3.2 Kết quả lắp ghép virus LaSoTa TTH mang gen H5 virus cúm A/H5N1 73 3.3.3 Kết quả kiểm tra giống virus tái tổ hợp……… 73

3.3.3.1 Bố trí thí nghiệm 73

3.3.3.2 Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp của giống virus vaccine ……… 74

3.3.3.3 Kết quả kiểm tra an toàn, vô trùng của giống virus vaccine ……… 76

3.3.3.4 Kiểm tra tính ổn định của giống vaccine tái tổ hợp ……… 77

3.3.3.5 Kết quả kiểm tra virus vaccine LaSoTa tái tổ hợp chứa gen H5 ……… 77

3.3.4 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của giống virus vaccine tái tổ hợp 78 3.3.4.1 Bố trí thí nghiệm ……… 78

3.3.4.2 Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 … 79 3.3.4.3 Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle……… 80

KẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ VIỆT NAM-THÁI LAN……… 81

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 85

PHỤ LỤC……… 90

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

được phân lập và giải trình tự………

Bảng 3.1: Danh sách các biến chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và

thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh………

43

Bảng 3.2: Các vị trí nucleotide sai khác trong gen H5 giữa 14 chủng của

Việt Nam và 18 chủng của thế giới………

45

giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của virus cúm A/H5N1………

75

M

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1a Virus cúm với các yếu tố kháng nguyên H và N, lớp màng bao

(envelop), protein liên kết (matrix protein M1), ribonucleoprotein (RNP)…

4

Hình 1.1b Influenza A virus, loại virus gây bệnh cúm gia cầm……… 4

Hình 1.2 Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A……… 5

Hình 1.3 Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A……… 6

Hình 1.4 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á 11 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A 22

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát qui trình chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp HA1 28

Hình 3.1: Điện di sản phẩm RT-PCR gen H5 38

Hình 3.2 Điện di sản phẩm RT-PCR gen N1 ……… 39

Hình 3.3 Kết quả tách dòng gen H5 các chủng ……… 40

Hình 3.4 Kết quả tách dòng gen N1 của các chủng ……… 41

Hình 3.6 Trình tự amino acid của chuỗi polypeptide H5……… 48

Hình 3.7 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ……… 52

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu nhận gen HA1………… 57

Hình 39 Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp……… 58

Hình 3.10 Phân tích sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pCRha1 58

Hình 3.11 Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid táo tổ hợp (pET22Trxha1)   59

Hình 3.12 Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E coli BL21 60

Hình 3.13 Xác định hàm lượng protein tái tổ hợp 60

Hình 3.14 Xác định độ sạch của protein HA1 61

Hình 3.15 Phân tích khả năng liên kết giữa kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng viurs H5N1

62 Hình 3.16 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thiết kế vector chứa toàn bộ hệ gen 69

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasimd tái tổ hợp 70

Hình 318 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen N2.1và N2.2 71

Hình 3.19 Phương pháp gắn gen HA của virus H5N1 vào plasmid 72

Hình 3.20 Kết quả điện di kiểm tra gen H5 của virus tái tổ hợp 73

Hình 3.21 Hình ảnh ấp trứng và tiếp truyền virus tái tổ hợp 74

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR mẫu virus LaSoTa TTH 77

Hình 3.23 Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 80

Hình 3.24 Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle 80

MỞ ĐẦU

Từ cuối năm 2003 cho đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực (HPAI) cao gây dịch cúm gia cầm (còn gọi là dịch cúm A/H5N1) bùng phát ở nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam Dịch bệnh liên tục tái phát hàng năm, lây lan nhanh chóng và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia ở các châu lục trên thế giới Việt Nam là một trong các nước có số người nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 cao nhất trong khu

vực và trên thế giới, được WHO xác định là một trong các quốc gia “tiêu điểm”, có

thể xảy ra dịch cúm mới ở người cần đặc biệt quan tâm khống chế

Virus cúm A/H5N1 là một phân type (chủng) trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, loại hình phân type kháng nguyên Hemagglutinin (HA) là H5 và Neuraminidase (NA) là N1 trên bề mặt capsid của hạt virus hoàn chỉnh, có độc lực cao gây bệnh dịch nặng nề ở gia cầm và gây được bệnh cúm nặng trên người HA

và NA là hai protein vỏ có vai trò quan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễm, độc lực gây bệnh của virus trên vật chủ Trong đó, protein HA được mã hoá bởi gen

HA (phân đoạn 4) trong hệ gen virus cúm A, có vai trò khởi động quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm thụ của động vật cảm nhiễm, thông qua sự kết hợp

HA với thụ thể đặc hiệu của nó có trên bề mặt màng của các tế bào này, và do đó

quyết định khả năng thích ứng xâm nhiễm của virus cúm A ở các loài vật chủ Đoạn

bệnh của virus cúm A/H5N1 Bên cạnh đó, HA còn là một protein kháng nguyên của virus, có ý nghĩa quan trọng kích thích cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus, tham gia vào phản ứng trung hòa virus, và do đó được coi là đích chủ yếu của bảo hộ miễn dịch bảo vệ cơ thể nhiễm Sử dụng các vaccine phòng cúm

là nhằm vô hiệu hóa vai trò của HA(H5) trong quá trình lây nhiễm của A/H5N1, qua đó phòng chống dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm, và ngăn chặn đại dịch cúm trên người

Virus cúm A/H5N1 luôn có sự biến đổi hệ gen Sự tích lũy các đột biến điểm

nội gen (antigenic drift) , hoặc trao đổi các gen (antigenic shift) của virus A/H5N1

với các chủng virus cúm A đã thích nghi lây nhiễm trên người trong quá trình lây

truyền tự nhiên, hình thành virus cúm gây đại dịch ở người, như các chủng: A/H1N1; A/H2N2 và A/H3N1 gây ra trong lịch sử

Đặc điểm biến đổi thành phần nucleotide và acid amin của gen H5 cho phép phân tích mối quan hệ tiến hoá và phân type, xác định tương đồng kháng nguyên-miễn dịch và phân định nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 Do đó, phân tích, giám sát chặt chẽ gen H5 và hệ gen virus cúm A/H5N1 là thực sự cần thiết, nhằm tìm hiểu những đặc điểm biến đổi về các đặc tính phân tử gen H5, và ảnh hưởng của những biến đổi đó đến tương quan kháng nguyên-miễn dịch, qua đó

dự báo sớm và chính xác về dịch tễ học phân tử, giúp định hướng sử dụng và sản xuất vaccine phòng cúm cho gia cầm, cũng như cho người

Có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu bao gồm cả vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và

di truyền ngược Tuy nhiên các loại vaccine này vẫn có những nhược điểm khó khắc phục như giá thành cao, khó bảo quản và khó sử dụng (đưa vaccine vào cơ thể bằng đường tiêm) Do vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản hơn và dễ sử dụng để có thể sử dụng đại trà Virus Newcastle (NDV) là virus có vai trò dịch tễ học quan trọng ở gia cầm, là loại có hệ gen đơn sợi RNA, không phân đoạn, không khép kín, nên trở thành đối tượng lý tưởng tạo vector cho vaccine đa dụng Trong số các chủng tự nhiên của NDV, LaSoTa là chủng hoàn toàn vô độc, có khả năng kích thích miễn dịch niêm mạc, rất thuận lợi cho việc thiết kế vector sử dụng cho ăn/uống/khí dung

Từ sự cấp thiết của tình hình hiện nay và trên cơ sở một số thành công trong việc tạo vaccine thế hệ mới, được sự phê duyệt của Bộ Khoa học và Công nghệ, chúng tôi hợp tác với Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia

Thái Lan (BIOTEC) thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống”

Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 qua giải mã gen kháng nguyên H5 và N1 của các chủng virus phân lập tại Việt Nam

3 Nghiên cứu tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của cúm A/H5N1

Nội dung nghiên cứu:

1 Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1

- Thu thập mẫu bệnh phẩm cúm A/H5N1 tại các vùng khác nhau của Việt Nam

- Lưu giữ gen HA (H5) và gen NA (N1) trong plasmid

- Nghiên cứu dịch tễ học phân tử qua phân tích, so sánh với các chủng của thế giới

tính kháng nguyên của virus)

- Tạo protein HA1 tái tổ hợp cho mục đích chẩn đoán

3 Tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của cúm A/H5N1

- Thu nhận toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa

- Thiết kế plasmid vector tái tổ hợp mang toàn bộ hệ gen virus LaSoTa

- Gắn gen HA (H5) của chủng virus cúm A/H5N1 DkNA-114 phân lập tại Việt Nam thuộc dòng Phúc Kiến vào plasmid vector LaSoTa Chuyển nạp vào vector biểu hiện

- Đồng nhiễm vào tế bào biểu hiện BHK-21

- Tiếp truyền giống virus tái tổ hợp nhiều đời trên phôi trứng gà 10 ngày tuổi để nhân giống virus tái tổ hợp

- Thử nghiệm đáp ứng miễn dịch của virus tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH CÚM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1

nay, cúm H5N1- phân type virus cúm nguy hiểm nhất hiện nay đã lan truyền trên 40 quốc gia ở Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi Chủng này mới xuất hiện gần đây, nhưng là một loại subtype có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996-2005 Theo tổng kết của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam

là nước có số người mắc bệnh và tử vong cao nhất trong số 8 nước có dịch xảy ra ở châu Á

Hình 1.1a Virus cúm với các yếu tố

vi điện từ truyền qua)

Virus cúm A/H5N1 chính thức được công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003, đã nhanh chóng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn trong cả nước Đây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra, chưa có một cơ sở nghiên cứu nào ở nước ta tiến hành nghiên cứu một cách sâu sắc nên đã có sự lúng túng trong việc phòng chống cũng như dập tắt các ổ dịch Chỉ trong một thời gian ngắn, dịch cúm gia cầm

đã bùng phát tại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu con gia cầm bị

Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại (Basic Taxomomy) (Murphy and Webster, 1996)

Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80-120 nanomet (nm), đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng

250 triệu Dalton (Da) Phân tích thành phần hoá học một virion có chứa khoảng 1,1% RNA; 70-75% là protein; 20-24% lipid và 5-8% là carbonhydrate (Murphy, 1996)

0,8-Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm: vỏ (capsid), màng bao ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn đối mã (sợi đơn âm – negative single strand) (Murphy and Webster, 1996) (Hình 1.3)

Hình 1.2 Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A (Lê Thanh Hòa, 2006)

(A: Ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử truyền qua B: Mô hình

cấu tạo hạt virus cúm A Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân

tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: Hệ gen virus)

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hoá gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô

ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10-14 nm có đường kính 4-6 nm, đó

là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein (GP) gồm:

HA, NA, M (matrix antigen) và các dấu ấn khác của virus (Murphy and Webster,

1996; Bender, 1999) Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỉ

lệ khoảng 4HA/1NA), đây là hai protein kháng nguyên vỏ có vai trò quan trọng

trong quá trình xâm nhiễm vật chủ của virus (Murphy and Webster, 1996; Wagner,

Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-)

ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS) nối với

Năm phân lập

Số hiệu chủng Năm phân lập Phân type

HA và NA

A/VN/1194/2004(H5N1) B

Hình 1.3 Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A (WHO, 2004)

(A: Phân lập ở các loài động vật; B: Phân lập trên người)

Nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type (subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính protein kháng nguyên bề mặt (HA và NA) của chúng, cho đáp ứng kháng thể khác nhau giữa các chủng virus

và 9 phân type NA đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lý thuyết, có thể tạo ra hơn 144 chủng virus khác nhau (Webster, 1998, WHO, 2004)

Tổ chức Y tế thế giới đã qui định thống nhất danh pháp lưu trữ hệ gen của các chủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ liệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype/Loài động vật bị nhiễm/Vùng địa lí phân lập/Số hiệu đăng kí chủng

dụ: A/Chicken/VietNam/TY31/05(H5N1) Đối với các virus được phân lập trên

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Virus cúm A/H5N1 chính thức được công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003, đã nhanh chóng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn trong cả nước Đây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra, chưa có một cơ sở nghiên cứu nào ở nước ta tiến hành nghiên cứu một cách sâu sắc nên đã có sự lúng túng trong việc phòng chống cũng như dập tắt các ổ dịch Chỉ trong một thời gian ngắn, dịch cúm gia cầm

đã bùng phát tại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu con gia cầm bị tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế quốc dân

Dịch cúm gia cầm xảy ra từ tháng 12/2003 đến cuối năm 2005, được chia thành các đợt như sau:

Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến tháng 30/3/2004: xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng dịch đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ hơn 57,5 triệu con

Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4-11/2004: dịch bệnh cúm gà tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 Tổng số gia cầm tiêu hủy ở giai đoạn này là 84 ngàn con Trong đợt này có 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong

Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch xảy ra trên

36 tỉnh thành trong cả nước (15 tỉnh phía Bắc và 21 tỉnh phía Nam), những tỉnh bị dịch bệnh nặng là Long An, Tiền Giang, Bạc Liêu, Đồng Tháp Số gia cầm bị tiêu huỷ là 1.846 triệu con (gồm: 470 ngàn gà, 825 ngàn thuỷ cầm và 551 ngàn chim cút) Đánh giá thiệt hại trong các đợt dịch cúm gia cầm ở Việt Nam đã làm thiệt hại khoảng 3.000 tỷ đồng, trong đó thiệt hại trực tiếp do gia cầm bị chết và tiêu huỷ là 1.800 tỷ đồng

Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005, tuy thiệt hại không lớn nhưng gây sự hoang mang trong cộng đồng dân cư là dịch cúm vẫn còn dai dẳng xảy ra

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người bị nhiễm cúm gia cầm từ năm 2003 đến 09/08/2011 thì toàn thế giới đã có 519 trường hợp người mắc cúm A subtype H5N1, trong đó có 306 trường hợp đã tử vong, riêng Việt Nam có

119 người mắc, trong đó có 59 người tử vong

Cho đến nay chỉ có hai biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 được xem là loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ hợp phân type H7N7 gây đại dịch cúm gà ở châu Âu và H5N1 ở châu Á Tuy nhiên, không phải tất

cả các chủng chứa H5 và H7 đều gây bệnh và chính bản thân H7N7 hoặc H5N1 cũng tồn tại nhiều biến chủng vô độc hoặc độc lực thấp H5N1 mới xuất hiện gần đây ở các nước châu Á là một phân type có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch

Tháng 6/2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố đại dịch cúm do virus type A/H1N1 trên toàn thế giới

1.2.2 Tình hình nghiên cứu virus H5N1 và biện pháp phòng chống bệnh tại Việt Nam

khoa học công nghệ đã đặc biệt quan tâm đến bệnh mới phát sinh này Bộ Chính trị

đã ban hành Chỉ thị số 35-CT/TW, ngày 06-02-2004 về triển khai các biện pháp cấp

bách ngăn chặn dịch cúm gia cầm và cúm A (H5N1) trên người Ý thức được tầm

quan trọng và mức độ nguy hiểm của bệnh, ngay từ những ngày đầu tiên xuất hiện bệnh , các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học, Viện Paster thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Thú y đã giải mã các gen quan trọng, quyết định tính gây bệnh cho người và gia cầm là HA (H5), NA (N1), NP và một số gen quan trọng khác của một số chủng virus H5N1 lây nhiễm ở gia cầm Các trình

tự gen này đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank) Trên cơ sở phân tích gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả đã khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với của Thái

al., 2004; Muramoto et al., 2006a; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; Lê Thanh Hòa et

al., 2005; Lê Trần Bình et al., 2006) Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về gen học và quan hệ phân tử với các nhóm trong vùng và thế giới, kết quả đã khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (Viết tắt: Vietnam-Thailan-Malaysia) có những đặc tính

2004; Chen et al., 2006; Hulse-Post et al., 2007)

Để có thể đáp ứng nhanh nhu cầu về vaccine cúm gia cầm, ngoài việc tiếp tục những nghiên cứu về vaccine tái tổ hợp trên cơ sở các tiểu đơn vị và vaccine DNA, ngày 3 tháng 11 năm 2005 Viện Công nghệ Sinh học đã hoàn tất các thủ tục

và tiến hành tiếp nhận chủng virus sản xuất vaccine NIBRG-14 từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học, Vương Quốc Anh Đây là chủng virus được tạo bằng công nghệ di truyền ngược, tái tổ hợp trên cơ sở các gen của chủng gốc PR8/34 với các gen HA (đã bị đột biến mất 4 amino acid RRRL và đột biến thay thế

3 axit amin tại vùng gây độc) và NA có nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân

Tổ chức Y tế thế giới công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các chủng dùng cho sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay Các chủng này cũng được nhiều nước như Trung Quốc, Hungary, Brazil sử dụng để sản xuất vaccine cho gia cầm Một số nước đã sử dụng chủng này để sản xuất vaccine cho người

Theo sự khuyến cáo của WHO, Viện Công nghệ sinh học đã sử dụng chủng NIBRG-14 để nhân virus trên phôi gà và kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của một giống virus Viện cũng đã phối hợp với Bộ NN&PTNT và một số cơ quan xây dựng và triển khai đề án sản xuất vaccine cúm gia cầm A/H5N1 bằng chủng virus vaccine NIBRG-14

1.3 Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm A/H5N1

cầm được coi là chủng cổ điển Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm

1996 virus H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) đây là chủng đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm vừa

qua (Xu et al, 1999) Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA(H5) cho quá trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997, và nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông

NA(N1) trong cấu trúc của gen đã có hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19

amino acid, tại vùng đầu N của protein neuraminidase, và đột biến “xóa gen” của N1

có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người (Matrosovich et al., 1999)

số 18 người bị nhiễm, do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus

đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng

ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới

chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade ) có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong những năm 2001 - 2002 Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột biến mới do hậu quả của

hiện tượng ”lệch” kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên biến chủng có tính gây

độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập

Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2001,

lực cao và H5N2, H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm

clade 1 thuộc phân dòng Quảng Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003

(Jadhao et al., 2009) Tiến hóa chủng/type và dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát

từ các tỉnh ở Nam Trung Quốc (Smith, 2006 ; Wang et al., 2008)

Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện

về đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và

người trong các năm 2004 - 2005 (Smith et al., 2006) Tuy nhiên, xét về di truyền

học phân tử và tính kháng nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông (Chen, 2009) và bắt đầu phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.4)

Hình 1.4 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á Các mũi tên

chỉ sự lan truyền của virus theo các năm (Nguồn : Duan et al., 2008)

Cuối năm 2005, ngoài phân dòng Quảng Đông còn có nhiều subtype (phân dòng) của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện của phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng

Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan (Li và cs, 2011; Smith và cs, 2006), tràn sang

Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không

thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm

cắt protease là (-RRRK-) đã giảm mất một Lysine (K) so với các chủng thuộc phân

kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong đó có

ra không ác liệt như những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở nên phức tạp hơn (Zhao et al., 2008; Gambotto et al., 2008)

1.4 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam

Kể từ khi cúm gia cầm type A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông

A, B, C, D, E, X(X0-X3), V, Y, W, Z(Z+) và G

Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E), nhưng lại tiến hóa xuất hiện 8 genotype của H5N1 (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) (Macken et al., 2006) Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là bằng chứng

chủng virus H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004-2006, thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G, nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt Nam và nhóm S

type virus phổ biến nhất lưu hành trong khu vực châu Á từ năm 2003 Đặc điểm của

protease) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus Đến 2007, Việt Nam

đã tồn tại 9 nhóm di truyền kí hiệu VN1 – VN9 được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành genotype (Wan et al., 2008)

Các nhóm kháng nguyên và nhóm di truyền đó là : clade 3 (VN1, năm 2001); clade 5 (VN2, năm 2003 ; clade 1 (VN3 năm 2003 - 2007); clade 2.3.2 (VN4 năm 2005; clade 0 (VN5 năm 2005); clade 2.3.4 (VN6 năm 2007); clade 2.3.4 (VN7, năm 2007); clade 2.3.4 (VN8, năm 2007) ; clade 2.3.4 (VN9, năm 2007), clade 7 thuộc

et al., 2008; Nguyen et al., 2009; Davis et al., 2010)

trao đổi nguồn gen trong quá trình tiến hoá; một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau

đó không phát hiện được; số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 có nguồn gốc từ Thanh Hải - Trung Quốc hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng biến đổi khác nhau

1.5 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1

Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng

nhiều đến đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh cho người và clade 2 cũng đã phát triển thành các nhóm khác nhau trên cơ sở thay đổi

hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao thuộc

mà do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành Phân nhánh 1.1 có nguồn gốc tứ clade 1 trước đây Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được phát hiện từ chim hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông

Hiện nay, clade 1.1 thay thế cho clade 1 giai đoạn 2004-2005 ở hầu hết các tỉnh thành xuất hiện cúm gia cầm A/H5N1 Trong năm 2011, clade 2.3.2.1 đã được

phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên hải miền Trung thay thế

vùng đồng bằng sông Cửu Long vẫn lưu hành chủ yếu clade 1

Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1 Clade 1.1 đã được phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam; ở gia cầm và người tại

tích đặc điểm di truyền của gen HA đã chỉ ra là, đến thời điểm hiện nay, tại Việt Nam, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam và clade 2.3.2 và phân nhánh

gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm và cộng đồng và

là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vacxin hiện nay không có đáp ứng miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011 Kết quả thí nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể gây chết 60 – 70% vịt) (http://www.cucthuy.gov.vn/)

Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người Tuy nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây bệnh trên người Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích hợp Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền từ gia cầm sang người

1.6 SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A/H5N1

Hệ gen virus cúm A là ARN sợi đơn âm ((-)ssARN), gồm 8 phân đoạn gen

riêng biệt, mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp

theo trật tư: PB2, PB1 (PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và

virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10

nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi ARN duy nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo

từng chủng virus cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus

HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập vật liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp để giải phóng virus từ các tế bào cảm thụ Các glycoprotein HA và NA quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng type virus khác nhau và cũng là vị trí để các loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vacxin Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến

tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections) Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ

cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vacxin vô hoạt cho gia cầm

Để khắc phục điều này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vacxin H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse gentics) Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch

nhưng không gây bệnh Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi

1.7 VACCINE VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG DỊCH CÚM A/H5N1

Do đặc điểm hệ gen của virus cúm A/H5N1 luôn biến đổi cũng như rất khó khống chế nguồn tàng trữ và lây lan bệnh từ chim di cư và thuỷ cầm, nên dịch cúm gia cầm hàng năm đều diễn biến rất phức tạp và khó lường Đối với H5N1, ngoài các biện pháp phòng chống dịch một cách tiên quyết như tiêu độc, xử lý gà bệnh, thanh lý gà nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm, tìm kiếm và sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn lây lan sang người

Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu, trong đó có vaccine bất hoạt (inactivated vaccine) và vaccine nhược độc (attenuated vaccine) được tạo ra bằng các phương pháp truyền thống và hiện đại, sử dụng cho uống, tiêm hoặc qua đường

được tạo ra bằng các phương pháp thông thường trong khi đó nhóm vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược Có thể liệt kê một số vaccine như sau: vaccine dưới nhóm chứa protein HA và NA (subunit vaccine); vaccine niêm mạc split chứa protein HA sử dụng qua đường hô hấp (split vaccine); vaccine vô hoạt chứa toàn bộ hạt virion; vaccine tái tổ hợp gen kháng nguyên có vector dẫn truyền (vectoral vaccine); vaccine DNA chứa gen HA hay/hoặc NA (DNA vaccine); vaccine di truyền ngược (rg-vaccine) Nhiều loại vaccine virus cúm A cần được bất hoạt để đảm bảo an toàn và đều cần có chất bổ

2005)

Tuy đã có nhiều loại vaccine được sản xuất nhưng các nhà khoa học trên thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu và phát triển thêm các loại vaccine mới tiên tiến hơn, hiệu quả hơn và dễ sử dụng hơn Trong các loại vaccine thì vaccine cho uống là loại vaccine dễ sử dụng nhất nên có thể áp dụng rộng rãi

1.8 TỔNG QUAN VỀ VIRUS NEWCASTLE VÀ VAI TRÒ TRONG CHIẾN LƯỢC TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI

Vaccine thiết kế dựa trên vector virus tái tổ hợp (recombinant virus-based vectoral vaccine) có vai trò quan trọng trong phát triển vaccine thế hệ mới, khả năng biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật trên đối tượng hưởng vaccine Một số vector có khả năng kích thích miễn dịch niêm mạc huy động được tất cả các loại hình miễn dịch phòng chống bệnh Vaccine cho động vật đã có trên

50 năm nghiên cứu chủ yếu bằng phương pháp truyền thống Những tiến bộ về công nghệ DNA tái tổ hợp đã tạo nên bước nhảy vọt trong thiết kế vaccine sử dụng trong lĩnh vực thú y Phát hiện và khám phá khả năng dùng virus đơn giản làm vector và phát triển công nghệ “di truyền ngược” (reverse genetics) để tái tổ hợp và lắp ráp virus mới, đã giải quyết một số bước có tính quyết định táo bạo tạo vaccine thế hệ mới Virus Newcastle (NDV) là virus có vai trò dịch tễ học quan trọng ở gia cầm, là loại có hệ gen đơn sợi RNA, không phân đoạn, không khép kín, nên trở thành đối tượng lý tưởng tạo vector cho vaccine lưỡng dụng Trong số các chủng tự nhiên của NDV, LaSoTa là chủng hoàn toàn vô độc, có khả năng kích thích miễn dịch niêm mạc, rất thuận lợi cho việc thiết kế vector sử dụng cho ăn/uống/khí dung

Việc sử dụng vector virus đã đem lại lợi ích sinh miễn dịch với các kháng nguyên ngoại lai được biểu hiện tự nhiên trong phạm vi của tế bào nhiễm, do gây ra các đáp ứng miễn dịch tế bào cũng như đáp ứng miễn dịch dịch thể Vì vậy, các vector vaccine virus tái tổ hợp hứa hẹn nhiều triển vọng phát triển trong tương lai Trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm hiện nay, bệnh do virus ở gia cầm gây thiệt hại nặng nề Trong công nghệ vector sử dụng virus gia cầm, các loại virus herpes của gà tây, virus gây bệnh Marek’s, virus adeno và các thành viên trong họ

gia cầm đã được chứng minh Tuy nhiên, việc ứng dụng vẫn cần được kiểm chứng lại những đặc tính cùng với các yếu tố được quan tâm chủ yếu như: tính an toàn,

NDV được sử dụng làm vector cho kiến tạo vaccine thế hệ mới đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng Những đặc tính cơ bản của NDV cho

thấy NDV tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein ngoại lai tốt, sẽ trở thành vaccine

có hiệu quả NDV có thể nhân lên đến hàm lượng rất cao trong rất nhiều dòng tế bào và trứng và khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể rất mạnh trong cơ thể

NDV tự nhiên lây nhiễm qua đường hô hấp và qua bề mặt biểu mô nhày hệ thống tiêu hoá, vì vậy, loại virus này đặc biệt cần thiết cho việc loại bỏ các kháng nguyên bảo vệ của các tác nhân gây ra bệnh lý hô hấp Thêm vào đó, các vaccine NDV sống đã được sử dụng rộng rãi tại Mỹ và hầu hết các nước khác Các vaccine dựa trên NDV sống tái tổ hợp cũng có những thuận lợi hơn so với các vector vaccine tái tổ hợp khác Trước tiên, protein ngoại lai chỉ được biểu hiện cùng với một vài protein NDV không làm nhiễu đáp ứng miễn dịch Trái lại, vector virus herpes và một số virus kích thước lớn khác, nếu làm vector, ngoài biểu hiện protein kháng nguyên đích, còn có một lượng lớn các protein của chính vector được tổng hợp Yêu cầu cơ bản của vector là chỉ biểu hiện ít protein vector chủ, tập trung biểu hiên protein kháng nguyên đích Do vậy, NDV đáp ứng yêu cầu này Thứ hai, NDV nhân lên trong tế bào chất của các tế bào nhiễm bỏ qua pha chuyển thành DNA, không có sự nạp gen của hệ gen virus vào trong DNA của tế bào chủ

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

- Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm dùng trong nghiên cứu là chất thẩm dịch (exudate) và niêm mạc của hầu họng - khí - phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1 thu thập từ gia cầm bị bệnh (gà, ngan, vịt), đã được vô hoạt bằng nhiệt độ,

trực tiếp để tách chiết RNA tổng số Mẫu bệnh phẩm được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu là 14 mẫu virus cúm A/H5N1 đại diện tại một số địa phương trong cả nước (Bảng 2.1)

- Mẫu vaccine: Là virus Newcastle chủng vaccine LaSoTa được thu nhận từ vaccine nhược độc đang được sử dụng rộng rãi tại Thái Lan, được xác định có tỷ lệ tương đồng trên 99% so với các chủng của Việt Nam và thế giới

- Trứng gà SPF và trứng gà sạch mầm bệnh:

Trứng gà sạch các tác nhân gây bệnh đặc chủng (Specific Pathogen Free) được nhập từ Công ty Lohmann (CHLB Đức) có chứng chỉ kiểm định sạch 18 loại virus,

các vi khuẩn chi Salmonella, Mycobacterium avium và Mycoplasmosis Trứng SPF

chủ yếu dùng để sản xuất giống cấp 1 và dùng làm đối chứng âm trong kiểm tra tính miễn dịch tồn lưu trong trứng và phôi

Trứng dùng cho sản xuất vaccine thành phẩm phải được kiểm tra sạch H5N1,

Newcastle và Salmonella, được sản xuất bởi những đàn gà trong các trại gà tập

trung, có theo dõi dịch bệnh Tiêu chuẩn sạch là trứng được kiểm tra sạch virus/kháng thể H5N1 và Newcastle Trứng gà sạch do Trung tâm giống gia cầm Thụy Phương cung cấp

- Gà thí nghiệm: Gà một ngày tuổi sạch H5N1 và Newcastle, được nuôi và tiêm phòng bệnh theo qui trình chăn nuôi công nghiệp hiện hành Xác định độ sạch của gà về kháng thể và virus trước khi gây bệnh thực nghiệm Lấy máu để xác định kháng thể kháng virus cúm H5N1 và swab (ổ nhớp và họng) để xác định độ sạch về mặt virus cúm type A bằng phương pháp realtime RT-PCR (RRT-PCR)

Bảng 2.1: Danh sách 14 chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu đã được phân lập và giải trình tự

2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Máy PCR (máy PTC-100) của MJ Research Inc

- Máy ly tâm lạnh

- Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin - DOC (Wealtec- Mỹ)

- Bộ điện di DNA (Bio-Rad)

- Máy lắc có điều nhiệt, máy khuấy từ, máy vortex, lò vi sóng Samsung, box laminair vô trùng, tủ lạnh -20oC và -80oC (SANYO-Nhật Bản)

- Tủ ấm 370C

- Bộ pipetman (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), đầu côn các loại, đĩa Petri,

lọ đựng môi trường, và ống nuôi vi khuẩn

7 CkTV98-08 A/Chicken/VN/TV98/2008(H5N1) 2008 Kiên Giang

8 DkNA72-07 A/Duck/Vietnam/NA72/2007(H5N1) 2007 QL Nghê An

- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA do hãng Fermentas cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIONEER cung cấp

- Bộ kit dùng để tách DNA từ thạch agarose ”MinElute Gel Extraction Kit” do hãng QIAGEN cung cấp

- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp

- Kháng sinh kanamycin, ampicilin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối

- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng QIAGEN cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1

Từ khuôn RNA tổng số tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm của gia cầm mắc bệnh tại các địa phương từ năm 2004 - 2011, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu để thu nhận các gen quan trọng là gen HA (H5) và gen NA (N1), lưu giữ trong plasmid và giải trình trình tự Từ đó, truy cập Ngân hàng gen, so sánh đối chiếu và phân tích với các chủng của thế giới, nhằm tìm hiểu đặc tính sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của các chủng virus cúm gây bệnh tại Việt Nam (Hình 2.1)

2.3.1.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chứa virus bao gồm RNA của hệ gen virus cúm gà và RNA của tế bào Chúng tôi sử dụng bộ hoá chất

QIAamp Viral RNA kit để tách chiết RNA tổng số theo các bước sau:

Bước 1: Lấy 560 µl AVL/carrier RNA vào ống Eppendorf

Bước 2: Thêm 140 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm, trộn đều trên máy vortex 15 giây,

để ở nhiệt độ phòng 10 phút

Bước 3: Thêm 560 µl cồn tuyệt đối, votex 15 giây

Bước 4: Chuyển 630 µl hỗn dịch trên sang cột có màng lọc (QIAamp Mini Spin column), ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch phía dưới cột

Bước 5: Lặp lại bước 4 với 630 µl hỗn dịch còn lại

Bước 6: Sau khi ly tâm, thêm 500 µl đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A/H5N1phân lập tại Việt Nam.

RNA tổng số

Chuyển cDNA

Phản ứng RT-PCR Phản ứng PCR

Giải trình tự Chuỗi DNA ( đã xử lý)

Tìm kiếm/ so sánh/ tìm cấu trúc gen Chuỗi DNA sản phẩm (cuối cùng)

Phân tích xử lý chuỗi gen

So sánh đối chiếu

Lập phả hệ

2.3.1.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR

Các đoạn gen nghiên cứu được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR một bước

(QIAGEN) với chu trình nhiệt và cặp mồi đặc hiệu

Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’->3’)

Độ dài (bp)

Vị trí bám trong gen

Độ dài của sản phẩm thu được

GEN HA (H5) (HEMAGGLUTININ) H5F1 ACATACTGGAAAGGACACACAACG 24 168-191

H5BAMF CCGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT

(Đầu 5’ gen H5 có BamHI)

9+27 19-34 H5NOTR

ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAAT

TCTGCATTGTAACGA

(Cuối 3’ gen N1 có NotI) 16+27 1708-1735

H5NOTR:

H5BAMF-1733 bp (chứa toàn bộ gen H5) GEN NA (N1) (NEURAMINIDASE)

N1R3 CTACTTGTCAATGGTGAATGG 21 1427-1448 Cuối gen N1

N1ECOF CCGGAATTCAAAATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATT

(Đầu 5’ gen N1 có EcoRI) 9+33 23-65

N1NOTR ATAAGAATGCGGCCGCTCACTACTTGTCAATGGTGAATGGCAA

(Cuối 3’ gen N1 có NotI) 9+33 1422-1445

N1NOTR:

N1ECOF-1370bp (chứa toàn bộ gen N1)

2.3.1.3 Phương pháp chuyển đổi cDNA

Để thu nhận toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa nghiên cứu, chúng tôi sử

dụng phương pháp chuyển đổi RNA thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi xác

suất hexamer Tiếp theo đó, sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu để

nhân các vùng gen mong muốn

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA trong nghiên cứu

RiboLock TM Rnase Inhibitor (20U/µl) 0,5 µl

Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl) 1 µl

TỔNG: 20 µl

hecxamer do Fermentas cung cấp, đó là hỗn hợp đơn đoạn các đoạn oligonucleotide

có 6 nucleotide bất kỳ, có khả năng bám xác suất vào sợi DNA đối xứng bổ sung với tần suất cao để tổng hợp kế tiếp nhau chuỗi nucleotide tạo nên hai sợi DNA là sản phẩm cDNA của toàn bộ hệ gen Quá trình chuyển đổi được thực hiện trong một giờ

được trình bày ở bảng 2.3

2.3.1.4 Phương pháp thôi gen và tinh sạh sản phẩm thôi gen

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% và cắt lấy băng quan tâm Sau

(Bioneer):

- Cân gel theo quy ước : 1 mg tương đương với 1 µl

- Bố sung dịch GB theo tỉ lệ : Vmãu : VGB = 1 : 5 (µl)

- Ủ ở 60oC trong 10 phút, 2 phút mix nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 2 phút cho gel tan hoàn toàn

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

- Bổ sung 500 µl GB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

- Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

- Thêm 500 µl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại

bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết

dung dịch WB

- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml

- Hòa tan DNA trong 30 - 50 µl nước khử ion, khử trùng hoặc dung dịch EL,

để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút Thu lấy phần dịch

2.3.1.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen

- Phương pháp ghép nối gen

Sau khi có sản phẩm RT-PCR của toàn bộ gen HA và NA, cần phải đưa đoạn

gen đó gài vào trong một vector dẫn truyền (plasmid mang DNA) để có thể nhân lên

một lượng lớn số lượng bản sao DNA plasmid (DNA tái tổ hợp) Các DNA plasmid

sẽ được dùng để giải trình trình tự và lưu giữ nguồn gen

Các phản ứng ghép nối được thực hiện với thành phần như sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Đoạn gen cần nối (~200 ng) 0,5 – 4

Đệm 1 Nước cât đề ion khử trùng Thêm nước đển thể tích bằng 5

Vector 1 Tổng thể tích 6

nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5 α-T1 (Invitrogen)

- Chuyển nạp vào tế bào

- Lấy 3 µl sản phẩm phản ứng nối (ligation) nói trên cho vào 50-100 µl tế bào khả

biến E coli DH5α-T1 (108-109 tế bào/ml)

- Ủ trong đá trong 45 phút Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây,

- Ngay lập tức ủ lại vào đá trong 2 phút

giờ

Sản phẩm chuyển nạp được trải đều trên đĩa thạch LB-agar 1,5% có bổ sung

từ 18-20 giờ (qua đêm)

- Chọn lọc DNA tái tổ hợp

Sau 18-20 giờ, các đĩa thạch sẽ được lấy ra để chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp Chọn các khuẩn lạc có màu trắng vì đó là khuẩn lạc của các vi khuẩn có khả năng mang plasmid tái tổ hợp Nuôi cấy các khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin hoặc ampicilin, các ống nuôi cấy

(qua đêm) để các tế bào sinh trưởng và nhân lên tạo nhiều bản sao mang vector tái

tổ hợp

- Tách chiết DNA tái tổ hợp

DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep Kit của hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tiếp theo được

kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI

Nếu điện di cho kết quả tương ứng với độ dài của sản phẩm PCR, thì DNA vector tái tổ hợp này được thu nhận và sẽ được tiến hành giải trình trình tự

2.3.1.6 Phương pháp giải trình trình tự

Giải trình tự (DNA sequencing) là quá trình thu nhận và xác lập trình tự nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu Nguyên lý của phương pháp giải trình tự là dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mạch đơn, gắn nucleotide vào vị trí 3’-OH tự do, nếu đó là nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại

Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí

cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên Kết quả là tạo ra các đoạn

DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide, sau khi phân tích sẽ cho một dãy có độ dài vài trăm nucleotide

Mồi dùng để giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp được dùng nhiều nhất là M13F và M13R, gồm:

- Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ hoặc

- Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’

Sản phẩm của phản ứng đọc trình tự trong nghiên cứu của chúng tôi được tinh sạch, đông khô và gửi đọc trình tự trên máy tự động ABI-3100 Avant Gentic Analyzer (Mỹ) có tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự

Neighbour-Joining, với hệ số kiểm định (bootstrap) là 1000 bootstrap (Tamura et al.,

Đối với virus cúm A/H5N1, protein hemagglutinin (HA) là kháng nguyên bề

mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của

nguyên, kích thích cơ thể sản sinh đáp ứng miễn dịch để trung hoà virus Chính vì

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát qui trình chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp HA1 của virus cúm H5N1 và kiểm tra tính kháng nguyên của HA 1 tạo ra

2.3.2.1 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện

trình tự của enzym hạn chế NcoI và BamHI Sản phẩm PCR được nối trực tiếp vào

vector tách dòng pCR2.1 Trong vector tách dòng, chúng tôi tiến hành kiểm tra và

giải trình tự gen Sau đó gen HA 1 được cắt bằng hai enzyme hạn chế trên và đưa vào vector biểu hiện pET22trx để tạo thành vector pET22trxha1 Protein thioredoxin mã

hoá từ gen trx giúp cho protein tái tổ hợp biểu hiện ổn định hơn và cuộn xoắn chính

xác hơn, hạn chế lỗi trong quá trình cuộn xoắn Plasmid pET22trxha1 được biến nạp

vào tế bào E coli BL21 để biểu hiện gen

2.3.2.2 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp

Một khuẩn lạc E coli tái tổ hợp được nuôi cấy trong 2 ml LB lỏng có bổ

pCR2.1

3,9 KbKan Amp pUC ori

Plac LacZF1ori

Kan

Amp pUC ori Plac

LacI

ori(3684) Amp f1 ori T7t Histag

pET22Trx

5,9 Kb

T7t Histag trxA T7p

LacI

ori(3684) Amp f1 ori

Xho I Not I Hind III Bam HI Nco I Xba I

Cắt thu gen ha1

Đưa gen vào pCR2.1

Nguồn gen ha1

Đưa gen vào vector biểu hiện

Lên men sản xuất HA1 Tinh chế HA1

Kiểm tra tính đặc hiệu của HA1

pCR2.1

3,9 KbKan Amp pUC ori

Plac LacZF1ori

Kan

Amp pUC ori Plac

LacI

ori(3684) Amp f1 ori T7t Histag

pET22Trx

5,9 Kb

T7t Histag trxA T7p

LacI

ori(3684) Amp f1 ori

Xho I Not I Hind III Bam HI Nco I Xba I

Cắt thu gen ha1

Đưa gen vào pCR2.1

Nguồn gen ha1

Đưa gen vào vector biểu hiện

Lên men sản xuất HA1 Tinh chế HA1

Kiểm tra tính đặc hiệu của HA1

40 µl dịch nuôi cấy sang 100 ml LBA, lắc tiếp trong 2 giờ ở 37oC cho đến khi đạt

được thu lại bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Tế bào được hòa vào

2.3.2.3 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide: được thực hiện theo

phương pháp của Laemmli (Laemmli, 1970)

Các dung dịch gốc: acrylamide 30%; Tris 1,5 M, pH 8,8; Tris 0,5 M pH 6,8; SDS 10%; APS (Ammonium persulfate) 10%; TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) nguyên chất; đệm chạy điện di Tris-Glycine pH 8,3 (0,05

M Tris.Cl, 0,192 M glycine, 0,1% SDS); dung dịch đệm tra mẫu 5X (0,125 M Tris.Cl

pH 8; 4% SDS; 20% glycerol; 0,02% bromophenol blue; 1/10 (v/v) mecaptoethanol); dung dịch nhuộm gel (0,025% (w/v) Coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid); dung dịch rửa gel 1 (30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid); dung dịch rửa 2 (1-2% glycerol, 35% ethanol)

trên đá và tiến hành điện di Điện di được tiến hành trên bộ điện di chuẩn của hãng Bio-Rad Gel 4% acrylamide (0,125 M Tris, pH 6,8) được sử dụng để cô mẫu, gel 12,6% acrylamide (0,375 M Tris, pH 8,8) được sử dụng để phân tách protein theo khối lượng phân tử Gel được nhuộm với dung dịch nhuộm trong khoảng 30 phút đến 1 giờ và được rửa bằng dung dịch rửa gel 1 trong 2 giờ Để loại bỏ triệt để vết màu trên gel, gel được ngâm trong dung dịch rửa 2 khoảng 2 giờ

2.3.2.4 Phương pháp tinh chế HA1

TrxHA1 tái tổ hợp được thiết kế gắn thêm một đoạn trình tự gồm 6 histidine,

vì thế protein tái tổ hợp dễ dàng được tinh sạch bằng cột sắt ký ái lực Dịch tế bào thu được sau khi nuôi cấy cảm ứng bằng IPTG được bổ sung lyzozyme 1 mg/ml và

mẫu tế bào đã ly giải đến pH khoảng 10 nhằm tạo môi trường tối ưu cho quá trình

siêu âm Do 90% TrxHA1 được tổng hợp trong E coli ở dạng không tan (inclusion