NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT CỦA CÁC DẪN XUẤT VITAMIN K3 VỚI AMYLOID BETA PEPTID VÀ ĐÁM RỐI CỦA CHÚNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP DOCKING VÀ PHƢƠNG PHÁP MM-PBSA

MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Năm 1901, lần đầu tiên bác sĩ tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer trình bày một trường hợp của bệnh nhân tên Auguste D, 50 tuổi, bị mất trí. [55] Năm năm sau (1906), ông đã chính thức công bố về căn bệnh này như căn bệnh gây thoái hóa và gây tử vong nhưng không chữa được nó. Từ năm 1906 căn bệnh này được đặt theo tên ông. Những thập kỷ đầu thế kỷ 20, chữ "bệnh Alzheimer" thường chỉ dùng để định bệnh cho những người mất trí tuổi 45 đến 65 ("bị lẫn trước khi già", "lẫn sớm"). Những người lớn tuổi hơn mà bị mất trí được coi như là chuyện thông thường, do tuổi cao làm não bộ tê cứng. Nhưng trong những năm 1970 – 1985 khoa học nhận thấy người mất trí ở các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau, nên kết luận AD có ở nhiều lứa tuổi. [17] Bệnh AD thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi, dạng AD sớm hơn 45 tuổi thường không phổ biến. [17] Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc AD trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc AD trên thế giới sẽ là 1 người/85 người vào năm 2050. Mặc dù các ca bệnh AD có đặc điểm riêng biệt đối với mỗi cá nhân, tuy nhiên có nhiều triệu chứng tương đồng xuất hiện sớm. Khi quan sát thường nhầm lẫn với các bệnh “liên quan đến tuổi già”, hoặc biểu hiện của stress. [100] Trong giai đoạn đầu, triệu chứng phổ biến nhất được công nhận là không có khả năng để nhớ được việc vừa xảy ra. Khi nghi ngờ mắc bệnh AD, chẩn đoán thường được thực hiện bằng cách đánh giá hành vi và kiểm tra nhận thức, có thể kèm theo chụp cắt lớp não

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT CỦA CÁC DẪN XUẤT VITAMIN K3

VỚI AMYLOID BETA PEPTID VÀ ĐÁM RỐI CỦA CHÚNG BẰNG

PHƯƠNG PHÁP DOCKING VÀ PHƯƠNG PHÁP MM-PBSA

LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT CỦA CÁC DẪN XUẤT VITAMIN K3 VỚI AMYLOID BETA PEPTID VÀ ĐÁM RỐI CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING VÀ PHƯƠNG PHÁP MM-PBSA

Chuyên ngành: Vật Lí Lý thuyết – Vật Lí Toán

Mã số: 604401

LUẬN VĂN THẠC SĨ: VẬT LÍ LÝ THUYẾT - VẬT LÍ TOÁN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TSKH MAI XUÂN LÝ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ Vật lý lí thuyết – Vật lý toán có tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT CỦA CÁC DẪN XUẤT VITAMIN K3 VỚI

AMYLOID BETA PEPTID VÀ ĐÁM RỐI CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING VÀ PHƯƠNG PHÁP MM-PBSA” là công trình nghiên cứu

của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của GS TSKH Mai Xuân Lý và sự cộng tác của một số người như trong nội dung luận văn có trình bày chi tiết Các kết quả và số liệu thu được trong luận văn là hoàn toàn trung thực

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2012

Trần Văn Thảo Học viên cao học khóa 19

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh sách các ký hiệu và các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN 5 1.1 Một số nghiên cứu về AD 5

1.2 Nguyên nhân AD 7

1.3 Cấu trúc sợi amyloid beta 8

1.4 Cơ chế hình các sợi amyloid beta và mảng amyloid 9

1.5 Vitamin K (VK) và các dẫn xuất Vitamin K3 (VK3) đối với bệnh AD 11

1.6 Giới thiệu Curcumin 13

1.7 Các phương pháp nghiên cứu 14

1.7.1 Phương pháp docking 14

1.7.2 Phương pháp động lực học phân tử 19

1.7.3 Phương pháp MM – PBSA 22

1.7.4 Các phương pháp thực nghiệm 24

1.8 Phần mềm sử dụng 25

1.9 Các đại lượng dùng phân tích kết quả 26

1.9.1 Hệ số tương quan 26

1.9.2 Liên kết hydro và liên kết nhánh phụ 26

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.1 Phối tử 28

2.1.1 Các dẫn xuất VK3 28

2.1.2 Curcumin 29

2.2 Mục tiêu gắn kết 29

2.2.1 Cấu trúc đơn của Aβ42 và Aβ40 trong môi trường nước- micelle 29

2.2.2 Cấu trúc đơn của Aβ40 trong nước 30

2.2.3 Cấu trúc sợi nhị xứng 12Aβ 9-40 và tam xứng 18Aβ 9-40 32

2.2.4 Cấu trúc sợi nhị xứng 5Aβ17-42 32

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 34 3.1 So sánh năng lượng liên kết các mục tiêu gắn kết khác nhau 34

3.2 So sánh về năng lượng liên kết giữa các dẫn xuất VK3 37

3.3 Vùng gắn kết của các mục tiêu gắn kết 38

3.4 Tương quan về năng lượng liên kết của curcumin và dẫn

xuất VK3 40

3.4.1 So sánh Curcumin và các dẫn xuất VK3 40 3.4.2 Tương quan năng lượng liên kết giữa Curcumin và các

dẫn xuất VK3 43

3.5 Liên kết Hydro không đóng vai trò quyết định khả năng liên kết 44

3.6 Năng lượng tự do liên kết của VK3-9 và VK3-10 thu được từ

phương pháp MM-PBSA 47 3.7 So sánh kết quả lý thuyết và thực nghiệm 51

3.7.1 VK3-9 có khả năng chống lại độc tính gây ra bởi Aβ40 tốt

nhất 51 3.7.2 Khả năng ức chế sự kết tập của các dẫn xuất VK3 52 3.7.3 Các dẫn xuất VK3 làm suy yếu sự sinh ra gốc tự do bắt

nguồn từ Aβ40 54

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APP: Gen sản xuất protein tiền chất amyloid

APOE4: Apolipoprotein E4, một yếu tố nguy cơ di truyền của bệnh

Alzheimer N-APP: Một đoạn ở phía đầu amine của protein APP

DR6: Một thụ thể thần kinh gọi là thụ thể chết 6

AFM: Atomic force microscope - Kính hiển vi lực nguyên tử

TEM: Transmission electron microscopy – Kính hiển vi điện tử truyền

qua MRI: Magnetic resonance imaging - hình ảnh chụp cộng hưởng Từ

Aβ40-1BA4: PDB ID của Monomer Amyloid beta 40 trong môi trường micelle Aβ42-1Z0Q: PDB ID của Monomer Amyloid beta 42 trong môi trường micelle WT-Aβ40: Cấu trúc của Monomer Amyloid beta 40 trong môi trường nước

12Aβ9-40: Cấu trúc sợi trưởng thành (mature fibril) nhị xứng của 12 đoạn

9-40 của Aβ9-40 18Aβ9-40: Cấu trúc sợi trưởng thành tam xứng của 18 đoạn 9-40 của Aβ40 5Aβ17-42: Cấu trúc sợi trưởng thành (mature fibril) của 5 đoạn 17-42 của

Aβ42 NMR: Nuclear magnetic resonance – cộng hưởng từ hạt nhân

ASN: Asparagine

MM-PBSA Molecular mechanics - Poisson Boltzmann surface area

MD Molecular dynamics – động lực học phân tử

SC contact Tiếp xúc với nhánh phụ

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Năng lượng liên kết kcal.mol-1 của các dẫn xuất VK3 với 6 mục

tiêu gắn kết

của các dẫn xuất VK3với các mục tiêu gắn kết Aβ40-1BA4, Aβ42-1Z0Q, WT-Aβ40, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40

Bảng 3.3: Năng lượng liên kết curcumin với 6 mục tiêu gắn kết thu được

bằng phương pháp docking

Bảng 3.4: Năng lượng tự do liên kết, tương tác tĩnh điện, tương tác

van-der-walls kcal.mol-1 của 5 dẫn xuất VK3 với myloid beta 1-40 peptid thu được bằng phương pháp MM-PBSA

DANH SÁCH CÁC HÌNH

ra thành các mảnh Mảnh amyloid beta đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các mảng lão hóa ở bệnh AD

phẳng chứa các sợi

Hình 2.1: Curcumin dạng Keto cấu trúc 2D (A); Curcumin dạng enol cấu

trúc 2D (B); Curcumin cấu trúc 3D (C)

Hình 2.2: (A) Cấu trúc đơn của Aβ40 lấy từ ngân hàng protein có ID là

1BA4 và được ký hiệu là Aβ40-1BA4; (B) Cấu trúc đơn của Aβ42

có ID là 1Z0Q và được ký hiệu là Aβ42-1Z0Q

từ trái qua: WT-Aβ40-1, WT-Aβ40-2, WT-Aβ40-3, WT-Aβ40-4

và WT-Aβ40-5 Hình cuối là tổ hợp của 5 cấu trúc

tam xứng 18Aβ9-40 (B) Hai cấu trúc này do nhóm thực nghiệm của

GS Tycko (NIH, USA) cung cấp

là 2BEG

Hình 3.1: Biểu đồ năng lượng liên kết của các dẫn xuất VK3 với các mục

tiêu gắn kết Năng lượng liên kết của 12Aβ9-40 với các dẫn xuất VK3 là nhỏ nhất trong các mục tiêu gắn kết, kế tiếp là 18Aβ9-40

18Aβ9-40 Vẽ đại diện với phối tử VK3-9 màu đỏ

Hình 3.3: Cấu trúc không gian 18Aβ9-40, vị trí liên kết nằm ngoài biên hơn so

với 12Aβ9-40 Vẽ đại diện với phối tử VK3-9 màu đỏ

Hình 3.4: Biểu đồ tương quan năng lượng liên kết của Aβ40-1BA4,

Aβ42-1Z0Q, 5Aβ17-42, 12Aβ9-40 và 18Aβ9-40 với mục tiêu gắn kết Aβ40 Hệ số tương quan lớn nhất R=0.91 (Aβ40-1BA4), nhỏ nhất R=0.08 (5Aβ17-42) Năng lượng liên kết thu được bằng phương pháp docking

WT-Hình 3.5: Vùng gắn kết Aβ40-1BA4, các dẫn xuất có độ phân tán rất nhỏ

Chỉ vẽ đại diện hai phối tử VK221 màu đỏ và VK3-1 màu xanh

VK3 chủ yếu tập trung tại 4 vị trí chính này

Hình 3.8: Vùng gắn kết 5Aβ17-42, các dẫn xuất tập trung tại vị trí biên có độ

phân tán nhỏ Đỏ VK221, xanh VK3-1

Hình 3.9: Vùng gắn kết 12Aβ9-40 Các dẫn xuất VK3 tập trung tại một vị trí,

hầu như không có độ phân tán Vẽ tượng trưng hai phối tử, VK221 màu đỏ và VK3-1 màu xanh

Hình 3.10: Vùng gắn kết 18Aβ9-40 , các dẫn xuất tập trung vị trí biên có độ

phân tán nhỏ giống hình 3.9

xuất VK3 khi liên kết với mục tiêu gắn kết Aβ40-1BA4 Curcumin

có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

Hình 3.12: Tương tự như hình 3.11 vùng gắn kết Curcumin hầu như không

khác nhau với vùng gắn kết của các dẫn xuất VK3 khi liên kết với mục tiêu gắn kết Aβ42-1Z0Q Curcumin có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

Hình 3.13: Vùng tập trung nhiều Curcumin và vùng tập trung nhiều các dẫn

xuất VK3 khi liên kết với mục tiêu gắn kết WT-Aβ40-5 là gần như nhau Curcumin có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

dẫn xuất VK3 đối với mục tiêu gắn kết 5Aβ17-42 Curcumin có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

không khác so với vùng gắn kết của các dẫn xuất VK3 khi liên kết với mục tiêu gắn kết 12Aβ9-40 Curcumin có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

với mục tiêu gắn kết 18Aβ9-40 khác nhau không nhiều Curcumin

có màu xanh lá cây, VK3-10 đại diện dẫn xuất VK3 có màu vàng

Hình 3.17: Biểu đồ tương quan năng lượng liên kết VK3-1, VK3-2, VK3-3,

VK3-4 với Curcumin; hệ số tương quan của VK3-4 với Curcumin rất lớn (R=0.96)

VK3-8, VK3-9 với Curcumin; hệ số tương quan của VK3-5 là lớn nhất (R=0.96)

Hình 3.19: Biểu đồ tương quan năng lượng liên kết của VK3-10, VK-199,

VK-221, VK-231 với Curcumin; trong đó hệ số tương quan của VK-221 với Curcumin nhỏ nhất trong 15 dẫn xuất VK3 (R=0.73)

VK-224 với Curcumin; hệ số tương quan của VK-233 với Curcumin có độ lớn bằng với VK3-4 và VK3-5 với Curcumin (R=0.96)

liên kết hydro tạo bởi VK3-4 với hai acid amin GLN15 và GLU11 của WT-Aβ40-5

Hình 3.22: Liên kết hydro của VK3-5 với Aβ40; trên hình có chỉ ra hai liên

kết hydro tạo bởi VK3-5 với acid amin VAL40 của WT-Aβ40-5

kết hydro tạo bởi VK3-221 và ba acid amin ASN27, ALA30, ILE31 của WT-Aβ40-5

kết hydro tạo bởi VK3-10 và hai acid amin ALA30, ASN27 của WT-Aβ40-5

Hình 3.25: Liên kết nhánh phụ của VK3-4 với Aβ40; trên hình có chỉ ra 6 liên

kết nhánh phụ được tạo bởi VK3-4 với 6 acid amin PHE19, PHE20, GLU11, GLN15, VAL12, LYS16 của WT-Aβ40-5

Hình 3.26: Liên kết nhánh phụ của VK3-5 với Aβ40; trên hình có chỉ ra 12

liên kết nhánh phụ tạo bởi VK3-5 và 12 acid amin GLY38, GLY37, VAL40, VAL36, PHE20, GLY9, GLN15, SER8, TYR10, GLU11, HIE13, VAL12 của WT-Aβ40-5

Hình 3.27: Liên kết nhánh phụ của VK3-221 với Aβ40;trên hình có chỉ ra 7

liên kết nhánh phụ tạo bởi VK3-221 và 7 acid amin ILE31, GLY37, GLY38,ALA30,PHE4, GLY29, ASN27 của WT-Aβ40-5

Hình 3.28: Liên kết nhánh phụ của VK3-10 với Aβ40; trên hình có chỉ ra 8

liên kết nhánh phụ tạo bởi VK3-10 và 8 acid amin ILE31, GlY37, ALA30, GLY38, GLY29, PHE4, ASN27, HIE6 của WT-Aβ40-5

Hình 3.29: Peptid Aβ40 và phối tử VK3-9 trong hộp nước hình lập phương

dùng để chạy mô phỏng MD Cạnh của hình này dài 5.2 nm Có khoảng 3700 phân tử nước Các hình cầu màu xanh là 3 ion Na+ được thêm vào để trung hòa điện tích của hệ

Hính 3.30: Sự biến đổi theo thời gian của năng lượng tương tác của Aβ40

peptid và VK3-9 Mũi tên chỉ thời điểm hệ đạt trạng thái cân bằng Kết quả thu được cho 6 quỹ đạo

Hình 3.31: Sự biến đổi theo thời gian của năng lượng tương tác của Aβ1-40

peptid và VK3-10 Mũi tên chỉ thời điểm hệ đạt trạng thái cân bằng Kết quả thu được cho 4 quỹ đạo

gây bởi Aβ40 được đánh giá bằng WST-1 cho các trường hợp: chỉ

có 25 μM Aβ40 trong 24 giờ, có 100ng/ml từng dẫn xuất VK3 khác nhau cộng với 25 μM Aβ40 trong 24 giờ, kết quả cho thấy chỉ có VK3-9 có khả năng bảo vệ tế bào chống lại độc tính của Aβ40 Hình (B) cho thấy tương quan giữa khả năng tồn tại của tế bào và năng lượng liên kết các dẫn xuất VK3 với Aβ40, hệ số tương quan nhỏ R = 0.13

Hình 3.33: Hình (A) biểu diễn sự kết tập của Aβ40 được giám sát bằng

Thioflavin-T, tỉ lệ cường độ huỳnh quang ThT ứng với các mẫu chứa từng dẫn xuất VK3 + 25 μM Aβ40; và mẫu chỉ có 25 μM Aβ40; các dẫn xuất VK3-2, VK3-6, VK3-8, VK3-9, VK3-10, 199,

221, 232-2d và 224 có khả năng làm giảm kết tập Aβ40 Hình (B) diễn tả sự tương quan giữa kết tập của Aβ40 thông qua tỉ lệ ThT

và năng lượng liên kết các dẫn xuất VK3, hệ số tương quan khá lớn R = 0.88

sử dụng khảo sát dichlorofluoresein diacetate (DCFH-DA) 25 μM Aβ40 được ủ với 100 ng/ml các dẫn xuất VK3, rõ ràng VK3-9 là chất ức chế sự sinh ra góc tự do của Aβ40 Hình (B) cho thấy sự tương quan giữa quá trình sinh góc tự do và năng lượng liên kết của các dẫn xuất VK3 với Aβ40 rất kém, hệ số tương quan âm và rất nhỏ R = -0.0014

MỞ ĐẦU

Bệnh Alzheimer (AD) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất Năm 1901, lần đầu tiên bác sĩ tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer trình bày một trường hợp của bệnh nhân tên Auguste D, 50 tuổi, bị mất trí.[55] Năm năm sau (1906), ông đã chính thức công bố về căn bệnh này như căn bệnh gây thoái hóa và gây tử vong nhưng không chữa được nó Từ năm 1906 căn bệnh này được đặt theo tên ông Những thập kỷ đầu thế kỷ 20, chữ "bệnh Alzheimer" thường chỉ dùng để định bệnh cho những người mất trí tuổi 45 đến 65 ("bị lẫn trước khi già", "lẫn sớm") Những người lớn tuổi hơn mà bị mất trí được coi như là chuyện thông thường, do tuổi cao làm não bộ tê cứng Nhưng trong những năm 1970 – 1985 khoa học nhận thấy người mất trí ở các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau, nên kết luận AD có ở nhiều lứa tuổi.[17] Bệnh AD thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi, dạng AD sớm hơn 45 tuổi thường không phổ biến.[17]

Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc AD trên toàn thế giới Dự đoán tỉ lệ mắc

AD trên thế giới sẽ là 1 người/85 người vào năm 2050

Mặc dù các ca bệnh AD có đặc điểm riêng biệt đối với mỗi cá nhân, tuy nhiên có nhiều triệu chứng tương đồng xuất hiện sớm Khi quan sát thường nhầm lẫn với các bệnh “liên quan đến tuổi già”, hoặc biểu hiện của stress.[100] Trong giai đoạn đầu, triệu chứng phổ biến nhất được công nhận là không có khả năng để nhớ được việc vừa xảy ra Khi nghi ngờ mắc bệnh AD, chẩn đoán thường được thực hiện bằng cách đánh giá hành vi và kiểm tra nhận thức, có thể kèm theo chụp cắt lớp não

Khi bệnh tiến triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất khả năng phân tích ngôn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết Bệnh

AD có thể phát triển tiềm tàng trong 1 thời gian dài trước khi xuất hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh Thông thường khi các triệu chứng này bộc lộ , thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm, dưới 3% bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh.[100]

Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần nhỏ triệu chứng bệnh Tính tới thời điểm 2008, đã có hơn 500 thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh AD, nhưng vẫn chưa có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử nghiệm.[64]

Người bệnh AD phải được chăm sóc bởi những người thân trong gia đình Đây quả thực là những áp lực rất lớn về mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người chăm sóc Ở các nước phát triển, AD là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội.[4]

Tổ chức Y tế Thế giới ước tính rằng trong năm 2005 có khoảng 0,379% người trên thế giới mắc bệnh, và tỷ lệ sẽ tăng lên 0,441% vào năm 2015 và 0,556% vào năm 2030 Các nghiên cứu khác cũng cho kết luận tương tự.[4]

Tỷ lệ người mắc bệnh AD sau 65 tuổi[4]

Luận văn này nghiên cứu khả năng của một số hợp chất trong việc ức chế bệnh AD, cụ thể là nghiên cứu 15 dẫn xuất của Vitamin K3 như được trình bày ở các chương sau Với những mục tiêu nghiên cứu cụ thể như sau:

- Dùng phương pháp docking và MM-PBSA để tính năng lương liên kết của các dẫn xuất VK3 với các cấu trúc đơn của amyloid peptid Aβ40, Aβ42 và các cấu trúc sợi của chúng Các kết quả thu được cho phép dự đoán về khả năng phá hủy liên kết các đám rối Amyloid β peptid bởi các dẫn xuất VK3 Từ đó suy ra khả năng của các dẫn xuất VK3 trong việc chữa trị bệnh AD

- Các tính toán bằng phương pháp MM-PBSA và docking cho phép làm rõ đóng góp của các loại tương tác như tương tác van der Waal, tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết nhánh phụ vào năng lương liên kết giữa các phối tử và mục tiêu gắn kết Từ đó chỉ ra thành phần năng lượng nào đóng vai trò then chốt giúp các dẫn xuất VK3 gắn kết với các mục tiêu Cũng bằng phương pháp MM-PBSA thu được năng lượng liên kết của dẫn xuất VK3 với đơn thể Aβ40 để bổ sung cho phương pháp docking

- Cuối cùng trình bày một số kết quả thực nghiệm của nhóm Giáo sư Y-C

Chen và so sánh với các kết quả tính toán lý thuyết

Đề tài có ý nghĩa khoa học trong việc ứng dụng mô hình mô tả phân tử docking và phương pháp cơ học phân tử định hướng tìm kiếm các chất có khả năng gắn kết với các thụ thể liên quan đến bệnh AD từ đó tìm kiếm chất khởi nguồn cho quá trình phát triển thuốc tiếp theo chống bệnh AD

Luận văn bao gồm ba chương:

Chương 1 – Tổng quan

Trình bày về nguyên nhân bệnh AD và chỉ tập trung vào nguyên nhân bắt nguồn từ sự kết tập các amyloid beta peptid Nêu sơ lược các nghiên cứu về bệnh

AD và tình hình quan tâm của cộng đồng khoa học về căn bệnh này Trình bày cơ chế hình thành các đám rối amyloid beta peptid Giới thiệu về Vitamin K và các dẫn xuất Vitamin K3 đối với bệnh AD trong những nghiên cứu gần đây Cuối cùng là trình bày các phương pháp và các phần mềm tương ứng trong nghiên cứu

Chương 2 – Đối tượng nghiên cứu

Trình bày chi tiết cách thức tổng hợp mười lăm dẫn xuất Vitamin K3 trên máy tính dùng làm phối tử trong nghiên cứu, bên cạnh đó để làm đối chứng cho các dẫn xuất của VK3, Curcumin được tổng hợp để nghiên cứu thêm Liệt kê mười cấu trúc amyloid beta peptid dùng làm mục tiêu gắn kết, nêu rõ nguồn góc của một số mục tiêu có sẵn và nêu cách tổng hợp bằng mô phỏng các mục tiêu chưa có sẵn như amyloid beta 40 peptid trong môi trường nước

Chương 3 – Kết quả và nhận xét

Có bảy nội dung:

1 So sánh năng lượng liên kết của các mục tiêu gắn kết khác nhau

2 So sánh về năng lượng liên kết giữa các dẫn xuất VK3

3 Vùng gắn kết của các mục tiêu gắn kết

4 Tương quan về năng lượng liên kết của Curcumin và các dẫn xuất VK3

5 Liên kết Hydro không đóng vai trò quyết định khả năng liên kết

6 Năng lương tự do liên kết thu được từ phương pháp MM-PBSA

7 So sánh kết quả lý thuyết và kết quả thực nghiệm

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Một số nghiên cứu về AD

Những nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và đám rối trong não.[91]

Vào năm 1991 người ta đưa ra giả thuyết amyloid cho rằng sự tích

tụ của peptid amyloid beta (Aβ) là nguyên nhân cơ bản của bệnh.[30][11] Một cơ sở ủng hộ giả thuyết này là do vị trí của gen sản xuất protein tiền chất amyloid (APP) nằm trên nhiễm sắc thể 21, trong khi những người mắc hội chứng Down (có 3 nhiễm sắc thể 21) tức là có thêm 1 phiên bản của gen APP thì hầu hết đều mắc bệnh

AD ở độ tuổi trên 40.[8][53] Đồng thời, đột biến gen APOE4 (apolipoprotein E4), một yếu tố nguy cơ di truyền của bệnh AD, gây ra việc tích tụ quá nhiều amyloid peptid trong não trước khi có các biểu hiện của bệnh AD xuất hiện Vì vậy sự tích tụ peptid Aβ luôn có trước các biểu hiện bệnh AD trên lâm sàng Một bằng chứng nữa

là ở chuột bị biến đổi gen, biểu hiện một dạng đột biến của gen APP giống như ở người, đã cho thấy có các đám rối sợi amyloid và các bệnh lý ở não của chuột tương

tự trong bệnh AD ở người như sự suy giảm khả năng định hướng về không gian.[71]

Một nghiên cứu vào năm 2004 cho thấy rằng sự tích tụ các mảng amyloid không tương quan nhiều với việc mất các nơ-ron.[80] Nghiên cứu này hỗ trợ cho giả thuyết Tau là các thể bất thường của protein Tau khởi đầu cho chuỗi phản ứng gây bệnh.[56] Trong mô hình này, các protein Tau bị photphorylate hóa quá nhiều sẽ bắt cặp với các sợi Tau khác Cuối cùng, chúng hình thành các đám rối sợi thần kinh (neurofibrillary tangles) bên trong thân tế bào thần kinh.[27] Khi điều đó xảy ra,

các vi ống tế bào (microtubule - là thành phần cấu tạo của khung xương tế bào) bị tan rã, làm hỏng hệ thống vận chuyển của nơ ron.[38]

Điều này đầu tiên sẽ làm hỏng các chức năng liên lạc hóa sinh giữa các nơ-ron và sau đó gây chết tế bào.[21]

Trong năm 2009, lý thuyết amyloid đã được cập nhật rằng một họ hàng gần của protein amyloid beta (không nhất thiết phải là chính amyloid beta) có thể là thủ phạm chính trong căn bệnh này Lý thuyết này cho rằng một cơ chế liên quan với amyloid - có tác dụng cắt bỏ bớt các cầu nối thần kinh trong não bộ ở giai đoạn phát triển của trẻ con - có thể bị kích hoạt bởi quá trình lão hóa sau này, làm mất dần tế bào thần kinh ở bệnh AD.[65] N-APP, một đoạn ở phía đầu amine của protein APP, nằm cạnh đoạn amyloid beta và được cắt bỏ khỏi APP bởi cùng 1 loại enzyme N-APP kích hoạt chuỗi phản ứng tự hủy bằng cách bám vào một thụ thể thần kinh gọi là thụ thể chết 6 (DR6, hay còn gọi là TNFRSF21).[65] DR6 được biểu hiện nhiều ở những vùng não bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi bệnh AD, vì vậy rất có thể chuỗi phản ứng N-APP/DR6 của quá trình lão hóa của não đã bị kích hoạt để gây bệnh Trong mô hình này, amyloid beta đóng vai trò bổ sung, bằng cách làm giảm chức năng xy-náp

Hình 1.1: Enzime tác động lên APP (protein tiền chất của amyloid) và cắt nó ra thành các mảnh Mảnh amyloid beta đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các mảng lão hóa

ở bệnh AD

1.2 Nguyên nhân bệnh AD

Có hai giả thuyết về hệnh AD Giả thuyết thứ nhất liên quan đến sự tích tụ các protein amyloid beta Giả thuyết thứ hai là bệnh này được gây ra vì protein Tau cuộn sai (misfolding) trong não.[31]

Theo giả thuyết thứ nhất, các mảng được tạo thành từ một loại peptid nhỏ, dài từ 39–43 acid amin, gọi là amyloid beta (hay là A-beta hoặc Aβ) Amyloid beta

là một đoạn của một loại protein lớn hơn gọi là protein tiền chất của amyloid (APP) (xem hình 1.1), một protein xuyên màng (transmembrane protein) nằm xuyên qua màng tế bào của nơ-ron APP rất quan trọng cho quá trình phát triển, tồn tại và sửa chữa của nơ-ron.[72][92]

Ở bệnh AD, quá trình APP bị chia thành các phần nhỏ hơn bởi enzym trong quá trình phân hủy (proteolysis)[32]

chưa được sáng tỏ Một trong các đoạn đó tạo ra các sợi amyloid beta, và tạo nên những cụm tích tụ bên ngoài nơ-ron dưới dạng dày đặc gọi là mảng lão hóa (senile plaques).[5][66]

Theo giả thuyết thứ hai, AD còn được coi là bệnh do protein Tau (tauopathy), bệnh do sự tích tụ bất thường của protein Tau Mỗi tế bào nơ-ron đều

có một bộ khung xương tế bào, một cấu trúc đỡ bên trong góp phần tạo nên cấu trúc

tế bào gọi là vi ống (microtubule) Các vi ống này hoạt động như các loại đường ống dẫn cho các chất dinh dưỡng và phân tử từ thân tế bào đến đầu kia của trục axon và quay ngược trở lại Một protein gọi là Tau giúp ổn định cấu trúc vi ống khi được photphorylat hóa, và vì thế được gọi là protein liên hệ với vi ống Ở bệnh

AD, Tau bị thay đổi về mặt hóa học, trở nên photphorylat hóa quá nhiều; nó bắt cặp với các sợi khác, tạo thành các đám rối sợi thần kinh và làm tan rã hệ thống vận chuyển của nơ-ron.[33] Trong phạm vi luận văn này chúng tôi chỉ đề cập tới giả thuyết liên quan tới quá trình ngưng tụ của các amyloid beta peptid

1.3 Cấu trúc sợi amyloid beta

Từ kết quả thực nghiệm, các sợi amyloid đều có chung cấu trúc tờ β ngang (cross-β sheet structure) ở vùng lõi với các dãy β nằm song song và vuông góc với trục sợi (xem hình 1.2) Các tương tác lặp đi lặp lại giữa các nhóm kỵ nước và phân cực dọc theo theo trục sợi [73] Đa số các sợi amyloid có vùng lõi bao gồm từ hai tới bốn tờ β tương tác gần với nhau Các tờ β này ít bị xoắn hơn nhiều so với các tờ β trong các protein dạng cầu

Hình 1.2: Cấu trúc sợi amyloid beta Mũi tên chỉ trục sợi vuông góc với mặt phẳng chứa các sợi

Bên cạnh các đặt điểm chung, cấu trúc sợi amyloid rất khác nhau về chi tiết, nguyên nhân là do ảnh hưởng của các nhánh phụ (side chain) trong từng trường hợp

cụ thể Các sợi amyloid cũng là những trạng thái bền vững nên chúng thường là những cấu trúc có năng lượng thấp nhất, hoặc là cấu trúc dễ đạt đến về mặt động học Do vậy, tương tác giữa các nhánh phụ với nhau và giữa các nhánh phụ với môi trường sẽ có vai trò chủ yếu trong việc xác định các biến thể của cấu trúc sợi, còn những tương tác do chuỗi chính chỉ xác định khung chung cho các biến thể đó Những sự khác biệt đáng kể thể hiện ở số tờ β trong một sợi đơn vị, chiều dài của các dãy β với sự sắp xếp song song hoặc phản song song của chúng trong tờ từng β, cộng với đặt điểm của cấu trúc các phần không nằm trong vùng lõi

Khoảng cách của các tờ β chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, đặt biệt là sự sắp xếp của các nhánh phụ trong vùng lõi Tỉ lệ số acid amin của chuỗi polypeptid tham

gia vào vùng lõi của sợi cũng biến đổi trong một phạm vi rất rộng [26] Sự đa dạng

về hình thái cấu trúc còn thể hiện ở chỗ các biến thể xuất hiện ngay cả với các sợi amyloid hình thành từ cùng một peptid hay protein, các biến thể hình thái này là hệ quả của tính không đồng nhất trong cấu trúc phân tử của sợi amyloid, cụ thể là sự sắp xếp các chuỗi polypeptid trong từng sợi đối với mỗi điều kiện cụ thể

Theo những kết quả trên, mỗi protein có thể tham gia vào dạng sợi với một phổ cấu trúc rất khác nhau, và các yếu tố động học có vai trò quyết định trong việc chọn lựa cấu trúc xuất hiện trong sợi amyloid với từng trường hợp cụ thể Như vậy,

có sự tương phản giữa sự đa dạng của các khả năng hình thành sợi amyloid và quá trình cuộn về một trạng thái tự nhiên duy nhất của protein

1.4 Cơ chế hình thành các sợi amyloid và mảng amyloid

Quá trình hình thành sợi amyloid diễn ra theo một trình tự chung và chỉ một vài cấu hình quan trọng đã được quan sát thấy trong thực nghiệm [23]

Các sợi amyloid là kết quả của quá trình tập hợp tự phát của các protein hay peptid (được gọi chung là các đơn phân hay monomer) Ban đầu các đơn phân có thể ở vào trạng thái giãn hoàn toàn, giãn một phần hay trạng thái tự nhiên và có thể chuyển hóa qua lại giữa các trạng thái này Sau đó, các protein nhanh chóng tập hợp lại thành các kết tập gọi là các oligomer (tập hợp protein hay peptid với số lượng nhỏ và chưa có dạng sợi) mất trật tự Các oligomer tập hợp từ các protein ở trạng thái tự nhiên mang dáng dấp của trạng thái này Ngoài ra ở giai đoạn này, các protein cũng có thể tập hợp thành những oligomer hay sợi có chức năng với đặt trưng khác xa so với các sợi amyloid Tiếp theo các oligomer và một số cấu trúc có chức năng sẽ phân rã hoặc kết hợp với nhau rồi xếp lại để tạo thành các protofibril, những oligomer lớn hơn có cấu trúc trật tự đặt trưng của trạng thái sợi với số lượng tờ β đáng kể Các quan sát với AFM và TEM cho thấy các protofibril thường có dạng các hạt cầu nhỏ hoặc chuỗi các hạt cầu, hoặc có dạng khuyên tạo bởi chuỗi các hạt cầu đó Các protofibril sau đó sẽ kết hợp với nhau hoặc tiếp nhận các đơn phân khác để tạo nên sợi amyloid

Các khảo sát chi tiết đã dẫn đến kết luận rằng sự hình thành các sợi amyloid mang nhiều đặt điểm của một cơ chế tạo nhân (nucleated growth) Quá trình các protein hay peptid chuyển tập hợp về cấu trúc sợi được đặt trưng bởi một pha chậm (lag phase) và một pha nhanh nối tiếp sau đó [61][74][81][98] Khoảng thời gian ứng với pha chậm được xem là khoàng thời gian nhân được hình thành Sau đó sợi amyloid

sẽ được cấu trúc nhanh chóng nhờ sự kết hợp của các aligomer hoặc các đơn phân vào nhân

Cơ chế tạo nhân đã được khảo sát chi tiết trên nhiều hệ cả bằng lý thuyết và thực nghiệm Các nghiên cứu cho thấy các cấu trúc được thêm vào một mẫu protein đang trong quá trình tập hợp sẽ làm pha chậm bị thu ngắn lại cho đến khi bị khử hẳn Điều này không có nghĩa là cơ chế tạo nhân bị phá vỡ, mà có nghĩa là khoảng thời gian cần để sợi phát triển theo là rất dài so với quá trình tạo nhân

Hiện tượng pha chậm bị rút ngắn do sự thêm vào các cấu trúc khác được giải thích bằng sự tồn tại của các số lượng phân tử tới hạn trong nhân Pha chậm xuất hiện trong quá trình hình thành sợi amyloid (cũng là sự tạo nhân) phản ánh giai đoạn các oligomer hoặc các protofibril phân rã để sau đó kết hợp lại thành các cấu trúc có trật tự hơn Bình thường là sự giảm enthalpy do quá trình tập hợp sẽ bù trừ cho sự giảm entropy cấu hình Khi số lượng phân tử tăng lên, sự giảm enthalpy theo quá trình tập hợp sẽ là nhân tố chủ đạo và do đó đẩy nhanh quá trình tập hợp và rút ngắn pha chậm Khi giá trị giới hạn được đạt đến, các cấu trúc được thêm vào sẽ có

xu hướng kết hợp ngay với oligomer với số lượng phân tử tới hạn để hình thành sợi amyloid thay vì làm cho các oligomer bị phân rã, và do đó pha chậm bị loại trừ.[28]

Ngoài ra cũng có một số cơ chế khác, cơ chế sợi đồng thời [39] được đưa ra để giải thích quá trình hình thành sợi amyloid mà không cần đến bước tạo nhân Tuy nhiên, cơ chế tạo nhân là cơ chế được các nhà khoa học chấp nhận nhiều nhất hiện nay.[1]

Các quan sát về các mảng đám rối dựa trên hình ảnh chụp cộng hưởng

từ và chụp cắt lớp đã cho thấy cả các mảng amyloid (amyloid plaque) và đám rối sợi thần kinh (neurofibrillary tangle) ở hình ảnh hiển vi của não bệnh nhân

AD.[57] Các mảng thường dày đặc, đa số là dạng tích tụ không tan được của các peptid amyloid beta và vật chất trong tế bào nằm bên ngoài và bao quanh các nơ-ron Các đám rối (đám rối sợi thần kinh) là sự tích tụ của các protein Tau có liên quan đến vi ống (microtubule) đã bị photphorylate hóa quá nhiều và đọng lại trong các tế bào Mặc dù có nhiều người già có hình thành các mảng và đám rối do quá trình lão hóa, nhưng não của bệnh nhân AD thường có số lượng các mảng và đám rối nhiều hơn ở những vùng não nhất định, ví dụ như thùy thái dương.[16]

1.5 Vitamin K (VK) và các dẫn xuất Vitamin K3 (VK3) đối với bệnh AD

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh AD có liên quan tới quá trình hình thành oligomer của những đoạn peptid Aβ.[83] Từ đó, một trong những chiến lược để đối phó với bệnh này là việc tìm kiếm các hợp chất có thể ngăn cản sự tập hợp của Aβ

Vì Aβ có cơ chế tự ngưng tụ nên việc sử dụng những mảnh peptid ngắn tương đồng với độ dài đầy đủ của protein ban đầu[83][95] và những peptid N-methyl hóa [28] như những chất ức chế là hoàn toàn khả thi Các hợp chất có chứa carbohydrate, như polyamines, chaperone, metal chelators v.v có thể được sử dụng để can thiệp quá trình hình thành sợi Aβ.[104] Nutraceutical là những dịch chiết xuất tự nhiên, được sử dụng cho các nghiên cứu lâm sàng có thể được coi là liệu pháp tốt cho bệnh AD.[102]Trong số đó có chất curcumin (diferulomrthan),[105] ginkgo biloba[54] và epigallocatechin-3-gallate (trà xanh)[9] từ các loại thảo dược truyền thống của Trung Quốc và Ấn Độ đã được sử dụng để ức chế sự tập hợp Aβ và có khả năng chống lại độc tính do Aβ gây ra

Khả năng thiếu hụt VK trong cơ chế gây bệnh AD đã được phát hiện bởi Allison.[3] Ông đưa ra giả thuyết rằng tình trạng thiếu hụt VK góp phần vào quá trình bệnh AD và việc bổ sung VK có thể dẫn đến hiệu quả tốt trong việc ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh Bên cạnh đó, việc hấp thụ VK của những người mang bệnh được

khảo sát là rất thấp,[75][84] Tuy nhiên, cơ chế của sự ảnh hưởng của VK đối với bệnh

AD vẫn chưa được sáng tỏ vì vấn đề này vẫn chưa thu hút nhiều sự chú ý của cộng đồng khoa học

Gần đây, Giáo sư Y-C Chen ( MacKay Medical College, Taipei, Taiwan) và các cộng tác viên trường Đại học y khoa MacKay, Đài Bắc, Đài Loan đã bắt đầu thí nghiệm về ảnh hưởng của 15 dẫn xuất Vitamin K3 (xem các cấu trúc hóa học bảng 1.1 và 2.1) tới sự kết tập của chuỗi Aβ peptid Kết quả sơ bộ của họ cho thấy một số những hợp chất này có thể can thiệp vào quá trình tạo oligomer, đã mở ra một khả năng để sử dụng chúng như các chất ức chế tiềm năng cho bệnh AD Vì các kỹ thuật thực nghiệm không thể cung cấp những hình ảnh chi tiết về các cơ chế phân tử của sự ức chế hình thành oligomer, Giáo sư GS Y-C Chen đã mời chúng tôi tham gia dự án của mình Do đó luận văn này nằm trong chương trình hợp tác và nhiệm

vụ của chúng tôi là thực hiện mô phỏng động lực phân tử, ước tính ái lực liên kết của các phối tử trên với các Aβ40 và Aβ42 peptid và sợi trưởng thành Mô phỏng của chúng tôi sẽ bổ sung cho các thí nghiệm để hiểu được mối quan hệ giữa các dẫn xuất VK3 và bệnh AD ở cấp độ nguyên tử

VK là dẫn xuất naphtoquinon bao gồm các loại K1, K2, K3, K4, K5, K6, K7 Trong đề tài này chúng tôi chỉ nghiên cứu 15 dẫn xuất của VK3mà không xét VK3,

vì bản thân VK3 có độc tính[47][87]

VK là bột tinh thể vàng, nhiệt độ nóng chảy 160C0 hòa tan tốt trong rượu, ête, không tan trong nước VK có tính oxi hóa khử, nó bị khử thành các dẫn xuất

hydroquinon và oxi hóa trở lại sẽ chuyển thành dạng quinon

VK nói chung chủ yếu tham gia quá trình tổng hợp yếu tố đông máu thrombin, vì vậy khi thiếu VK sẽ xảy ra các hiện tượng chảy máu như: chảy máu da cam, chảy máu nội quan

Ngoài ra có nhiều nghiên cứu gần đây (như đã nêu ở trên) nói về khả năng trị bệnh AD có liên quan đến VK Vào năm 1996 tiến sĩ Martin Kohlmeier của đại học North Carolina khám phá ra rằng VK có vai trò trong bệnh AD Martin Kohlmeier phát triển lý thuyết của ông sau khi nhận thấy rằng các bệnh nhân thẩm tách ( dialysis) với một gene không thể xử lý VK đúng cách Gene đó gọi là apoE4 (apolipoprotein E4) phổ biến ở những bệnh nhân AD Bệnh nhân AD với apoE4 dễ

bị thiếu VK Từ đó ông dự đoán rằng sự thiếu VK có liên quan tới bệnh AD.[24] Vào năm 1996, Lindahl chỉ ra sự thiếu hụt VK có liên quan đến sự sulfat decrased trong não, Sulfat Keratan thì giảm đáng kể trong vỏ não của bệnh nhân AD.[24] Allison

AC vào năm 2001 [42], đề xuất vai trò thiếu hụt VK trong sự sinh bệnh AD và tổn thương não có liên quan đến bệnh mạch máu não Dựa trên những hoạt động tiềm năng của VK trong não và thông qua một liên kết đến các kiểu gen apoE4.[45] Năm

2005 Denisova và Booth, cung cấp bằng chứng chứng minh rằng VK có khả năng bảo vệ và chống lại tổn thương do bị oxy hóa trong tế bào thần kinh.[45]

VK đa số có ở thực vật: bắp cải, cà chua, cà rốt, đậu vàng, rau má, ngũ cốc, Ở động vật có trong sữa, lòng đỏ trứng, các loại gan động vật, thận động vật, mỡ gan lợn gà.[2]

Trong ruột động vật có vi khuẩn tổng hợp được VK, do vậy cơ thể ở trạng thái bình thường ít bị thiếu VK; chỉ thiếu khi có rối loạn tiêu hóa, có bệnh dạ dày, ruột, hoặc dùng quá nhiều kháng sinh gây diệt vi khuẩn đường ruột Yếu tố giúp

tổng hợp tốt VK là acid mật

1.6 Giới thiệu Curcumin

Hiện nay Curcumin đang được thử nghiệm ở giai đoạn hai của quá trình thử nghiệm lâm sàng[38]

Do vậy chúng tôi muốn dùng Curcumin như vật mẫu để so

sánh các kết quả của mình

Curcumin có khả năng ức chế quá trình tạo sợi của các amyloid peptid [39]

curcuminoit – một chất trong củ nghệ thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) được sử dụng

như một gia vị phổ biến ở Ấn Độ Có 2 loại curcuminoit khác là desmethoxycurcumin và bis-desmethoxycurcumin Các curcuminoit là các polyphenol và là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Curcumin có thể tồn tại ít nhất ở 2 dạng tautome là keto và enol Cấu trúc dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch[43] Curcumin có màu sáng đậm và được dùng để tạo màu cho thực phẩm như một chất phụ gia, được biết tới với tên gọi E100

Nghiên cứu của các nhà khoa học vào cuối thế kỷ 20 đã xác định Curcumin đóng vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ nghệ[4] Dựa trên những nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và trên động vật, các nhà khoa học đưa ra giả thuyết khả năng chữa bệnh hoặc ngăn ngừa bệnh của Curcumin Năm 2008, nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đang được thực hiện để nghiên cứu về tác dụng của Curcumin trong việc điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh AD[35] Theo nhiều nghiên cứu cũng cho thấy Curcumin có tính chất chống ung thư[5][18], chống ôxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ.[85] Curcumin làm vô hiệu hóa

tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới Curcumin giúp cơ thể phòng ngừa và chống ung thư Curcumin là một chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV và AD Trong phạm vi luận văn này việc nghiên cứu thêm Curcumin là để làm đối chứng cho các dẫn suất của Vitamin K3

1.7 Các phương pháp nghiên cứu

1.7.1 Phương pháp docking

Đề tài sử phương pháp docking để thu được năng lương liên kết Ebind Đại lương này cho phép giải thích khả năng gắn kết của của 15 dẫn xuất VK3 lên 10 mục tiêu gắn kết được liệt kê ở phần trên Phần mềm Autodock Vina [96] được sử dụng để thu được kết các quả sau:

- Thu được cấu trúc 3D của hai phân tử VK3 và mục tiêu gắn kết

- Tìm được vùng gắn kết (binding site)

- Xác định được kiểu gắn kết

- Tính được năng lượng liên kết

Từ công thức cấu tạo của dẫn xuất VK3, dùng phần mềm Gaussview thiết kế các phân tử 3D dẫn xuất VK3 tương ứng; kế tiếp lấy kết quả vừa có này cho chạy phần mềm Gaussian09W, cuối cùng thu được kết quả với sự tối ưu cấu trúc của những dẫn xuất VK3 (xem hình ảnh chi tiết từng chất trong bảng 1.1) Những dẫn xuất VK3 này sau đó được đem mô phỏng gắn kết với 10 mục tiêu được mô tả ở phần trên

Để có thể gắn kết (dock) các phối tử vào các mục tiêu gắn kết, cần sử dụng AutodockTools 1.5.4 để tạo file PDBQT cho mục tiêu gắn kết và dẫn xuất VK3 Trường lực CHARMM được dùng để diễn tả tương tác nguyên tử Phần mềm autodock vina sử dụng thuật toán Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno[89] dùng cho việc tối ưu hóa cực trị địa phương Để thu được kết quả đáng tin cậy, việc chọn tham số chi tiết (exhaustiveness) bằng 400 là cần thiết, trong khi độ chênh lệch năng lượng lớn nhất giữa cấu hình liên kết tốt nhất và cấu hình liên kết tồi nhất được chọn là 7 kcal/mol Dẫn xuất VK3 sẽ được xếp ngẫu nhiên ở vị trí ban đầu và các góc xoắn được tự do hoàn toàn Hai mươi kiểu liên kết được sinh ra với vị trí ngẫu nhiên của dẫn xuất VK3 khi gắn vào mục tiêu gắn kết Tâm của lưới (grid) mô phỏng được đặt tại tâm khối lượng của mục tiêu gắn kết, những kích thước của lưới

mô phỏng là 60x40x40 Å và nó đủ lớn để bao trùm tất cả mục tiêu gắn kết

Bảng 1.1: Cấu trúc 3D của các dẫn xuất VK3

bỏ qua thay đổi cấu hình của mục tiêu gắn kết và các cấu hình cho phép của phối tử cũng hữu hạn Do vậy phương pháp này được dùng như cách lọc thô các phối tử tiềm năng từ các ngân hàng dữ liệu lớn Tuy nhiên một ưu điểm lớn của phương pháp docking là nó cho phép tìm vị trí liên kết với độ tin cậy cao Trong phần tiếp theo sẽ giới thiệu phương pháp tính năng lượng liên kết tự do chính xác hơn đó là

phương pháp MM-PBSA

1.7.2 Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử

Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một trong những công

cụ cơ bản trong nghiên cứu lý thuyết của sinh học phân tử Phương pháp này tính toán sự vận động phụ thuộc thời gian của hệ phân tử Mô phỏng MD cung cấp thông tin chi tiết về những thay đổi cấu hình của protein và acid nucleic Phương pháp MD thường được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc , động lực học và nhiệt động lực học của các phân tử sinh học và các tổ chức phức hợp của chúng

1.7.2.1 Trường lực (force fileds)

Một trong những yếu tố mấu chốt quyết định độ chính xác của mô phỏng

MD là trường lực hay thế năng tương tác giữa các nguyên tử Hầu hết trường lực sử dụng trong mô phỏng sinh học phân tử được diễn tả bởi thế năng có dạng sau:

A B q q V

ta sử dụng các trường lực chính như AMBER[41], CHAARM[42], OPLS [6] và GROMOS [99] Các hằng số tương tác và điện tích như Aij, Bij, qi v.v phụ thuộc vào trường lực cụ thể Trong luận văn này chúng tôi sử dụng trường lực hiệu dụng GROMOS96 43a1[14], được cập nhật trong phần mền GROMACS phiên bản 4.0.5

và mô hình nước SPC[14]

để chạy mô phỏng MD Trường lực này đã được chứng minh là tốt trong nghiên cứu các chuỗi acid amin[62][63] và bài toán tính năng lượng liên kết [94]

1.7.2.2 Phương trình Langevin

Khi đã xác định được trường lực (2.1) ta có thể giải phương trình Langevin

cổ điển để tìm ra trạng thái của hệ Phương trình này có dạng sau:

1.7.2.3 Thuật toán nhảy cóc (leap-frog)

Chúng ta có thể giải phương trình Langevin (2.2)-(2.3) bằng nhiều cách

nhưng phương pháp MD được sử dụng trong GROMACS là thuật toán leap-frog[36]

nó thực hiện việc lấy tích phân phương trình chuyển động Thuật toán leap-frog sử

dụng tọa độ r ở thời điểm t và vận tốc v ở thời gian t – 1/2∆t; nó cập nhật tọa độ và

vận tốc bằng cách thông qua lực F(t) xác định bởi tọa độ ở thời điểm t:

Nó tạo ra quỹ đạo giống hệt thuật toán Verlet[52]:

1.7.2.4 Các thông số được sử dụng cho trường lực GROMOS

Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sử dụng mô phỏng MD với trường lực GROMOS 96 43a1 có sẵn trong phần mền GROMACS[99] Các thông số được chọn như sau Các phương trình chuyển động được tích hợp bằng cách sử dụng thuật toán leap-frog (phương trình 2.4-2.6) [36] với bước nhảy thời gian ∆t = 2 fs Thuật toán

Lincs [37] được sử dụng để hạn chế chiều dài của tất cả các liên kết hóa học với một dung sai hình học tương đối bằng 10-4 Nhiệt độ coupling V-rescale được sử dụng

để thay đổi vận tốc với thuật toán ngẫu nhiên[11], đã được sử dụng cho mỗi cặp nguyên tử để xác định nhiệt độ trong hệ với thời gian hồi phục là 0,1 ps Áp suất được thiết lập bằng thuật toán Berendsen[12], được áp dụng để điều chỉnh áp suất, áp suất trong trường hợp này không đổi ở 1 atm Lực van-der-waals (vdw) được tính toán với khoảng không tương tác (cutoff) 1,4nm Phương pháp mạng lưới hạt Ewald (PME)[22] được sử dụng để mô tả tương tác điện tầm xa Sự tương tác đối với các phần tử không liên kết cộng hóa trị với nhau được cập nhật mỗi 10fs với thiết lập khoảng không tương tác 1 nm

1.7.2.5 Tính các giá trị trung bình trong mô phỏng MD

Phương pháp MD khi ta biết tọa độ và vận tốc của mỗi hạt tại thời điểm ban đầu, thì sau đó trạng thái của hệ có thể được dự đoán ở bất kỳ thời điểm nào Để

tính trung bình một đại lượng A nào đó ta dùng công thức tính trung bình theo thời gian:

1 0

A p r là giá trị tức thời của A Muốn có độ chính xác cao thời gian mô phỏng

phải đủ lớn để hệ quét qua (hầu như) toàn bộ không gian pha Trung bình theo thời gian (2.7) tương đương với trung bình theo hàm phân bố nếu điều kiện ergodic được đảm bảo

1.7.3 Phương pháp MM-PBSA

Phương pháp này dựa trên mô phỏng động học phân tử Năng lượng tự do

liên kết ∆Gbind được định nghĩa như sau:

∆Gbind = Gcomplex – Gfree-protein – Gfree-ligand (1.8) Trong phương pháp tiếp cận MM-PBSA năng lượng tự do của mỗi phân tử được tính như sau:

G = Egas + Gsolvation – TS

Gsolvation = GPB + Gsur (1.9)

Gsur = γA + b

Năng lượng tuyệt đối trong pha khí Egas được tính như sau:

Egas = Ebond + Eangle + Etors + Evdw + Eelec (1.10)

Các đại lượng Ebond, Eangle và Etors theo thứ tự là năng lương liên kết cộng hóa

trị, năng lương liên kết tương ứng với sự uốn, và tương tác torsion Đại lượng Evdw

là tương tác van der Waals, Eelec tương tác tĩnh điện Egas được tính trong GROMACS với trường lực GROMOS96 43a1, nhưng không sử dụng hạn chế cho

bán kính tương tác (cutoff) Điều này làm tăng độ chính xác khi đánh giá các tương tác không liên kết Trong phương pháp MM-PBSA[44][87] năng lượng tự do (các phương trình 2.8-2.10) chứa đựng sự đóng góp từ các loại tương tác khác nhau

Gsolvation đại diện cho năng lượng tự do hòa tan hóa (the free energy of solvation),

còn TS là đóng góp của entropy Gsolvation chứa hai phần, phần năng lượng tự do hòa

tan hóa phân cực (GPB) và phần năng lượng tự do hòa tan hóa không phân cực

(Gsur) GPB phát sinh từ thế tĩnh điện giữa chất tan và dung môi, và nó được xác định với sự giả định dung môi là liên tục[88]

Phần mềm APBS được dùng để giải phương trình Poisson-Boltzmann tuyến tính bằng phương pháp giải số Kích thước của mỗi ô lập phương trong lưới không gian là 0,5 Å Hằng số điện môi được giả thiết là nằm trong khoảng ε = 78,54 (môi trường nước cất) đến ε = 2 (môi trường dung dịch chứa chất tan) Năng lượng bề mặt hay phần năng lượng tự do hòa tan

hóa không phân cực Gsur được định nghĩa bởi diện tích bề mặt dung môi có thể

tiếp cận (solvent-accessible) A và hai tham số kinh nghiệm (hiệu chỉnh) γ = 0,0072

kcal.mol-1.Å-2 và b = 0 Ở đây A được tính gần đúng bằng phương pháp số

Shrake-Rupley[89] trong gói phần mềm APBS

Các cấu hình thu được trong trạng thái cân bằng (cứ 10 ps ta giữ lại một cấu hình) sẽ dùng để ước tính enthalpy Trong phương pháp gần đúng MM-PBSA những cấu hình thu được từ việc chạy MD cho hệ phức protein – phối tử được sử

dụng để đánh giá Gfree-protein và Gfree-ligand

Sự đóng góp của entropy chất tan được tính thông qua những cấu hình cuối cùng thu được từ việc chạy MD Sử dụng liên hợp gradien và phương pháp bộ nhớ thấp (low-memory) Broyden-Fletcher-Goldfarb Shanno[99] cho tới khi lực cực đại nhỏ hơn 10-6 kJ.mol-1.nm-1thì ta thu được những cấu trúc cực tiểu hóa Phân tích dao động riêng (normal mode) thực hiện bằng cách tính toán và chéo hóa ma trận khối lượng Hessian Tần số dao động riêng, được sử dụng để tính toán entropy dao động [59]

theo phương trình dưới đây:

0 0

Trong đó S vib là entropy dao động, h là hằng số Planck, υ 0 là tần số của dao

động riêng, k B là hằng số Boltzmann, T = 300 K, và N A là số Avogadro

1.7.4 Các phương pháp thực nghiệm

Tổng hợp và thanh lọc Aβ1-40: Aβ1-40 được tổng hợp bằng máy ABI 433A (máy tổng hợp peptid pha rắn)[97] sử dụng chuẩn giao thức FMOC (standard FMOC protocol - Fluorenylmethyloxycarbonyl) với chất dẻo nhân tạo HMP (HMP resin)

acid/H2O/ethanedithiol/thioanisole/phenol, các chuỗi peptide được chiết suất bằng dung dịch ether:H2O tỷ lệ 1:1 (v/v) chứa 0.1% 2- mercaptothanol Aβpeptid vừa tổng hợp sẽ được tinh sạch bằng sắc ký cột đảo pha C18 với thang nồng độ từ 0% đến 78% Độ tinh khiết của peptid thu được là trên 95% được xác định bởi phổ khối lượng MALDI–TOF Một mg của A peptid tinh chế được hòa tan trong 0,23 ml với 100% TFE (Tetrafluoroethylene) tạo thành một hỗn hợp dung dịch mẹ và sau đó đem pha loãng để tạo thành hỗn peptid dùng trong thí nghiệm ứng với các điều kiện

đã được thiết kế

Mật độ những gốc tự do gây ra bởi Aβ1-40 được phân tích bằng cách sử dụng khảo sát dichlorofluoresein diacetat (DCFH-DA)[106] Dichlorofluoresein diacetat được hòa tan trong hỗn hợp bao gồm: 100% thể tích dimethyl sulfoxid, deacetylated với 50% v/v và 0,05 M NaOH trong thời gian 30 phút Sau đó được trung hòa (pH 7.5) và cô cạn sao cho đến nồng độ cuối cùng là 200 μM dung dịch

mẹ Dung dịch mẹ được đông lạnh và đặt trong bóng tối cho tới khi sử dụng Phản ứng được thực hiện trong Dulbecco PBS với pH=7,5 trong một hệ thống đĩa 96 giếng với thể tích 200 μl/giếng chứa 25 μM Aβ40 và các nồng độ khác nhau của dẫn xuất VK3 Việc đọc huỳnh quang đã được ghi trên một đầu đọc microplate (FlexStation 3) với bước sóng kích thích 485nm và bước sóng bức xạ 530nm

Thioflavin-T (ThT) được sử dụng để giám sát trạng thái kết tập của Aβ1-40 Aβ1-40 peptid từ 1mM peptid dung dịch mẹ trong DMSO được pha loãng trong 25mM phosphate đệm với pH=7,4 Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong nồng độ 25 μM Aβ40 peptid và 3 μM ThT ở nhiệt độ 37°C; các thí nghiệm thực hiện trong hai trường hợp không có dẫn xuất VK3 hoặc có từng dẫn xuất VK3 với

100 ng/ml dẫn xuất VK3 Việc đo huỳnh quang được thực hiện bằng một đầu đọc microplate (FlexStation 3) ở 37°C Bước sóng kích thích 440 nm và bước sóng bức

xạ 485 nm

Khả năng tồn tại của tế bào được đo bằng cách sử dụng khảo sát tế bào WST-1[46] 1mM Aβ1-40 peptid được pha trong DMSO để làm dung dịch mẹ Dung dịch mẹ mới pha được sấy khô bằng khí N2, và đưa lại vào trong chất đệm PBS pH=7, cho tới khi nồng độ peptide đạt 500 μM Dung dịch thu được đem pha loãng cho đến 25 μM Aβ1-40 để đem khảo sát khả năng tồn tại Trong một đĩa 96 giếng vi chuẩn, 5×104 tế bào được ủ với sự có mặt từng dẫn xuất VK3 hoặc không có dẫn xuất VK3 ứng với 25 μM A40 peptid trong tổng thể tích 200 μl trong mỗi buồng trong 24 giờ ở 37°C trong không khí ẩm với 5% CO2, trước khi đem khảo sát khả năng tồn tại của những tế bào Dung dịch WST-1 (10 μl) được thêm vào trong mỗi buồng, và những buồng được ủ khoảng 4-5 giờ ở nhiệt độ phòng Mật độ quang học (OD) được xác định tại bước sóng 450nm bằng cách sử dụng một đầu đọc microplate (FlexStation 3)

1.8 Phần mềm sử dụng

Phần mềm sử dụng: Autodock Vina phiên bản 1.1.2 [96], Pymol phiên bản 1.3[76], Autodock 4[77][78], Gaussview phiên bản 5.0.9[10], Gaussian09w phiên bản 7.0[29], Origin phiên bản 6.0[23], Gromacs phiên bản 4.5.4[40] Ngoài phần mềm Autodock Vina còn nhiều phần mềm khác dùng để mô phỏng gắn kết phối tử vào mục tiêu gắn kết, ví dụ như phần mềm Autodock 4 Tuy nhiên phần mềm Autodock Vina có nhiều ưu điểm hơn phần mềm Autodock 4.[77][78] Do đó Autodock Vina