Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS

Chính vì lý do đó chúng tôi xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS”, với mục tiêu phân tích được nhiều loại dư lượng th

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐA DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG CÁC MẪU RAU QUẢ

LỜI NÓI ĐẦU

Đề tài : “ Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực

vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS”, được thực hiện trong thời

gian 12 tháng theo “Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch

vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ” số

034.09.RD/HĐ-KHCN ký ngày 25 tháng 02 năm 2009 giữa Bộ Công

Thương và Viện Công nghiệp thực phẩm Đề tài đã hoàn thành đầy

đủ các nội dung nghiên cứu trong Hợp đồng đã ký kết bao gồm:

1 Nghiên cứu xây dựng qui trình chuẩn để phân tích dư lượng

thuốc bảo vệ thực vật với khả năng phát hiện 110 chất thuộc

nhiều nhóm khác nhau

2 Áp dụng qui trình đã xây dựng để phân tích các mẫu rau

quả trên thị trường Hà Nội

Thành công của đề tài đã góp phần nâng cao năng lực phòng thí

nghiệm phân tích của Trung tâm Phân tích và Giám định thực

phẩm quốc gia trong công tác kiểm soát chất lượng, an toàn vệ

sinh thực phẩm

Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám ơn Vụ Khoa học và

Công nghệ - Bộ Công Thương, Viện Công nghiệp thực phẩm và các

đơn vị bạn đã tạo điều kiện và hỗ trợ chúng tôi hoàn thành

nhiệm vụ này

Nhóm thực hiện đề tài

1.2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV đến môi trường

và sức khoẻ con người

1.5 Phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV 13

1.5.1 Phương pháp phân loại để phân tích dư lượng

2.1.1 Các loại rau quả nghiên cứu 21

3.2 Nghiên cứu điều kiện tách, làm sạch, làm giàu

mẫu và lựa chọn chế độ phân tích trên GC/MS

32

3.3 Đánh giá phương pháp chiết tách và phân tích

đa dư lượng thuốc BVTV trong rau quả

40

3.3.1 Đường nội chuẩn của các loại thuốc BVTV 40

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định

(LOQ)

48

3.5 Kết quả khảo sát một số mẫu rau, qủa trên thị

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV Bảo vệ thực vật

LC/MS Liquid Chromatography/ Mass spectrophotomet

NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

VSAT Vệ sinh an toàn

Mở đầu

Những năm gần đây, lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tiêu thụ ở Việt Nam lên tới hàng chục ngàn tấn Những loại thuốc thường dùng chủ yếu là các loại thuốc thuộc nhóm clo hữu cơ và lân hữu cơ; đây là những loại thuốc có hiệu quả phòng trừ cao nhưng cũng lại có độ độc rất cao và khó phân huỷ gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và sức khoẻ con người Ngoài tác động trực tiếp bởi dư lượng còn lại trên các sản phẩm, thuốc bảo vệ thực vật còn có thể làm thay đổi thành phần và tính chất đất như làm chua cứng, thay đổi cân bằng các chất dinh dưỡng đối với cây trồng Vấn đề tồn dư thuốc BVTV trong môi trường đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Các số liệu phân tích môi trường cho thấy, dù sau một thời gian dài không sử dụng, thuốc BVTV vẫn còn lưu trong môi trường dù ở dạng vết [5] [6] [7] Theo tác giả Lê Văn Khoa, kết quả phân tích tồn dư thuốc BVTV gồm các loại: DDT, methyl parathion, lindan… trong 17 mẫu đất trồng rau trên địa bàn Hà Nội cho thấy có tới 70% số mẫu có chứa ít nhất một loại thuốc, trong đó có 6 mẫu có chứa hàm lượng DDT cao quá tiêu chuẩn cho phép Đối với các loại thuốc BVTV ở các nhóm khác như lân hữu cơ, cacbamat, pyrethroid tổng hợp tuy ít bền vững hơn nhóm thuốc clo hữu cơ nhưng chúng lại được sử dụng với số lượng lớn Vì vậy mối đe doạ của các loại thuốc này đối với môi trường cũng không phải nhỏ khi có sự ước tính khoảng 50% lượng thuốc BVTV khi dùng là phun vào đất Trong đất, thuốc BVTV

bị phân huỷ dần bởi các yếu tố vô sinh và hữu sinh Một số vi sinh vật có thể sử dụng thuốc BVTV như một nguồn dinh dưỡng; ngược lại, nhiều loại vi sinh vật không phải đối tượng phòng trừ cũng bị ảnh hưởng Nhiều thí nghiệm cho thấy, khi sử dụng thuốc BVTV, hoạt độ của đất giảm 50 đến 90% so với điều kiện tự nhiên Trên thực

tế, việc kiểm tra, giám sát dư lượng thuốc BVTV vô cùng phức tạp, ngay cả với các nước công nghiệp phát triển, có hệ thống kiểm soát dư lượng thuốc BVTV cao thì những rủi ro về ngộ độc do thuốc BVTV vẫn có thể xảy ra Ở Việt Nam, kết quả kiểm tra hàng năm của Trung tâm kiểm định thuốc BVTV phía Bắc và phía Nam cho

thấy dư lượng thuốc BVTV trong rau quả rất đáng báo động, số các sản phẩm bị nhiễm thuốc BVTV có xu hướng tăng lên, ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ người tiêu dùng Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong các sản phẩm luôn là bài toán khó đối với các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu Một lý do không nhỏ làm hạn chế sự kiểm soát này là phương pháp phân tích hiện nay còn phức tạp, mỗi qui trình chỉ có thể áp dụng cho một số nhóm, một số chất nhất định

Hiện nay, trong bộ tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cũng chỉ ban hành tiêu chuẩn kiểm tra thuốc BVTV cho nhóm ngũ cốc và chè, hơn nữa mỗi tiêu chuẩn chỉ dùng xác định một số chất, số các loại thuốc BVTV có thể xác định được khi áp dụng các tiêu chuẩn này rất ít chỉ gồm: parathiomethyl, metamidophos, gama-BHC, dimethoit, diclovot, lidan và một vài chất khác [26] [27] [28] [29][30] [31] Cũng vì

lý do đó nhiều phòng thí nghiệm trong nước có điều kiện trang thiết bị tốt như Trung tâm TC-ĐL-CL 1, Trung tâm TC-ĐL-CL 2, Trung tâm TC-ĐL-CL 3, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh đã tự xây dựng cho mình qui trình phân tích dư lượng thuốc BVTV để áp dụng trong phòng thử nghiệm Tuy nhiên các qui trình này cũng chỉ áp dụng trong nội bộ, hơn nữa mỗi qui trình cũng chỉ áp dụng cho một nhóm chất hoặc cơ clo, hoặc cơ phot pho, hoặc pyrethroid với các điều kiện kỹ thuật khác nhau trên sắc ký khí (GC) tương ứng với việc sử dụng các loại detector FID, ECD, FPD Chính vì lý do đó chúng tôi xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS”, với mục tiêu phân tích được nhiều loại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thuộc nhiều nhóm khác nhau trên một qui trình phân tích, có độ chính xác tương đương các tiêu chuẩn AOAC, đáp ứng yêu cầu về giới hạn kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong các sản phẩm rau quả theo TCVN 5624-1991

Phân loại thuốc BVTV :

Có nhiều cách để phân loại thuốc bảo vệ thực vật [19], có thể phân loại thuốc theo đối tượng phòng trừ, theo cơ chế tác động, theo mức độ độc hại,

+ Phân loại theo đối tượng phòng trừ

Theo cách này, thuốc BVTV được chia ra thành các nhóm

+ Phân loại theo cơ chế tác động

- Thuốc gây độc do tiếp xúc

- Thuốc gây độc vị độc

- Thuốc nội hấp, thấm sâu

- Nhóm thuốc xông hơi

+ Phân loại theo độ độc

Theo cách phân loại này (WHO), thuốc BVTV được chia thành các nhóm như sau

Bảng 1 Phân loại thuốc BVTV theo độ độc của tổ chức Y tế Thế giới

IV nền xanh

1.2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV đến môi trường và sức khoẻ con người

Sản xuất nông nghiệp ở bất cứ nơi nào trên thế giới đều không thể thiếu thuốc BVTV nếu muốn đạt năng suất cao Tuy nhiên, thuốc BVTV cũng chính là chất độc gây hại cho sức khoẻ con người và môi trường nếu không được quản lý và sử dụng đúng cách Thuốc BVTV có tác động mạnh mẽ đến môi trường Chúng có thể làm thay đổi thành phần và tính chất của đất, làm chua cứng và thay đổi cân bằng dinh dưỡng trong đất

Vấn đề tồn dư của các chất BVTV trong môi trường đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đặc biệt các chất clo hữu cơ có khả năng gây độc cao và bền vững trong môi trường Các số liệu phân tích môi trường cho thấy, dù sau một thời gian dài không sử dụng, một lượng tồn lưu các hợp chất này vẫn được tìm thấy (Lê Văn Khoa 1997) Cũng theo tác giả Lê Văn Khoa, trong số 17 mẫu đất trồng rau lấy

ở Hà Nội để phân tích các chất thuộc nhóm DDT, methyl parathion, lidan, monitor thì

có tới 70% số mẫu phát hiện ra có một trong các chất phân tích, trong đó có tới 36%

số mẫu phát hiện có DDT vượt mức cho phép Đối với các thuốc BVTV ở các nhóm khác như lân hữu cơ, cacbamat, pyrethroid ít bềnn vững hơn nhóm thuốc clo hữu cơ nhưng chúng lại đang được sử dụng rộng khắp với số lượng lớn, vì vậy những hiểm hoạ cho môi trường từ những nhóm này cũng không hề nhỏ

Trên thực tế, không phải tất cả lượng thuốc BVTV đem sử dụng đều nhằm đúng mục đích Người ta ước tính khi phun thuốc có tới 50% lượng thuốc phun thẳng vào đất Trong đất thuốc BVTV bị phân huỷ dần bởi các yếu tố vô sinh và hữu sinh Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng thuốc như một nguồn dinh dưỡng, ngược lại nhiều loại không thuộc đối tượng phòng trừ cũng bị tiêu diệt Nhiều nghiên cứu cho thấy thuốc BVTV làm giảm 50-90% hoạt độ của đất so với điều kiện tự nhiên Ngoài việc tích tụ trong đất, thuốc BVTV còn phân tán vào nước, các trầm tích nước

ngọt, vào cá, qua cây cỏ vào sữa bò là những hiểm hoạ trực tiếp đến sức khoẻ con người

Thuốc BVTV không chỉ tích tụ trong đất mà khi bị rửa trôi do quá trình tưới tiêu, mưa bão, chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm và nước vùng cửa sông Người ta ước tính khoảng 340 tấn altrazin hay 1,2% lượng thuốc được dùng tại

12 bang của Mỹ đã chảy vào sông Misisipi và ra vịnh Mehicô Tại California- Mỹ, từ

1980 đến 1984 đã phát hiện chất dibromo propan ở 2.000 giếng nước ăn trong khu vực rộng 18.000 km2 Các loại thuốc diệt cỏ như altrazin, alaclo, sumazin trở thành các chất gây ô nhiễm phổ biến dưới tầng canh tác của nhiều nước trên thế giới Thậm chí có nơi đã phát hiện thấy dư lượng thuốc BVTV ngay cả trong nước mưa và sương

mù

1.3 Tình hình sử dụng và tiêu thụ thuốc BVTV ở Việt Nam và trên thế giới

Những năm trước đây, nhiều người cho rằng thuốc hoá học có thể dập tắt mọi dịch sâu bệnh, bảo vệ mùa màng, tăng năng suất cây trồng, hơn nữa chi phí cho việc

sử dụng thuốc hoá học lại rất thấp Chính vì vậy, việc sử dụng thuốc BVTV bị lạm dụng tràn lan ngay cả khi không thật cần thiết Theo ước tính, lượng thuốc trừ sâu bệnh được sử dụng thời gian này ở Mỹ gấp hàng trăm lần lượng thuốc cần thiết [6] [7] Hậu quả của việc sử dụng này đã gây tác hại rất xấu cho môi trường và con người Ngày nay có tới trên 1300 loại hoá chất được công nhận là thuốc BVTV [8] [20] Vào cuối những năm 40 của thế kỷ trước, lượng thuốc hoá học sản xuất trên thế giới chỉ vào khoảng vài trăm tấn (tương đương vài trăm triệu USD), nhưng đến nay giá trị sản lượng thuốc BVTV trên thế giới đã lên đến 31,25 tỷ USD

Theo nhận định của Hội nghị liên tịch FAO và UNEP, thị trường thuốc BVTV trên thế giới vẫn tiếp tục tăng mạnh, nhất là ở các nước đang phát triển thuộc Mỹ La tinh và Châu Á Hiện nay, tác dụng không mong muốn của thuốc hoá học đã được chứng minh rõ ràng nên xu hướng nghiên cứu và sử dụng thuốc BVTV sinh học đang

được khuyến khích Theo dự tính đến 2010 thuốc BVTV sinh học sẽ chiếm 10% thị phần thuốc BVTV tiêu thụ trên thế giới Tuỳ theo trình độ canh tác, mức độ đầu tư về thuốc BVTV ở các nước cũng khác nhau Mức độ sử dụng thuốc BVTV cũng như chi phí cho thuốc BVTV trên một hec-ta gieo trồng ở một số nước trong khu vực Đông Nam Á được thể hiện trong bảng sau :

Bảng 2 Tình hình sử dụng thuốc BVTV ở một số nước khu vực Đông Nam Á

Bình quân trên một ha Quốc gia

Diện tích canh tác ( triệu ha)

Số lượng (tấn a.i*)

Giá trị (triệu USD)

tỷ lệ này có phẩn thay đổi Pakistan thuốc trừ sâu chiếm 92%, thuốc trừ cỏ chỉ chiếm 6% [1] [3]

Ở Việt nam, trong những năm 90, lượng thuốc tiêu thụ khoảng 4000 tấn hoạt chất, tương đương với khoảng 13 đến 15 ngàn tấn thành phẩm, trị giá khoảng 8,5 triệu USD Giai đoạn này, mức độ sử dụng hoá chất BVTV còn rất thấp, chỉ vào

khoảng 0,40 kg a.i./ha ; chủng loại sử dụng chủ yếu là nhóm clo hữu cơ và lân hữu

cơ Các loại thuốc này tuy có hiệu quả phòng trừ tốt nhưng lại có độ độc cao, thời gian phân huỷ chậm gây tác động xấu đến môi trường và con người Năm 1999, số lượng thuốc BVTV đạt 33,715 tấn tương đương 158,8 triệu USD, số tiền đầu tư cho thuốc BVTV là 15,11 USD/ha Những năm gần đây con số này tăng lên rất nhiều, năm sau tăng hơn năm trước Nếu năm 2006 giá trị thuốc BVTV nhập khẩu là 305 triệu USD thì năm 2007 là 383 triệu USD (tăng 25% so với 2006) Đến năm 2008 con số này là 472 triệu USD (tăng 23,3% so với 2007) ; dự đoán con số này sẽ không

giảm vào 2009 (Nguồn từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn)

Cơ cấu các loại thuốc BVTV ở Việt Nam cũng như một số nước Nam Á, số lượng thuốc trừ sâu được tiêu thụ cao hơn thuốc trừ bệnh và trừ cỏ Tuy nhiên, những năm gần đây số lượng thuốc trừ cỏ tăng 5,6 lần trong khi thuốc trừ sâu và trừ bệnh chỉ tăng 2,6 lần Điều này chứng tỏ đang có sự thay đổi đáng kể trong cơ cấu thuốc BVTV ở Việt Nam và phù hợp với xu thế tăng cường thuốc trừ cở trên thế giới

1.4 Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong nông sản thực phẩm ở Việt Nam

Những năm gần đây, việc kiểm soát dư lượng thuốc BVTV ở Việt Nam được quan tâm rất nhiều Tại các Trung tâm kiểm định thuốc BVTV, hàng năm đều tiến hành khảo sát đánh giá dư lượng thuốc BVTV trên một số loại nông sản tại một số khu vực trọng điểm Kết quả cho thấy, rau cải, đậu đỗ, nho, dưa chuột đều có mẫu có chứa hàm lượng thuốc BVTV vượt quá MRLs Tỷ lệ các mẫu nhiễm này là 15% đối với rau cải, 20% đối với nho và đậu đỗ, dưa lê là 19,6%, dưa chuột là 12%[1] [7]

Theo một số tác giả Viện Rau quả thì dư lượng một số loại thuốc trên các loại rau cao hơn nhiều so với giới hạn tối đa cho phép Ví dụ : Wotabox trên rau cải là 1ppm (MRLs là 0,2 ppm) ; Monitor trên rau cải là 2,0ppm (MRLs là 0,1 ppm)

Việc kiểm soát thuốc BVTV tại Việt Nam rất khó khăn, ngoài lượng thuốc nhập khẩu có giá trị hàng trăm triệu USD mỗi năm, một lượng không nhỏ các loại

thuốc BVTV khác được nhập lậu qua biên giới, đặc biệt là biên giới phía Bắc hầu như không được kiểm soát Trong số này có không ít loại thuốc đã bị cấm sử dụng

Về số lượng các chủng loại thuốc BVTV thương mại đang lưu hành trên thị trường cũng gia tăng rất nhanh Chỉ trong vòng 6 năm (từ năm 1998 đến 2004), số lượng tên thuốc BVTV thương mại đã tăng gấp đôi, trong đó thuốc trừ sâu chiếm tỷ

lệ rất cao (499/261) khoảng 45%, thuốc trừ bệnh (364/208) chiếm khoảng 32%, thuốc trừ cỏ (266/156) chiếm khoag 20%

Năm 2000, Cục Bảo Vệ thực vật đã có đợt thanh tra lớn, kết quả 70% trong số 19.063 cơ sở bán lẻ thuốc BVTV tại các tỉnh và thành phố trong cả nước hoạt động không có giấy phép, hoặc bán thuốc ngoài danh mục, hàng không đúng qui cách Ngoài ra kiến thức về sử dụng thuốc BVTV sao cho an toàn, bảo đảm sức khoẻ và bảo vệ môi trường của đại đa số nông dân còn rất thấp Nhiều nơi nông dân thích mua thuốc rẻ, có độc tính cao để sử dụng Điều này càng làm tăng nguy cơ ngộ độc cho người sử dụng và huỷ hoại môi trường sống

1.5 Phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV

1.5.1 Phương pháp phân loại để phân tích thuốc BVTV

Do tính chất phức tạp của thuốc BVTV: về số lượng (tới trên 1000 chất), về đặc tính hoá học (rất nhiều nhóm chất khác nhau), và về cả phương thức sử dụng, đối tượng sử dụng Chính vì vậy việc phân tích dư lượng thuốc BVTV cần phải được phân loại cụ thể cho từng đối tượng Theo tổ chức tiêu chuẩn CODEX, nông sản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được phân loại thành 86 nhóm khác nhau để phân tích dư lương thuốc BVTV [26] Việc phân loại này được chia thành 5 lớp : A,B,C,D và E

- Lớp A : Các mặt hàng thực phẩm ban đầu có nguồn gốc thực vật, từ nhóm 1 đến nhóm 29

- Lớp B : Các mặt hàng thực phẩm ban đầu có nguồn gốc động vật, từ nhóm

Đối với lớp A, việc phân loại lại được chi tiết như sau :

- Loại 1 : Quả, được thu hái từ nhiều loại thực vật lâu năm khác nhau tuỳ thuộc loại cây gỗ và cây bụi, thường là cây gieo trồng Chúng bao gồm hầu hết là quả chín mọng nước hoặc đầy thịt quả, được phát triển từ bầu hoa thực vật và các phần phụ của nó Sự tiếp xúc với thuốc bảo vệ thực vật của chúng thường phụ thuộc vào phần riêng biệt của quả được dùng làm thực phẩm Quả có thể được tiêu thụ toàn bộ sau khi loại bỏ vỏ hoặc một phần quả (loại này được chia thành 8 nhóm)

- Loại 2 : Rau, được lấy từ nhiều loại khác nhau của các cây, phần lớn được canh tác một năm Sự phơi nhiễm thuốc BVTV của rau phụ thuộc vào phần của cây dùng làm thực phẩm và thực tế gieo trồng Các loại rau được phân thành các nhóm đặc trưng : rau thân hành, rau cải (cải dầu hoặc cải), rau loại quả bầu bí, rau loại quả không phải bầu bí, rau lá, rau đậu, đậu hạt, rau thân rễ

củ, rau thân và cuống, cây có tinh dầu và gia vị v.v (bao gồm 21 nhóm)

1.5.2 Phương pháp lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc BVTV

Để bảo đảm tính khách quan, mẫu lấy phải đủ đại diện cho lô hàng phân tích Đối với phân tích dư lượng thuốc BVTV thì yêu cầu này càng được qui định một cách nghiêm ngặt Trong quá trình lấy mẫu ban đầu, cần tránh không gây nhiễm

bẩn mẫu hoặc biến đổi mẫu Việc lấy mẫu phải phù hợp về số lượng và vị trí khi lấy mẫu Đối với đối tượng dạng rời, về số lượng mẫu ban đầu cần lấy theo bảng sau :

Bảng 3 Số lượng mẫu ban đầu cần lấy

STT Khối lượng lô hàng

Bảng 4 Khối lượng mẫu cần lấy

4 Các sản phẩm sữa

- Sữa nguyên chất

1.5.3 Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV

Hiện nay các phương pháp cơ bản được sử dụng để xác định dư lượng thuốc BVTV gồm có: phương pháp ELIA, phương pháp TLC, phương pháp CE, phương pháp HPLC, phương pháp GC (mở rộng có LC/MS và GC/MS)[15] [16] [17] [24]

- Phương pháp EIA hay ELIZA là phương pháp thử nghiệm miễn dịch, gắn enzyme theo phương pháp cạnh tranh trực tiếp Dung dịch chiết xuất từ mẫu được trộn với conjugate (kết gắn) Hỗn hợp được chuyển vào các giếng phủ kháng thể, tại đó chất cần phân tích và conjute cạnh tranh nhau để gắn kết với kháng thể Phương pháp này

sử dụng dạng kit thử được chế tạo sẵn, ưu điểm là đơn giản, dễ thao tác, cho kết quả nhanh (chỉ trong vòng một giờ); tuy nhiên độ chính xác không thật cao, để khẳng định kết quả vẫn phải sử dụng kết hợp các phương pháp khác

- Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), phương pháp này được phát triển từ những năm 1950 và được ứng dụng khá rộng rãi với ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền Phương pháp có thể sử dụng để phân tích định tính, định lượng nhiều loại thuốc BVTV Rất nhiều bộ TCVN về xác định dư lượng thuốc BVTV vẫn còn sử dụng phương pháp này

- Phương pháp điện di mao quản (CE) Những năm gần đây, điện di mao quản phát triển và trở thành một kỹ thuật có tiềm năng trong nghiên cứu Giai đoạn đầu, CE được ứng dụng chủ yếu vào phân tích sinh học, thời gian gần đây đã được đã được ứng dụng nhiều trong phân tích hoá học CE có khả năng phân tích nhanh và có hiệu quả các hợp chất dạng ion, ion hoá và các hợp chất trung tính dựa trên một kỹ thuật khác với sắc ký khí và sắc ký lỏng, vì vậy CE là một kỹ thuật có giá trị khi kết hợp với sắc ký để phân tích một số chất BVTV, khi các hợp chất này cần phải dẫn xuất hoá khi phân tích bằng sắc ký khí hoặc không thể phân tích bằng sắc ký lỏng

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), về nguyên tắc, kỹ thuật tách bằng HPLC giống với sắc ký cột truyền thống, tuy nhiên HPLC dùng bơm cao áp, cột nhồi nhỏ, các cấu tử được phát hiện bằng các detector có độ nhậy cao

- Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp này liên quan đến sự tương tác giữa pha hơi và pha tĩnh nên khó phát hiện các chất không bay hơi Có hai loại sắc ký khí

là sắc ký khí - lỏng (pha tĩnh là chất lỏng) và sắc ký khí - rắn (pha tĩnh là chất rắn) Mẫu được bơm vào buồng mẫu có nhiệt độ cao đủ để mẫu có thể hoá hơi, khí mang

sẽ kéo theo các cấu tử phân tích qua cột Tại đây sẽ có sự tương tác với pha tĩnh dẫn đến thời gian lưu của các cấu tử sẽ khác nhau Các cấu tử sẽ lần lượt đi ra khỏi cột và

đi vào detector Detector sẽ cho tín hiệu khi có mặt một chất hoặc một nhóm chức nào đó Tín hiệu này có cường độ tỷ lệ với nồng độ cấu tử được phát hiện

- Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Sự kết hợp giữa sắc sắc ký khí (GC) và khốiphổ (MS), tạo nên một phương pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân tích Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phương pháp này được sử dụng rất hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lượng các chất[13] Hai kỹ thuật trên ghép nối với nhau có thể tách và định lượng các chất có nồng độ 10-10 gram hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ khác Ngoài

ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có có thể được phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên

Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [4], [9] Có nhiều giải pháp kỹ thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong hệ thống Với thiết bị hiện đại ngày

nay, toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột nhồi hoặc cột mao quản được chuyển thẳng vào bộ phận chiết khí mang trung gian, sau đó được đưa trực tiếp vào nguồn ion hoá mẫu Thiết bị chiết khí mang trung gian có thể có những cấu trúc khác nhau, nhưng khi làm việc chúng phải tuân theo một nguyên lý chung là khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp hoặc khuyếch tán trong một thiết bị tách khuếch tán phân tử

Sắc ký đồ được ghi lại từ tín hiệu của dòng ion tổng cộng Những sắc đồ thu được từ tín hiệu dòng ion hoá và detector ion hoá ngọn lửa nói chung tương tự nhau

Sắc ký khối phổ đã được sử dụng rộng rãi, đặc biệt nó có thể giúp phát hiện các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp Nhiều cải tiến quan trọng đã được áp dụng, đặc biệt trong phân tích các hợp chất sinh hoá Ngoài ra các chương trình xử lý số liệu khi ghép nối với máy tính khiến quá trình phân tích trở nên đơn giản hơn và cho phép thu được những kết quả đáng tin cậy

Phổ khối được sử dụng như một detector đặc biệt có độ nhạy cao Trong trường hợp này, các thiết bị sẽ cho các giá trị số khối khác nhau và dòng ion đáp ứng được tập hợp và ghi lại dưới dạng một sắc đồ (phân mảnh khối) quá trình này cho phép xác định được tất cả các mẫu có nồng độ rất nhỏ (tới 10-10g)

Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc hai electron để trở thành các ion mang dương mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể quá trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm gọi là ion hoá phân tử Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích dương hoặc âm Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng lượng va chạm dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau Các ion này sẽ được tách và đo khối lượng sau đó ghi trên sắc phổ đồ

Một ưu điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể được áp dụng một cách hữu hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền Nhờ những ưu điểm đó

mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong phân tích dư lượng các chất kích thích, độc chất dễ bay hơi trong kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường

Ngoài những kỹ thuật phân tích đã nêu trên, hiện nay với sự phát triển không ngừng của khoa học, kỹ thuật phân tích sắc ký khố phổ đã nâng lên thành LC/MS/MS; GC/MS/MS, với sự ghép nối hai lần khối phổ này làm tăng lên rất nhiều

độ chính xác của phương pháp, và khẳng định sự chắc chắn cho các kết quả thu được

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Các loại rau quả nghiên cứu

Trong phạm vi đề tài này, các loại rau quả tươi được lấy từ các chợ trên địa bàn Hà Nội để khảo sát và nghiên cứu

2.1.2 Các thuốc BVTV nghiên cứu

Nhóm Clo- hữu cơ: 10 loại

Aldrine1), BHC(BHC alpha, beta, gamma, and delta) 2), Chlorobenzilate,

Dieldrin1), DDT (o,p'-DDD, p,p'-DDD, p,p'-DDE, p,p'-DDT) 1) 2), Endosulfan(Endosulfan alpha, beta, and Endosulfan sulfate) 2), Endrin, Heptachlor (Heptachlor, Heptachlor Epoxide isomer A, isomer B) 1) 2), Dicofol, Phenisobromorate

Nhóm Photpho-hữu cơ: 30 loại

Butamifos, Cadusafos, Chlorpyrifos, Chlorpyrifosmethyl, Chlorfenvinfos( (E)- and (Z)-Chlorfenvinfos) 2), Cyanofenphos, Diazinon, Dimethoate, Edifenphos, EPN, Ethion, Ethoprophos, Etrimfos, Fenitrothion, Fensulfothion, Fenthion, Iprobenfos, Isoxathion, Malathion, Methidathion, Methylparathion,

Parathion, Phenthoate, Phorate, Phosalone, Pirimiphos-methyl, Prothiofos, Quinalphos, Salithion, , Terbufos, Tolclofos-methyl

Nhóm Pyrethroid: 10 loại

Bifenthrin, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin, Ethofenprox, Fenpropathrin, Fenvalerate, Flucythrinate, Fluvalinate, Permethrin, Tefluthrin

Halfenprox, Pyridaben, Tebufenpyrad

Nhóm ức chế tổng hợp sinh học Ergosterol (EBI): 5 loại

Bitertanol, Fenarimol , Propiconazole , Triadimefon, Triadimenol, Triflumizole (Triflumizole and Triflumizole metabolite)

Nhóm ức chế sự tăng trưởng của côn trùng (IGR): 1 loại

Buprofezin

Các loại khác: 9 loại

Atrazine, Chlorfenapyr, Difenamid, Fenoxaprop - ethyl, Kresoxim-methyl, Paclobutrazol, Pendimetharin, Procymidone, Trifluralin

2.2.Cách tiến hành thực nghiệm

Các thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị phân tích:

- Máy sắc ký khí AgilentTMmodel 6890N

- Detector khối phổ AgilentTM model 5973i

Dụng cụ:

- Máy cô quay chân không có hệ điều chỉnh áp suất,nhiệt độ

- Máy đồng hóa mẫu

- Máy cất nước khử ion

- Phễu lọc chân không Kiriyama loại 60mm

- Phễu thủy tinh

- Giấy lọc 5C

- Các loại pipet thể tích 0,5ml, 1ml, và 2ml, pipet Pasteur:loại thủy tinh dài

- Các bình định mức 10ml, 20ml, 50ml, 100ml

- Ống nghiệm, bông thủy tinh

- Bể lọc chân không, SupelcoTM

- Lọ thủy tinh (Vial) đựng mẫu loại 1,5 đến 2ml, dung cho hệ bơm mẫu tự động của hệ thống GC/MS

- Các loại cột làm sạch pha rắn: SupelcleanTM ENVI-Carb/LC-NH2 6ml (500mg/500mg): SupelcoTM part# 54035-U, Cột Florisil, Ôxit nhôm, Silicagen

Hóa chất:

- Acetonitril: độ tinh khiết dùng cho hệ thống HPLC

- n-Hexan: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV

- Aceton: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV

- Toluen: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV

- Ethyl acetat: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV

- Natri Chloride (NaCl): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học

- Natri sulfate khan (Na2SO4): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học

- CeliteTM: Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học

- Triphenyl phosphate: Độ tinh khiết > 99,9%

- Khí Nitrogen: Độ tinh khiết > 99,99%

- Khí Helium: Độ tinh khiết > 99,999%

- Chất chuẩn của các loại thuốc BVTV, đều phải có độ tinh khiết dùng phân tích sắc kí khí và chứng chỉ chất lượng phù hợp

- n- Hexan bão hòa với Acetonitril

Lắc n-hexan và acetonitril với tỷ lệ thể tích phù hợp, giữ lại lớp n-Hexan

- Toluen/Ethyl acetate 2:8 (V/V) : Dùng ống đong lấy chính xác 2 phần thể tích toluen và 8 phần thể tích ethyl acetate, trộn đều vào nhau

- Dung dịch nội chuẩn gốc (1mg/ml)

Cân chính xác 100mg triphelyl phosphate cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và định mức bằng dung môi acetone

- Dung dịch nội chuẩn nồng độ 10µg/ml

Dùng pipet lấy chính xác 1ml dung dịch nội chuẩn gốc nồng độ 1mg/ml cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng dung môi aceton

* Pha dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1mg/ml pha trong bình định mức màu nâu, cổ nhám bảo quản ở nhiệt độ < 40C để tránh bay hơi, dung môi pha

là aceton

- Dung dịch chuẩn trung gian: Dung dịch này có nồng độ 100 µg/ml được chuẩn bị bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml cho vào bình định mức nâu 10ml, định mức đến vạch bằng acetone, lắc đều, bảo quản ở nhiệt độ < 40C

- Dung dịch chuẩn làm việc hàng ngày: Dung dịch này được pha ở nồng

độ 10 µg/ml bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn bằng acetone, lắc đều, bảo quản ở nhiệt độ < 40C

* Xây dựng đường nội chuẩn:

Đường nội chuẩn được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa tỷ lệ nồng độ chất cần phân tích với nồng độ chất nội chuẩn ( biểu diễn trên trục hoành) và tỷ lệ của số đếm diện tích píc của chất cần phân tích với nội chuẩn ( biểu diễn trên trục tung)

X ( trục hoành): Nồng độ của chất phân tích/ nồng độ chất nội chuẩn

Y(trục tung): Số đếm diện tích pic chất phân tích / Số đếm diện tích pic chất nội chuẩn

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng đường nội chuẩn của các chất nghiên cứu ở năm điểm nồng độ: 0,050 µg/ml; 0,100 µg/ml; 0,500 µg/ml; 1,000 µg/ml

và 5,000 µg/ml Chất nội chuẩn triphenyl phosphate nồng độ 1,000 µg/ml Cách pha thể hiện ở bảng 5

Bảng 5 Pha dung dịch chất chuẩn cho đường nội chuẩn

Thể tích lấy (ml)

Dung môi lấy pha

V định mức (ml)

Nồng

độ chất chuẩn cần pha (µg/ml)

Nồng

độ chất nội chuẩn trong hỗn hợp (µg/ml)

0,05 0,05 0,1 0,1 0,5 0,5 1,0 1,0

Sử dụng dung dịch đã có chất nội chuẩn đã có chất nội chuẩn ở năm mức nồng

độ như bảng trên bơm vào máy sắc ký khí khối phổ, mỗi nồng độ bơm 3 lần để xác

định số đếm diện tích píc của chất phân tích và chất nội chuẩn, ở mỗi mức nồng độ

bơm 3 lần, lấy kết quả số đếm diện tích píc trung bình của 3 lần bơm để xây dựng

đường nội chuẩn cho từng chất riêng biệt

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn dung môi và điều kiện tách chiết, làm sạch mẫu

phân tích

Khảo sát lựa chọn dung môi, điều kiện tách chiết và làm sạch

*Tách chiết:

Tách chiết là bước quan trọng trong quá trình phân tích, trong bước này cần

phải lựa chọn dung môi để chuyển chất cần xác định từ mẫu phân tích ra dung môi

chiết Có nhiều loại dung môi khác nhau được lựa chọn để chiết mẫu Dung môi được

lựa chọn cần phải hòa tan tốt các chất cần chiết nhằm đạt được hiệu suất thu hồi cao

nhất Với những mẫu có hàm lượng nước cao, dung môi chiết có thể là acetone, ethyl

acetat , axetonitril, hoặc hỗn hợp các dung môi như hỗn hợp axeton : n-hexan (5:95,v/v), hỗn hợp axeton : diclometan Đối với những mẫu có hàm lượng nước thấp dung môi chiết có thể dùng hỗn hợp axeton: nước (65:35, v/v), thể tích dung môi có thể từ 100ml đến 200ml tùy phương pháp

Trong khuôn khổ đề tài, với mục đích phân tích đa dư lượng các thuốc BVTV trên đối tượng rau quả chúng tôi đẫ tiến hành khảo sát 3 dung môi khác nhau để sử dụng trong bước tách chiết etyl axetat, axeton và axetonitril với lượng mẫu là 20g

* Làm sạch:

Yêu cầu của bước tách chiết mẫu trong phương pháp phân tích đa dư lượng các thuốc BVTV phải tách chiết được nhiều loại thuốc BVTV cùng một lúc Tuy nhiên, trong quá trình chiết suất có rất nhiều tạp chất đi kèm theo vào dịch chiết, bước làm sạch được thực hiện với mục đích loại bỏ các tạp chất đi kèm mà vẫn giữ được chất cần phân tích Có hai phương pháp làm sạch thường được sử dụng:

- Chiết lỏng – lỏng: Quà trình chiết lỏng – lỏng cũng được xem như một bước làm sạch để loại bổ cơ chất thực vật dựa trên khả năng phân bố khác nhau của thuốc BVTV và các nội chất thực vật trong hai dung môi không hòa tan vào nhau Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng n-hexan bão hòa axetonitril để làm sạch dịch chiết

- Sắc ký cột: Cột hấp phụ có thể là silicagel với môi rửa giải là diclometan hoặc hỗn hợp etyl ete: petroleum ete (15:85, v:v), hoặc silicagel 10% H2O Ngoài ra còn có các chất làm sạch khác như florisil, oxit nhôm trung tính Trong một số phương pháp người ta làm sạch mẫu nhờ các chất nhồi cột SPE – C18, SPE – Florisil

Ưu điểm của các phương pháp này là tốn ít dung môi rửa giải, giảm giá thành, tuy nhiên những catridge chỉ dùng được một lần Kỹ thuật GPC là một kỹ thuật hiện đại, yêu cầu trang bị đồng bộ những ưu điểm của nó là tốn ít dung môi và cột sắc ký có thể dùng lại nhiều lần, nó rất thích hợp cho các bước làm sạch trong các phép phân tích đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

Trong đề tài này, dịch chiết sau khi qua bước làm sạch lỏng-lỏng ở trên được cho qua cột làm sạch, chúng tôi tiến hành khảo sát 4 loại cột: Florisil, Silicagen, Oxit nhôm, ENVI-Card/ LC-NH2, với dung môi rửa giải ở các phân đoạn khác nhau

Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 6

Bảng 6 Khảo sát cột làm sạch

Florisil diethyl ete : n-hexan 10ml

(15:85,v:v)

10ml diethyl ete : n-hexan (15:85,v:v)

Silicagen n-hexan : diclometan 10ml

(1 : 1, v:v)

10ml n-hexan : diclometan (1 : 1, v:v)

Envi-Card/LC-NH2

5ml toluene : ethyl axetat (2 : 8, v:v)

25ml toluene : ethyl axetat (2 : 8, v:v)

Việc lựa chọn cột đúng loại cột làm sạch và dung môi rửa giải là rất quan trong, nó phải đảm bảo loại bỏ được các tạp chát đi kèm và hiệu suất thu hồi của phương pháp đạt được phải cao

2.3.2 Quy trình ban đầu sử dụng để phân tích đa dư lượng thuốc BVTV

Chiết tách từ mẫu: Mẫu phân tích được chuẩn bị, đưa về nhiệt độ phòng, cắt

mẫu đến kích thước phù hợp, cân khoảng 20g mẫu cho vào cốc 500 ml, thêm 100 ml dung môi , đồng hóa khoảng 5 phút Dịch đồng hóa được lọc qua lớp trợ lọc CeliteTM

và giấy lọc 5C, dung dịch lọc được hứng vào bình chứa thủy tinh (A)

Chiết lỏng-lỏng: Dung dich A được chuyển qua phễu chiết 500 ml, thêm vào

7g NaCl, 50 ml dung môi n-hexan bảo hòa với acetonitril Tiến hành lắc 15 phút, để yên cho đến khi các lớp dung môi được phân tách hoàn toàn Loại lớp nước và lớp n-hexan, lớp dung môi ở giữa được lọc qua muối natri sunphat khan để loại nước vào bình cầu 300 ml (B)

Làm sạch và làm giàu mẫu:

Cô quay chân không dung dịch B ở nhiệt độ < 400C còn khoảng 2 ml-3 ml, thổi khô bằng khí nitơ sạch, cho 5 ml dung dịch rửa giải ngay lập tức để hòa tan cặn (C)

Cột làm sạch chiết pha rắn SPE được hoạt hóa bằng 10 ml dung môi thích hợp, Cho toàn bộ 5 ml dung dịch C vào cột, rửa giải bằng 25 ml dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải khoảng 2 giọt /giây

Dung dịch rửa giải được cô quay chân không <400C, thổi khô bằng khí nitơ sạch, đặt bình cầu vào khay đá lạnh, cho chính xác 2 ml acetone có chứa chất nội chuẩn triphenyl phosphate nồng độ 1ppm, chuyển vào lọ đựng mẫu và bơm vào máy GC/MS

2.3.3 Xác định khả năng thu hồi mẫu, LOD và LOQ

Nghiên cứu khả năng thu hồi mẫu bằng cách bổ sung một lượng mẫu chuẩn biết trước vào mẫu sau đó tiến hành các điều kiện phân tích như đã lựa chọn để đánh giá phương pháp

Xác định hiệu suất thu hồi :

100(%)

Trong đó : m1 - lượng chất xác định được có trong mẫu tự tạo (µg)

m2 - lượng chất xác định được trong mẫu trắng (µg)

mo - lượng chất chuẩn trong hỗn hợp dùng để cho vào mẫu tự tạo (µg)

R : Độ thu hồi (%)

Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) :

Giới hạn phát hiện (LOD) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95% ; thông thường LOD được lấy gấp 3 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu nhiễu đường nền

Giá trị LOD được tính :

LOD = 3 (N/S) x C

Trong đó : N - Độ nhiễu trung bình đường nền

S - Chiều cao pic của chất cần phân tích

C - Nồng độ chất

Giới hạn xác định (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng được trong điều kiện tiến hành phép thử Thông thường LOQ được lấy từ 3 đến 5 lần LOD

2.3.4 Các công thức tính toán các thông số

Nồng độ trung bình:

1

N

i i

x x

1

N

i i

x x s

x: Nồng độ trung bình của mẫu với n lần lặp lại

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

3.1 Lựa chọn mẫu và chất phân tích

Mẫu được lựa chọn ở đây là các loại rau quả trên thị trường tự do tại Hà Nội Đối tượng chất cần phân tích là các loại thuốc BVTV, tuy nhiên với số lượng các chủng loại thuốc BVTV rất nhiều, vì vậy chúng tôi chỉ có thể lựa chọn một số chất đại diện cho các nhóm chất cần phân tích bao gồm các nhóm Phốt pho hữu cơ, Clo hữu cơ, Pyrethroid, Cacbamate, các nghiên cứu sẽ được tiến hành trên các chất đã được lựa chọn

3.2 Nghiên cứu điều kiện chiết tách, làm sạch, làm giàu và lựa chọn chế độ phân tích trên GC

Việc chiết tách, làm sạch và làm giàu mẫu là khâu rất quan trọng cho mọi quá trình phân tích, đặc biệt là những chất phân tích có hàm lượng nhỏ trong mẫu (dạng

dư lượng) Ảnh hưởng của giai đoạn này rất lớn, có thể chiếm tới 70% sai số của cả quá trình phân tích Trong nội dung nghiên cứu của đề tài này, để đảm bảo cho việc chiết tách, làm sạch thuốc BVTV từ mẫu chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo các bước sau :

a Xử lý mẫu sơ bộ : Mẫu nghiên cứu được nghiền nhỏ bằng máy nghiền và

máy đồng hoá để phá vỡ tế bào và tăng cường khả năng tiếp xúc của mẫu với dung môi chiết ở bước tiếp theo, tạo điều kiện cho quá trình chiết mẫu được triệt để

b Chiết tách :

Chiết tách là bước cơ bản trong quá trình phân tích, mục đích của bước này là

sử dụng dung môi thích hợp cho việc chuyển toàn bộ chất cần phân tích vào dung môi chiết Có nhiều loại dung môi có thể sử dụng, tuy nhiên dung môi lựa chọn cần hoà tan tốt nhất các chất cần chiết và không tạo phản ứng hoá học với chất chiết Trên

cơ sở tài liệu tham khảo và thực tiễn nghiên cứu, những dung môi thường được sử

dụng gồm : aceton, acetonitril, n- hexan, ethyl acetat Việc lựa chọn phương pháp chiết tách trong phân tích dư lượng thuốc BVTV có vai trò rất lớn vì trong các mẫu thường chứa nhiều loại thuốc khác nhau, hơn nữa chúng ta thường không biết trước trong mẫu có chứa những loại thuốc gì Chính vì vậy dung môi chiết tách mẫu phải

có khả năng hoà tan nhiều loại, nhiều nhóm thuốc

Quá trình tiến hành khảo sát dung môi chiết tách được tiến hành như sau : Cân 20g mẫu trắng (mẫu không chứa các loại thuốc BVTV), bổ sung các loại thuốc BVTV đã chuẩn bị sẵn, cho dung môi chiết vào, đồng hoá mẫu bằng máy đồng hoá tốc độ cao (8000 đến 9000 v/ph) ; lọc hỗn hợp qua phễu lọc, sử dụng trợ lọc Celite ; tráng rửa cốc nghiền mẫu hai lần, mỗi lần bằng 20 ml dung môi chiết Lấy toàn bộ dịch lọc cho vào phễu chiết, thêm 7 g natri clorua, 100 ml dung dịch tách, lắc mạnh 5 phút Thu phần dung môi hữu cơ, phần nước cho tiếp 50 ml dung dịch tách tiếp tục tách lấy phần dung môi hữu cơ như trên Hỗn hợp thu được của cả hai lần chiết tách được loại nước bằng natri sulfate khan Sau khi loại nước đem dịch thu được cô quay chân không ở nhiệt độ < 400C, hòa tan cặn thu được bằng dung môi aceton có chứa chất nội chuẩn triphenyl phosphate 1ppm

Với mục đích tách chiết được nhiều loại thuốc BVTV khác nhau trong mẫu, trên cơ sở tham khảo tài liệu nghiên cứu, các tiêu chuẩn đã công bố, chúng tôi lựa chọn 3 loại dung môi để nghiên cứu khả năng tách chiết của chúng là acetone, acetonitril, ethyl acetate

Kết quả nghiên cứu được trình bầy ở bảng 7

B¶ng 7 Lùa chän dung m«i chiÕt

Dung môi chiết

Hiệu quả

Acetone Ehyl acetate Aceto nitril

- Khả năng chiết

Chiết tách được nhiều chất thuộc các nhóm khác nhau, có nhiều tạp trong quá trình chiết

Chiết tách được nhiều chất thuộc các nhóm khác nhau, hạn chế với các chất phân cực

Chiết tách được nhiều chất thuộc các nhóm khác nhau

- Độ thu hồi mẫu Đáp ứng được

yêu cầu

Đáp ứng được yêu cầu, hạn chế với các chất phân cực

Đáp ứng được yêu cầu

Kết quả thu được cho thấy :

Ở bước chiết suất nếu sử dụng dung môi acetone hiệu quả tách các chất là tương đối cao, tuy nhiên quá trình tách cũng sẽ kéo theo nhiều tạp chất gây khó khăn trong quá trình làm sạch về sau

Sử dụng dung môi ethyl axetate, độ thu hồi của các chất có tính phân cực sẽ thấp

Sử dụng dung môi acetonitril là tối ưu trong nghiên cứu này vì nó khắc phục được cả hai nhược điểm của hai loại dung môi kể trên

c Lựa chọn điều kiện làm sạch

Quá trình làm sạch của các chất nghiên cứu được tiến hành trên 4 loại cột chiết theo như qui trình của kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), kết quả được nêu ở bảng 8

Bảng 8 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của các loại cột làm sạch

(Sử dụng nội chuẩn là Triphenyl phosphate )

Hiệu suất thu hồi, (%)

Florisil

Cột Silicagen

Cột Nhôm ôxit

Cột ENVI- Carb/NH 2

109 Fluvalinate2 83,46 4,45 0,00 87,89

Nhận xét: Nhìn vào kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi ở bảng trên ta thấy:

- Đối với cột Florisil thì hiệu suất thu hồi đối với nhóm thuốc clo hữu cơ và

pyrethoid tương đối cao (>70%), nhưng đối với nhóm thuốc BVTV khác lại

có độ thu hồi thấp hoặc không tìm thấy Do vậy không thể dùng cột này để

làm sạch các mẫu nghiên cứu

- Đối với cột Silicagel thì cho hiệu suất thu hồi của nhóm thuốc photpho hữu cơ

và một số chất thuộc nhóm cacbamat có độ thu hồi khá cao (>70%), còn đối

với các nhóm thuốc BVTV khác lại có độ thu hồi thấp hoặc không tìm thấy

Do vậy cột này không được chọn để làm sạch các mẫu nghiên cứu

- Đối với cột Oxit nhôm, hiệu suất thu hồi của hầu hết các nhóm thuốc đều thấp

hoặc không tìm thấy Do vậy cũng không được chọn cho việc làm sạch các

mẫu nghiên cứu

- Hệ cột Envi-carb/LC-NH2 cho kết quả độ thu hồi của toàn bộ các chất nghiên

cứu khá cao (> 80%) Kết quả này phù hợp với điều kiện để làm sạch mẫu

phân tích các thuốc BVTV trong rau quả Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn hệ cột

Envi-carb/LC-NH2 để làm sạch trong quá trình phân tích các thuốc BVTV

trong các mẫu rau quả

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra quy trình phân tích đa dư

lượng thuốc BVTV trong rau quả theo sơ đồ sau:

Sơ đồ: Qui trình phân tích thuốc BVTV trong rau quả

Dung dịch lọc được chuyển vào phễu chiết 500ml

Lọc với lớp Celite

d Lựa chọn chế độ phân tích trên GC/MS

Trên cơ sở tham khảo tài liệu, quá trình thực nghiệm và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn chế độ phân tích cho dư lượng thuốc BVTV trên GC/MS như sau:

- Cột tách: BP – 5MS (AgilentTM Technologies Co.LTD) 0,25 x 30 m

- Nhiệt độ Injector : 2500 C

- Kiểu bơm: Không chia dòng

- Khí mang: Helium (99,999%)

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

- Thể tích bơm mẫu 1 microlit

- Chương trình nhiệt độ lò cột phân tích

Chương trình nhiệt độ

0 50 100 150 200 250 300 350