Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axit rosmarinic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống chức năng

Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu lá tía tô tại Việt Nam giàu axít rosmarinic và phương pháp xử lý nguyên liệu - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế ph

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

8798

Hà Nội - 12/2010

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABS: Độ hấp thụ ánh sáng

BVTV: Bảo vệ thực vật

EtOAC: Ethyl acetate

PA: Perilla aldehyte

RA: Axít rosmarinic

SS/A: Đường/Axít (Sugar/acid)

TÓM TẮT NHIỆM VỤ

1 Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất dịch chiết lá tía tô giàu axít

rosmarinic để ứng dụng sản xuất đồ uống chức năng

2 Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu lá tía tô tại Việt Nam giàu axít

rosmarinic và phương pháp xử lý nguyên liệu

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô

giàu axít rosmarinic

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu

axít rosmarinic

- Ứng dụng chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axít rosmarinic để sản

xuất thử đồ uống chức năng giàu axít rosmarinic

3 Phương pháp nghiên cứu và kết quả đạt được

3.1 Phương pháp nghiên cứu:

- Thu thập và sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý đánh giá thành

phần, đặc biệt thành phần RA của các mẫu lá tía tô từ các địa phương lân cận Hà Nội

- Các phương pháp vật lý, hóa học để xử lý nguyên liệu lá tía tô

- Sử dụng công nghệ trích ly để tách chiết RA trong lá tía tô

- Sử dụng các biện pháp hóa lý để nâng cao hàm lượng RA trong dịch

chiết lên 10%

- Sử dụng các biện pháp công nghệ để thu hồi dịch chiết từ lá tía tô tươi

để làm nguyên liệu sản xuất đồ uống từ lá tía tô

- Nghiên cứu sản xuất sản phẩm đồ uống từ lá tía có hàm lượng RA

0,05%

- Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý để đánh giá các chỉ tiêu

chất lượng sản phẩm

- Sử dụng các phép thử cảm quan để đánh giá chất lượng sản phẩm và

- thăm dò thị hiếu người tiêu dùng

3.2 Kết quả đạt được;

- Lựa chọn được nguyên liệu lá tía tô sạch, có hàm lượng RA cao

- Có được các thông số cho quá trình xử lý thu nguyên liệu bột lá độ ẩm

5%

- Có quy trình công nghệ chiết tách, thu hồi và cô đặc dịch chiết lá tía tô

đạt đến hàm lượng RA 10%

- Sản xuất thử nghiệm 5 lít dịch chiết từ lá tía tô có hàm lượng RA 10%

- Có dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm dịch chiết lá tía tô có hàm

MỞ ĐẦU

RA (Rosmarinic axít) là một hoạt chất sinh học quan trọng trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp thực phẩm Từ những nghiên cứu ban đầu vào năm 1958 về cấu trúc, con đường sinh tổng hợp cũng như hoạt tính sinh học của hợp chất, đến ngày nay con người đã thu được khá nhiều hiểu biết có ý nghĩa trong công nghệ sinh tổng hợp, chiết tách, thu hồi, và ứng dụng RA trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm Rosmarinic axít (RA), có công thức hóa học là C18H16O8, là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer Trong công nghiệp thực phẩm, RA là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo quản tự nhiên, chất chống ôxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn của các nước Châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc…và Việt Nam

RA được tìm thấy với một hàm lượng đáng kể trong họ thực vật

Boraginaceae, trong phân họ Nepetoideae của họ Lamiaceae Ngoài ra, RA cũng được tìm thấy ở các họ thực vật khác như trong các cây thuộc họ Blechnoceae

(Hausler và cộng sự, 1992), các thực vật bậc thấp như rêu (Takeda và cộng sự

1990) và trong loại Monocotyledonous thí dụ như cỏ biển thuộc họ Zosteraceae

và gần đây RA được phát hiện có trong họ Potamogetonaceae (Petersen) và họ

Cannaceae Các loại thực vật có hàm lượng RA đáng kể là Origanum vulgare

(họ bạc hà); Rosmariunus oficinalis (họ hương thảo), Salvia oficinalis (họ xô thơm), Melissa officinalis (họ húng chanh) và Perilla frutescems (họ tía tô) [21]

Perilla fruiescems hay tía tô là một cây gia vị và cũng là một loại cây thuốc

được trồng phổ biến tại Việt Nam Cây tía tô phù hợp với nhiều vùng khí hậu, địa hình khác nhau Với sự phổ biến của tía tô cùng với hàm lượng đáng kể RA

có mặt trong các bộ phận của cây, tía tô là một nguồn nguyên liệu tiềm năng để tách chiết RA ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp thực phẩm Nhằm mục đích tạo ra sản phẩm đồ uống thảo dược mới có giá trị kinh tế,

có tác dụng tốt cho sức khỏe người tiêu dùng, phù hợp với thị hiếu và xu hướng chiến lược của thị trường đồ uống, Trung tâm Thực nghiệm sản xuất và chuyển

giao công nghệ – Viện CNTP tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axít rosmarinic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống chức năng” với mục tiêu: Xây dựng được quy trình

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về axít rosmarinic: [27]

RA thường có mặt trong rất nhiều các loại thực vật như: các cây thuộc

loài Boraginaceae, họ Lamiaceae, phân họ Nepetoideae; dương xỉ thuộc họ

Blenchnaceae; một số thực vật bậc thấp như rêu sừng (Takeda và cộng sự, 1990)

và trong cây một lá mầm như cỏ biển họ Zosteraceae ; họ Potamogetonaceae (

họ Cannaceae Simmonds và cộng sự, phát hiện) Sự phân bố này cho thấy sự có

mặt khá vphổ biến của RA trong thực vật

1.1.1 Thành phần cấu tạo:

Rosmarinic axít (RA), có công thức hóa học là C18H16O8, là một hợp chất polyphenol Dẫn xuất của RA thường là hợp chất tự nhiên chứa một hoặc hai phần tử RA cộng thêm thành phần chất thơm khác nhau được xác định từ các loài thực vật bậc cao hơn Dẫn xuất của RA được biết đến nhiều nhất có lẽ là lithospermic axít, là liên kết của RA và cafeic axít; và lithospermic axít B, một

RA nhị phân (Kelley và cộng sự, 1975; Tanaka và cộng sự, 1989)

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của axít rosmarinic

1.1.2 Các tính chất vật lý, hóa học:

RA là ester của axit caffeic với R -(+)-3-(3,4-dihydroxylphenyl)lactic axít Ở dạng tinh thể, nó là một chất bột màu đỏ cam, tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực RA có khối lượng phân tử là 360,31 g/mol; điểm nóng chảy là

171 – 1750C

1.1.3 Các tính chất chức năng: [28], [29]

Hai tính chất chức năng nổi bật của RA là chống ôxi hóa và kháng khuẩn Tính chất chống ôxi hóa của RA đã được biết đến từ khá lâu cùng với hệ các axít cinimic – một nhóm chất có tính chất polyphenol Một số nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chứng minh axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa cực mạnh, có khả năng chống lại quá trình peroxy hóa nguy hiểm của màng sinh học So với axit cafeic và các dẫn xuất khác có cùng bản chất, axit rosmarinic là một trong những chất ức chế mạnh phản ứng 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl (DPPH)

Ở hàm lượng 15 mg/l - 25 mg/l dung dịch RA có khả năng diệt khuẩn cao Axit rosmarinic cung cấp hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đáng chú ý

đối với Bacillus subtilis, Microccocus luteus và E.Coli Hợp chất này cũng được

xem như có hiệu quả trong việc giảm viêm nướu và mảng bám như chất chống oxy hóa và chống viêm tổng hợp chống ebselen (2 phenyl 1, 2 benzisoselenazol

3 (2H)- one) khi được điều trị tại chỗ Hoạt tính kháng khuẩn và giảm viêm của

RA cũng là lý tưởng đối với các nhiễm trùng da tại chỗ của biểu bì và niêm mạc miệng

1.1.4 Công nghệ sản xuất axít rosmarinic: [5], [8], [11], [23],

RA có thể được tổng hợp bằng phương pháp hóa học từ các thành phần cấu tạo: axít caffeic và 3,4 dihydroxylphenyllactic axít, hoặc được chiết tách từ thực vật giàu RA Từ trước khi cấu trúc hóa học của RA được xác định, hợp chất này cũng như các dẫn xuất đã được biết đến như là labiatengerbstoffe, một

loại tannin thuộc họ Lamiaceae Hợp chất này được mô tả là catechin cô đặc

hoặc gallo hay ellagitannin, nhưng có chứa caffeic axít Ngay sau đó, hai nhà hóa học người Italia là Scarpati và Oriente (1958) đã lần đầu phân định được RA

tinh khiết và đặt tên theo tên loại thực vật đã được họ sử dụng là Rosmarinus

officinalis Kết quả cho thấy RA là hợp chất của một ester của axit caffeic và

chuyển hóa thành RA Đồng thời các nghiên cứu cũng cho thấy, caffeic axít được hình thành từ phenylalanine và 3,4-dihydroxyphenyl lactic axít hình thành

từ tyrosine ( Ellis và Tower, 1970) Kết quả này được lặp lại trong nhiều thí

nghiệm tương tự trên môi trường là cây thuộc họ Coleus Blumei ( Razzaque và

Ellis, 1977) Quá trình tổng hợp hóa học RA được bắt đầu nghiên cứu từ rất lâu

và chỉ mới có một số kết quả được ghi nhận vào năm 1991 bởi Albrecht (Zinsmeister và cộng sự, 1991) Kể từ đó, một số RA và dẫn xuất đã được tổng hợp bằng phương pháp hóa học thí dụ như methyl ester, một loại stereoisomers khác hoặc một số ít là hydroxylated isorinic axít (Matsuno và cộng sự, 2002)

a Cơ chế sinh tổng hợp axit rosmarinic [26], [27]

Một số enzyme được cho là ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp RA: CoA-ligase, CoA-thioester, D-lactate dehydrogenase hay cụ thể hơn là D-hydroxyisocaproate dehydrogenase Phenylalanine được chuyển hóa thành dạng hydroxylcinnamic axít hoạt động bởi enzyme theo con đường cơ bản là phenylpropanoid được biết từ các quá trình sinh tổng hợp khác, thí dụ như flavonoid hoặc lignin Sự tích lũy xảy ra lên tới 21% RA trên tổng trọng lượng khô của tế bào chỉ trong mười ngày nuôi cấy trên môi trường B5 có hàm lượng sucrose cao (Ulbrich và cộng sự, 1985; Petersen và cộng sự, 1994)

Nuôi cấy tế bào thực vật

Nghiên cứu của Llieva và Pavlov, 1997: nồng độ đường trong môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và sự tích lũy rosmarinic axit của Lavandula.vera Kết quả thí nghiệm chỉ ra môi trường nuôi cấy với nồng độ đường 7% tốt nhất cho sự phát triển và tích lũy rosmarinic axit trong tế bào loại cây này

Nghiên cứu của Karam và cộng sự, 2003 về sự tích lũy rosmarinic axit trong mô sẹo, tế bào nuôi cấy trên môi trường đặc và rễ cây của Salvia Fruticosa Tiến hành nuôi cấy tế bào tạo mô sẹo, mầm từ lá cây trong môi trường MS chứa thidiazuron (TDZ) với các nồng độ khác nhau và indole 3-acetic acid (IAA) ( 0 hoặc 3µM) Kết quả sau 5 tuần là mô sẹo phát triển tốt nhất với hiệu suất tích lũy rosmarinic axit cao ( 2,12mg/100 mg trọng lượng khô)

Nghiên cứu của Xu và cộng sự, 2008: nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào trên môi trường đặc Agastache rugosa cho kết quả: trên môi trường dung dịch B5 bổ sung 2mg/l 2,4-D và 0,1mg/l BAP sau 10 ngày tế bào phát triển tốt nhất với hàm lượng rosmarinic axit tích lũy cao nhất là 11,5mg/g

Nuôi cấy mô mầm

Nghiên cứu của Eguchi và cộng sự, 1996: Nhân dòng vô tính tế bào của Lamiaceae từ nhiều mô mầm bằng 1mg/l benzylaminopurine trên môi trường

MS chuẩn có 3% đường Dưới điều kiện này, 7-10 mô mầm được cấy truyền để tiến hành tái nhân bản Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS chứa hormone

tự do cho thấy Pseudomonas sp gián tiếp kích thích sản xuất phenolic và

rosmarinic axit trong mô mầm

Xử lý bằng chất mồi sinh học một số nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp rosmarinic axit sử dụng chất mồi như: dimethyl sulfoxide (DMSO) với các nồng

độ, pythium aphanidermatum hoặc với methyl jassmonate kết hợp với bổ sung cao dịch chiết cao nấm men đậm đặc với tỉ lệ 4-6 g/l cho kết quả lượng axít rosmarinic lượng thu được tăng từ 5-7 lần so với mẫu đối chứng

b Thu hồi axít rosmarinic từ nguồn thực vật: [7], [5], [27],

Bên cạnh xu hướng công nghệ đang được nghiên cứu là tạo giống thực vật có khả năng sinh hàm lượng RA cao bằng công nghệ sinh học, hoặc sử dụng các tế bào thực vật để sinh tổng hợp RA, phương pháp thu nhận RA phổ biến nhất hiện nay đang được sử dụng là sử dụng dung môi trích ly RA từ nguồn thực vật

Các nguồn thực vật có hàm lượng RA cao thường được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất RA là: cây húng chanh (balm), cây hương nhu, … Các dung môi thường được sử dụng là etanol, metanol, propanol và nước tùy theo mục đích sử dụng và yêu cầu của sản phẩm

Chiết tách và tinh sạch RA: Wang, Provan và Helliwell, 2004; Yilmaz và Toledo, 2004: sử dụng dung môi hữu cơ để chiết tách các hợp chất phenolic bao gồm cả rosmarinic axit trong thực vật

Ammann, Hinz, Addleman, Wai và Wenclawiak, 1998; Seidel, 2006: sử dụng chưng cất lôi cuốn hơi nước và carbone dioxide siêu tới hạn ( SC- CO2) để chiết tách rosmarinic axit từ thực vật Phương pháp này có hạn chế do chưng cất lôi cuốn hơi nước làm oxy hóa polyphenolic do nhiệt độ sử dụng chiết tách cao; SC-CO2 có tính kỵ nước cao nên việc chiết tách polyphenolic gặp khó khăn Boyadzhiev và Dimitrova, 2006: sử dụng lọc màng để cô đặc chọn lọc

Bruno Zelic và cộng sự, 2004: thu hồi và tinh chế rosmarinic axit từ hương thảo sử dụng phương pháp thẩm tích điện từ Tuy nhiên, phương pháp này được đánh giá là chưa thích hợp khi sử dụng để thu hồi và tinh chế rosmarinic axit từ cả dung dịch nước và chất khô của hương thảo Nguyên nhân chính là do sự cân bằng hằng số phân ly cho rosmarinic axit thấp nên độ dẫn điện thấp

Kumaran và Karunakaran, 2007: tinh sạch rosmarinic axit từ Coleus

aromaticus sử dụng nhựa Sepadex LH -20, rửa giải bằng nước, sau đó cô đặc

trong methanol và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của rosmarinic axit thu được

Kim, Lee, Shin và Hug, 1999: chiết xuất rosmarinic axit từ Agastache

rugosa được tinh chế bằng nhựa Sephadex LH 20, rửa giải bằng nước

Elena Kovacheva, Milen Georgiev và cộng sự, 2004: tinh sạch dịch chiết rosmarinic axit từ sinh khối tế bào Lavandula vera Thí nghiệm được tiến hành hấp phụ trên các loại nhựa Amberlite XAD khác nhau và trích ly bằng ethylacetate Mẫu tiến hành hấp phụ trên Amberllite XAD -7 và rửa giải bằng ethanol 80% có 29,8% là rosmarinic axit, độ tinh sạch cao hơn 7,7 lần so với mẫu đối chứng Độ tinh sạch của mẫu cao hơn đối chứng 18,7 lần khi chiết bằng ethylacetate Kết tủa rosmarinic axit dưới dạng Canxi rosmarinate cho kết quả tốt

Kyoung Heon Kim và cộng sự, 2009: trích ly lá húng chanh ( Melissa oficinalis) bằng methanol sử dụng phương pháp hấp phụ bề mặt Dịch chiết rosmarinic axit sau đó chạy qua cột nhồi Sephadex LH -20 và rửa giải bằng methanol 100% Rosmarinic axit thu được có độ tinh khiết là 38,8%, tăng 3,1 lần so với mẫu đối chứng, hiệu suất là 43,8%

Một số xu hướng mới trong nghiên cứu sản xuất RA là:

- Ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống thực vật có hàm lượng RA cao, hoặc sinh tổng hợp RA bằng phương pháp nuôi cấy tế bào

- Chiết tách RA từ thực vật sau đó dùng công nghệ cao: lọc màng, hoặc điện phân có màng ngăn thu RA

- Chuyển RA thành các dạng dẫn xuất có hoạt tính cao hơn như rosmarinyl glucoside với khả năng chống ôxi hóa cao hơn nhiều lần

1.1.5 Một số ứng dụng của axít rosmarinic trong y tế và thực phẩm chức năng: [14], [23], [27], [29]

Vai trò của axit rosmarinic trong các chế phẩm chống oxy hóa đã được khá nhiều nghiên cứu đề cập đến Axít rosmarinic thuộc nhóm polyphenols có tác dụng chống o xy hóa và kháng khuẩn Theo nghiên cứu của Đại học bang Michigan Hoa Kỳ, hợp chất axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa tốt ở nồng độ 10 microM Các tác dụng chống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn

so với vitamin E Axít rosmarinic giúp ngăn ngừa các thiệt hại gây ra bởi các gốc tự do của tế bào, do đó làm giảm nguy cơ ung thư và xơ vữa động mạch

RA có một số hoạt tính sinh học chính là chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus ( Parnham và Kesslring, 1985) RA từ dịch chiết của cây thuộc họ bạc hà được sử dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm vi rút Herpes Khả năng chống viêm của rosmarinic do tác dụng ứng chế enzyme lipoxygenase

và cyclooxygenase của dung dịch có mặt RA (Parnham và Kesselring, 1985) Khi được truyền tĩnh mạch, RA nhanh chóng bị loại bỏ khỏi dòng máu lưu thông, gây độc rất thấp khi thử nghiệm trên chuột RA thường được dùng để hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày tá tràng, viêm khớp, ung thư, đục thủy tinh tế, viêm khớp dạng thấp, dị ứng và bệnh hen phế quản

Khả năng chống oxy hóa của RA đã được chứng minh mạnh hơn so với vitamin E RA giúp ngăn ngừa sự tổn thương tế bào gây ra bởi các gốc tự do, do

đó làm giảm nguy cơ ung thư và xơ vữa động mạch Hợp chất này còn có thể ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào u bướu cũng như có khả năng chống oxy hóa tốt, có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng vào công nghiệp hóa mỹ phẩm

Dịch chiết từ tía tô, giàu axit rosmarinic qua những thử nghiệm lâm sàng (Sangongi và cộng sự, 2004) đã cho thấy uống RA can thiệp hiệu quả đối với bệnh nhân bị hen suyễn dị ứng Youn J và cộng sự (2003) cũng đã chứng minh

RA ức chế sự viêm màng hoạt dịch ở chuột, do đó có lợi cho việc điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp Không giống như các thuốc kháng histamine khác, RA ngăn cản sự kích hoạt tế bào miễn dịch đáp ứng thường gây sưng và hình thành các chất lỏng

RA cũng thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm do nó có đặc tính chống ôxi hóa và kháng khuẩn Với đặc tính chống ôxi hóa, RA có tác dụng hỗ

1.2 Tổng quan về cây tía tô: [1],[2] [11], [16], [20], [21], [22], [23], [25]

Tía tô hay còn được gọi là é tía, tử tô, xích tô, perilla, purple, common

perilla, pérille…tía tô có danh pháp khoa học là Perilla frutescens thuộc giới

Plantae, bộ Lamiales, họ Lamiaceae, phân họ Nepetoideae, bộ Elsholtzieae, chi Perilla [1],[2]

Tía tô là một trong những cây gia vị được trồng rộng rãi và sử dụng đại trà ở Châu Á, đặc biệt là Đông Á, rau tía tô được xem như một loại gia vị không thể thiếu trong nhiều món ăn truyền thống ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Tía tô còn là một cây nguyên liệu quan trọng để lấy dầu cũng như là một loại dược liệu cổ truyền có nhiều tác dụng hữu ích, đặc biệt là nên y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản [20], [21], [22]

Có 4 loại chính gồm:

- Perilla frutescens var crispa

- Perilla frutescens var frutescens

- Perilla frutescens var hirtella

- Perilla frutescens var purpurascens

Dựa trên mục đích sử dụng, tía tô được chia thành hai loại chính là Perilla

frutescens var frutescens thường được trồng để lấy dầu thường có hạt lớn và

mềm và Perilla frutescens var crispa được dùng để làm thuốc trong y học cổ

truyền, thân có nhiều nhánh nhỏ, hạt nhỏ và cứng.[1]

Hình 1.2 Perilla frutescens var Frutescens Hình 1.3: Perilla frutescens var crispa

1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái:

Cây tía tô có một số đặc điểm chính như sau [1], [2] :

- Cây nhỏ, cao 0,5 – 1 mét Thân vuông, mọc đứng, phân cành nhiều, có rãnh dọc và có lông.Lá mọc đối, hình bầu dục, dài 2 – 3 cm gốc tròn, dầu

nhọn, mép khía răng và uốn lượn, mặt trên xanh lục, ở dưới màu tía, có khi cả hai mặt đều tía có lông; cuống lá dài Khi vò ra, lá có mùi thơm đặc biệt

- Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, dài 6 – 20 cm; lá bắc hình mác, dài hơn hoa; hoa nhỏ, màu trắng hay tím; đài hình chuông

- Quả ( hạt) hạch nhỏ, hình cầu, đường kính dao động từ 1,11mm tới 2,47

mm, trung bình là 1,68mm

Hình 1.4: Tía tô

1 Đoạn cành mang lá và hoa; 2 Hoa; 3 Quả; 4 Hạt

Tía tô là cây mọc hằng năm, gieo hạt sau lập xuân (tháng 1 - 2) với 20 - 30 kg/ha hạt giống, tháng 3 - 4 đã hái được lá lần đầu, bón phân tưới nước để hái thêm 2 - 3 lần, mùa hoa, quả chính là tháng 5- tháng 8

Dựa trên những đặc điểm về màu lá, mùi hương, độ cứng và kích thước của hạt, người ta thường chia tía tô thành các nhóm [2]:

- Loại tía tô lá màu xanh, hạt cứng,không có terpenoid của perillaldehyde (PA) là chất tạo nên mùi thơm dễ chịu của tía tô, có mặt trong dầu thơm của tía tô Loại tía tô này có kích thước hạt lớn, thường được trồng để lấy dầu

- Loại tía tô lá màu xanh, không có PA, hạt mềm, kích thước lớn, được dùng để lấy dầu

- Loại tía tô lá đỏ, có PA, hạt cứng, kích thước nhỏ, được trồng để làm thuốc và làm gia vị

1.2.2 Vùng trồng và sản lượng: [20], [21], [22],

Tía tô được phân bố dọc theo dãy Hymalaya của Ấn độ, Bhutan, Pakistan

và Nepal, phía bắc Đông Nam Á như Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam; Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan Gần đây, tía tô được đưa vào Châu Âu, Nga và Mỹ như một loại cây lấy dầu hoặc cây gia vị trồng trong vườn Tía tô được sử dụng như một loại hương liệu trong chế biến thực phẩm, là nguồn nguyên liệu ép dầu, là nguồn dược liệu quý trong điều trị một số bệnh như hen suyễn, cảm, viêm khớp, dị ứng…

Tía tô được ghi nhận lần đầu trong thư tịch cổ của Trung Quốc vào thế kỷ thứ 5- thứ 6 [4], là cây ưa sáng và ưa ẩm, thích nghi với những vùng khí hậu ôn hòa, nhiệt độ trung bình từ 18 -250C Loại cây này mọc chủ yếu ở vùng khí hậu

ôn hòa, có nguồn gốc từ vùng núi Ấn Độ và Trung Quốc, sau được nhân trồng ở nhiều nơi trên Thế giới ở cả Châu Á, Châu Âu và Châu Mỹ Tại Châu Á, tía tô được trồng hoặc mọc hoang ở vĩ độ chủ yếu từ 36 đến 42 độ vĩ bắc đối với cây lấy dầu và được trồng hoặc mọc hoang trên núi cao đối với cây dùng làm thuốc Các quốc gia trồng nhiều loại cây này là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nepal, Pakistan, Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam [20], [21], [22], [25]

Tại Nhật Bản, tía tô được trồng chủ yếu ở tỉnh Hokkai, Miyagi, Fukushima, Nagano, Tokyo, Shiga, Osaka, Nara, Hiroshima, Kyoto, Nagasaki, Wakayama, Kochi, Fukuoka, và Okinawa Sản lượng tía tô hàng năm tại Nhật là 10.000 tấn Người Nhật thường gọi tía tô là aojiso, aobam hoặc aoshiso Nó thường được dùng để ăn với món sashimi, một món ăn truyền thống từ hải sản của Nhật, cũng như thường được dùng như một loại rau gia vị trong salad, mì ống, thịt và các món ăn từ cá khác Năm 2009, hãng Pepsi tại Nhật Bản đã cho ra một loại nước giải khát mang hương vị tía tô là pepsi tía tô Trong y học cổ truyền Nhật Bản, tía tô được sử dụng như một hoạt chất chữa bệnh dị ứng, hen suyễn do dị ứng, viêm khớp và bước đầu ứng dụng để điều trị bệnh alzheimer [22]

Tại Hàn Quốc, tía tô được trồng chủ yếu ở các tỉnh Kangwon, Kyonggi, Kyongsangbuk, Chungchongnam, Chungchongbuk, Chollanam và Jeju Diện tích trồng năm 1001 tại Hàn Quốc là 40.800 ha, số lượng hạt giống thu được là 770kg/ha, sản lượng đạt gấp đôi năm 1993 Ngoài những ứng dụng trong y học, trong thực phẩm, tía tô được sử dụng như một loại cây lấy dầu và cây gia vị Dầu từ tía tô được sử dụng phổ biến tương tự dầu mè trong chế biến thực phẩm Hạt tía tô được dùng sau khi nấu chín trong bữa ăn, trong đồ nướng cũng như

dùng làm thành phần tăng hương vị của đồ ăn cùng với vừng và muối Tía tô được dùng như một trong những thành phần không thể thiếu trong ẩm thực Hàn Quốc [22]

Tại Trung Quốc, tía tô được trồng nhiều ở các tỉnh Yunnan, Zheng Ning, Guangdong và Guangxi Diện tích trồng hàng năm chỉ riêng tại tỉnh Zheng Ning là 110.000 ha với sản lượng hàng năm trên 10.000 tấn.Tại nước này, tía tô

là một loại dược thảo cổ truyền trị cảm, nhức mỏi, ho suyễn và tạo hưng phấn

Nó cũng là loại gia vị dân dã được sử dụng hết sức phổ biến trong điều chế thuốc đông y cũng như chế biến và bảo quản thực phẩm

Tại Việt Nam, tía tô là một loại cây gia vị quen thuộc được sử dụng trong chế biến thực phẩm, trong trang trí món ăn hoặc ăn sống Tại Việt Nam, theo Vũ Xuân Phương [2000], tía tô gồm nhiều giống khác nhau, mọc tự nhiên và được trồng ở nhiều nơi khắp cả nước nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình… , ở miền Nam, tía tô được trồng nhiều

ở Bình Chánh, Củ Chi, Hóc Môn Ở miền Bắc, do nhu cầu sử dụng tía tô làm gia

vị, cây được trồng quanh năm ở các vùng ngoại thành như Đông Dư ( Gia Lâm); Hoàng Liệt ( Thanh trì); Duyên Hà (Thanh Trì), Hà An ( Giang Biên, Long Biên); Vân Nội ( Hà Nội )…

1.2.3 Thành phần hóa học và hàm lượng axít rosmarinic trong lá tía tô: [1],

Thành phần hóa học của tía tô bao gồm các chất bay hơi, chất màu và một

số thành phần khác có hoạt tính sinh học Các chất này bao gồm terpenoid, phenol, flavonoid, cyanogenic glycosides và anthocyanin Trong vài năm gần

perillosides A và C và gần đây là monoterpene glucoside trên đường 5 cacbon tồn dư và mối quan hệ với cấu trúc động của chúng cũng đã được chứng minh

Bằng các phương pháp phân tích hiên đại được ứng dụng gần đây trong phân tích hóa học như GC, TLC, HPLC, IR, UV, MS , NMR, các hợp chất có trong tía tô được chia thành hai nhóm thành phần chính là chất bay hơi và chất không bay hơi Nhóm hợp chất không bay hơi được chia thành năm nhóm gồm terpenid, phenolic, flavonoid glycosides và các thành phần khác Thành phần bay hơi trong lá tía tô được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Có 4 loại chính là mono và sesquiterpenes, phenylpropanoid và furylketones Nói chung các chất này được chia thành 6 loại riêng biệt dựa trên thành phần hợp chất bay hơi chính ( Honda, 1994) gồm perillaldehyde (PA); Elsholtziaketone (EK); perillaketone hay isogomaketone (PK); Citral ©; và PP ( một hoặc nhiều gốc phenylpropanoid đặc biệt là myristicin, dillapiole và elemicin); PL ( chứa perillene ) Nhóm PA gồm perillaldehyde chiếm 71%, limonene chiếm 9,3% và caryophyllene chiếm 5,8% , sesquiterpene với nhóm

PP gồm myristicin chiếm 52,7% và caryophyllene chiếm 38,2% phần monoterpenoid ( Nishizawa và cộng sự , 1992)

Hàm lượng axít rosmarinic trong các cây tía tô và một số thực vật khác cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu xác định Theo kết quả thu được của các nhà khoa học Nhật Bản tại hàm lượng rosmarrinic trong lá tía

tô là 3,95 ± 0,42 mg/g Hàm lượng axít rosmarinic trong hạt tía tô là 0,2475mg

và trong dầu tía tô tương ứng là 0.0794mg/g Các nhà khoa học tại Viện Khoa học thu hoạch quốc gia Hàn Quốc đã công bố kết quả phân tích trên 203 giống tía tô trồng tại Hàn Quốc, kết quả thu được, hàm lượng rosmarinic dao động trong khoảng 15,7 đến 2717 µg/g

1.2.4 Một số nghiên cứu về RA từ lá tía tô: [6], [8], [11], [17], [29]

- Nghiên cứu xác định và đánh giá hàm lượng RA trong các loại nguyên liệu từ tía tô: phương pháp phổ biến để phân tích hàm lượng axít rosmarinic trong thực vật được sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với pha động phổ biến là methanol, TFA (Trifluoroacetic acid),

- Nghiên cứu chiết tách RA từ nguồn nguyên liệu tía tô

- Nghiên cứu về tính chất chức năng của RA từ nguồn nguyên liệu tía tô

1.2.5 Ứng dụng của lá tía tô trong y học và thực phẩm truyền thống:

Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, lá tía tô có tác dụng làm toát mồ hôi và trừ hàn, điều hòa chức năng dạ dày, chữa cảm hàn với ho và nôn, nôn do thai nghén, tiêu chảy, ngộ độc cua cá Ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản… tía tô được coi như có tác dụng an thần, chống co thắt, làm tot mồ hôi, chống dị ứng , chữa nhức đầu và rối lọan hoạt động tử cung Tía tô cũng được dùng làm thuốc

ra mồ hôi, giải biểu, hành khí, giải độc tôm cá

Theo y học cổ truyền Việt Nam, cả thân, lá và hạt tía tô đều là những vị thuốc hay Theo đông y, tía tô có vị cay, mùi thơm, tính ấm, vào hai kinh phế và

tỳ, có tác dụng phát tán, phong hàn, hành khí, hóa trung Lá tía tô được gọi là tô diệp, thân là tô ngạnh, quả là tô tử Các bộ phận này khi thu hoạch được phơi trong râm mát hay sấy nhẹ cho khô để giữ nguyên mùi vị

Lá tía tô được dùng chữa cảm mạo, không có mồ hôi, phong hàn, ho nhiều đờm, ngạt mũi, nhức đầu, tiêu hóa kém, nôn mửa, đau bụng, động thai, ngộ độc Cành tía tô có tác dụng như lá nhưng kém hơn Hạt tía tô chữa ho có đờm, hen suyễn, tê thấp Liều dùng ngày 3 - 10g lá và hạt, 6 - 20g cành, dạng thuốc sắc và xông Có thể uống nước hãm 15 – 20g lá tươi hoặc thái nhỏ 10 lá tươi trộn với cháo nóng ăn

Thân tía tô điều hòa lưu thông khí, làm giảm rối loạn chức năng dạ dày, giảm đau, phòng ngừa sẩy thai Chủ trị : tức thở ở ngực và đau vùng thượng vị với cảm giác nóng, nôn, đe dọa sẩy thai Hạt tía tô làm giảm khó thở và giảm ho, trừ đờm, làm thư giãn rụôt Chủ trị : ho và khó thở do ứ trệ đờm, táo bón Lá tía

tô và thân non được dùng như rau gia vị hoặc rau xanh trong nhiều món ăn ngon, hấp dẫn.Hạt tía tô được dùng để ăn sống hoặc rang khô dùng trong nhiều mục đích khác nhau như làm gia vị, ép dầu…Tinh dầu tía tô có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loại vi sinh vật như tụ cầu vàng, trực khuẩn lỵ Flexner, trực

khuẩn lao, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, liên cầu tan máu, trực khuẩn lỵ

Shigela, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Candida albicans, trực khuẩn Coli,

phế cầu Đồng thời, nó có tác dụng diệt lỵ amip với nồng độ ức chế thấp là 1/1280

Dịch chiết methanol của tía tô có tác dụng kháng nấm Candida albicans

do có chứa một hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm là perilladehyd citral

1.2.6 Các sản phẩm ứng dụng trong y học hiện đại và thực phẩm chức năng:

a Trong y học hiện đại:

Một nghiên cứu của Sanbongi C và đồng nghiệp (Tạp chí Thử nghiệm lâm sàng và Dị ứng, 6/2004) đã cho thấy uống axit rosmarinic có hiệu quả đối với bệnh suyễn dị ứng Không giống như antihistamines, axit rosmarinic ngăn không kích hoạt các tế bào miễn dịch gây ra sưng và hình thành chất lỏng

Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng điều trị hàng ngày với 1,5 mg axít rosmarinic trong lá tía tô cho chuột có thể ngăn ngừa bệnh hen suyễn do dị ứng bụi Axít rosmarinic ngăn chặn sự gia tăng đáng kể IL-4, IL-5, và eotaxin trong dịch rửa phế quản và khí quản Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đi đến kết luận, uống axít rosmarinic từ tía tô có thể là một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh hen suyễn dị ứng bằng cách hạn chế phân bào và kháng thể đặc hiệu dị ứng

Axit rosmarinic đặc biệt ức chế các triệu chứng dị ứng theo mùa liên quan đến các chứng ngứa mắt và mũi Kết quả xét nghiệm chức năng thận và gan cho thấy axít rosmarinic không có tác dụng phụ Sử dụng axít rosmarinic trong điều trị các bệnh dị ứng theo mùa ở người hiệu quả, an toàn và ít tốn kém hơn so với thuốc chống dị ứng thông thường và hoàn toàn có thể thay thế đơn thuốc

Hiện nay tại Nhật Bản có khoảng hơn 210 chế phẩm thuốc dựa trên công thức thảo dược cổ truyền Kampo (thảo dược Kampo dựa trên y học cổ truyền Trung Quốc nhưng thích nghi với văn hóa Nhật Bản) có sẵn tại các hiệu thuốc Theo một khảo sát của Chiến dịch quốc gia phòng chống hen suyễn, 70% người

bị bệnh hen suyễn nặng sử dụng thuốc dựa trên công thức thảo dược Nhiều chế phẩm chống dị ứng được bào chế từ các bài thuốc Kampo truyền thống chứa acid rosmarinic và luteolin chiết xuất từ lá tía tô

b Trong sản phẩm thực phẩm chức năng:

Cây tía tô với thành phần hóa học chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, không độc nên là một nguồn nguyên liệu tự nhiên dùng làm thực phẩm chức năng được nhiều nhà sản xuất quan tâm Đặc biệt trong số đó, hoạt chất axít rosmarinic được coi là một thành phần chủ yếu của các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ lá tía tô

Các chế phẩm chống oxy hóa, chống lão hóa được bào chế từ hoạt chất sinh học axít rosmarinic có tác dụng khử các gốc tự do, kích hoạt các enzyme kháng ô xy hóa trong cơ thể Hiện nay, đã có rất nhiều sản phẩm thực phẩm

chức năng làm từ lá tía tô tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc Các sản phẩm này tập trung chủ yếu là các loại đồ uống, các loại trà, bột tía tô bổ sung vào bánh, kẹo, bột súp

Công ty Thực phẩm KODAMA Nhật Bản đã sản xuất đồ uống chiết xuất

từ lá tía tô và dịch cô đặc bổ sung vào các loại rượu Bên cạnh đồ uống, người Nhật Bản còn có món ăn có chứa lá tía tô như bột rắc cơm, các món súp, dưa muối

Tại Hàn Quốc, Trung Quốc cũng có rất nhiều công ty có các sản phẩm chức năng sản xuất từ lá tía tô chủ yếu đưa ra dưới trà, dạng bột, viên nén, đồ hộp như các công ty Sangsoo Herb, Milal Food, Dowoodang Pharmacy (Hàn Quốc); Naturalin Bio-resources, JoryHerb, Changsha Huancheng Biotech Inc., (Trung Quốc)

Ngoài các sản phẩm truyền thống như: bột, dầu, trà nhúng, trên thị trường thế giới đã xuất hiện sản phẩm đồ uống đóng chai từ lá tía tô

Hình 1.5: Một số sản phẩm đồ uống từ lá tía tô

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp hóa học:

2.1.1 Xác định hàm lượng axít rosmarinic bằng phương pháp so màu với

máy UV- Spectrophotometter:

a Nguyên tắc: axit rosmarinic tạo phức chất màu vàng sáng với Zr4+ ,có độ hấp

phụ màu trên máy spectrophotometer cao nhất ở bước sóng 362nm

b Hóa chất và thiết bị

Axit rosmarinic (97%) – Sigma –Aldrich ( Chemie, GmbH Steinheim, Đức)

Zirconium (IV) oxide chloride octahydrate (ZrOCl2.8H2O)- Merck (KgaA, Darmstadt, Đức)

Dung môi, hóa chất khác thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích

Máy Spectrophotometer: UV –Visible spectrophotometric Shimadzu 1601(Kyoto, Japan)

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuẩn của axit rosmarinic có nồng độ 10-3M (0,0901g hòa tan trong cồn và định mức tới 250ml)

Dung dịch Zirconium (IV) oxide chloride: nồng độ 0,5M (hòa tan 1,6117g trong nước và định mức đến 10 ml bằng nước)

Dung dịch chiết tách mẫu: dung dịch methanol 0,125M pha trong ethanol 96%, pha trước khi dùng

Phương pháp chiết mẫu: 25 g mẫu khô ngâm trong 100 ml dung môi /lần, chiết 3 lần/24h Cô chân không loại hết dung môi Phần kết tủa hòa tan trong 100 ml ethanol 96%

* Dựng đường chuẩn axit rosmarinic:

Pha các mẫu dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượng là 50, 70, 125, 150, 175 và 200µl từ dung dịch tiêu chuẩn trong các ống mẫu khác nhau có dung tích 5ml, thêm 4,6ml ethanol, lượng dung dịch axit rosmarinic gốc với hàm lượng xác định và lượng ethanol = (200-x)µl Thêm dung dịch Zr ( nồng độ 200µl) vào mỗi ống chuẩn, trộn đều Sau 5 phút, đem xác định độ hấp phụ trên máy UV ở bước sóng 362nm, mẫu blank là nước cất tinh khiết Dựng đường chuẩn bằng phương pháp tính graph trên excel 2007 Tính chỉ số R

c Phương pháp tính: Nồng độ của rosmarinic acid trong dịch chiết được tính

bằng công thức sau, dựa trên đồ thị hàm lượng rosmarinic tiêu chuẩn:

Độ hấp thụ = [0,0266µM acid – 0,0269.]*R

2.1.2 Xác định hàm lượng axít rosmarinic bằng HPLC:

Mẫu chiết được để trong 12h ở 4°C, ly tâm 5000 vòng/phút Lọc qua màng lọc 0,2 µm

2.1.3 Xác định dư lượng thuốc BVTV bằng GC:

Hệ máy: Agillent 6890N MS: 5973i

T0 inject: 2500C ; Thể tích bơm mẫu : 10µl

2.1.5 Phân tích hàm lượng anthocyanin:

Lá tía tô tươi sạch: 20 g/mẫu, nghiền nhỏ, ngâm trong 200 ml dung dịch ethanol/nước (1:1) trong 60 phút Lọc sơ bộ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong

Bột lá, lá khô: 5 g/mẫu nghiền nhỏ, ngâm trong 200 ml dung dịch ethanol/nước (1:1) trong 60 phút Lọc sơ bộ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong

Anthocyanin tổng số được xác định theo phương pháp chênh lệch pH (Metivier et al., 1980)

a Nguyên tắc

Dựa trên sự phụ thuộc của màu sắc của anthocyanin vào pH Khi pH ≤ 1

≥

b Tiến hành

Lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành pha loãng 10 lần với cả 2 dung dịch đệm ở trên, trường hợp màu đậm quá có thể pha loãng trước bằng nước cất hoặc pha loãng nhiều lần hơn bằng dung dịch đệm Sau đó đặt ở chỗ tối trong vòng 1 giờ cho màu sắc ổn định Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 524nm với mẫu trắng là các dung dịch đệm tương ứng

f - Hệ số pha loãng

2.2 Phương pháp vật lý:

- Xác định độ hấp thụ ánh sáng ánh sáng của dung dịch chiết: Lấy 5 ml dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH = 1,0 trong bình định mức

25 ml, lọc qua màng 0,45 µm, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến (λ =

450 – 720 nm) trên máy quang phổ UV - Vis, kết quả thu được Bước sóng hấp thụ cực đại và độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng cực đại λmax = 524 (nm) Đo độ hấp thụ ánh sáng tại 524 nm

2.3 Phương pháp vi sinh:

Theo TCVN 5042:1994: Nước giải khát Yêu cầu vệ sinh Phương pháp thử

- Phương pháp phân tích tổng số nấm men nấm mốc

- Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí

- Phương pháp phân tích phân tích E.Coli

- Phương pháp phân tích tổng số Coliform

2.5 Phương pháp công nghệ:

2.5.1 Xác định thành phần hóa học, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và hàm

lượng axít rosmarinic (RA) của lá tía tô tại các vùng nguyên liệu khác nhau

2.5.2 Nghiên cứu lựa chọn dạng nguyên liệu sơ chế:

- Các dạng nguyên liệu được thử nghiệm là: lá tía tô tươi làm sạch (bỏ cành, cuộng,), lá tía tô khô, lá tía tô cắt sợi khô, và bột lá tía tô

2.5.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách RA từ lá tía tô:

- Nghiên cứu xác định loại dung môi phù hợp: Dung môi sử dụng: Nước; ethanol, propan-2-ol

- Nghiên cứu xác định nồng độ (%v/v) của loại dung môi phù hợp

- Nghiên cứu xác định tỉ lệ khối lượng nguyên liệu/V dung môi

- Nghiên cứu xác định thời gian trích ly

- Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn

- Nghiên cứu số lần trích ly

2.5.4 Nghiên cứu nâng cao hàm lượng RA của dung dịch thu được:

- Nghiên cứu các thông số cho quá trình cô đặc chân không dung dịch: nhiệt độ, áp suất, thời gian quy trình chiết lại bằng các dung môi hữu cơ khác

2.5.5 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm dung dịch RA

từ lá tía tô

2.5.6 Nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống giàu RA từ lá tía tô:

- Nghiên cứu các điều kiện chiết tách thu dịch chiết lá tía tô: nồng độ muối, tỉ lệ lá/V dung dịch, nhiệt độ

- Nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống pha chế: chọn tỉ lệ phối chế dịch chiết

RA – xác định màu sắc, hương vị sản phẩm, xác định tỉ lệ SS/A được ưa thích, lựa chọn chất điều vị: chua, ngọt

- Nghiên cứu chế độ thanh trùng và bảo quản sản phẩm nước uống tía tô

2.5.7 Điều tra sơ bộ thị hiếu người tiêu dùng: Sử dụng phiếu điều tra

- Đường tinh luyện

- Đường: glucoza - Merck

- Axít citric, malic, latic, tartatric, ascorbic - Meck

- Ethanol, propan-2-ol; tOAc, n-butanol– Meck

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN:

Với mục tiêu đặt ra của đề tài là nghiên cứu công nghệ sản xuất dịch chiết có hàm lượng axít rosmarinic đạt nồng độ ≥ 10% và ứng dụng vào sản xuất đồ uống chức năng, đề tài sẽ tiến hành hai phần nghiên cứu chính :

- Phần 1: Nghiên cứu tạo sản phẩm dịch chiết từ lá tía tô có hàm lượng

RA ≥ 10%

- Phần 2: Dịch chiết có hàm lượng RA 10% có thể được bổ sung vào một trong rất nhiều dạng sản phẩm đồ uống: nước giải khát pha chế, nước quả, trà đóng chai thanh trùng, rượu vang, … Tuy nhiên với thời gian 1 năm, đề tài quyết định lựa chọn tạo sản phẩm đồ uống từ chính lá tía tô

và bổ sung dịch chiết hàm lượng axít rosmarinic đạt nồng độ ≥ 10% thu được để sản phẩm đồ uống có hàm lượng hàm lượng axít rosmarinic ≥ 0,05% với những lý do sau:

+ Sản phẩm dịch chiết không phải là dung dịch tinh sạch của RA 10% mà

là dịch chiết từ lá tía tô nên sản phẩm còn chứa một số các thành phần khác của lá tía tô Khi bổ sung dịch chiết này vào các sản phẩm đồ uống

có nguồn gốc nguyên liệu khác, các thành phần này có tác dụng với các thành phần của đồ uống đó tạo ra các sản phẩm không mong muốn và có ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng hay không, cần thời gian và nhiều thí nghiệm đánh giá Nếu sử dụng chính dịch chiết này cho sản phẩm đồ uống từ nước lá tía tô sẽ giảm thiểu tối đa sự khác biệt thành phần

+ Dịch chiết từ lá tía tô tươi là một loại đồ uống thảo dược truyền thống khá phổ biến ở Nhật Bản và Trung Quốc, được sử dụng phòng chống cảm cúm, nhức đầu, dị ứng, … và chưa ghi nhận hiện tượng ngộ độc Dịch chiết lá tía tô tươi có chứa cả 3 thành phần là: rosmarinic axít, màu (anthocyanin) và hương Sản phẩm đồ uống từ lá tía tô tươi có màu sắc đẹp, hương thơm hấp dẫn, không cần bổ sung hương và màu nhân tạo sẽ

là một sản phẩm mới nhiều ưu điểm

Do vậy, đề tài đã lựa chọn nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống từ lá tía tô tươi sau đó bổ sung dịch chiết chưa 10% RA tăng thêm tính chất chức năng cho sản phẩm đồ uống từ lá tía tô

3.1 Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu:

Lá tía tô được thu thập từ các địa phương tại Hà Nội và được phân tích hai chỉ số chính: hàm lượng RA và dư lượng thuốc BVTV Nguyên liệu được lựa chọn trên hai tiêu chí:

- Có hàm lượng RA cao: phục vụ cho quá trình nghiên cứu tạo sản phẩm dịch chiết giàu RA

- Cho dịch chiết có màu sắc (hàm lượng anthocyanin cao) và hương thơm đặc trưng

Đề tài đã tiến hành phân tích các chỉ tiêu: hàm lượng RA (mg/g lá tươi), anthocyanin và cảm quan hương của các nguyên liệu

Các mẫu lá tươi được cân 5g/mẫu Nghiền nhỏ, trích ly trong dung môi methanol/water/TFA (50:50:0.1) với tỉ lệ 1g/10 ml dung môi Trích ly trong 30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút – trong 5 phút, lục qua màng lọc 0,45 Dịch chiết thu được đưa đi phân tích bằng hệ HPLC

Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.1: Hàm lượng RA và dư lượng thuốc BVTV một số mẫu lá tía tô

Mẫu Hàm

lượng

RA (%

chất khô)

Anthoc yanin (%)

Tên thuốc BVTV

Hàm lượng thuốc BVTV

Cảm quan Vùng trồng

1 0,269 0,309 Cypermethrin

Cyhalothrin

3,25 0,06

Lá xanh, tím sẫm, mùi hơi hắc

Vân Nội – Đông Anh – Hà Nội

nhạt, mùi hắc nhẹ

4 0,279 0,311 Cypermethrin 2,20 Lá xanh, tím, mùi

thơm hắc đặc trưng

Hoài Đức - Hà Nội

mùi thơm hắc đặc trưng

Đông Dư – Hà

Nội

6 0,414 0,256 Cypermethrin 4,10 Lá xanh, tím,

mùi thơm hắc đặc trưng

Gia Lâm – Hà

Nội

7 0,244 0,300 Cypermethrin 3,23 Lá xanh, tím, mùi

thơm hắc đặc trưng

Đông Anh – Hà Nội

nhạt, mùi thơm hắc, hơi ngái

Đông Anh – Hà

Nội

9 0,310 0,285 Cypermethrin 3,24 Lá xanh, mùi

thơm hắc đặc trưng

Hải Dương

10 0,411 0,178 KPH - Lá xanh, tím rất

nhạt, mùi thơm rất nhẹ, hơi ngái

Hải Dương

Các giống tía tô được trồng ở Việt Nam chủ yếu thuộc Perilla frutescens

var Crispa, lá có đặc điểm một mặt xanh và một mặt tím Các mẫu lá được lấy

tại các vùng trồng rau gia vị quanh Hà Nội Đề tài lựa chọn nguyên liệu cho hai quy trình sản xuất:

- Đối với nguyên liệu để sản xuất dịch chiết giàu axít rosmarinic, yêu cầu

nguyên liệu có hàm lượng axít rosmarinic cao

- Đối với nguyên liệu để sản xuất dịch chiết lá tía tô sử dụng làm đồ uống,

nguyên liệu cần có hàm lượng anthocyanin cao

Từ kết quả thu được, có thể nhận thấy:

- Về hàm lượng RA, các mẫu lá tía tô có hàm lượng RA nằm trong khoảng từ

0,2 đến 0,4% chất khô Trong đó các mẫu: 2; 6 và 10 có hàm lượng axít rosmarinic cao nhất xấp xỉ 0,4% chất khô

- Về hàm lượng antocyanin, các mẫu 1, 3, 5 và 7 có hàm lượng anthocyanin

xấp xỉ 0,3%, tuy nhiên mẫu 5 có hương vị tốt hơn các mẫu còn lại

Nguyên liệu tía tô cũng đồng thời được kiểm tra với danh mục hơn 100 loại thuốc BVTV Kết quả bảng trên cho thấy, các mẫu tía tô chủ yếu bị nhiễm hai loại thuốc có gốc Cypermethrin và Cyhalothrin, chỉ có 3 mẫu 5, 8 và 10 đạt tiêu chuẩn không phát hiện dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

3.2 Nghiên cứu lựa chọn dạng nguyên liệu sơ chế:

Nguyên liệu lá tía tô được sơ chế thành các dạng như sau:

- Mẫu lá tía tô tươi: Lá được rửa sạch, bỏ cuộng, cành, phơi ráo nước

- Mẫu lá tía tô khô: Lá tía tô tươi được bỏ cuộng, cành, làm sạch và phơi ráo nước sau đó được sấy theo chế độ có đảo trộn: 500C – 2h nâng lên 700C – 6h nâng tiếp lên 800C – 4h đạt độ ẩm xấp xỉ 5%

- Mẫu bột lá: Lá tía tô khô được xay nhỏ với 0,05<d< 1 mm; độ ẩm xấp xỉ 5%

- Mẫu lá khô thái sợi: Lá tía tô khô được thái sợi trước khi sấy; độ ẩm xấp xỉ 5%

Mẫu được trích ly như sau : cân mỗi mẫu 5g, nghiền nhỏ, trích ly trong dung môi methanol/water/TFA (50:50:0.1) với tỉ lệ 1g/10 ml dung môi Trích ly trong 30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút – trong

5 phút, lục qua màng lọc 0,45 µm Dịch chiết thu được đưa đi phân tích xác định hàm lượng RA bằng hệ HPLC

Kết quả được đưa về hàm lượng mg/g lá tươi và so sánh với hàm lượng RA trong lá tươi để đánh giá sự hao hụt RA trong quá trình sơ chế

Bảng 3.2: Hàm lượng RA trong các mẫu nguyên liệu lá tía tô đã sơ chế

RA trong dịch chiết Quá trình sấy khô gần như không làm giảm hàm lượng rosmarinic, điều này cũng phù hợp với lý thuyết bởi RA là hợp chất khá bền nhiệt

Đề tài lựa chọn nguyên liệu bột lá tía tô sấy khô đến độ ẩm 5% làm nguyên

liệu cho quá trình chiết thu dịch giàu RA với những lý do như sau:

- Nâng cao được hàm lượng RA trong dịch chiết

- Tiết kiệm được thể tích dung môi và thể tích vật chứa

- Thuận lợi cho quá trình tàng trữ nguyên liệu

3.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ thu dịch chiết giàu RA từ lá tía tô:

3.3.1 Nghiên cứu chiết tách bằng dung môi: loại dung môi, tỉ lệ, thời gian

nhiệt độ, tốc độ khuấy trộn

a) Nghiên cứu xác định loại dung môi thích hợp cho quá trình trích ly RA từ

bột lá tía tô:

Đề tài đã tiến hành nghiên cứu sử dụng loại dung môi phân cực đồng thời

an toàn cho chế biến thực phẩm là: nước, ethanol, propan-2-ol cho quá trình

chiết tách, đồng thời nghiên cứu tỉ lệ thể tích nước/dung môi

Các mẫu được chuẩn bị với tỉ lệ: 4g bột lá/100 ml dung môi Thử nghiệm

với dung môi ở nhiệt độ 300C và nhiệt độ nhỏ hơn nhiệt độ sôi của dung môi

100C, thời gian chiết là 2h

Bảng 3.3-1: Nghiên cứu khả năng hòa tan RA của một số dung môi ở

Bảng 3.3-2: Nghiên cứu khả năng hòa tan RA của một số dung môi ở

Kết quả cho thấy:

- Ở nhiệt độ 300C: Nước là dung môi hòa tan RA kém nhất Các dung môi nguyên chất ethanol và propanol cũng hòa tan RA kém Dung dịch hỗn hợp ethanol-nước hoặc propanol-nước hòa tan RA tốt hơn Hàm lượng

RA thu được trong dịch chiết cao hơn 20-30 lần so với dùng dung môi nguyên chất Các tỉ lệ nước/ethanol hoặc nước/propanol: 40-60 và 50-50 cao nhất so với các mẫu còn lại

- Ở nhiệt độ cao: khi nâng cao nhiệt độ, khả năng hòa tan RA vào dung môi sẽ tăng lên, đề tài lựa chọn nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 100C để thử nghiệm kết quả cho thấy ở nhiệt độ cao, khả năng hòa tan RA của các dung môi tăng lên rất nhiều lần Lúc này, hỗn dịch ethanol-nước lại có khả năng hòa tan RA tốt nhất

Kết quả này khá hợp lý với cấu tạo của axít rosmarinic: có chứa 2 vòng thơm, và nhóm thế COOH Ở nhiệt độ thường, RA phân cực yếu do 2 vòng

thơm có tác dụng hút điện tử, làm giảm độ phân cực của nhóm COOH, do vậy khả năng tan trong nước ở nhiệt độ thường không cao bằng trong các loại dung môi hữu cơ phân cực như ethanol và propan-2-ol Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ, khả năng phân ly của nhóm thế COOH mạnh lên, đồng thời với độ phân cực của dung môi và nước cũng tăng lên nhiều lần đã tăng cường sự hòa tan vào nước của RA Theo lý thuyết, ở pH axít, thậm chí khả năng hòa tan RA vào dung môi phân cực còn tăng cao hơn, đặc biệt với có sự có mặt của axít hữu cơ Từ kết quả thu được, đề tài quyết định lựa chọn dung môi cho quá trình thu dịch chiết

giàu RA từ lá tía tô là ethanol- nước với tỉ lệ 50/50

b) Nghiên cứu tỉ lệ khối lượng bột lá tía tô/thể tích dung môi cho quá trình

trích ly RA từ bột lá tía tô:

Tỉ lệ thể tích dung môi trên khối lượng bột lá ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan RA Về mặt lý thuyết khi tăng thể tích dung môi đến một lượng nhất định, hàm lượng RA trong dịch chiết sẽ tăng, sau đó dung dịch đạt trạng thái bão hòa, lúc này nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi lên, lượng RA hòa tan sẽ không tăng tiếp, kết quả là hàm lượng RA trong dịch chiết sẽ giảm Mặt khác, nếu thể tích dung môi quá lớn sẽ gây tốn kém và kéo dài thời gian của quá trình

cô đặc Do vậy, việc nghiên cứu tỉ lệ khối lượng bột lá/V dung môi nhằm mục đích tìm ra tỉ lệ hợp lý để trích ly được tối đa lượng RA trong bột lá nhưng lại không quá lớn để làm giảm hàm lượng RA trong dịch chiết

Đề tài tiến hành nghiên cứu tỉ lệ bột lá tía tô/thể tích dung môi với các mức tỉ

lệ như sau: 1/10 ; 1/25; 1/30; 1/40; 1/50 Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.4: Nghiên cứu tỉ lệ khối lượng bột lá tía tô/V dung môi

Mẫu Tỉ lệ bột lá tía tô g/ V dung

đạt tỉ lệ 1/40 Đề tài quyết định chọn tỉ lệ khối lượng bột lá (g)/V nước (ml)

là 1/25 để tiếp tục thí nghiệm tiếp theo

c) Nghiên cứu nhiệt độ phù hợp cho quá trình trích ly RA từ bột lá tía tô:

Theo như thực tế thí nghiệm cũng như theo lý thuyết, nhiệt độ của dung môi ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng RA dịch chiết Đồng thời, nhiệt độ cũng có thể ảnh hưởng đến màu sắc, hương của dịch chiết

Bảng 3.5: Nghiên cứu nhiệt độ cho quá trình trích ly RA

Mẫu Nhiệt độ

( 0 C)

Hàm lượng RA (mg/l)

Cảm quan

1 60 988,93 Mùi ngái, màu xanh nhạt

3 78 904,15 Mùi ngái nhẹ, màu xanh tím

Kết quả cho thấy, nhiệt độ càng cao thì hàm lượng RA trong dịch thu được càng lớn, cho tới khi đạt nhiệt độ 700C Khi nhiệt độ cao tới 780C (là nhiệt độ sôi của ethanol), hàm lượng RA lại giảm Nguyên nhân có thể do ở nhiệt độ sôi của ethanol, một phần dung môi bị bay hơi làm giảm khả năng hòa tan của hệ hỗn hợp dung môi Đề tài quyết định chọn nhiệt độ 700C cho quá trình trích ly RA từ bột lá tía tô

d) Nghiên cứu thời gian cho quá trình trích ly RA từ bột lá tía tô:

Nếu ngâm bột lá trong hệ dung môi với thời gian càng dài, thì khả năng hòa tan của RA vào dung môi càng cao Tuy nhiên, ở nhiệt độ khá cao 700C, với thời gian kéo dài dung môi là ethanol sẽ bay hơi, gây hao tổn dung môi và có thể lượng RA hòa tan vào hệ dung môi sẽ không tăng lên Mặt khác, việc giữ hệ trích ly ở nhiệt độ cao kéo dài sẽ đòi hỏi lượng năng lượng lớn và tăng chi phí cho quá trình trích ly Bởi vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu thời gian thích hợp cho quá trình trích ly RA từ bột lá tía tô

Mẫu được chuẩn bị với tỉ lệ 4g bột lá/100 ml dung môi ethanol: nước 50:50; nhiệt độ 700C, được ngâm trích ly với các khoảng thời gian khác nhau từ 10 phút đến 60 phút như ở bảng sau:

Bảng 3.6: Nghiên cứu thời gian cho quá trình trích ly RA

e) Nghiên cứu tốc độ khuấy trộn cho quá trình chiết RA bột lá tía tô:

Giả thiết quá trình khuấy trộn sẽ giúp tăng khả năng hòa tan của RA vào dung môi, đề tài đã tiến hành nghiên cứu một số tốc độ khuấy trong quá trình trích ly, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7: Nghiên cứu chế độ khuấy trộn cho quá trình trích ly RA

3.3.2 Nghiên cứu nâng cao hàm lượng RA trong dịch chiết lá tía tô và loại

- Ly tâm, lọc trong thu dịch chiết

Để đạt được hàm lượng RA 10% từ dịch chiết ban đầu có hàm lượng khoảng 1300 mg/lít (tương đương 1,3 g/l xấp xỉ 0,13%) thì cần giảm thể tích dung môi khoảng khoảng 80-100 lần Đề tài đã lựa chọn công nghệ xử lý loại bỏ dung môi và tạp chất để nâng cao hàm lượng RA trong dịch chiết như sau:

- Giai đoạn 1: Chưng cất loại bỏ dung môi ethanol và một phần dung môi nước, thu cao chiết

- Giai đoạn 2: Làm sạch cao tía tô đã được cô đặc Cao tía tô sau cô đặc lần 1 đã được loại bỏ phần lớn dung môi ethanol, phần còn lại là nước, axít rosmarinic và các thành phần khác từ bột lá tía tô Để có thể tiếp tục cô đặc thu thành phẩm, cần loại bỏ một số thành phần như: tinh dầu, các ester, polyphenol cao phân tử, … Đề tài nghiên cứu sử dụng dung môi ethyl axetate (EtOAc) và n-butanol để loại bỏ các thành phần không hòa tan trong nước Sau đó chiết tách phần dung môi EtOAc và n-butanol bằng phễu chiết, loại bỏ các tạp chất hòa tan trong phần dung môi này

- Giai đoạn 3: Cô đặc lần 2 để thu dịch chiết đạt đến nồng độ 10% axít rosmarinic

a Nghiên cứu chưng cất loại bỏ dung môi lần 1:

Các mẫu ban đầu dưa vào cô đặc có thể tích là 1000 ml, nhiệt độ phòng: 27-300C Nhiệt độ cô đặc được xác định ở các nhiệt độ từ 50-1000C Dung dịch được cô đến thể tích xấp xỉ 200 ml