Nghiên cứu công nghệ sản xuất "chất bảo quản sinh học bacterioxin" bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Trên thế giới bacterioxin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic vì vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và được coi là an toàn.. Shim

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên Đề tài:

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên Đề tài:

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……….……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Giới thiệu về bacterioxin và vi khuẩn lactic……… ………3

1.1.1 Giới thiệu về bacterioxin………3

1.1.2 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin……….…….5

1.2 Giới thiệu về nisin……… … ….7

1.2.1 Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin……….… 7

1.2.2 Cấu trúc phân tử của nisin……… 9

1.2.3 Tính chất của nisin… ……… … ……10

1.2.4 Cơ chế tác dụng của nisin……… 11

1.2.5 Sinh tổng hợp và điều hòa phiên mã……… 14

1.2.6 Sự liên hệ giữa các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và kháng nisin……… ……….16

1.2.7 Sự ổn định tính trạng Suc-Nis……… 17

1.2.8 Sự sắp xếp lại plasmid của Lactococcus trong quá trình ít dinh dưỡng kéo dài……… …… 18

1.3 Ứng dụng bacterioxin và nisin……… … ….…21

1.4 Công nghệ sản xuất sản xuất nisin……… …… ….26

1.4.1 Công nghệ lên men……… ………26

1.4.2 Công nghệ lên men kết hợp hấp phụ nisin……….………… 28

1.4.3 Công nghệ thu hồi ……….……….…28

1.5 Giới thiệu một số công nghệ tinh chế và thu nhận protein ……….……….32

1.5.1 Chiết pha rắn ……… …………32

1.5.2 Phương pháp lọc tiếp tuyến - cắt phân đoạn ……….……….……35

1.5.3 Phương pháp sấy phun……….…………39

1.5.4 Phương pháp sấy phun xung đốt……… ………42

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 45

2.1 Nguyên vật liệu……… ……….45

2.1.1 Các chủng vi sinh vật……… ………45

2.1.2 Môi trường……… ……….45

2.1.3 Các nguyên vật liệu hấp phụ ……….……….46

2.2.1 Phân lập vi sinh vật……… 47

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống……….……… 47

2.2.3 Phân loại bằng hình thái tế bào và khuẩn lạc……….………… 47

2.2.4 Phương pháp xác định kiểu hình axit lactic……….48

2.2.5 Phương pháp xác định meso- DAP trong thành tế bào……….48

2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hình lên men của vi khuẩn lactic…… …… 48

2.2.7 Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường………48

2.2.8 Kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin……… ………48

2.2.9 Kiểm tra tính nhậy cảm của bacterioxin với protease……….…….49

2.2.10 Kiểm tra tính bền nhiệt của bacterioxin……….… 49

2.2.11 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacterioxin……… … 49

2.2.12 Phương pháp tách DNA tổng số……… ….50

2.2.13 Phương pháp đinh tên bằng đọc trình tự đoạn gen V1-V3 16S r.DNA… 50

2.2.14 Phương pháp tách plasmid……… 51

2.2.15 Phương pháp PCR để tách dòng gen nis……… 51

2.2.16 Tinh sạch sản phẩm DNA gen nis……….……… 52

2.2.17 Xác định trình tự gene nis bằng phương pháp đọc trình tự trực tiếp…… 52

2.2.18 Xác định trình tự gene nis thông qua AT cloning………53

2.2.19 Phương pháp xác định kích thước phân tử bacterioxin………53

2.2.20 Phương pháp Điện di Tricine –SDS – PAGE……… 54

2.2.21 Phương pháp đọc trình tự amino acid từ N- terminus……… 54

2.2.22 Xác định hoạt tính bacterioxin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch….55 2.2.23 Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch …… 55

2.2.24 Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp HPLC……….56

2.2.25 Phương pháp xác định sinh khối……… 57

2.2.26 Phương pháp xác định đường tổng……… 57

2.2.27 Phương pháp xác định đạm……… ………57

2.2.28 Phương pháp lên men……….… 57

2.2.29 Phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ bằng tế bào chủng sản xuất …… 58

2.2.30 Phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate……… ……… 58

2.2.31 Phương pháp thu hồi bằng vật liệu hấp phụ ……….……….59

2.2.32 Các phương pháp tinh sạch nisin……… 60

3.1 Phân lập, sưu tập, trao đổi, lưu giữ bảo quản các chủng giống có hoạt tính sinh

bacterioxin……….……… 61

3.2 Nghiên cứu khảo sát, tuyển chọn các chủng giống có đặc tính sinh bacterioxin……….……… ……….….63

3.2.1 Sự nhạy cảm của bacterioxin với enzym proteinase … …… ….……… 64

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của bacterioxin… 65

3.3 Nghiên cứu định tên chủng giống……… ……….65

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá……….65

3.3.2 Nghiên cứu đọc trình tự đoạn gen 16SrDNA……….……… 68

3.3.3 Khảo sát tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin… 69

3.4 Nghiên cứu đặc điểm bacterioxin……… ……….…….70

3.4.1 Khảo sát sự có mặt gen mã hóa nisin ở các chủng vi khuẩn ……….…….70

3.4.2 Đọc trình tự đoạn gen mã hóa nisin ……….………….71

3.4.2.1 Đặc điểm gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp lactis DSM 20729……… ……… 71

3.4.2.2 Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae BV20……….72

3.4.2.3 Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae Tn63………….….73

3.4.2.4 Trình thự gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp lactis PĐ14… 74

3.4.3 Nghiên cứu đọc trình tự amino axit từ N-terminus……….………….78

3.5 Ổn định hoạt tính chủng giống……….………80

3.5.1 Sàng lọc phân lập chủng giống sinh tổng hợp nisin cao……….………….80

3.5.2 Xác định vị trí gen mã hóa nisin……….……… 83

3.5.3 Nguyên nhân gây đến sự giảm hoạt tính……….……….86

3.5.4 Ảnh hưởng quá trình hoạt hóa đến hoạt lực chủng giống…… …….……94

3.5.5 Quy trình biện pháp duy trì hoạt tính chủng ……….………….96

3.6 Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp bacterioxin (nisin)……… ……… 98

3.6.1 Nghiên cứu thành phần môi trường……….…….98

3.6.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men……… 105

3.6.3 Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ……… 107

3.6.4 Nghiên cứu quá trình lên men tiếp dần nồng độ……… …… 110

3.6.5 Nghiên cứu quá trình lên men kết hợp hấp phụ bacterioxin……… 114

3.6.5.1 Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ kết hợp với hấp phụ…… ……115

3.8 Nghiên cứu công nghệ thu hồi sản phẩm……….…… 124

3.8.1 Nghiên cứu các biện pháp tách sản phẩm khỏi dịch canh trường ……124

3.8.1.1 Thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ - phản hấp phụ tế bào…… 124

3.8.1.2 Thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate…… 125

3.8.1.3 Thu hồi nisin bằng phương pháp sử dụng vật liệu hấp phụ………125

3.8.1.3.1 Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silicone ………126

3.8.1.3.2 Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng diatomite……… 127

3.8.1.3.3 Thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ là hạt trao đổi cation……….130

3.8.1.3.4 Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silica gel……… 133

3.8.1.3.5 Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng axit silicic………136

3.8.1.3.6 Kết luận nghiên cứu thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ……… 141

3.8.1.4 Kết quả so sánh các phương pháp thu hồi nisin……… 142

3.8.2 Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch……… …………143

3.8.2.1 Lọc và cô đặc dịch phản hấp phụ………143

3.8.2.2 Tinh sạch bằng SPE………145

3.8.3 Nghiên cứu các phương pháp tạo sản phẩm……… 146

3.8.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt lực nisin trong dung dịch…….146

3.8.3.2 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của nisin………146

3.8.3.3 Tạo sản phẩm bằng phương pháp sấy phun………146

3.9 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bacterioxin……… … 150

3.10 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, phân tích tính vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm ………153

3.10.1 Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin T…………153

3.10.2 Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin P………….154

3.11 Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất……… 156

3.11.1 Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất nước mắm……… 156

3.11.1.1 Khảo sát một số loại nước mắm trên thị trường……… 156

3.11.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Bacillus cereus của nisin……… ……… ………157

3.11.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…159 3.11.1.4 Lựa chọn nồng độ nisin thích hợp cho việc ứng dụng trong quá trình sản xuất nước mắm……….159

3.11.1.6 Ảnh hưởng của nisin đến Staphylococcus aureus CNTP6083

và

Bacillus cereus CNTP6089 bổ sung trong nước mắm thành

phẩm…162 3.11.1.7 Ứng dụng nisin trong quá trình chế biến nước mắm và trong bảo

quản nước mắm thành phẩm tại cơ sở sản xuất……… 163

3.11.2 Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất sữa……… 165

3.11.2.1 Xác định kháng khuẩn của nisin đối với chủng kiểm định Listeria monocytogenes ATCC13932……… 165

3.11.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932……… 166

3.11.2.3 Ảnh hưởng của chất nhũ tương hóa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…… 167

3.11.2.4 Ảnh hưởng của nisin và polysorbate 80 0,1% đến Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa……… 169

3.11.2.5 Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi trong điều kiện phòng thí nghiệm………170

3.11.2.6 Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi tại cơ sở sản xuất……… 172

CHƯƠNG IV CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC……… 173

4.1 Hoàn thành các nội dung nghiên cứu với kết quả có độ tin cậy cao ………173

4.2 Sản phẩm của đề tài được thực hiện đầy đủ và cụ thể như sau……… 174

4.3 Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường……….175

4.4 Một số hạn chế của đề tài……… 175

KẾT LUẬN……… …… 177

KIẾN NGHỊ……… ….179

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 180 PHỤ LỤC

CNTP Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sưu tập giống, Viện Công nghiệp thực phẩm

DNA Deoxyribonucleic acid

DSM Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sưu tập Vi sinh vật và Tế bào của Đức,

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO Food and Agriculture Organization

HPLC High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MRS CT1 Môi trường MRS cải tiến số 1

MRS CT2 Môi trường MRS cải tiến số 2

NCBI National Centerfor Biotechnology Information

NFRI National Food Research Institute, Japan

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SPE Solid phase extraction

STG Sưu tập giống vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TFA Trifluoroacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số bacterioxin từ vi khuẩn lactic……… ………… ………4

Bảng 1.2 Sự đa dạng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin… ……… ……6

Bảng 1.3 So sánh đặc điểm máy sấy phun xung với các dạng sấy phun khác…….……44

Bảng 3.1 Thống kê các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………61

Bảng 3.2 Một số đặc điểm của chủng LAB mới phân lập………… ……… 62

Bảng 3.3 Một số đặc điểm các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh …63

Bảng 3.4 Sự nhậy cảm của bacterioxin với enzym proteinase………… ……… 65

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của bacterioxin……….……65

Bảng 3.6 Một số đặc điểm sinh trưởng, sinh hóa……….……66

Bảng 3.7 Một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng, sinh hóa……….66

Bảng 3.8 Một số khả năng lên men đường……….……… 67

Bảng 3.9 Sự tính nhảy cảm với clindamycin của các chủng nghiên cứu……… …70

Bảng 3.10 Sự phát triển của chủng kiểm định khi có mặt bacterioxin với pH khác nhau 76

Bảng 3.11 Phổ kháng khuẩn của bacterioxin từ chủng 0-5 và DSM 20729……… 76

Bảng 3.12 Tinh chế bacterioxin từ chủng 0-5… ……… 77

Bảng 3.13 Trình tự 18 amino acids từ đầu N-terminus của bacterioxin từ chủng 0-5……78

Bảng 3.14 Hoạt lực còn lại của các chủng dẫn xuất sau sàng lọc so với thời điểm bắt đầu bảo quản (%)……… ………….…… 87

Bảng 3.15 Khả năng sống sót của các chủng dẫn xuất sau sang lọc kể từ thời điểm bắt đầu bảo quản……….89

Bảng 3.16 So sánh hoạt lực chủng giống bằng các phương pháp hoạt hóa khác nhau… 95

Bảng 3.17 So sánh các phương pháp bảo quản và hoạt hóa các chủng giống dẫn xuất từ DSM 20729 về khả năng sinh tổng hợp nisin……… 97

Bảng 3.18 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin…….100

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nguồn phospho lên sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin…… 101

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của tỉ lệ NH 4 H 2 PO 4 ……… 102

Bảng 3.21 Hàm lượng đạm hòa tan trong các nguyên liệu nguồn nitơ……….103

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ khác nhau………103

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của tỉ lệ đạm trong sữa gầy……… 104

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ……… 105

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy……….106

Bảng 3.27 Điều kiện bổ sung cơ chất của các mẫu thí nghiệm khác nhau……… 111

Bảng 3.28 Động học của quá trình lên men tiếp dần nồng độ……….…….111

Bảng 3.29 Hiệu suất thu hồi nisin khi lên men kết hợp với hâp phụ với thời điểm bổ sung acid silicic khác nhau……… ………117

Bảng 3.30 Kết quả thu hồi nisin trong lên men tiếp dần nồng độ 50% cơ chất so với ban đầu, kết hợp với hấp phụ………119

Bảng 3.31 Điều kiện bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau .………120

Bảng 3.32 Kết quả thí nghiệm lên men tiếp dần nồng độ kết hợp thu hồi với nồng độ bổ sung cơ chất khác nhau……… …121

Bảng 3.33 Động học của quá trình lên men theo mẻ quy mô thiết bị lên men………….122

Bảng 3.34 Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ tế bào…… 124

Bảng 3.35 Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bởi amonium sulphate…….125

Bảng 3.36 Ảnh hưởng của tỷ lệ silicone tới khả năng hấp phụ nisin………126

Bảng 3.37 Ảnh hưởng của chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ diatomite 128

Bảng 3.38 Kết quả thu hồi nisin khi sử dụng diatomite với các tỷ lệ khác nhau……… 129

Bảng 3.39 Ảnh hưởng của nồng độ SDS tới hiệu quả phản hấp phụ nisin từ diatomite 129

Bảng 3.40 Ảnh hưởng của tỷ lệ hạt trao đổi cation tới khả năng hấp phụ nisin … … 131

Bảng 3.41 Ảnh hưởng của pH dịch canh trường tới khả năng hấp phụ nisin của hạt trao đổi cation……… ……… 132

Bảng 3.42 Ảnh hưởng của các chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ hạt trao đổi cation……… ……… 132

Bảng 3.43 Ảnh hưởng của tỷ lệ silica gel tới khả năng hấp phụ nisin……… 133

Bảng 3.44 Ảnh hưởng pH dịch canh trường tới sự hấp phụ nisin của silica gel……… 134

Bảng 3.45 Ảnh hưởng thành phần dịch phản hấp phụ tới sự phản hấp phụ từ silica gel 135

Bảng 3.46 Xác định thành phần phù hợp của dung dịch NaCl 1M và ethanol………….135

Bảng 3.47 Ảnh hưởng của tỷ lệ axit silicic tới khả năng hấp phụ nisin………136

Bảng 3.48 Ảnh hưởng pH dịch canh trường khả năng hấp phụ nisin của axit silicic… 137

Bảng 3.49 Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch phản hấp phụ so với dịch lên men ban đầu khi sử dụng axit silicic làm chất hấp phụ………138

Bảng 3.50 Hiệu suất thu hồi nisin với các chất phản hấp phụ……… 139

Bảng 3.51 Xác định thành phần tỷ lệ dịch phản hấp phụ đối với axit silicic………140

Bảng 3.52 Ảnh hưởng của thời gian phản hấp phụ……… 140

Bảng 3.55 Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong lọc dòng tiếp tuyến cô đặc……… 144

Bảng 3.56 Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong SPE………146

Bảng 3.57 Sự bền hoạt tính của nisin ở các pH khác nhau theo thời gian………147

Bảng 3.58 Khảo sát nhiệt độ đầu vào trong việc tạo sản phẩm sấy phun……….148

Bảng 3.59 Tinh sạch và thu nhận sản phẩm nisin thô và tinh……… ………148

Bảng 3.60 Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin thô……….153

Bảng 3.61 Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin thô……… 153

Bảng 3.62 Hàm lượng kim loại nặng của nisin thô……… 153

Bảng 3.63 Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin thô ……….154

Bảng 3.64 Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin tinh………154

Bảng 3.65 Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin tinh……… 154

Bảng 3.66 Hàm lượng kim loại nặng của nisin tinh……… 155

Bảng 3.67 Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin tinh………155

Bảng 3.68 Một số chỉ tiêu hóa học của nước mắm……… 156

Bảng 3.69 Chỉ số vi sinh của các mẫu nước mắm……….156

Bảng 3.70 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế S aureus CNTP6083 157

Bảng 3.71 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế B cereus CNTP6089 ……….158

Bảng 3.72 Khả năng ức chế B aureus CNTP6089 và S aureus CNTP6083 của nisin ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện hàm lượng muối 20% 160

Bảng 3.73 Khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932….………165

Bảng 3.74 Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932……….166

Bảng 3.75 Ảnh hưởng của lecithin đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes ATCC 13932 trong môi trường sữa……… ……… 168

Bảng 3.76 Ảnh hưởng của Polysorbate 80 đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes ATCC 13932 trong môi trường sữa……… ……… 168

Bảng 3.77 Ảnh hưởng của nisin và polysorbate80 đến sự ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa……… 169

Bảng 3.78 Chỉ tiêu vi sinh trong sữa tươi có bổ sung nisin và polysorbate 80………….171

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử nisin (Gross và Morell, 1971)………10

Hình 1.2 Mô hình nisin tấn công làm thủng màng tế bào………13

Hình 1.3 Các gen tham gia vào sản xuất nisin Z, điều hòa và đề kháng………… … 15

Hình 1.4 Điện di agarose gel plasmid DNA……….17

Hình 1.5 Điện di thành phần plasmid……… 18

Hình 1.6 Sơ đồ phương pháp lọc dòng chảy ngang……….35

Hình 1.7 Dòng tuần hoàn của phương pháp lọc dòng chảy ngang……… 36

Hình 1.8 Phân loại các dạng lọc dòng chảy ngang theo kích cỡ lỗ trên vật liệu lọc……38

Hình 1.9 Mô hình, thiết bị và vật liệu trong lọc dòng chảy ngang……… 39

Hình 1.10 Sơ đồ hoạt động của máy sấy phun……… 41

Hình 1.11 Các loại đầu phun của máy sấy phun SDX®………42

Hình 1.12 Sơ đồ máy sấy phun xung đốt………43

Hình 3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………… 63

Hình 3.2 Kiểm tra hoạt lực tính bacterioxin của vi khuẩn lactic bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với chủng kiểm định JCM 1149……… 64

Hình 3.3 Phát hiện gen mã hóa prenisin………… ………69

Hình 3.4 Các cấu tử bacterioxin do chủng 0-5 sinh tổng hợp……… 77

Hình 3.5 Điện di trên Tricine-SDS-PAGE bacterioxin từ các chủng nghiên cứu…… 78

Hình 3.6 Xác định trình tự amino acids từ N-terminus của chủng 0-5………79

Hình 3.7 Tỷ lệ sống sót của tế bào Lactococcus lactis sp lactis DSM 20729 trên môi trường MRS- sucrose có bổ sung nisin ở các nồng độ 300-1200IU/ml… …81

Hình 3.8 Tỷ lệ các chủng dẫn xuất từ DSM 20729 dưới áp lực tuyển chọn nisin có hoạt lực sinh tổng hợp nisin khác nhau……….82

Hình 3.9 Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 thay đổi theo thời gian lên men….84 Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR gen nis với khuôn là các băng DNA cắt ra từ gel trên hình 3.16 A………85

Hình 3.11 Sự thay đổi hoạt lực sinh tổng hợp nisin của các chủng dẫn xuất từ DSM 20729 theo thời gian, được bảo quản bằng phương pháp cấy truyền, tại 40C, trên các môi trường khác nhau……… ………88

Hình 3.12 Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 ở các điều kiện bảo quản khác nhau……… 90

dưỡng với các điều kiện môi trường khác nhau trong 24 giờ……… ….93 Hình 3.14 Ảnh hưởng môi trường lên men tới sinh tổng hợp nisin……… 98 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh tổng hợp nisin của DSM 20729….99 Hình 3.16 Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng dẫn xuất DSM 20729

hoạt lực mạnh đã qua quy trình ổn định hoạt lực……….……… 108 Hình 3.17 Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 gốc….108 Hình 3.18 Sinh tổng hợp nisin trong lên men tiếp dần nồng độ với cơ chất khác nhau 113 Hình 3.19 Khả năng sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 đã qua quy trình ổn định

hoạt lực chủng giống trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men……….123 Hình 3.20 So sánh hiệu quả của các phương pháp thu hồi nisin……… 143 Hình 3.21 Điện di về các mẫu thu nhận và tinh sạch nisin từ DSM 20729……… 146

Hình 3.22 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nisin từ chủng vi khuẩn Lactococcus

lactis subsp lactis DSM 20729 ( hay CNTP 6520)……… ….150 Hình 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lưc của nisin ức chế Bacillus cereus

CNTP6089 và Staphylococcus aureus CNTP6083……….158

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian……….159

Hình 3.25 Nồng độ nisin và khả năng ức chế Bacillus cereus CNTP6089 và

Staphylococcus aureus CNTP6083 ……… 160 Hình 3.26 Ảnh hưởng của nisin đến B cereus CNTP6089 và S aureus CNTP6083 trong

lên men nước mắm……… 161

Hình 3.27 Ảnh hưởng của nisin đến S.aureus CNTP6083 và B.cereus CNTP6089 bổ sung

trong nước mắm thành phẩm……… 162 Hình 3.28 Sơ đồ ứng dụng nisin trong quá trình chế biến và bảo quản nước mắm tại Công

ty Cổ phần Thủy sản Nghệ An………164

Hình 3.29 Đường cong chuẩn của nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 166

MỞ ĐẦU

Bacterioxin là chất bảo quản thực phẩm mới, nếu so sánh với chất bảo quản tổng hợp hóa học truyền thống Nhu cầu về chất bảo quản tự nhiên này đang tăng nhiều vì xu hướng sử dụng thực phẩm gần với thiên nhiên trở nên phổ biển Việc sử dụng chất kháng sinh có nguốn gốc hoá học trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hiện nay đã bị hạn chế, thậm chí là nghiêm cấm sử dụng do khó bị phân huỷ, để lại dư lượng trong thực phẩm, dẫn tới hiện tượng nhờn kháng sinh cho người và động vật, làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột Do đó chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học đã trở thành mối quan tâm lớn của các nhà khoa học và sản xuất Hiện nay các chất bảo quản này được sản xuất chủ yếu bởi các công ty ở Châu Âu, Mỹ và gần đây ở Trung Quốc

Trên thế giới bacterioxin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic vì vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và được coi là an toàn Tìm kiếm các dạng khác nhau của bacterioxin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học tham gia, nhằm tìm ra các bacterioxin có đặc tính mới, ứng dụng cao, nhằm cung cấp các thông tin trong việc giải thích mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacterioxin – một vấn đề đến nay còn chưa được sáng tỏ hoàn toàn

Bacterioxin được nghiên cứu nhiều nhất là nisin được sinh tổng hợp bởi

Lactococcus lactis subsp lactis Việc các nhà khoa học phát hiện ra nisin - chất bảo

quản sinh học có giá trị vào đầu thế kỉ 20 được xem là có ý nghĩa rất lớn Ngoài khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh có nguồn gốc hoá học, nhiệt độ, chiếu xạ nisin còn có nhiều ưu điểm khác như phạm

vi ứng dụng của nisin khá rộng bao gồm các sản phẩm tươi sống như thịt, cá, sữa, rau quả, các thực phẩm lên men, đồ hộp ; nisin giúp làm giảm thời gian và nhiệt độ thanh trùng của các sản phẩm dẫn tới hiệu quả kinh tế cao, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm; nisin không ảnh hưởng tới sức khoẻ con người, có khả năng phân huỷ trong cơ thể con người nhờ tác dụng của

enzym pancreatin trong tuyến tuỵ ở 370C trong 15 – 30 phút

Trên thế giới, sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học cũng như công nghệ vi sinh vật, việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng bacterioxin đã đạt được nhiều thành công trong các lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y học Các hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay là tìm kiếm các bacterioxin mới, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các bacterioxin trong các lĩnh vực cải tạo chủng giống, xây dựng và áp dụng các kỹ thuật lên men hiệu quả, nâng cao hiệu suất thu hồi, xây dựng các phương pháp đơn giản, hiệu quả cao

Tại Việt nam, các nghiên cứu về bacterioxin ở vi khuẩn lactic chỉ mới bắt đầu trong những năm gần đây và đạt được một số kết quả ban đầu Với chủ trương của Nhà nước là ưu tiên phát triển công nghệ sinh nhằm hình thành và phát triển ngành công nghiệp sinh học nội địa trong cả bốn lĩnh vực gồm nông nghiệp, công nghiệp chế biến, y dược và bảo vệ môi trường, sự quan tâm của các khoa học đến nghiên cứu bacterioxin từ vi khuẩn lactic với mục đích ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau là hiện tượng đáng khích lệ Để thực hiện được nhiệm vụ này, việc hợp tác quốc tế trong lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt với các nước có ngành công nghệ sinh học phát triển là rất cần thiết Giáo sư, tiến sĩ Jun Shima nguyên là trưởng nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Vi sinh vật ứng dụng, thuộc Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (Tsukuba, Nhật Bản), đến 4/2010 ông giữ trách nhiệm Chủ nhiệm Bộ phận nghiên cứu về lĩnh vực các khoa học Vi sinh, trường Đại học Tổng hợp Kyoto Ông

là chuyên gia có nhiều năm nghiên cứu về các hoạt chất kháng sinh, hoạt chất kháng khuẩn từ vi sinh vật, đã thực hiện nhiều hợp tác nghiên cứu với doanh nghiệp, tham gia hướng dẫn đào tạo các nghiên cứu viên trong và ngoài nước Do đó chúng tôi đã cùng hợp tác với GS.TS Shima và các đối tác Nhật Bản thực hiện đề tài nghị định thư “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bảo quản sinh học bacterioxin bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” với các mục tiêu như sau: (i)- Có được bộ chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh một số bacterioxin với các đặc điểm được xác định; (ii)- Có được quy trình công nghệ sản xuất nisin bằng phương pháp sinh tổng hợp hiệu suất đạt 30%; (iii)- Có kết quả ứng dụng nisin trong cơ sở sản xuất sữa và nước mắm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về bacterioxin và vi khuẩn lactic

1.1.1 Giới thiệu về bacterioxin

Bacterioxin là một nhóm chất được tạo ra bởi vi khuẩn, có bản chất là polypeptide, có đặc tính tiêu diệt các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sinh ra nó

(Cleveland và cs 2001) Bacterioxin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi

nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gen (Klaenhammer 1993)

Bacterioxin được biết đến đầu tiên là colicin - tạo bởi một chủng vi khuẩn Gram

âm E coli có tác dụng chống lại các chủng E coli khác Đến năm 1953 Jacob và các

cộng sự đã gọi bằng thuật ngữ “Bacterioxin” để chỉ chung các protein có khả năng kháng khuẩn

Bacterioxin được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacterioxin

từ vi khuẩn lactic nhận được sự quan tâm đặc biệt bởi hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm Bacterioxin được ứng dụng làm chất kháng khuẩn trong chế biến thực phẩm Trên thế giới bacterioxin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic

Bacterioxin từ vi khuẩn lactic được xác định là các peptide mang điện dương, có kích cơ nhỏ, được tổng hợp tại ribosome và có khả năng thấm qua màng tế

bào (Klaenhammer 1993, Jack và cs 1995)

Bacterioxin từ vi khuẩn lactic bao gồm các nhóm sau đây (Klaenhammer 1993):

- Nhóm I: Gồm các lanbiotics hoặc các bacterioxin nhỏ, kích thước phân tử lượng thường nhỏ hơn 5Kda, chịu nhiệt, có chứa Lanthionine hoặc β-methyllanthionine s và một số axit amin dehydrat (2,3-didehydroalanine do serine khử nước); có cấu tạo từ một hoặc hai peptide

- Nhóm II: Bacterioxin nhỏ, kích thước phân tử thường nhỏ hơn 10Kda, chịu nhiệt không chứa Lanthionine ; bao gồm các nhóm nhỏ: (IIa)- bacterioxin

Listeria; (IIb)- bacterioxin gồm 2 peptide; (IIc)- bacterioxin vòng, được kích hoạt

bởi nhóm thiol

- Nhóm III: Bacteriolysin hoặc protein có kích thước lớn, không chịu

nhiệt, thường có tính thủy phân murein

- Nhóm IV: Bacterioxin có cấu tạo phức giữa peptide/ protein với các nhóm

khác

Trong nhiều báo cáo phân loại bacterioxin đôi khi người ta gộp nhóm III và

nhóm IV vào cùng một nhóm (De Vuyst & Leroy, 2007) Sự đa dạng về

bacterioxin được thể hiện ở bảng 1.1 Về cơ chế hoạt động, bacterioxin thuộc

nhóm I và II thường là các peptide mang điện dương và có khả năng thấm qua

màng tế bào, gây thủng màng tế bào và làm thất thoát các ion, ATP và thành

phần nội bào, dẫn đến tiêu diệt tế bào (Klaenhammer 1988,1993; Jack và cs

,1995) Nhóm lantibiotics là nhóm được chú ý nhất trong các nghiên cứu hiện

nay Đây là nhóm gồm các bacterioxin có khả năng phân tử nhỏ hơn 5 kDa,

có khả năng chịu nhiệt, chứa các axit amin bất thường (Lanthionine, β-methyllanthionĐến nay bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra được phát hiện có đặc tính ức

chế một số vi khuẩn Gram dương, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng

thực phẩm như Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, Bacillus cereus Bacterioxin cũng được chứng minh có tác

dụng lên vi khuẩn Gram âm như E coli và Samonella nhưng chỉ khi màng ngoài

của tế bào bị tổn thương bởi các yếu tố sau: sốc thẩm thấu, pH thấp, sự có

mặt của chất bề mặt (EDTA), chất có tính chất chelat, sốc bởi xung điện

trường hoặc áp suất cao (Stevens và cs., 1991)

Bảng 1.1 Một số bacterioxin từ vi khuẩn lactic Bacterioxin Chủng vi sinh vật Phổ tác dụng Kích thước (số axit amin)

Nhóm I: Lantibiotics

Bacterioxin Chủng vi sinh vật Phổ tác dụng Kích thước (số axit amin)

Nhóm II: Phi-lantibiotics , kích thước nhỏ, bền nhiệt

Mesenterocin 52B mesenteroides Leuconostoc Hẹp 32

Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus Trung bình 31

Bacterioxin giống Pediocin

CarnoBacterioxin A,B Carnobacterium piscicola Trung bình 48; 53

Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici Trung bình 44

Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Trung bình 37 Enterocin 1146/A Enterococcus faecium Trung bình 47 Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola Trung bình 44

Mesenterocin Y105 mesenteroides Leuconostoc Trung bình 37

Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt

Bacterioxin thường nhạy cảm với ít nhất một enzym thuỷ phân protein (De Vuyst

và Vandamme, 1994) Một số bacterioxin không nhạy cảm với dịch vị thường được sử dụng trong sản xuất phomat Một số bacterioxin như helvetixin J và plantarixin B của

Lactobacillus helveticus và Lb plantarum không bị ảnh hưởng bởi tác dụng của một số

enzym như lipase, amylase hay phospholipase (Desmazeaud, 1996)

1.1.2 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin

Các nghiên cứu gần đây đã công bố những phát hiện mới về bacterioxin ở các loài

thuộc chi Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus và Pediococcus Các bacterioxin được phát hiện là brevicin ở chủng Lb brevis (Filipov,

1979; Benoit và cs., 1997), bacterioxin từ P acidilactici (Bhunia và cs., 1988;

Chikindas và cs., 1993; Martinez và cs.,1998), từ Lb fermenti, Lb buchneri (Filipov,

1979), từ Lb pentosus (Okkers và cs., 1999), divercin từ Carnobacterium

divergen

Ivanova và cs., 2000), mundticin từ Enterococcus mundtii (Kawamoto và cs., 2002), enterocin từ Enterococcus faecium (Đỗ Thị Huyền, 2009) Những vi khuẩn này

thường có mặt trong thực phẩm lên men, rau quả muối chua và sản phẩm từ sữa (Diop

và cs., 2007; Leroy & De Vuyst, 2004; Ennahar và cs., 1999)

Tìm kiếm các dạng khác nhau của bacterioxin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học tham gia theo đuổi, nhằm tìm ra các bacterioxin mới và có đặc tính ứng dụng cao; nhằm so sánh các bacterioxin để cung cấp các thông tin quý báu trong việc giải thích mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacterioxin – một vấn đề đến nay còn chưa được sáng tỏ (Tagg và cs., 1976; Eijsink và cs., 1998; Sato và cs., 2002; Sakayori và cs., 2003) Bacterioxin có hoạt tính mạnh nhất thường phát hiện ở

vi khuẩn Lactococcus, ở các chi khác thường yếu hơn Sự đa dạng vi khẩn

lactic sinh bacterioxins thể hiện trên bảng 1.2

Vi khuẩn lactic đựơc coi là an toàn (GRAS- genrally regarded as safe), do vậy đã

có nhiều công trình về xây dựng các công cụ gen để biểu hiện/sản xuất các protein quan trọng trong vi khuẩn lactic Chẳng hạn như việc sử dụng gen khởi động cấu trúc

(consitutive promotor) của Lac lactis để sản xuất protein có năng suất cao (de

Vos,1999) và hiện tại thông dụng và hiệu quả nhất là hệ biểu hiện được kiểm soát bởi gen khởi động cảm ứng bởi nisin (NICE- nisin controlled gen expression system) (Kuipers và cs., 1998; Zhou và cs., 2006)

Bảng 1.2 Sự đa dạng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin

Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp

bacterioxin Tên bacterioxin Trích dẫn

Lactobacillus

Lb plantarum plantaricin A Nissen-Meyer và cs., 1993

Lb plantarum plantaricin EF Anderssen và cs., 1998

Lb plantarum plantaricin JK Anderssen và cs., 1998

Lb plantarum plantaricin S Jimenez-Diaz và cs., 1995

Lb plantarum LL441 plantaricin C Gonzalez và cs., 1994

Lb acidophilus acidocin B Leer và cs., 1995

Lb acidophilus JCM1132 acidocin J1132 Tahara và cs., 1996

Lb acidophilus TK9201 acidocin A Kanatani và cs., 1995

Lb heleveticus helveticin J Joerger & Klaenhammer, 1986

Lb helveticus helveticin V-1829 Vaughan và cs., 1992

Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp

bacterioxin Tên bacterioxin Trích dẫn

Lb sake Lactocin S Mortvedt và cs., 1991

Lb bavaricus bavaricin A Larsen & Norrung, 1993

Lb curvatus LTH1174 curvacin A Eijsink và cs., 1998

Lb johnsonii lactacin F Allison và cs., 1994

Lactococcus

Lac.lactis Lacticin 481 Piard và cs., 1992

Lac.lactis lacticin 3147 Ryan và cs., 1996

Lac.lactis lactococcin MMFII Ferchichi và cs., 2001

Lac.lactis lactococcin G Nissen-Meyer và cs., 1992

Pediococcus pentosaceous Pediocin Piva & Headon, 1994

Pediococcus acidilactici PAC

1.0 pediocin PA-1 Cintas và cs., 1998 Eijsink và cs., 1998

Chikindas và cs., 1993;

Martinez và cs.,1998

Carnobacterium

Carnobacterium spp Carnocin Stoffels và cs., 1992

Carnobacterium piscicola Piscicolin Schillinger và cs., 1993

Carnobacterium divergen divercin Metivier và cs., 1998

1.2 Giới thiệu về nisin

1.2.1 Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin

Bacterioxin được nghiên cứu nhiều nhất là nisin được sinh tổng hợp bởi

Lactococcus lactis subsp lactis Lần đầu tiên nisin được phát hiện năm 1928 từ hiện tượng Streptococcus lactis gây ức chế Lactobacillus bulgaricus (Rogers và Whittier,

1928) Tên nisin được Mattick và Hirsch (1947) đặt xuất phát từ ý nghĩa “chất ức chế

N” (N inhibitory substance) vì Lactococcus lactis ban đầu đươc phân vào nhóm

N Streptococcus

Khi được phát hiện vào năm 1928, theo hệ thống phân loại kinh điển của

Lancefield thì nisin được xếp là chất ức chế sinh học do Streptococcus lactis sinh tổng

hợp Năm 1985, theo khoá phân loại của Schleifert và cộng sự, các

chủng Streptococcus lactis được phân thành 2 nhóm là Streptococcus mesophiles (ưa ấm) và Streptococcus thermophiles (ưa nhiệt) Nhóm Streptococcus mesophiles bao gồm 2 loài chủ yếu là Lactococcus lactis và Lactococcus cremoris Trong đó chủng sinh tổng hợp nisin thuộc loài Lactococcus lactis (Schleifert và cs., 1985) Theo khóa phân loại chi Lactococcus có 7 loài và dưới loài có thể phân biệt được bằng các phản ứng sinh lý Trong đó loài Lactococcus garvieae và Lactococcus lactis rất xa nhau về

mặt phả hệ là nhưng lại rất tương tự nhau về mặt kiểu hình Sự phân biệt rõ ràng các loài này đựơc thực hiện bởi các kỹ thuật DNA homology (Garvie và cs., 1981), phân tích trình tự r.RNA (Collins và cs., 1989), kiểu hình rRNA cắt hạn chế (Rodrigues và cs 1991), hoặc các phương pháp khác như xác định sự kháng với clindamycin (Collins và cs.,

1989), phân tích protein bộ của tế bào ( Elliott và cs., 1991), PCR đặc hiệu với Lac garvieae (Zlotkin và cs., 1998) Theo Elliott và Facklam (1996), MIC clindamycin (µg/ml) đối với Lac lactis là ≤ 0,12 µg/ml và đối với Lac garvieae là ≥

8µg/ml

Lactoccocus lactis là vi khuẩn Gram âm được sử dụng phổ biến trong sản xuất bơ

và pho mát Lac lactis là vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc chuỗi ngắn, đường kính tế bào

từ 0,5-1,5µm tuỳ thuộc vào điều kiện sinh trưởng Chúng bị ức chế trên môi trường chứa 6% NaCl hoặc môi trường quá kiềm tính (pH 9,6 trở lên) và có thể sinh trưởng trong môi trường sữa chứa 0,1% xanh metylen Chúng mang các đặc tính chung của vi khuẩn lactic đó là không có khả năng tạo bào tử, không di động và là

trình lên men đồng hình, sinh ra axít lactic L(+) Tuy nhiên trong vài trường hợp chúng cũng có thể sinh axít lactic D(-) khi nuôi cấy trong điều kiện pH thấp Khả năng tạo axít

lactic là lí do tại sao loài Lac lactis là một trong những vi sinh vật đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghiệp sữa Lac lactis là loại vi khuẩn có vai trò quan

trọng chủ yếu trong công nghiệp sữa như sản xuất nước sữa (buttermilk), sữa chua, pho

mát Khi Lac lactis được thêm vào sữa, chúng sử dụng enzym để sinh năng lượng ATP

từ đường lactose Axit lactic sinh ra bởi tế bào vi khuẩn làm đông sữa và được sử dụng

để sản xuất pho mát và sữa tương (whey)

Ngoài ra, loài vi khuẩn này cũng đã được ứng dụng trong công nghệ sản xuất các loại rau muối chua, bia, rượu vang, một số loại bánh mỳ và các sản phẩm thực phẩm lên men khác Ngày nay, các nhà nghiên cứu tin tưởng rằng việc hiểu biết về đặc tính sinh

lý và di truyền của loài vi khuẩn này sẽ cung cấp cho ngành chế biến thực phẩm cũng như dược phẩm nguồn lợi quý

1.2.2 Cấu trúc phân tử của nisin

Công thức hoàn chỉnh của nisin A vào năm 1971 Khối lượng phân tử nisin là

3353 Da gồm 34 axit amin trong đó có một số axit amin dị thường như sự khử nước ở serinee và threonine tạo axit amin dehydroalanine và dehydrobutyrine Các axit amin

liên kết nhau qua cầu nối lưu huỳnh tạo 5 vòng đặc trưng (Gross và Morell, 1971)

Nisin thuộc nhóm lantibiotics, do có chứa các gốc axit amin đặc biệt dehydroalanine, dehydrobutyrine, lanthionine và 3-methyllanthionine (Klaenhammer,

1993) Đến nay người ta đã phát hiện ra 4 dạng của nisin, đó là: nisin A (Gross và

Morell, 1971), nisin Z (Mulder và cs., 1991), nisin Q (Zendo và cs., 2003) và nisin F

(Kwaadsteniet và cs., 2008) NisA và NisZ khác nhau ở vị trí axit amin thứ 27 (NisA - histidin; NisZ –asparagin) NisA và NisF khác nhau ở 2 vị trí axit amin thứ 27 (NisA- histidin; NisF- asparagin) và vị trí 30 (NisA- isoleucine và NisF- valine) NisQ khác biệt hơn cả, khác NisA ở 4 axit amin (ở vị trí thứ tự 15, 21, 27 và 30) và khác nisin Z

ở 3 axit amin (ở vị trí thứ tự 15, 21 và 30) Tìm kiếm các dạng khác nhau của bacterioxin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học tham gia theo đuổi, nhằm tìm ra các bacterioxin có đặc tính ứng dụng cao; nhằm so sánh các bacterioxin để cung cấp các thông tin quý báu trong việc giải thích mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacterioxin – một vấn đề đến nay còn chưa hoàn toàn được sáng tỏ (Tagg và cs., 1976; Eijsink và cs., 1998; Sato và cs., 2002; Sakayori và cs., 2003)

Ala-S-Ala : Lanthionine ; Abu-S-Ala: 3-methyllanthionine ;

DHA : dehydroalanine DHB : Dehydrobutyrine

( β-metyldehydroalanine)

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử nisin (Gross và Morell, 1971)

Nisin có cấu trúc xoắn α tương tự colixin, khoảng cách của cầu nối C – S là 1,83 A¨ và góc C – S – C là 103 A¨ Phân tử nisin có gốc amino và cacboxyl ở cuối nhóm, năm vòng bên trong được tạo bởi liên kết thioether Vòng đầu tiên Ala-S-Ala là lanthionine, 4 vòng còn lại là Abu-S-Ala là các β-methyllanthionine Ngoài cầu nối disulfide giữa dạng lanthionine với methyllanthionine, mạch peptide còn nối với nhau bằng –NH− tạo ra dạng polymer hay nhiều monomer (Hurst, 1981) Nisin không hấp phụ ở bước sóng 260 nm hay 280 nm do trong cấu trúc phân tử của nó không chứa các axit amin thơm Nisin thường xuất hiện ở dạng dimer và tetramer với trọng lượng phân tử khoảng 7000 và 14000 Da (Bailey và Hurst, 1971)

1.2.3 Tính chất của nisin

Nisin tương đối bền nhiệt Độ bền và khả năng hoà tan của nisin phụ thuộc nhiều vào pH Khi thanh trùng ở 1150C nisin vẫn bền ở pH 2, bị mất hoạt tính 40% ở pH 5

và mất hơn 90% ở pH 6,8 Khi pH >7 xảy ra hiện tượng mất hoạt tính không thể khắc phục kể cả ở nhiệt độ thường (Hurst, 1981)

Khả năng hoà tan của nisin tốt nhất ở pH 2, tại pH 2,5 giảm xuống còn 60%, tại

pH 5,0 giảm xuỗng còn 4% và hầu như không tan ở pH trung tính và kiềm Khi hoà tan nisin trong HCl pH 2,5 (hoặc thấp hơn), tại nhiệt độ sôi mà không mất hoạt tính và thậm chí khi thanh trùng cũng không mất hoạt tính Nisin có độ hoà tan thấp ở pH sinh lý (Hurst, 1981)

Nồng độ muối cũng ảnh hưởng đến độ bền của nisin Hoạt tính nisin tăng lên khi

có mặt NaCl từ 0% đến 4% Trong dung dịch 4 – 10% NaCl, hoạt tính nisin còn giữ được 80% (Phan Thị Khánh Hoa, 2003) Tính chất này cho thấy tiềm năng áp dụng nisin trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm có nồng độ muối cao

Nisin bị phá huỷ bởi một số protease như α-chymotripsin, proteinase K

của Bacillus cereus và nisinase của Streptococcus thermophilus Nisin thường bị hạn

chế bởi một số protease đặc biệt là protease của dạ dày và của tuyến tuỵ Nisin không tìm thấy trong nước bọt của con người sau hơn 10 phút ăn thực phẩm có chứa nisin Đây

là yếu tố quan trọng giúp nisin trở thành một trong những chất bảo quản thực phẩm an toàn đối với con người được tin tưởng sử dụng hiện nay

1.2.4 Cơ chế tác dụng của nisin

Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn gram dương, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh,

gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl Tyrobutiricum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus (Chinachoti,1997; Desmazeaud,1996; Dodd và Gasson,

1994; Hurst, 1981; Rauch và De Vos, 1992) Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế

sự nảy mầm của chúng Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram ) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit thì nisin

(-có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này (Blackburn và cs.,1989; Stevens và cs., 1991)

Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn Gram (+) Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn

rất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng (Desmazeaud, 1996) Nguyên nhân do sự phá

vỡ các tổ chức cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó ( Garriga và cs., 1993; Tagg

và cs., 1976)

Nisin cũng như phần lớn các bacterioxin khác không có khả năng ức chế và tiêu

diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E coli bị ức chế khi có mặt của

EDTA Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-) đều

do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng Điều này được giải thích là do sự khác nhau của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Bacterioxin chỉ tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-) (Desmazeaud,1996)

Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình (Hình 1.2) Kiểu tác dụng không đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà không cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn (Dodd và cs., 1994; Gao và cs., 1991) Kiểu hình thứ 2: nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào đích (Wiedemann và cs., 2001) và sự tương tắc đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế bào (Wiedemann và cs., 2006)

Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn (Ruhr và Sahl, 1985) Ở

vi khuẩn Gram (+), peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới 25 lớp Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn

có một lớp màng ngoài quan trọng (outer membrane – OM) Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương tự màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipid hình thành nên cấu trúc mà còn có polysaccharide và protein Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide

tế bào Vi khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phép các hợp chất kị nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng Lớp ngoài cùng của màng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán kị nước (Hauben và cs., 1996)

Hình 1.2 Mô hình nisin tấn công làm thủng màng tế bào

A- Cơ chế kiểu cái nêm, tấn công tạo lỗ độc lập Tại nồng độ micromol, nisin

tác dụng với đầu ưa nước của phospholipids tạo thành lỗ trên cầu trúc 2 lớp

phospholipids; B- Nisin bám vào lipid II bằng đầu N-terminus; C- Đầu

C- terminus của nisin di chuyển qua màng Lỗ hổng được tạo bởi tỷ lệ 5 đến 8

phức nisin-lipid II; D- Các phân đoạn cấu trúc chức năng của nisin; Vòng ABC

ở đầu N-terminus gắn kết với lipids II, các vòng ở đầu C-terminus có khả năng

xuyên thủng màng và vùng bản lề linh hoạt ở giữa chúng

Các ký hiệu: CM- cytoplasmic membrane (màng tế bào); G- N- acetylglucosamine; M- N-acetylmuramic acid Các amino acids gắn với

N- acetylmuramic acid ở lipids II là: L-Ala, D-Glu, L-Lysin, D-Ala, A-Ala

(theo Héchard và Sahl, 2002 (A); Wiedemann và cs., 2001 (B-D))

Chính nhờ lớp màng ngoài OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của các bacterioxin Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảm chức năng rào cản của lớp màng ngoài OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức “càng”

(chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốc

thẩm thấu Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp với bacterioxin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) EDTA là hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram(-) Stevens và các cộng

sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt một số

chủng Salmonella Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50mg/ml và EDTA 20nM thì sau

1 giờ xử lý ở 370C, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm từ 103,2 đến

106,9 CFU/ml Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân EDTA hoặc nisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể (Hague và cs., 1997)

1.2.5 Sinh tổng hợp và điều hòa phiên mã

Nisin được tổng hợp ở ribosome như là một tiền peptide không có họat tính Sau

đó chịu sự biến đổi sau dịch mã bao gồm: tách nước (dehydration), tạo vòng Lanthionine , tiết ra và phân tách phần đầu Quá trình nhằm tạo ra nisine hoàn chỉnh (chín muồi) và có họat tính sinh học Quá trình này cần đến 14 kb DNA của gen nhảy nisin-sucrose liên hợp (conjugative nisin-sucrose transposon) (McAuliffe và cs., 2001; Zendo và cs., 2003), bao gồm 11 gen theo trình tự như sau

nisA/Z/QBTCIPRKFEG trên hình 1.3

Gen cấu trúc nisA/Z/Q mã hóa cho prepeptied có 57 amino acids bao gồm

cả peptide phần đầu có 23 amino acids Nisin operon bao gồm các gen chịu trách nhiệm

cho sự biến đổi sau dịch mã nội bào (nisBC) qua đó các amino acids bị tách nước và tạo

vòng lathionine Sau đó peptide được tiết ra bởi protein vận chuyển NisT và phần đầu peptide bị phân tách bởi protease NisP Việc sản xuất nisin được điều hòa tự động bởi

hệ điều hóa gồm 2 thành phần: nisR mã hóa cho điều hòa phản ứng và nisK mã hóa cho histidine kinase Ở một chủng sản xuất nisin, người ta phát hiện ra promoter nisA không

chỉ bị cảm ứng bởi nisin mà còn bởi galactose (Chandrapati và O’Sullivan

1999; Chandrapati và O’Sullivan 2002)

Màng tế bào bào chủng sản lactococci nhậy cảm với nisin Để tự bảo vệ màng, chủng sản có cơ chế kháng tổng hợp Cơ chế tự bảo vệ này được gọi là đề kháng nisin

NisF, NisE và NisG tạo nên phức vận chuyển ABC NisF là cytoplasmic ATP-binding protein (protein màng tế bào chất liên kết ATP) NisE và NisG là các protein có tính kỵ nước thuộc thành phần màng (hydrophobic integral membrane proteins) Chức năng của phức NisFEG là xuất khẩu nisin liên kết với tế bào ra môi trường bên ngoài

(Stein và cs., 2003) Gen nisI mã hóa cho NisI là một lipoprotein gắn với phía ngoài của

tế bào của màng tế bào (Kuiper và cs., 1993 và Qiao và cs., 1995) Gen nisI rất độc đáo,

không có sự tương đồng nào với các chuỗi đã được biết Tiền NisI là peptide có

19 amino acids và có vị trí để có thể biến đối (gắn kết) với lipid Khi phần đầu bị phân tách ra, protein hoàn chỉnh được tiết ra qua màng thế bào và cuối cùng bám vào màng bởi các nhóm lipids của bó Phần protein trong NisI hoàn chỉnh là protein ưa nước mang điện âm Nếu phần đầu bị tách trước khi nhóm lipid gắn vào thì protein này

sẽ bị tiết ra ngoài môi trường hoàn toàn và không gắn với màng nữa (Koponen

và cs.,

2004) NisI bảo vệ tế bào khỏi nisin Cơ chế NisI bảo vệ tế bào chưa hoàn toàn được hiểu rõ Tương tác nisin:NisI tạo ra phức không bền vững (Stein và c.s., 2003), chính đầu C-terminus của NisI đảm bảo cho sự đặc hiệu của tương tác này (Takala và Saris, 2006) Người ta cho rằng NisI có chức năng như là “protein ngăn chặn” có tác dụng làm giảm số lượng phân tử nisin trên màng tế bào “NisI gắn với màng tế bào” có thể ngăn cản nisin chèn vào màng tế bào hoặc NisI giúp đỡ phức NisFEG trong việc xuất khẩu nisin từ màng tế bào (Takala và cs., 2004)

Hình 1.3 Các gen tham gia vào sản xuất nisin Z, điều hòa và đề kháng

Toàn bộ nisin gen block kể từ nisZ promoter, qua 11 gen đến phiên mã terminator

350bp ở sau gen nisG là 14 kb Tam giác đen chỉ promoters cảm ứng bởi nisin (nisin- inducble); Tam giác trắng chỉ promoter constitutive; Móc tròn chỉ vòng kết thúc phiên

mã (theo Takala, 2005)

Gen nisI trong tế bào chủng sản chịu trách nhiệm cho 80% khả năng kháng nisin (Siegers và Entian 1995; Ra và cs., 1999), gen nisFEG chịu trách nhiệm cho 20% khả năng kháng nisin (Duan và cs., 1996) Tuy nhiên khi biểu hiện nisI ở chủng nhạy cảm

với nisin chỉ tăng được từ 1 đến 4% khả năng kháng nisin Từ đó người ta cho rằng có

sự hiệp lực giữa NisI và NisFEG

1.2.6 Sự liên hệ giữa các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và

kháng nisin

Sự có mặt plasmid DNA được phát hiện trong các vi khuẩn thuộc nhóm N

Streptococcus (Lactococcus) (McKay và Baldwin,1982; Pechman và Teuber,

1981) Các đặc tính nổi trội (phenotype) được thể hiện bởi các gen nằm ở DNA

plasmid: đối với Streptococcus lactis là khả năng lên men lactose (Snook và McKay, 1981), thủy phân casein (Efstathiou và McKay,1976); đối với Streptococcus lactis subsp diacetylactis là khả năng sử dụng citrate (Kempler và McKay,1979) Các chủng vi khuẩn thuộc loài S lactis sinh tổng hợp nisin có mang plasmid DNA

(Fuchs và cs.,

1975; LeBlanc và cs., 1980; LeBlanc và cs.,1979) và đã được chứng minh có mối liên

hệ giữa sự có mặt của plasmid và khả năng sinh tổng hợp nisin (Kozak và cs., 1974)

Kích thước plasmid DNA có mặt trong S lactis có thể rất khác nhau: có plasmid kích

thước nhỏ (1-5,5 MDa) nhưng cũng có plasmid kích thước lên đến 60 - 80 MDa, lớn hơn cả kích thước chromosomal DNA (Hình 1.4, Anderson và McKay, 1983)

LeBlanc và cộng sự (1980) cho rằng chủng S lactis ATCC 11454 có khả năng sử

dụng sucrose và sinh tổng hợp nisin là tính trạng được quyết định bởi plasmid Sau đó,

Gasson (1984) công bố rằng chủng S lactis có các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và kháng nisin, có khả năng truyền các tính trạng này cho chủng S lactis không có plasmid bằng con đường tiếp hợp chuyển gen (conjugal transfer) Ngoài ra McKay và Balwin chỉ ra rằng chủng S lactis subsp diacetylactis

DRC3 có mang plasmid kích thước 40- MDa chứa gen mã hóa tính trạng kháng nisin và hạn chế (kháng) bacteriophage phụ thuộc vào nhiệt độ

Gondazalezt và Kunka (1985) đã phát hiện ra khả năng chuyển gen bằng

hợp nisin ( tinh trạng Suc- Nis) từ chủng S lactis này đến chủng S lactis kia; tiếp đến chủng S lactis nhận lại có thể truyền cho chủng S lactis khác và S lactis subsp diacetylactis Ngoài ra tính trạng kháng bacteriophage phụ thuộc nhiệt độ cũng được phát hiện ở chủng chuyển gen bằng phương pháp tiếp hợp (transconjugants) S lactis subsp diacetylactis

Hình 1.4 Điện di agarose gel plasmid DNA

Plasmids tách chiết từ các chủng vi khuẩn S lactis

PW1, NP2, ML3 và PW2 Kích thước các băng được được thể hiện với đơn vị Mdal (10 6 Da) Chr.- Băng DNA chromosomal

(theo Anderson và McKay, 1983)

1.2.7 Sự ổn định tính trạng Suc-Nis

Gonzalez và Kunka đã phát hiện đối với một chủng Lactococcus lactis, các tính

trạng lên men lactose, sucrose và sinh tổng hợp nisin được quy định bởi sự có mặt của plasmid (Gonzalez và Kunka, 1985) Các chủng đột biến có dẫn xuất nhận được bằng cách xử lý các chủng ở nhiệt độ cao (35-400C) nhằm loại các plasmid sẵn có trong tế bào liên quan đến khả năng lên men lactic (Lac+), lên men đường sucrose (Suc+), sinh tổng hợp nisin (Nis+) Các chủng dẫn xuất thu được có đặc tính khác nhau như Lac-Suc+, Lac+Suc- hay Lac- Suc- (Hình 1.5)

1    2  3    4    5   

Plasmids tách từ chủng Lactococcus lactis gốc

và các chủng đột biến dẫn xuất: 1- Thang chuẩn; 2 – Chủng gốc; 3- Chủng Lac- Suc+; 4- Chủng Lac + Suc - ; 5- Chủng Lac - Suc - (Gonzalez

và Kunka ,1985)

1,4

Sự ổn định tính trạng Suc-Nis của các chủng nhận gen S lactis và S lactis subsp diacetylactis phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nuôi chủng gốc sinh nisin tại các nhiệt độ 37,

40, 420C đã cho phép tần số xuất hiện các chủng Suc-Nis- lần lượt là 6, 5 và 5%

Tuy nhiên các chủng dẫn xuất được chuyển gen là S lactis và S lactis

1.2.8 Sự sắp xếp lại plasmid của Lactococcus trong quá trình ít dinh

dưỡng kéo dài

Theo Woojin Kim và cộng sự (2001), sự sống sót của Lactococcus lactis trong quá

trình đói kéo dài không phụ thuộc vào bản chất của pha chuyển (từ pha log đến pha bão hòa) mà phụ thuộc vào bản chất môi trường vi sinh vật được giữ trong đó Trong môi trường nghèo, không có glucose, tế bào vẫn có khả năng sinh sôi do chúng có khả năng

sử dụng một lượng nhỏ peptide có mặt trong môi trường, hoặc sử dụng nguồn năng

Khi được duy trì trong tình trạng đói kéo dài (1- 2 năm), có những tế bào của giống thay đổi về hình thái rất rõ ràng Việc kiểm tra thành phần plasmid những tế bào này cho thấy: plasmid nguyên gốc từng có mặt trong tế bào bố mẹ đã xảy ra sự thay đổi, sắp xếp lại; bên cạnh đó có những plasmid mới tạo thành Sự thay đổi cũng xảy ra ở DNA chromosom và sự biểu hiện gen Ngoài ra, những tế bào bị đói kéo dài có khả năng phát triển tốt hơn tế bào bố mẹ ở trong cùng điều kiện môi trường nghèo năng lượng; chúng cũng có khả năng chịu đựng các loại stress khác nhau tốt hơn tế bào bố

mẹ như khả năng chịu muối mật và hydrogen peroxide Sự thay đổi tương tự nhau đã diễn ra ở các tế bào khác nhau được phân lập từ giống 2 năm tuổi Do vậy chiến thuật sống sót của các tế bào này là giống nhau để đảm bảo chúng tồn tại được trong thời gian dài này

Khi tế bào vi khuẩn ở trong tình trạng thiếu dinh dưỡng (bị đói), tế bào vi khuẩn phản ứng bằng hàng loạt những thay đổi xảy ra trong tế bào nhằm giúp tế bào có khả năng sống sót trong tình trạng đói (Losick và Shapiro, 1984; Shapiro và cs., 1993; Smith và cs., 1989) Sự phản ứng của vi sinh vật khác nhau ở từng loài Các loài

vi khuẩn không có khả năng tạo bào tử phản ứng tới sự đói không mạnh bằng các loài

có khả năng tạo bào tử, nhưng chúng cũng bị thay đổi hình thái, kích cỡ tế bào bị giảm (Shapiro và cs., 1993); chúng cũng có những thay đổi mạnh về sinh lý; và những thay đổi này giúp chúng có khả năng sống sót và chịu đựng stress (Foster và Spector, 1995; Kjelleberg và cs., 1993; Kolter và cs., 1993; Matin, 1991; Siegele và cs., 1993) Tuy nhiên khác với bào tử, tế bào loài vi khuẩn không tạo bào tử vẫn duy trì sự trao đổi chất

ở mức thấp trong quá trình đói (Kjelleberg và cs., 1993)

Trong quá trình đói kéo dài, sự đột biến ngẫu nhiên vẫn thường xảy ra; điều kiện đói có thể tạo áp lực tuyển chọn cho một loại tế bào đột biến nào đó; giúp cho chúng có khả năng sinh sôi Khi trộn tế bào trẻ 1 ngày tuổi cùng những tế bào 10 ngày tuổi của một chủng vi sinh vật, tế bào 10 ngày tuổi phát triển nhanh và lấn át tế bào 1 ngày tuổi

Do vậy có thể giải thích nguyên nhân là tế bào 10 ngày tuổi có đặc điểm lợi thế phát triển ở giai đoạn bão hòa (growth-advantage-in-stationary-phase properties - GASP) Khả năng sống sót của tế bào trong quá trình đói được xác nhận bởi sự thay

đổi theo quy luật xảy ra trong tế bào trong giai đoạn bão hòa và những đột biến ngẫu nhiên xảy ra tự nhiên trong quá trình đói

Ngoài ra điều kiện mà tế bào tồn tại trước giai đoạn đói cũng ảnh hưởng đến sự phản ứng của tế bào đến sự thiếu dinh dưỡng (Mason và Egli, 1993) Bản chất của pha chuyển (từ pha log đến pha bão hòa) phụ thuộc vào lượng dinh dưỡng có trong môi trường Nếu môi trường giàu dinh dưỡng (như glucose) thì tế bào phát triển nhanh, nồng độ tế bào cao, sự tích lũy sản phẩm trao đổi chất cao; vì nồng độ tế bào cao nên dinh dưỡng suy kiệt nhanh, do vậy pha chuyển diễn ra bất ngờ và nhanh Ngược lại, nếu môi trường dinh dưỡng hạn chế (như phytone peptone), tốc độ tăng trưởng có thể chậm, nồng độ tế bào thấp, sản phẩm trao đổi chất thấp, pha chuyển diễn ra từ từ và kéo dài; do vậy tế bào được luyện sống trong môi trường dinh dưỡng hạn chế, sẵn sàng thích ứng với điều kiện đói hơn

Sinha cũng nhận thấy Streptococcus cremoris và Streptococcus lactis bị mất

plasmid khi lên men ở nhiệt độ 320C qua đêm, sau đó giữ ở điều kiện này đến 96h Môi trường axit đã gây ra sự mất plasmid các kích cỡ khác nhau ở các chủng này

(Sinha, 1989) Sự mất plasmid ở chủng Lactococcus lactis là do thời gian lên men kéo

dài sau 72 giờ trong khoảng nhiệt độ 15-400C (Avsaroglu và cs., 2007)

Một số kết quả về cải tạo chủng giống

Đã có một số nghiên cứu thành công trong xây dựng được hệ thống biểu

hiện bacterioxin trong Lactococcus, Leusconostoc và Lactobaccillu spp (Kleerebezem và cs., 1997), Lb sake (Axelsson và cs., 1998), đã sản xuất

bacterioxin tái tổ hợp như pediocin (Miller và cs., 1998), piscicolin (Gerald và cs., 2004), sản xuất nisin A tái tổ hợp tăng 100% so với giống tự nhiên (Gasson và cs., 2002)… Fernández và cộng sự (2004) đã đồng sản xuất bacterioxin nisin A và

lactococcin A với năng suất cao bởi chủng Lac lactis Khả năng của lactoccocin A

như tiêu giải tế bào, giải phóng các enzim nội bào đã bổ sung cho phổ hoạt động rộng của nisin A Do vậy bacterioxin hỗn hợp này ngoài công dụng bảo quản còn có tác dụng thúc đẩy quá trình chín format, tạo hương và vị cảm quan trong thời gian ngắn hơn

Chủng vi khuẩn Lactococcus lactis subsp lactis A164 được cải tạo bằng

cách biến nạp thêm các gen nisRK hoặc nisFEG giúp làm tăng hoạt lực chủng giống lên

50% so với chủng gốc ban đầu (Chan-Ick Cheigh và cs., 2005)

1.3 Ứng dụng bacterioxin và nisin

Năm 1969 tại hội nghị Các chất phụ gia thực phẩm của Cộng đồng Kinh tế Châu

Âu, FAO và WHO đã chính thức cho phép sử dụng nisin được làm chất bảo quản thực phẩm với ký hiệu E234 với hàm lượng 400 IU/g Năm 1988, Cục Thuốc và Dược phẩm của Hoa Kỳ cho phép sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm; tại Hoa Kỳ trong bảo quản pho-mát, nisin được sử dụng với liều lượng 10.000 IU/g cao gấp 25 lần liều dùng thông thường (Chen và Hoover, 2003; Cleveland và cs., 2001; Delres-Broughton và cs., 1996; Delres-Broughton, 1990) Đến nay Nisin A đã được sử dụng rộng rãi nhất, ở trên 50 nước

Thị trường cho chất bảo quản tự nhiên bacterioxin là khoảng 30 triệu USD (năm 2003) và đươc dự đoán tăng đến 90 triệu USD năm 2010 (theo Báo cáo của tập đoàn Giract, Thụy sĩ , 2003) Hiện nay các chất bảo quản này được sản xuất chủ yếu bởi các công ty Handary Bio-Engineering B.V., Hà Lan, Profood International Inc, Hoa Kỳ và gần đây nhiều công ty ở Trung Quốc (Qingdao FTZ United International, Abana Foodstuff Co ) bắt đầu sản xuất Hiện nay, tại các nước phát triển, do xu hướng người tiêu dùng ưa chuộng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc gần với tự nhiên, các nhà sản xuất đã áp dụng phương pháp chế biến sạch và sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên thay thế dần các chất bảo quản được sản xuất bằng phương pháp hoá tổng hợp Đây được coi là chất bảo quản thực phẩm mới, nếu so sánh với chất bảo quản hóa tổng hợp truyền thống Nhờ đó thị trường chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày một gia tăng Hiện tại, thị phần chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên chiếm đến 15% tổng giá trị thị trường chất bảo quản thực phẩm tại Mỹ Nhu cầu về chất bảo quản tự nhiên này sẽ còn tăng nhiều vì xu hướng sử dụng thực phẩm gần với thiên nhiên trở nên phổ biển

Bacterioxin và vi khuẩn lactic sinh bacterioxin có ứng dụng lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, trong sản xuất sản phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc vì chúng là những chất bảo quản tự nhiên (Calo-Mata và cs., 2008)

Ưu điểm của sử dụng bacterioxin nói chung và nisin nói riêng trong bảo thực phẩm là : (i)- khắc phục được hiện tượng kháng kháng sinh ở vi sinh vật gây bệnh (so với phương pháp sử dụng kháng sinh); (ii)- Nisin có tính bền nhiệt cao, sử dụng nisin giúp giảm thời gian và nhiệt độ khử trùng giảm, mang lại chất lượng cho sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao

Hiện nay nisin chủ yếu được sử dụng làm chất bảo quản sinh học có tác dụng

chống lại Lactococcus, Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Listeria và Microbacteria (Lê Thanh Bình và cs., 2000; Harris và cs.,

1989) Nisin ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, bào tử chịu nhiệt gây thối

hỏng thực phẩm như Clostridium thermosaccharolyticum, Bacillus thermophilus, Bacillus cereus để bảo quản phomat và thực phẩm lên men, thịt hộp , cá, sữa, sản phẩm

hoa quả, đảm bảo cho thực phẩm đóng hộp không bị hư hỏng trong thời gian bảo quản

và giảm nhiệt độ thanh trùng, giảm 90% thời gian xử lý nhiệt (Broadibent và Kodo, 1990; Delres-Broughton, 1990) Nisin có vai trò quan trọng trong việc ức chế các vi khuẩn sinh histamin - một chất gây dị ứng sinh ra trong quá trình chín của phomat (Spelhaug và Harlander, 1989)

Ngoài ra nisin, người ta đã sản xuất và thương mại hóa pediocin PA-1 (hay còn có

tên AcH) (Rodriguez và cs., 2002) Các bacterioxin từ vi khuẩn Lactobacillus được sử

dụng ở dạng tinh sạch hoặc thô để bảo quản một số sản phẩm từ thịt, hoặc bổ sung bằng cách trực tiếp cấy vi khuẩn lactic vào nguyên liệu ban đầu Do vậy giải pháp bacterioxin do giống khởi động hoặc đồng giống khởi động sản xuất trực tiếp vào thực phẩm, được áp dụng cho các sản phẩm lên men từ thịt, rau, sữa như xúc xích lên men, rau quả lên men, phomat … (Leroy và De Vuyst, 2004)

Trong chế biến thịt, sữa vi khuẩn Listeria monocytogenes một thách thức cho các nhà sản xuất Vi khuẩn L monocytogenes có mặt rộng rãi trong tự nhiên, có thể sống sót

trong khoảng pH 4,1-9,6 và nhiệt độ từ 0oC đến 45oC, gây ảnh hưởng đến sức khỏe

của người tiêu dùng từ ngộ độc đến tử vong Tiêu chuẩn Hoa Kỳ không cho phép có mặt

Listeria trong thực phẩm từ thịt, sữa đã gây khó khăn cho các công ty xuất khẩu sang

Mỹ từ châu Âu và một số nơi khác, nơi mà tiêu chuẩn cho phép Listeria dưới 100 tế bào/gram sản phẩm Enterocin CCM 4231 được bổ sung vào salami có thể làm giảm L

monocytogenes từ 107 xuống 104 CFU/g (Laukova và cs., 1999) Sakacin K từ Lb sake CTC 494 có khả năng ức chế Listeria innocua khi bổ sung vào thịt lợn và gà đóng gói chân không (Hugas và cs.,1998) Lactocin 705 từ Lb casei CRL 705 có khả năng ức chế L monocytogenes trong thịt bò xay (Vignolo và cs 1996) Thời gian bảo

quản sữa khử trùng và pho-mat khi sử dụng các bacterioxins được kéo dài hơn hẳn

Lacticin 3147 hoặc chủng sản Lactococcus lactis DPC 3147 được cấy vào quá trình

lên men phomat có tác dụng giảm lượng vi khuẩn lactic dại (không phải giống khởi động) trong quá trình phomat chín (Ross và cs., 1999)

Việc bổ sung nisin từ 400- 800 IU/g kết hơp với 2% NaCl có tác dụng diệt L

monocytogenes trong thịt trâu băm (Pawar và cs., 2000) Nisin với nồng độ 100 IU/ml

có khả năng ức chế L monocytogenes trong pho-mát thời gian 8 tuần (Shillinger và

cộng sự., 1996) Nisin với nồng độ thấp (50 IU/ml) kết hợp với các bacterioxin khác

như curvatixin13 (160 AU/ml) có tác dụng mạnh ức chế L.monocytogenes, hơn hẳn

việc sử dụng từng loại bacterioxin riêng biệt (Bouttefroy và Milliere, 2000)

Tóm lại, có 3 cách sử dụng bacterioxin làm chất bảo quản thực phẩm (Shillinger

và cs., 1996):

- Cấy trực tiếp vi khuẩn lactic vào nguyên liệu thực phẩm cần chế biến Khả năng vi khuẩn lactic phát triển và phát tán bacterioxin vào nguyên liệu trong quá trình lên men là sự quan trọng cần thiết để tạo sản phẩm thành công Bacterioxin do vi khuẩn lactic giống khởi động hoặc đồng giống khởi động sinh ra có khả năng ức chế vi sinh vật gây hỏng thực phẩm hoặc gây bệnh

- Bổ sung bacterioxin tinh sạch hoặc bán tinh sạch (thô) vào sản phẩm trong vai trò chất bảo quản

- Sử dụng sản phẩm đã được lên men bởi chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin làm chất phụ gia trong chế biến thực phẩm

Bacterioxin có khả năng ứng dụng trong chế biến nhiều loại thực phẩm như sữa khử trùng, pho mat, sữa chua, các loại cream tạo hương, độ kết dính, độ bọt, các loại nước sốt có pH thấp kể cả mai-o-nê và sốt trộn xa-lat, súp khử trùng, rau thịt đóng hộp, các sản phẩm lên men bao gồm cả bia (theo www.danisco.com/ingredients)

Nisin ứng dụng trong bảo quản sữa

Sữa là môi trường dinh dưỡng tự nhiên tốt nhất cho các loại vi khuẩn sinh sản và phát triển trong đó có các vi khuẩn lactic, butiric, propionic, kết hợp với các vi khuẩn khác và cả nấm men, nấm mốc làm chua sữa, làm mất màu của sữa, cũng như có mùi hôi và vị đắng Ngoài ra rất nhiều loại vi khuẩn gây thối và gây bệnh có khả năng phát

triển tốt trong sữa Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong sữa tươi như sau: E coli,

vi khuẩn lactic, Coliforms, Listeria monocytogenes Vi khuẩn L monocytogenes

ưa lạnh, tăng trưởng được ở cả nhiệt độ 40C Do đó sữa tươi bảo quản lạnh vẫn có nguy

cơ bị nhiễm loại vi khuẩn này

Nisin được bổ sung như chất phụ gia vào sữa để kéo dài thời gian sử dụng ở những vùng khí hậu nóng và thời gian vận chuyển kéo dài Khi bổ sung nisin với hàm lượng 30 ÷ 100 ppm có thể kéo dài thời gian bảo quản sữa lên 4 ÷ 6 lần (Broadibent và Kodo, 1990)

Trong bảo quản sữa nước, chất béo và chất gây nhũ tương hóa có ảnh hưởng đến

hiệu quả nisin ức chế đến L monocytogenes sau 2 giờ tương tác: chất béo trong sữa làm

giảm hoạt tính nisin vì nisin có khả năng bám kết vào các khối cầu mỡ trong sữa, do vậy khi bổ sung chất tạo huyền phù có thể làm giảm sự liên kết này và làm tăng hoạt tính của nisin Việc bổ sung Tween 80 nồng độ từ 0,05% đến 0,2% làm tăng hoạt tính tác dụng của nisin, trong khi đó việc bổ sung lecithin 0,1- 0,3% cho hiệu quả thấp (Dong-Sun Jung, 1992)

Nisin có tác dụng trong bảo quản với tất cả các loại sữa, nhưng theo thứ tự giảm dần từ sữa gầy đến sữa 2% béo (đã tách một phần chất béo) và cuối cùng là sữa 3,5%

béo Ở nồng độ 125 IU/ml – 250 IU/ml, nisin có tác dụng ức chế L monocytogenes

đến 9 ngày trong sữa gầy (Meena Bhatti và cs., 2004)

Cơ chế tác dụng của nisin đến L monocytogenes được giải thích bằng sự tương tác hydrophobic giữa gốc axit amin của nisin và axit béo màng phospholipid của L monocytogenes (Henning và cs., 1986) Ngoài ra còn kể đến lực tĩnh điện giữa phân tử

nisin và màng phospholipids tĩnh điện âm (Sahl và Bierbaum, 1998) Ming và

Daeschel (1995) đã công bố rằng nisin có tác dụng khác nhau đến 2 chủng L monocytogenes khác nhau: nisin có tác dụng yếu hơn đến chủng có thành phần

phospholipids ít hơn Đã có công bố về thành phần phospholipids trong huyết tương sữa

bò là 0,19g/l (Swaisgood, 1985) Như vậy có thể nói rằng thành phần phospholipids trong sữa đã qua tiệt trùng pasteur hoặc quá trình đồng hóa có hàm lượng chất béo ≥2% đã thể hiện sự liên bám với nisin, do vậy làm giảm khả năng

bám của nisin đến thành tế bào L monocytogenes Trong trường hợp sữa gầy, hiện

tượng bám dính này không đáng kể, do vậy cùng nồng độ nisin, nhưng khả năng ức chế

L monocytogenes mạnh hơn so với trường hợp sữa béo

Khả năng ứng dụng nisin trong sản xuất nước mắm

Một số lĩnh vực chế biến thực phẩm ở Việt Nam như sản xuất nước mắm được thực hiện chủ yếu ở quy mô nhỏ, gặp nhiều khó khăn trong khâu ổn định chất lượng Nisin bền nhiệt, chịu được độ muối, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, bào tử chịu

nhiệt gây thối hỏng thực phẩm như Bacillus cereus và Clostridium thermosaccharolyticum, do vậy rất có tiềm năng trong lĩnh vực này

Hệ vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm rất phong phú, đặc biệt

có nhiều loại vi khuẩn như Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Staphylococcus…

Sự phát triển của những vi sinh vật không mong muốn làm hao tổn lượng đạm có trong nước mắm Khi vi khuẩn phát triển mạnh sẽ dẫn dến một số loại khí có mùi rất khó chịu như NH3, H2S… Các sản phẩm này có thể tan trong nước mắm, cũng có thể bay hơi tạo mùi khó chịu

Một số kỹ thuật đặc trưng trong chế biến nước mắm: muối ăn trong sản xuất nước mắm cũng đóng vai trò quan trọng là phòng thối Muối thẩm thấu vào nguyên liệu làm

nước thoát ra khiến cho vi khuẩn ở nguyên liệu bị thiếu nước không thể phát triển được NaCl khi hòa tan cũng sinh ra ion Cl- và ion này sẽ kết hợp với protein ở mối nối peptide làm cho các enzym phân huỷ protein của vi sinh vật không còn khả năng phá vỡ protein để lấy chất dinh dưỡng cung cấp cho sự sống Ngoài ra ion Cl- có độc tính làm vi khuẩn trúng độc Nồng độ muối càng lớn thì áp suất thẩm thấu càng mạnh, làm rách màng tế bào vi khuẩn, gây sát thương Do có muối nên oxy ít hoà tan trong môi trường ướp muối, khiến nhóm vi sinh vật hiếu khí ít có điều kiện phát triển Trong môi trường nước muối, quá trình tự phân giải bị kiềm chế, sản phẩm phân giải sinh ra ít, do đó làm cho vi khuẩn phát triển chậm Nồng độ nước muối từ 4,4% trở

lên có thể làm ngừng sự phát triển của một số vi khuẩn Gram âm như E coli, Samonella… Tuy vậy, đây không phải là giới hạn tuyệt đối vì các loại vi khuẩn khác

nhau có khả năng chịu muối khác nhau Thông thường loại cầu khuẩn chịu muối mạnh

hơn loại trực khuẩn, đặc biệt là cầu khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus

Trực khuẩn sinh bào tử cũng có khả năng tồn tại trong điều kiện nồng độ muối cao

trong một thời gian dài như trực khuẩn gây bệnh Bacillus cereus

Đến nay, chưa rõ về nghiên cứu ứng dụng nisin trong bảo quản và chế biến nước mắm

1.4 Công nghệ sản xuất sản xuất nisin

1.4.1 Công nghệ lên men

Bên cạnh các thành tựu về cải tạo chủng giống, các kỹ thuật lên men phù hợp vẫn

là biện pháp hữu hiệu nhất để nâng sản lượng sản phẩm trong sản xuất quy mô lớn Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp nisin khá nhậy cảm, dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như điều kiện lên men cũng như thành phần dinh dưỡng môi trường, khoáng chất

và sự có mặt của các ion kim loại Trong công nghệ lên men sinh tổng hợp nisin, việc nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật lên men tiên tiến vẫn là biện pháp hữu hiệu nhất

để nâng sản lượng trong sản xuất quy mô lớn

Sinh tổng hợp nisin diễn ra ở pha sinh trưởng Sự sinh trưởng của Lactococcus lactis cũng như sinh tổng hợp nisin chịu ảnh hưởng mạnh của quá trình nuôi cấy (nhiệt

độ, thời gian, pH, tỷ lệ tiếp giống) cũng như thành phần môi trường (Jensen và Hammer, 1993, De Vuyst và Vandamme 1993; De Vuyst 1995) Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp nisin nằm trong khoảng 30-350C, pH ban đầu 6,0- 8,0 (Parente và Hill,1992; ten Brink và cs., 1994) có thể nuôi cấy tĩnh hoặc có khuấy trộn (Vessoni Penna và cs., 2005) Họat lực nisin đạt cao nhất trong khoảng thời gian 10 đến 28 giờ lên men, tùy thuộc vào từng chủng (De Vuyst, 1995) Tỷ lệ tiếp giống trong khoảng 1-

10% Thành phần môi trường dinh dưỡng phù hợp cho Lactoccus như sau: (i) nguồn

cacbon – các loại đường đơn, đôi (glucose, lactose, galactose, maltose, sucrose ) tùy

thuộc vào từng chủng (De Vuyst và Vandamme, 1992); (ii) nguồn nitơ hữu cơ (cao thịt, cao nấm men, casein và dẫn xuất của nó, pepton ) (De Vuyst và

Vandamme,

1993); (iii) nguồn phosphor- các dạng muối phosphate (De Vuyst và Vandamme,

1993); (iv) nguồn khoáng như muối của Mg, Mn (De Vuyst, 1995; Verellen và cs., 1998); (iv) chất bề mặt (tween 80, tween 20 ); (v) vitamin (biotin, các vitamin nhóm B như riboflavin, pantothenat, nicotinic acid, pyridoxin) (Yoo và cs., 1997) ); (vi) muối NaCl từ 0-4% (Uguen và vs., 1999; Phan Thị Khánh Hoa, 2003; Leroy và De Vuyst, 1999)

Bằng phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men, sinh tổng hợp nisin đã đạt một số

kết quả: chủng Lac lactis IO-1 đạt 810 AU/ml (Chinachoti, 1997); chủng Lac lactis subsp lactics 11 đạt hoạt lực khoảng 1500 IU/ml quy mô phòng thí

nghiệm (Phan Khanh Hoa và cs., 2003; Nguyen Tien Thanh và cs., 2005)

Bằng những cố gắng phát hiện những cơ chất phù hợp cho sinh tổng hợp nisin, họat lực nisin trong dịch canh trường được cải thiện đáng kể Môi trường phức hợp với nồng độ muối KH2PO4 cao tới 5% có tính chất đệm ổn định pH dịch lên men, có tác dụng tạo sinh khối cao cùng với nâng cao hoạt lực sinh tổng hợp nisin tới 3500 IU/ml (De Vuyst và Vandamme, 1993) Jozala và cộng sự (2007) đã nghiên cứu môi trường có

sử dụng sữa gầy với hàm lượng chất rắn 2,27%, hoạt lực nisin đạt 3312 AU/ml sau