Báo cáo khoa học :Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn

Kết quả đạt được của đềtài: - Đã tách dòng và xác định trình tự thành công các đoạn gen CP, Nib của PRSV; CP, CPm và RDRP củaCTV. - Hoàn thiện quy trình đánh giá cây chuyển gen kháng virus trong phòng thí nghiệm và ngoài nhà lưới. - Tạo ra các dòng cây chuyển gen có triển vọng để phát triển thành giống. Tuy đã được một số kếtquả ban đầu đáng ghi nhận, nhưng để ứng dụng vào thực tiễn, TS. Chu Hoàng Hà vàcác cộng sự vẫn còn thực hiện một số công đoạn tiếp theo về khảo nghiệm giống biến đổi gen theo các quy định của pháp luật và hiện nay Việt Nam chưa có hành lang pháp lý hoàn chỉnh cho phép chúng ta sử dụng các sản phẩm biển đổi gen. Dođó các nghiên cứu này cần phải được tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo trước khi đến được tay bà con nông dân. Điều này là tất yếu không thể tránh khỏi, bởi giống cây nào, dù được chăm sóc tốt, cũng chỉ có một ngưỡng giới hạn về năng xuất và khả năng kháng bệnh. Nên nếu không áp dụng các côngnghệ sinh học mới nhất, sẽ khó có thể tạo được hiệu quả kinh tế cao. PGS TS Chu Hoàng Hà và cộng sự hy vọng, kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tiếp tục được phát triển, được đem khảo nghiệm rộngrãi trên các cánh đồng, để có những đánh giá và nhân rộng, đem lại ấm no cho người nông dân

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG

BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10

Chủ nhiệm đề tài: TS Chu Hoàng Hà Thư ký đề tài: TS Lê Văn Sơn

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG

CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10

Chủ nhiệm đề tài: TS Chu Hoàng Hà

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học

Địa chỉ: Nhà A10, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội

Điện thoại: 37562368 E-mail: chuhoangha@ibt.ac.vn

Hà Nội, 2010

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG

CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN

Mã số: KC.04.03/06-10

Chủ nhiệm đề tài

TS Chu Hoàng Hà

Cơ quan chủ trì đề tài

Ban chủ nhiệm Chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội, 2010

Lờ ờ ời i i c c cả ả ảm m m ơ ơ ơn n n

Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Văn phòng Các chương

trình trọng điểm cấp Nhà nước, Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban

Chủ nhiệm Chương trình KC04, Viện Nghiên cứu Rau quả, Viện

Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Phòng

Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã tham gia và hỗ trợ

công trình nghiên cứu này

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

TS Chu Hoàng Hà

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D Dichlorophenoxy acetic acid

BSA Bovine serum albumin

CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor

CPm Minor coat protein

CTV Citrus tristeza virus

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP deoxyribonucleotide

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay=Phản ứng miễn dịch liên kết

enzyme

gus β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase

IBA Indole-3-butyric Acid

IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside

Kb Kilobase

Km Kanamycine

LB Luria and Bertani

MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog

NAA 1 Napthye Acetic Acid

Nib Nuclear Inclusion Protein b

nptII Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hóa neomycine phosphotransferase II

PBS Phosphate buffer saline

PBST Phosphate buffer saline with 0.05 % Tween20

PCR Polymerase Chain Reaction

PRSV Papaya ring spot virus

RdRp RNA-dependent RNA polymerase

RNA Ribonucleic Acid

RT-PCR Reverse transcription PCR

T-DNA Transfer-DNA=DNA chuyển

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Báo cáo thống kê

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cây đu đủ và bệnh đốm vòng 5

1.1.1 Giới thiệu chung về cây đu đủ 5

1.1.2 Giới thiệu về bệnh đốm vòng và virus gây bệnh đốm vòng 6

1.1.3 Tình hình nghiên cứu tạo cây đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng 8

1.1.4 Hiện trạng sản xuất và nghiên cứu cây đu đủ 10

1.2 Cây cam quýt và bệnh tàn lụi 11

1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm cây cam quýt 11

1.2.2 Giới thiệu về bệnh tàn lụi và virus gây bệnh tàn lụi 14

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo cây cam quýt kháng bệnh tristeza 18

1.2.4 Hiện trạng sản xuất và nghiên cứu cây ăn quả có múi 19

1.3 Tạo cây trồng chuyển gen sử dụng kỹ thuật RNAi (RNA interference) và sử dụng các gen “đa đoạn” nhân tạo để tạo tính kháng phổ rộng 21

1.3.1 Lịch sử phát hiện cơ chế RNAi 21

1.3.2 Cơ chế hoạt động của RNAi trong thực vật 24

1.3.3 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh virus 28

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Phương pháp phát hiện bệnh 34

2.1.1 Các phương pháp phát hiện virus tristeza (CTV) 34

2.1.2 Phương pháp phát hiện PRSV 39

2.2 Phương pháp phân lập gen 39

2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 39

2.2.2 Phương pháp tách dòng 40

2.2.3 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu về trình tự gen 40

2.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen đa đoạn 40

2.3.1 Thiết kế gen đa đoạn gen CP, Nib và HC-pro của PRSV 40

2.3.2 Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen CP, Nib và HC-pro của PRSV 43

2.3.3 Thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV 45

2.3.4 Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 và RdRp-CP của CTV 46

2.4 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen thông qua Agrobacterium 47

2.4.1 Nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen ở đu đủ 47

2.4.2 Nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen ở cam quýt 49

2.5 Phương pháp phân tích cây chuyển gen 53

2.5.1 Phân tích cây chuyển gen qui mô phòng thí nghiệm 53

2.5.2 Phương pháp đánh giá cây chuyển gen ngoài nhà lưới 60

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63

3.1 Kết quả phân lập và thiết kế gen 63

3.1.1 Kết quả thu mẫu bệnh đốm vòng ở đu đủ và Tristeza ở cam quýt 63

3.1.2 Kết quả tách dòng và phân tích trình tự gen của PRSV 71

3.1.3 Phân lập và phân tích gen của CTV 96

3.1.4 Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn của PRSV 120

3.1.5 Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn của CTV 131

3.2 Kết quả tạo cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV 143

3.2.1 Kết quả xây dựng quy trình chuyển gen vào cây đu đủ thông qua phôi soma 143

3.2.2 Kết quả tạo cây đu đủ chuyển gen mang cấu trúc gen đa đoạn CP-Nib-HCpro 151

3.2.3 Đánh giá các dòng đu đủ chuyển gen 155

3.3 Kết quả tạo cây cam, quýt chuyển gen kháng CTV 161

3.3.1 Kết quả xây dựng quy trình chuyển gen vào cây có múi thông qua Agrobacterium 161

3.3.2 Kết quả tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV 188

3.3.3 Kết quả đánh giá các dòng cam, quýt chuyển gen 199

3.4 Thảo luận kết quả nghiên cứu 201

3.4.1 Kết quả xây dựng quy trình chuyển gen vào cây có múi thông qua Agrobacterium 161

3.4.2 Kết quả tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 của CTV 188

3.4.3 Kết quả đánh giá các dòng cam, quýt chuyển gen 199

3.4.4 Xây dựng quy trình chuyển gen cho các đối tượng nghiên cứu………… 206

3.4.5 Tạo cây đu đủ chuyển gen và đánh giá tính kháng PRSV 206

3.4.6 Tạo cây cam, quýt chuyển gen và đánh giá tính kháng CTV 207

3.4.7 Tổng kết kết quả đánh giá các dòng cây chuyển gen 208

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 210

4.1 Kết luận 210 4.2 Kiến nghị 213 TÀI LIỆU THAM KHẢO 214 PHỤ LỤC

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng đu đủ trên thế giới trong năm 2002-2004 6

Bảng 1.2: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam 10

Bảng 1.3: Sản lượng quả có múi trên thế giới trong năm 2001-2003 12

Bảng 1.5: Diện tích và sản lượng cam quýt ở Việt Nam năm 2007 19

Bảng 1.6: Các loại vector RNAi sử dụng công nghệ Gateway 29

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng gắn gen đa đoạn vào vector pENTRTM 43

Bảng 2.4: Kích thước các phân đoạn khi cắt plasmid tái tổ hợp bằng XbaI/HindIII 47

Bảng 2.7: Thành phần các môi trường nuôi cấy cam, quýt 50

Bảng 3.1: Danh sách các vùng thu mẫu PRSV cho kết quả dương tính 65

Bảng 3.2: Danh sách các vùng thu mẫu CTV kết quả dương tính 70

Bảng 3.3: Danh sách trình tự nucleotide gen CP PRSV đã phân lập được 73

Bảng 3.4: Hệ số tương đồng của gen CP ở mức độ nucleotide của các dòng PRSV của Việt Nam 75

Bảng 3.5: Hệ số tương đồng của CP ở mức độ amino acid của các dòng PRSV của Việt Nam 76

Bảng 3.6: Danh sách trình tự nucleotide gen Nib PRSV-P đã phân lập được 82

Bảng 3.7: Hệ số tương đồng của gen Nib ở mức độ nucleotide 83

Bảng 3.8: Hệ số tương đồng của gen Nib ở mức độ amino acid 84

Bảng 3.9: Mồi được sử dụng cho RT-PCR nhân dòng các vùng genome RNA của PRSV 86

Bảng 3.10: Hệ số tương đồng của trình tự nucleotide các chủng PRSV Việt Nam với các

Bảng 3.11: Mức độ tương đồng của trình tự amino acid các chủng PRSV Việt Nam với các

Bảng 3.12: Đặc điểm của một số dòng CTV được sử dụng để tách dòng gen 97

Bảng 3.13: Trình tự mồi sử dụng nhân các đoạn gen của CTV 99

Bảng 3.14: Danh sách các trình tự A, F, C, P của CTV đã được phân lập 100

Bảng 3.15: Danh sách trình tự nucleotide toàn bộ gen CP và CPm của CTV đã phân lập được 108

Bảng 3.16: Danh sách các đoạn gen của genome CTV đã được phân lập 115

Bảng 3.17: Trình tự các cặp mồi tách dòng gen CP và CPm 116

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D tới khả năng tạo mô sẹo và phôi đu đủ 143

Bảng 3.19: Xác định thời gian siêu âm thích hợp chuyển vào phôi soma đu đủ 146

Bảng 3.20: Xác định ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc 148

Bảng 3.21: Xác định mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen 149

Bảng 3.22 Hiệu suất chuyển gen phôi soma 151

Bảng 3.23: Kết quả chuyển gen CP-Nib-HcPro vào phôi soma đu đủ 153

Bảng 3.24: Thí nghiệm tính kháng virus với các dòng đu đủ Lạng Sơn T0 156

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cam Sành 162

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo quýt

Bảng 3.27: Kết quả tạo mô sẹo trên ba loại môi trường cơ bản khác nhau 164

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng tạo cụm chồi 166

Bảng 3.29: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP tới khả năng tạo đa chồi của

Bảng 3.30: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng ra rễ quýt Đường Canh 169

Bảng 3.31: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng ra rễ 171

Bảng 3.32: Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng tái sinh của cây 173

Bảng 3.33: Ảnh hưởng Km tới khả năng sống sót của cây quýt Đường Canh 176

Bảng 3.34: Ảnh hưởng Km tới khả năng sống sót của cây cam Sành 177

Bảng 3.35: Ảnh hưởng của mật độ Agrobacterium tới hiệu quả chuyển gen 178

Bảng 3.36: Ảnh hưởng của môi trường lây nhiễm khuẩn tới khả năng chuyển gen 180

Bảng 3.37: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose tới hiệu quả chuyển gen 182

Bảng 3.38: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng chuyển gen 184

Bảng 3.43: Kết quả đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza của một số dòng cam 195

Bảng 3.44: Kết quả đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza của một số dòng quýt 200

Bảng 3.45: Tổng kết kết quả phân tích cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và ngoài nhà

Hình 1.5: Ví dụ về cây hoa dã yên thảo trong đó các gen quy định sắc tố hoa đã bị làm

Hình 2.1: Triệu chứng vàng ở lá non trên lá chanh Eureka bị nhiễm chủng CTV 35

Hình 2.2: Triệu chứng lõm thân của thân cây bưởi bị nhiễm CTV-D 35

Hình 2.3: Dụng cụ dùng cho phương pháp phát hiện bằng que thử nhanh 37

Hình 2.4: Mô hình kết quả kiểm tra CTV bằng que thử nhanh 37

Hình 3.2: Một số mẫu đu đủ nhiễm PRSV với triệu chứng bệnh điển hình 64

Hình 3.3: Bản đồ các khu vực thu mẫu CTV ở Việt Nam 67

Hình 3.4: Hình ảnh thu mẫu tại các vùng miền núi phía Bắc 68

Hình 3.5: Kết quả giám định bệnh Tristeza bằng que thử nhanh 68

Hình 3.6: Kết quả giám định bệnh Tristeza bằng Elisa 69

Hình 3.8: Kết quả điện di các sản phẩm RT-PCR gen mã hóa protein vỏ (CP) của các mẫu

đủ đủ nhiễm bệnh thu thập tại các địa phương khác nhau 73

Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn mã hóa vùng N của gen CP của các dòng PRSV-P phân

lập của Việt Nam và trình tự của các dòng PRSV đã công bố trong Genebank 78

Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) 80

Hình 3.11: Sơ đồ các đoạn gen được tách dòng của genome PRSV 86

Hình 3.12: So sánh các chủng PRSV Việt Nam với các chủng khác trên thế giới theo trình

tự nucleotide tương ứng từ vị trí 9300-9400 của genome PRSV 91

Hình 3.13: So sánh đoạn protein CP ứng với vị trí 9300-9400 của genome các dòng PRSV

phân lập tại các vị trí khác nhau ở Việt Nam (amino acid) 92

Hình 3.14: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) được xây dựng dựa trên

trình tự genome 3 chủng PRSV Việt Nam (Lý Nhân, Kontum, Sai Gòn) với các chủng PRSV khác trên ngân hàng gen NCBI bằng phần mềm DNAstar 92

Hình 3.15: So sánh trình tự đầu 5’ của các genome PRSV Việt Nam với các trình tự

Hình 3.16: Kết quả PCR minh họa các đoạn A, F, C, P của một số dòng CTV 98

Hình 3.17: Cây phân loại dựa trên các đoạn gen của CTV 104

Hình 3.18: So sánh protein CP của một số dòng có triệu chứng bệnh nhẹ ở Việt Nam với

chủng T36 có triệu chứng bệnh nặng ở Mỹ Vị trí 124 của các protein đều là 109

phenylanlanine (F)

Hình 3.19: Điện di sản phẩm PCR tách dòng gen CP và CPm 111

Hình 3.20: Điện di sản phẩm colony-PCR của các dòng khuẩn lạc biến nạp gen CP và

Hình 3.21: So sánh trình tự gen CPm của VL1, CT2, DT1 với CPm của chủng T36 bằng

phần mềm BioEdit Dấu chấm thể hiện sự giống nhau giữa các nucleotide 113

Hình 3.22: So sánh trình tự protein CPm của VL1, CT2, DT1 với CPm của chủng T36

bằng phần mềm BioEdit Dấu chấm thể hiện sự giống nhau giữa các acid amin 114

Hình 3.23: Trình tự nucleotide và acid amin của CP và CPm 117

Hình 3.24: Kết quả điện di protein CP và CPm trên gel polyacrylamide 118

Hình 3.25: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen CP, Nib, Hcpro 122

Hình 3.26: Kết quả PCR gắn gen đa đoạn CP-Nib và CP-Nib-Hcpro 123

Hình 3.27: Kết quả điện di colony-PCR của các dòng khuẩn lạc E.coli biến nạp gen đa

Hình 3.28: Điện di sản phẩm PCR nhân gen đa đoạn CP-Nib và CP-Nib-HCpro 126

Hình 3.29: Kết quả điện di colony-PCR của các dòng E.coli biến nạp

Hình 3.30: Điện di colony-PCR của dòng E.coli biến nạp pK7GWIWG2(II)/CP-Nib và

Hình 3.31: Điện di pK7GWIWG2(II)/CP-Nib và pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro cắt bằng

Hình 3.32: Biến nạp cấu trúc RNAi pK7WIWG2(II)/CP-Nib-HCpro vào tế bào A

Hình 3.33: Điện di colony-PCR từ A tumefaciens pGV2260 mang vector

pK7WIWG2(II)/CP-Nib-HCpro và pK7WIWG2(II)/CP-Nib 130

Hình 3.35: Điện di sản phẩm PCR bốn đoạn gen RdRp, CP, p20, p23 136

Hình 3.37: Kết quả điện di sản phẩm PCR nối 4 phân đoạn gen RdRp, CP, p20 và p23 137

Hình 3.38: Điện di colony - PCR các khuẩn lạc pENTR/RdRP-CP và

Hình 3.43: Điện di sản phẩm plasmid cắt bằng enzyme giới hạn XbaI và HindIII 142

Hình 3.44: Một số hình ảnh tái sinh cây đu đủ qua phôi soma 145

Hình 3.45: Mức độ biểu hiện gen Gus ở OD600 khuẩn khác nhau sau 3 tuần 150

Hình 3.46: Quy trình chuyển gen vào phôi soma đu đủ thông qua Agrobacterium 151

Hình 3.47: Hình ảnh quả của 2 giống đu đủ sử dụng trong nghiên cứu 152

Hình 3.48: Một số hình ảnh của quy trình biến nạp gen đã được thực hiện 154

Hình 3.49: Ảnh điện di sản phẩm PCR các dòng đu đủ Lạng Sơn chuyển gen 154

Hình 3.50: Cây đu đủ chuyển gen được thử tính kháng virus PRSV 157

Hình 3.51: Ảnh phim lai Southern DNA gemone cây đu đủ cắt bằng HindIII và mẫu dò 159

Hình 3.52: Lai Nothern kiểm tra sự biểu hiện gen nptII các dòng đu đủ chuyển gen 160

Hình 3.53: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cam Sành 162 Hình 3.54: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây quýt

Hình 3.55: Ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng hình thành cam Sành 171

Hình 3.56: Cây cam quýt trên giá thể ½ cát vàng + ½ trấu hun 174

Hình 3.57: Mẫu cam Sành sống sót trên môi trường có bổ sung Km sau 8 tuần 177

Hình 3.58: Biểu hiện gen gus tạm thời ở các mật độ khuẩn khác nhau 179

Hình 3.59: Biểu hiện gus tạm thời ở môi trường nhiễm khuẩn MS bổ sung 3% sucrose 181

Hình 3.60: Biểu hiện tạm thời của gus trên mẫu đã được xử lý sucrose 183

Hình 3.61: Biểu hiện của gen gus ở lá cây chuyển gen chuyển gen 187

Hình 3.62: Điện di sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen Bar 187

Hình 3.63: Hình ảnh minh họa các bước chuyển gen đa đoạn vào cam quýt 189

Hình 3.64: Mô tả các bước của thí nghiệm thử tính kháng 194

Hình 3.65: Lai Southern DNA gemone các dòng cam Xã Đoài 197

Hình 3.66: Lai Nothern kiểm tra sự biểu hiện gen npt II các dòng cam Xã Đoài chuyển gen 198

Hình 3.67: Lai Southern DNA gemone cây quýt Đường Canh 201

NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

TT Họ và tên Học hàm, học vị Cơ quan trong Đề tài Nhiệm vụ

1 Chu Hoàng Hà TS Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm

2 Lê Văn Sơn TS Viện Công nghệ sinh học Thư ký

3 Lê Trần Bình GS.TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

4 Đỗ Xuân Đồng ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

5 Đỗ Tiến Phát ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

6 Đặng Thị Hương ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

7 Nguyễn Chi Mai KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

8 Nguyễn Văn Phượng KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

9 Nguyễn Minh Hùng CN Viện Công nghệ sinh học Thành viên

10 Phạm Bích Ngọc TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

11 Lâm Đại Nhân TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

12 Trần Mỹ Linh TS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

13 Phạm Thị Vân ThS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

14 Đinh Thu Hiền KS Viện Công nghệ sinh học Thành viên

15 Đỗ Đình Ca TS Viện Nghiên cứu Rau quả Thành viên

16 Ngô Vĩnh Viễn TS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên

17 Mai Thị Liên TS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên

18 Nguyễn Thị Bích Ngọc ThS Viện Bảo vệ thực vật Thành viên

19 Nguyễn Minh Châu PGS.TS Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam Thành viên

20 Lê Thị Thu Hồng TS Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam Thành viên

21 Nguyễn Thị Ngọc Trúc ThS Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam Thành viên

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn

Mã số: KC.04.03/06-10

Thuộc: Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước KC04

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Chu Hoàng Hà

Ngày, tháng, năm sinh: 1969 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính

Chức vụ: Phó Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật

Phó Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen

Điện thoại: Cơ quan: 37562368; Nhà riêng: 39745707; Mobile: 0912175636 Fax: 38363144 E-mail: chuhoangha@ibt.ac.vn

Tên cơ quan: Viện Công nghệ sinh học, Viện KH & CN Việt Nam

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: 302/11 Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

Điện thoại: 37562790 Fax: 38363144

E-mail: tnhai@ibt.ac.vn

Website: http://www.ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng cơ quan: PGS.TS Trương Nam Hải

Số tài khoản: 931.01.064

Tại: Kho bạc nhà nước Ba Đình, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm

2009

- Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 04 năm 2010

- Được gia hạn: Lần 1 từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 04 năm 2010 ( Quyết định số 2892/QĐ-BKHCN, ngày 18/12/2009 của Bộ Khoa học và Công nghệ )

Số

toán - VNĐ)Thời gian Kinh phí (VNĐ) Thời gian Kinh phí (VNĐ)

Số, thời gian ban

QĐ phê duyệt chủ nhiệm, cơ quan chủ trì và kinh phí các đề tài,

dự án bắt đầu thực hiện năm 2006 thuộc chương trình KHCN trọng điểm cấp NN giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển

21/2/2006 tài cấp NN để thực hiện trong kế hoạch năm 2006 thuộc lĩnh vực

8 2892/QĐ-BKHCN,

ngày 18/12/2009

QĐ về việc điều chỉnh thời gian thực hiện của Đề tài KC.04.03/06-10 thuộc chương trình KH & CN trọng điểm cấp NN giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng CNSH”, mã số KC.04/06-10

9 170/QĐ-CNSH, ngày

20/4/2010 QĐ nghiệm thu cấp cơ sở

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài

(1) Xây dựng đề tài; (2) Thu thập mẫu nhiễm bệnh; (3) Phân lập, thiết

kế gen và vector chuyển gen; (4) Tiến hành chuyển gen vào cây đu đủ

và cây cam, quýt; (5) Đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới; (6) Đào tạo và viết báo cáo tổng kết

Các mẫu bệnh Các dòng mang các đoạn gen của PRSV và CTV

Thiết kế các đoạn gen nhân tạo và các vector chuyển gen mang đa đoạn gen CP, Nib và HC-pro của PRSV và RdRp-CP và RdRp-CP-p20-p23 của CTV

Các dòng đu đủ, cam, quýt chuyển gen kháng virus

Các dòng chuyển đã đánh giá kháng virus ở nhà lưới

2 Viện NC Viện NC Thu thập mẫu nhiễm bệnh Các mẫu bệnh

Thu thập mẫu nhiễm bệnh Các mẫu bệnh

(1) Thu thập mẫu nhiễm bệnh; (2) Tham gia đánh giá các dòng cây chuyển gen trên đồng ruộng

Các mẫu bệnh Phương pháp đánh giá đánh giá tính kháng virus của cây cam, quýt chuyển gen đa đoạn

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài (không quá 10 người kể cả chủ nhiệm

đề tài)

Số

TT Tên cá nhân dăng kí theo Thuyết minh Tên cá nhân đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1 TS Chu Hoàng Hà TS Chu Hoàng Hà Chủ nhiệm

2 GS Lê Trần Bình GS Lê Trần Bình Tham gia

3 TS Lê Văn Sơn TS Lê Văn Sơn Thư ký

4 PGS Lê Thị Muội CN Nguyễn Chi Mai Tham gia

5 ThS Lê Xuân Đắc CN Nguyễn Văn Phượng Tham gia

6 CN Nguyễn Minh Hùng ThS Đỗ Xuân Đồng Tham gia

7 KS Bùi Chi Lăng ThS Đặng Thị Hương Tham gia

8 TS Vũ Mạnh Hải TS Đỗ Đình Ca Tham gia

9 TS Nguyễn Minh Châu TS Nguyễn Minh Châu Tham gia

10 TS Ngô Vĩnh Viễn TS Ngô Vĩnh Viễn Tham gia

Lý do thay đổi: Việc thay đổi cán bộ tham gia thực hiện đề tài chủ yếu do điều

kiện bận công tác, học tập ở nước ngoài hoăc bổ sung cán bộ mới PGS

TSKH Lê Thị Muội đã mất

6 Tình hình hợp tác quốc tế

1 Một đoàn công tác tại Mỹ Đoàn 3 người công tác tại Mỹ để trao đổi KH từ

15/6-3/7/2009, kinh phí từ đề tài KC04.03/06-10

TT

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Hội thảo về đề tài

Tổ chức được 3 hội thảo cấp Viện Công nghệ sinh học với mục đích thảo luận các kết quả nghiên cứu đã đạt được và hướng giải quyết các vấn đề tồn đọng, phương hướng thực hiện các nội dung nghiên cứu tiếp theo

Kinh phí tổ chức lấy từ đề tài KC04.03/06-10

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu

Thực tế đạt được

1.1 Thu mẫu virus

1/2007-5/2007

5/2007

1/2007-Viện Cây ăn quả miền Nam, Viện BVTV; Viện Nghiên cứu Rau quả, Viện CNSH

1.2 Phân lập gen CP và Nib của PRSV 2/2007 –

7/2007

2/2007 – 7/2007

Viện CNSH: Chu Hoàng

Hà, Đặng Thị Hương, Lê Văn Sơn

1.3 Phân lập gen CP, CPm và RDRP của

CTV

3/2007 – 9/2007

3/2007 – 9/2007

Viện CNSH: Chu Hoàng

Hà, Lê Văn Sơn và cs

1.4

Thiết kế các gen nhân tạo mang đa

đoạn gen CP và Nib của các dòng

PRSV

6/2007 – 10/2007

6/2007 – 10/2007

Viện CNSH: Chu Hoàng

Hà, Đặng Thị Hương

1.5

Thiết kế các gen nhân tạo mang đa

đoạn gen CP và RDRP của các dòng

CTV

8/2007 – 12/2007

8/2007 – 12/2007

Viện CNSH: Lê Văn Sơn

và cộng sự

1.6 Thiết kế các Ti-vector mang các đoạn

gen nhân tạo đã tạo được

9/2007 – 3/2008

9/2007 – 3/2008

Viện CNSH: Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà

2.1

Hoàn thiện quy trình chuyển gen

thông qua phôi soma sử dụng

Agrobacterium cho cây đu đủ

1/2006 – 10/2007

1/2006 – 10/2007

Viện CNSH: Đỗ Xuân Đồng và công sự

2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen sử 1/2007 – 1/2007 – Viện CNSH: Nguyễn Văn

3.1 Tạo cây đu đủ chuyển gen kháng

PRSV

8/2007 – 8/2008

8/2007 – 8/2008

Viện CNSH: Chu Hoàng

Hà, Đỗ Xuân Đồng 3.2 Tạo cây cam và quýt chuyển gen

CTV

2/2008 – 2/2009

2/2008 – 2/2009

Viện CNSH: Nguyễn Văn Phượng và cộng sự

4.1 Đánh giá các dòng cây chuyển gen

trong phòng thí nghiệm

2/2009 - 4/2009

6/2009

2/2009-Viện CNSH: Chu Hoàng

Hà và cộng sự 4.2

Đánh giá tính kháng bệnh của các

dòng cây trong nhà lưới thông qua

gây nhiễm nhân tạo

4/2009 - 8/2009

3/2010

6/2009-Viện CNSH, 6/2009-Viện bảo vệ thực vật

4/2010

3/2010-Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình và cộng sự

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Các đoạn gen CP, Nib của PRSV gen thu được 20-30 đoạn gen trong vector tách

3

Các đoạn gen nhân tạo

mang đa đoạn gen đại diện

nhất cho các dòng PRSV và

CTV của Việt Nam

gen thu được từ 2-4 gen nhân tạo 4

4 Các vector chuyển gen có mang các gen nhân tạo tổng

thu dược 2-3 dòng đu đủ; 1-2 dòng cam quýt

có triển vọng để phát triển thành giống

4 dòng đu đủ; 2 dòng quýt đường Canh ; 5 dòng cam xã Đoài chuyển gen đã kiểm tra có tính kháng virus

(Nguyên lý ứng dụng; phương pháp; tiêu chuẩn; quy phạm; phần mềm máy tính; bản vẽ thiết kế; quy trình công nghệ; sơ đồ, bản đồ; số liệu, cơ sở dữ liệu; báo cáo phân tích; tài liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mô hình, ); đề án, qui hoạch; luận chứng kinh tế-kỹ thuật, báo cáo nghiên cứu khả thi và các sản phẩm khác)

đảm bảo nhanh dễ thực hiện

và có độ chính xác cao Đảm bảo nhanh dễ thực hiện và có độ chính xác cao

4 Số liệu và cơ sở dữ liệu

các trình tự cấu trúc gen của các dòng PRSV và CTV của Việt Nam có giá trị công bố quốc tế, các số liệu đánh giá tính đa dạng di truyền của các virus Việt Nam

Các trình tự cấu trúc gen của các dòng PRSV và CTV của Việt Nam có giá trị công bố quốc tế, các số liệu đánh giá tính đa dạng di truyền của các virus Việt Nam

6 Báo cáo phân tích

Phân tích về hiện trạng bệnh PRSV và CTV ở Việt Nam, tính

đa dạng của các virus gây bệnh

Phân tích tính ổn định của các gen chuyển và khả năng sử dụng trong tạo giống

Phân tích về hiện trạng bệnh PRSV và CTV ở Việt Nam, tính đa dạng của các virus gây bệnh

Phân tích tính ổn định của các gen chuyển

và điều kiện của Việt Nam, đề xuất được các định hướng phát triển tương lai có tính khả thi

Đảm bảo cập nhật, mang tính khách quan, sat với tình hình và điều kiện của Việt Nam, đề xuất được các định hướng phát triển tương lai có tính khả thi

(Bài báo; Sách chuyên khảo; và các sản phẩm khác Tình hình công bố kết quả nghiên cứu

(bài báo, ấn phẩm, ) ở các tạp chí có uy tín trong, ngoài nước và mức độ trích dẫn)

Số

TT

Tên sản

phẩm

Yêu cầu khoa họccần đạt

Số lượng, nơi công bố

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Bài báo

Công bố 5-10 bài báo chuyên ngành

04 bài đã xuất bản

04 bài đã được tạp chí nhận chờ xuất bản

(1) Hội nghị quốc tế Malaysia;

(1) Tạp chí Nông nghiệp &

phát triển Nông thôn;

(2) Tạp chí Công nghệ sinh học

d) Kết quả đào tạo

Số TT Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo

(Thời gian kết thúc)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Quy trình chuyển gen thông qua

Agrobacterium cho cây cam, quýt 0

01 Giải pháp hữu ích 2010

2

Các đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn

gen của các dòng PRSV và CTV của

Việt Nam

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

1 Đề tài đã ứng dụng một cách thành công các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân lập, xác định, phân tích so sánh trình tự gen và đánh giá đa dạng di truyền số lượng lớn và một cách có hệ thống các chủng virus gây bệnh đốm vòng và bệnh tàn lụi, các kết quả thu được đạt trình độ tương đương các nghiên cứu trên thế giới

2 Tạo được những quy trình kỹ thuật, công nghệ nền như: công nghệ RNAi ứng dụng trong tạo cây trồng kháng bệnh virus đây là một công nghệ hiện đại và có tính hiệu quả cao hiện đang được ứng dụng trên thế giới, các quy trình kỹ thuật chuyển gen ở cây ăn quả có múi và cây đu

đủ là các đối tượng cây gỗ lâu năm khó chuyển gen, các qui phạm cơ bản về đánh giá cây ăn quả chuyển gen góp phần phát triển lĩnh vực khoa học tạo giống cây trồng kháng bệnh virus nói riêng và tạo giống cây trồng nói chung, góp phần tăng cường năng lực quản lý nhà nước

về an toàn sinh học đối với sinh vật chuyển gen

3 Đưa công nghệ tạo cây chuyển gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác tạo giống truyền thống cho cây ăn quả nói riêng và cây trồng nói chung, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong lĩnh vực tạo giống và khoa học cây trồng nói chung

4 Góp phần đưa sinh học phân tử kết hợp với các phương pháp miễn dịch enzyme vào chuẩn đoán các bệnh cây, quản lý cây chuyển gen và quản

lý dịch bệnh ở trên cây trồng

5 Góp phần nâng cao năng lực của cán bộ nghiên cứu tham gia đề tài,

trên các lĩnh vực về công nghệ sinh học thực vật nói chung và công nghệ tạo cây trồng biến đổi gen nói riêng

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội

1 Giảm chi phí sản xuất khi không phải dùng nhiều thuốc sâu, thuốc bệnh hoá chất, đảm bảo con người và môi trường không bị ô nhiễm hoá chất độc

2 Giảm chi phí bảo vệ thực vật, hạ giá thành nông sản, tăng thu nhập cho người nông dân

3 Đa dạng hóa sản phẩm, kéo dài tuổi thọ sản phẩm mở rộng thị trường (hoa tươi, quả nhiệt đới) tạo thêm công việc cho nông dân, góp phần chuyển dịch cơ cấu trong sản xuất nông nghiệp

4 Đưa nước ta hội nhập bình đẳng vào trào lưu phát triển nông nghiệp công nghệ cao của khu vực và thế giới thông qua giảm sử dụng hoá

chất và tăng cường chất lượng sản phẩm

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

(4) Xây dựng được quy trình

chuyển gen cho cây đu đủ

thông qua phôi soma sử

dụng Agrobacterium

1 – 10/2007

(1) Thu thập được một số lượng lớn các mẫu bệnh: 121 mẫu CTV và 136 mẫu PRSV

từ các vùng khác nhau đảm bảo đầy đủ về

số lượng so với đăng ký của đề tài;

(2) Phân lập và xác định trình tự được 47

gen (CP và Nib) của virus PRSV;

(3) Phân lập, xác định trình tự gen (CP,

CPm và RDRP) của 18 dòng virus CTV

nghiên cứu, ngoài ra để đánh giá quan hệ

và đa dạng di truyền của các giống này chúng tôi đã phân lập và xác định trình tự thêm 43 vùng gen của các chủng nghiên cứu;

(4) Xây dựng được 01 quy trình chuyển gen cho giống đu đủ Lý Nhân (Mexico) qua phôi

soma sử dụng Agrobacterium

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

mang các đoạn gen nhân

tạo đã tạo được;

(4) Xây dựng quy trình

chuyển gen sử dụng

Agrobacterium cho 2 giống

cam quýt có ý nghĩa kinh tế

của Việt Nam

10/2007 – 5/2008

gen CP và Nib của các dòng PRSV (2) Thiết kế các gen CP, CPm và RDRP của

các dòng CTV (3) Thiết kế các Ti-vector mang các đoạn gen nhân tạo đã tạo được

(4) Xây dựng được 01 quy trình chuyển gen cho giống cam Sành và 01 quy trình chuyển gen cho giống quýt Đường Canh sử

dụng Agrobacterium

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Lần 3

(1) Thiết kế gen nhân tạo

mang đa đoạn gen CP và

mang các đoạn gen nhân

tạo đã tạo được

5/2008 – 5/2009

(1) Đã thiết kế 02 vector mang gen đa đoạn CP+Nib của PRSV và CP+CPm+RDRP của CTV

(2) Đã thu được 35 dòng cây đu đủ chuyển gen đa đoạn CP+Nib của PRSV

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Lần 4

(1) Sàng lọc cây đu đủ biến

nạp thông qua gen chọn lọc

(2) Kiểm tra gen biến nạp ở

cây đu đủ bằng PCR

(3) Sàng lọc cây cam biến

nạp thông qua gen chọn

(4) Kiểm tra gen biến nạp ở

cây cam bằng PCR

(5) Sàng lọc cây quýt biến

nạp thông qua gen chọn lọc

5–

10/2009

(1) Đã thu được 435 cây cam quýt chuyển gen đa đoạn CTV sống sót trên môi trường chọn lọc

(2) 10 dòng cây đu đủ chuyển gen đa đoạn PRSV dương tính với PCR

(3) 39 dòng cam Vinh chuyển gen đa đoạn CTV dương tính với PCR

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Xây dựng được quy trình

chuyển gen cho cây đu đủ

thông qua phôi soma sử

01 quy trình chuyển gen cho giống đu đủ

Lý Nhân (Mexico) qua phôi soma sử dụng

Agrobacterium Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Kiểm tra lần 2

Thiết kế gen nhân tạo mang

đa đoạn gen CP và Nib của 10/2007 – 5/2008

Thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen

CP và Nib của các dòng PRSV

Xây dựng được 01 quy trình tạo mô sẹo và

chuyển gen cho giống quýt Đường Canh sử

dụng Agrobacterium

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Kiểm tra lần 3

Thiết kế gen nhân tạo mang

đa đoạn gen CP và Nib của

các dòng PRSV

Thiết kế các gen CP, CPm và

RDRP của các dòng CTV

Thiết kế các Ti-vector mang

các đoạn gen nhân tạo đã

tạo được

5/2008 – 5/2009

Thu được gen CP và Nib nhân tạo mang đa

đoạn gen

Thu được gen CP và RDRP nhân tạo mang

đa đoạn gen Thu được các Ti-vector mang đa đoạn gen CP+Nib của PRSV và CP+CPm+RDRP của CTV Tạo được 35 dòng cây đu đủ chuyển gen đa đoạn CP+Nib của PRSV

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

Kiểm tra lần 4

Tạo cây cam và quýt chuyển

gen

Đánh giá dòng cây chuyển

gen trong phòng thí nghiệm

5–

10/2009

Hoàn thành chuyển gen quýt và cam, thu được 435 cây cam quýt chuyển gen đa đoạn CTV sống sót trên môi trường chọn lọc Tạo được 10 dòng cây đu đủ, 39 dòng cam Vinh chuyển gen dương tính với PCR

56 dòng quýt chuyển phát triển tốt trên môi trường chọn lọc

Người chủ trì: TS Chu Hoàng Hà

III Nghiệm thu cấp cơ sở 5/2010

Báo cáo tổng hợp và các tài liệu cần thiết đầy đủ, công phu rõ ràng

Phương pháp hiện đại, đáng tin cậy, số liệu

có tính thống kê Chất lượng và yêu cầu khoa học của các sản phẩm đúng như đã đăng kí trong thuyết minh và hợp đồng

Cần bổ sung cập nhật tổng quan tình hình dịch bệnh, sản xuất của đối tượng nghiên cứu Phương pháp lây nhiễm nhân tạo, tính tần số chuyển gen

Đề tài được đề nghi tiếp tục pha II ……

IV Nghiệm thu cấp Nhà nước

Chủ nhiệm đề tài

TS Chu Hoàng Hà

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các loại bệnh virus trên cây đu đủ và cây ăn quả có múi là một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng, do vậy hạn chế sự tăng trưởng về diện tích và sản lượng Thách thức lớn nhất đặt ra cho sản xuất đu đủ của Việt Nam là hầu hết các vùng trồng đu đủ của Việt Nam đều bị nhiễm bệnh đốm vòng nặng do Papaya Ringspot Virus (PRSV) gây ra, bệnh không những làm giảm năng xuất mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng quả Tất cả các diện tích trồng đu đủ của Việt Nam đều bị nhiễm PRSV sau khi trồng 6 tháng dẫn đến kết quả là chỉ thu hoạch được 1 vụ đầu tiên là phải chặt bỏ Bệnh tàn lụi (Tristeza) do Citrus Tristeza Virus (CTV) gây ra là một trong hai loại bệnh gây thiệt hại nhiều nhất cho các loại cây cam quýt, theo số liệu điều tra có đến trên 60% cây ăn quả có múi trồng ở miền bắc nhiễm bệnh tàn lụi

Cho đến nay chưa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus gây ra, có nhiều biện pháp khác nhau đang được sử dụng để kiểm soát bệnh virus trên cây trồng tuy vậy mỗi biện pháp đều có những hạn chế nhất định chẳng hạn như: (1) sử dụng giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus Tuy nhiên, biện pháp này là hạn chế vì số lượng hạn chế các giống cây trồng kháng virus và hạn chế về các nguồn vật liệu di truyền kháng virus cho công tác lại tạo giống; (2) sử dụng các cây giống sạch bệnh được xem như vậy là biện pháp quan trọng nhất trong đối với trường hợp cây ăn quả có múi Tuy nhiên, do là loại cây lâu năm nên thường bị nhiễm virus trong quá trình canh tác trên đồng ruộng; (3) kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh và loại bỏ các loại ký chủ trung gian như cỏ dại, … nhưng cũng có một số hạn chế như sử dụng thuốc trừ sâu có thể gây ô nhiễm

môi trường, gây nguy hiểm cho nông dân và người tiêu dùng Hơn nữa virus

có thể được lây nhiễm với một số lượng rất ít môi giới truyền bệnh ví dụ: chỉ cần 1 con rầy nâu/cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV); (4) Công nghệ sinh học: trong 15 năm qua một số virus đã có thể kiểm soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính các virus gây bệnh (pathogen-derived resistance, PDR) Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh được sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau như: các cấu trúc của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) hay công nghệ RNAi (RNA interference) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh

RNAi được xem một trong những kỹ thuật đem lại nhiều kết quả khả quan và bắt đầu được ứng dụng rộng rãi trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng

ba loại virus Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc,… Tuy vậy, phương pháp này cũng có một số hạn chế nhất định mà một trong số đó là tính kháng của cây chuyển gen đối với một dòng virus phụ thuộc vào độ tương đồng của vật liệu gen được sử dụng để chuyển vào cây và trình tự gen tương ứng của virus đó Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng này nhỏ hơn 90% thì cây chuyển gen không kháng được dòng virus đó Hơn nữa nhiều loại virus như trường hợp của CTV có khả năng chống lại cơ chế đề kháng bằng cơ chế RNAi của thực vật thông qua

biểu hiệu các protein CP, P20, P23 có khả năng ức chế biểu hiện gen của tế bảo chủ, làm cho việc nghiên cứu tạo ra cây trồng kháng virus ứng dụng cơ chế RNAi chưa cho kết quả như mong đợi Để khắc phục nhược điểm này thì nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang tiến hành nghiên cứu theo hướng là tạo ra các gen nhân tạo được ghép lại bằng nhiều đoạn gen của các dòng virus khác nhau Cây chuyển gen các cấu trúc gen đa đoạn sẽ có phổ kháng bệnh rộng hơn so cây chỉ được chuyển gen nguyên bản của một dòng virus

Xuất phát từ đòi hỏi của thực tế sản xuất ở Việt Nam cần thiết phải có các giống cây đu đủ và cam quýt kháng bệnh và khả năng của công nghệ RNAi trong tạo giống cây kháng bệnh virus, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn” với các mục tiêu chính là: tạo được cây đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng và tạo được cây cam quýt kháng bệnh tàn lụi

Các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể sau:

(i) Phân lập gen: Thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử và công

nghệ gen như: RT-PCR, PCR, tách dòng phân tử và xác định trình

tự gen để thu được các gen mã hoá cho protein vỏ (CP) và protein

mã hoá cho replicase protein của các dòng virus PRSV và tristeza của Việt Nam

(ii) Thiết kế các gen CP và replicase nhân tạo: tạo được các gen mang

đa đoạn gen của các dòng virus khác nhau đảm bảo có tính kháng bệnh phổ rộng Sử dụng các gen này để thiết kế các Ti-vector phục

vụ cho chuyển gen vào cây đu đủ và cam quýt thông qua

Agrobacterium

(iii) Hoàn thiện công nghệ chuyển gen: xây dựng được kỹ thuật chuyển

gen đa đoạn thông qua Agrobacterium cho cây đu đủ và một số

giống cây ăn quả có múi có giá trị kinh tế của Việt Nam

(iv) Tiến hành chuyển gen có ích vào cây trồng: Chuyển thành công

các cấu trúc gen thiết kế được vào các giống đu đủ và cây ăn quả có múi đặc sản của Việt Nam

(v) Đánh giá tính kháng bệnh của cây chuyển gen: Các dòng cây

chuyển gen thu được sẽ được đánh giá tính kháng bệnh với các loại virus PRSV với cây đu đủ và tristeza với cây cam quýt Đảm bảo thu được 1-2 dòng cây có tính kháng bệnh tốt cho mỗi đối tượng cây nghiên cứu, có triển vọng để phát triển thành giống

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây đu đủ và bệnh đốm vòng

1.1.1 Giới thiệu chung về cây đu đủ

Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả nhiệt đới có giá trị kinh tế cao

được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Cây

đu đủ (Carica papaya L.) thuộc ngành Mộc lan (hạt kín, Magnoliophyta), lớp Mộc lan (hai lá mầm, Magnoliopsida), phân lớp Sổ (Dilleniidae), liên bộ Hoa tím (Violananae), bộ Hoa tím (Violales), họ Đu đủ (Caricaceae) (Nguyễn Nghĩa Thì & Đặng Thị Sy, 2004) Carica là chi lớn nhất trong họ với 23 loài

Mặc dù có ý kiến cho rằng nguồn gốc của đu đủ ở châu Mỹ nhiệt đới, nhưng

nó có thể bắt nguồn từ vùng đất thấp thuộc phía đông của Trung Mỹ, từ Mexico tới Panama (Nakasone & Paull, 1998) Hạt của nó được phát tán tới Caribbean và Đông Nam Á nhờ những người thám hiểm Tây Ban Nha vào thế

kỷ 16, từ đó nó được lan đi nhanh chóng tới Ấ Độ, Thái Bình Dương và châu Phi (Villegas, 1997)

Quả đu đủ rất giàu dinh dưỡng, có chứa nhiều vitamin và muối khoáng Ngoài ra, nhựa đu đủ có còn là nguồn nguyên liệu để tách papain một loại enzyme được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm (Villegard, 1997) Tổng sản lượng cả thế giới ước tính khoảng 6.5 triệu tấn trong năm 2004 và sản lượng tăng hàng năm là 25% trong giai đoạn từ 1999-

2004 (bảng 1.1) Các nước trồng nhiều đu đủ nhất phải kể đến Brazil, Mexico, Nigeria, Ấn Độ và Indonesia chiếm tới 71% tổng sản lượng đu đủ toàn thế giới Trong số đó khoảng 600 nghìn tấn được xuất khẩu với trị giá gần 200 triệu USD trong năm 2004 (FAO, 2004

Tuy có giá trị kinh tế cao nhưng cây đu đủ mắc nhiều loại bệnh khác

nhau, trong đó phải kể đến các bệnh do nấm gây ra như bệnh thối gốc do nấm

Pythium spp, bệnh cháy lá do nấm Helminthosporium, bệnh đốm lá do nấm

Phyllosticta sulata, bệnh phấn trắng do nấm Odium caricacea, và đặc biệt là

các bệnh do virus gây ra mà trong đó phổ biến nhất và gây thiệt hại nặng nề

nhất là bệnh đốm vòng do virus đốm vòng đu đủ gây ra (papaya ringspot

1.1.2 Giới thiệu về bệnh đốm vòng và virus gây bệnh đốm vòng

Bệnh đốm vòng do virus đốm vòng, thuộc họ Potyviridae, chi Potyvirus

(ICTV, 2002) gây ra là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng

suất và chất lượng quả đu đủ cho các vùng trồng đu đủ trên thế giới trong đó có

Việt Nam Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản lượng quả bị giảm, lá

bị khảm và biến dạng, tạo đốm có dạng như một cái vòng màu xanh mờ trên quả, cuống lá hay tạo các sọc xanh trên ngọn thân và cuống lá Ở quả khi chín, các vòng lộ rõ có màu vàng, quả bị nhạt, do virus đã làm giảm lượng đường trong quả ở mặt trên của các lá gần đỉnh sinh trưởng, vùng mô lá ở giữa gân phụ và gân nhánh bị nhăn phồng Bìa lá non bị cuốn vòng vào theo mặt dưới lá Bìa lá già thì cuốn lên (Nguyễn Thành Hối và Dương Minh, 2003)

Hình 1.1: Cấu trúc của PRSV

(A: PRSV dưới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài)

PRSV gây bệnh không truyền qua hạt giống, chúng lây bằng hai cách: Một là do tiếp xúc cơ giới (thông qua các vết thương cơ giới do trong quá trình canh tác con người vô ý tạo ra, do mưa gió gây xây sát hay do côn trùng hay động vật khác) Hai là do côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ

Aphididae như: Aphis gosipii, Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thường gây hại nhiều cho các loại rau cải, bầu bí,

mướp, dưa, Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là những cây được 5-6 tháng tuổi trở

lên (Quiot-Douine et al, 1990) PRSV được chia thành hai chủng dựa trên khả

năng lây nhiễm: (1) PRSV-p có khả năng lây nhiễm cho đu đủ và cả cây thuộc

họ bầu bí; (2) PRSV-w chỉ có khả năng lây nhiễm trên các cây thuộc họ Bầu bí Hai chủng này có quan hệ rất gần gũi với nhau và có nhiều bằng chứng chứng

tỏ PRSV-p được tiến hóa từ PRSV-w do đột biến (Bateson, et al., 2002)

Về cấu trúc PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, với chiều dài trọn vẹn 760-800nm, đường kính 12nm (Hình 1.2) Virion chứa 5,5% axit nucleic là một sợi RNA đơn dương liên kết với protein (VPg) ở đầu 5’ và có đuôi poly(A) đầu 3’ (Chiang & Yeh, 1997; ITCV, 2002) Hệ gen của PRSV dài khoảng 10326 nucleotit, ngoại trừ đầu poly(A), và chứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotit 86-88 và kết thúc ở vị trí 10118-10120, mã hoá cho một polyprotein với 3344 axit amin Polyprotein này được tự thủy phân tạo 12 protein trong đó có protein NIb, là enzym polymerase cần thiết cho sự tái bản của RNA virus Trình tự bảo thủ cao AAAUAAAANANCUCAACACAUA ở đầu 5’ của PRSV cũng đóng vai trò quan trọng cho sự tái bản của PRSV Tổ chức gen của PRSV được đưa ra tạm thời là VPg-5’ leader-63K NT-52K HC-Pro-46K- 72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35K coat protein- không mã hóa 3’- vùng poly(A) (Hình 1.2) (Yeh, 1992)

virus đốm vòng (Maureen et al., 1990) Cho tới nay các phương pháp truyền

thống ít có hiệu quả trong việc khắc phục ảnh hưởng của bệnh đốm vòng, hơn nữa lại đòi hỏi nhiều thời gian và công sức Gần đây một vài chiến lược dựa trên việc ứng dụng công nghệ gen đã được sử dụng cho việc tạo cây kháng

bệnh virus Trong đó, chuyển gen vào cây đu đủ mà điển hình là gen mã hoá cho protein vỏ (CP = coat protein) virus đã mở ra một khả năng mới cho việc

giải quyết vấn đề này một cách triệt để và hiệu quả hơn (Fitch et al., 1992; Tennant, 1996; Cai et al., 1999; Souza, 1999) Cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV đầu tiên đã được phát triển ở những năm đầu của thập kỷ 90 (Roberto et

al., 2001) Dòng cây chuyển gen mang gen CP từ dòng đột biến HA5-1 (Yeh,

Gonsalves, 1984), được đặt tên là 55-1 kháng lại các virus được phân lập ở

Hawaii (Fitch et al., 1992) Rainbow và SunUp là hai giống đu đủ chuyển gen

kháng lại virus PRSV đã được thương mại hoá lần đầu tiên trên thế giới (Gonsalves, 1998) Tuy nhiên, khi giống đu đủ này được trồng ở các khu vực

khác thì không có tính kháng với virus ở khu vực đó (Tennant et al., 1994) Tennant (1996) cho rằng cây mang gen CP chỉ kháng được virus ở khu vực mà

gen đó được phân lập Điều đó chứng tỏ tính đa dạng về di truyền của các dòng

virus PRSV liên quan đến tính kháng virus của cây chuyển gen Một số nghiên cứu cho thấy cây đu đủ chuyển gen chỉ kháng lại được virus khi mức độ tương đồng của gen vỏ được chuyển và gen vỏ của virus được gây nhiễm giống nhau

trên 95% (Tennant et al., 2001)

Chính vì vậy, hiện nay việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng PRSV

đã và đang được tiến hành ở nhiều nước khác nhau như: Thái Lan, Malaysia, Philippine, Đài Loan, các nghiên cứu này sử dụng các nguồn gen PRSV đặc trưng cho mỗi nước và cũng đã thu được những kết quả nhất định tương

ứng cho từng nước (Fermin et al., 2004; Lines et al., 2002; Bau et al., 2003; Davis & Ying, 2004; Habibuddin et al., 2005; Kanokwan et al., 2005; Hautea

Theo thông kê sơ bộ thì đu đủ được trồng trong vườn nhà (từ 5 đến 10 cây)

của gần 50% hộ nông dân Đu đủ cũng được trồng tập trung trong các nông

trường hoặc trang trại vùng đồng bằng sông Hồng, ven biển miền trung, đồng

bằng sông Mê Kông và sườn núi đá vôi Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha

gồm khoảng 1250 ha trồng tập trung (Bảng 1.2) và 1250 ha trồng trong vườn

nhà với tổng sản lượng hàng năm vào khoảng 100.000 tấn (Lê Trần Bình &

Nguyễn Thị Yến Oanh, 1999) Gần đây trong hội nghị của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn về trái cây vào tháng 6 năm 2004 tại thành phố Hồ

Chí Minh, cây đu đủ được đưa vào danh sách các loại trái cây mà Việt Nam

có ưu thế sản xuất để phục vụ xuất khẩu (Bùi Bá Bổng, 2004)

Bảng 1.2: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam

1 Vùng núi và Trung du phía Bắc (Sơn La, Lạng Sơn) 500

2 Đồng bằng sông Hồng (Hà Nội, Hưng Yên, Nam Hà, Ninh Bình) 250

3 Ven biển miền Trung (Nghệ An, Thanh Hoá) 100

4 Đồng bằng sông Mê Kông (Ninh Thuận, Nha Trang, Tây Ninh, Tiền Giang) 500-550

Tuy nhiên, diện tích trồng đu đủ và sản lượng đu đủ của Việt Nam trong

những năm gần đây không có sự tăng trưởng đáng kể do sự thiếu hụt các

giống có chất lượng cao và bị ảnh hưởng nghiêm trọng do dịch bệnh mà nguy

hiểm nhất là bệnh do virus đốm vòng gây ra (Vũ Công Hậu, 1999; Trần Thế

Tục, 1999; Trần Thế Tục & Đoàn Thế Lư, 2004; Nguyễn Thành Hối &

Dương Minh, 2003) Thông thường cây đu đủ có thể cho thu hoạch trong 4-5

năm mới phải trồng lại và năng xuất quả thường cao nhất vào các năm 2-3, do

đa số diện tích trồng đu đủ của Việt Nam bị nhiễm bệnh đốm vòng (Chu

Hoàng Hà et al., 2004) nên chỉ thu hoạch được trong năm đầu nên giá trị kinh

tế bị giảm sút mạnh

Thách thức lớn nhất đặt ra cho sản xuất đu đủ của Việt Nam là hầu hết

các vùng trồng đu đủ của Việt Nam đều bị nhiễm bệnh đốm vòng nặng

bệnh không những làm giảm năng xuất mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng quả Do vậy, việc tạo giống cây kháng bệnh đốm vòng là một vấn

đề cần phải giải quyết có tính cấp thiết Từ năm 1999, Viện Công nghệ sinh học đã tham gia vào chương trình nghiên cứu phát triển cây đu đủ chuyển gen cùng với 5 nước Asian do tổ chức ISAAA tài trợ và đã thu được một số kết quả ban đầu khả quan, như là: đã phân lập được gen CP của 16 chủng virus PRSV của các vùng khác nhau, đã xây dựng được quy trình tạo phôi soma phục vụ cho chuyển gen, đang xây dựng quy trình chuyển gen vào cây đu đủ

thông qua Agrobacterium v.v Tuy nhiên, do nước ta có diện tích trải dài cây

đu đủ du nhập có thể theo nhiều con đường khác nhau dẫn đến tính đa dạng

cao của các nòi PRSV (Chu Hoàng Hà et al., 2004) vì vậy cần thiết phải có

các nghiên cứu rất tổng quát về các chủng virus gây bệnh và ứng dụng các kỹ thuật tiến tiến nhất của sinh học phân tử và công nghệ sinh học thực vật vào việc nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh

1.2 Cây cam quýt và bệnh tàn lụi

1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm cây cam quýt

Cây ăn quả có múi là một số loài cam ngọt (Citrus sinensis), quýt (C

reticulata), chanh (C limonia; C aurantifolia), bưởi (C grandis; C maxima), thuộc chi Citrus, dưới họ Aurantioideae, họ Rutaceae, bộ

Sapindales, ngành Ngọc lan hạt kín Magnoliophyta, lớp cây 2 lá mầm Dicotyledons (Swingle & Reece, 1967; Jones, 1990) Trung tâm phát sinh của các loại cây trồng có múi được cho rằng xuất phát từ vùng Đông Nam Á và vùng quần đảo Malaysia Các loài cây ăn quả có múi đã được trồng từ rất xa

xưa, chanh quả (C medica L) được ghi nhận là có mặt tại châu Âu từ năm

300 BC Các loài cam ngọt (C sinensis (L.) Osbeck, C aurantium L) và

chanh (C limon Burn f) đã được trồng ở Trung Quốc từ rất sớm trước khi có

mặt tại châu Âu (Herron, 2003) Từ thế kỷ 15 các giống cây ăn quả có múi

được mang tới trồng tại châu Mỹ Một số loài khác như: bưởi chùm và cam

Temple được xem là có nguồn gốc ở miền tây Ấn Độ (Davies & Albrigo,

1998)

Cây cam quýt được trồng nhiều nhất là ở các vùng cận nhiệt đới Tổng

sản lượng của thế giới đạt khoảng 89,3 triệu tấn vào niên vụ 2000-2001 Sản

lượng hàng năm tăng khoảng 10 triệu tấn trong giai đoạn 1992-1997 Các

nước sản xuất nhiều cam quýt nhất là Brazil, Mỹ, Trung Quốc, Tây Ban Nha

6.357,2 1.633,1

6.208,3 1.433,0

Đối với châu Á trong đó có Việt Nam quả có múi là một trong những

loại quả quan trọng nhất Tuy nhiên, phần lớn các vườn cây cho múi của châu

á nhiệt đới đang bị tổn hại nghiêm trọng vì nhiễm các bệnh, trong đó có nhiều

bệnh lan rộng là do các côn trùng gây hại Trong số đó đặc biệt nghiêm trọng

là bệnh Greening do vi khuẩn Liberobacter asiaticum và bệnh tàn lụi do

Citrus tristeza virus (CTV) gây ra là hai loại bệnh gây hại nghiêm trọng nhất

Bảng 1.4: Một số bệnh chính trên cây cam quýt

Bệnh Tác nhân gây bệnh Bộ phận bị hại Mức độ gây hại (*)

Bệnh chảy gôm do nấm

(Gommosis) Phytophthora sp Cành, gốc thân +

Bệnh loét cam quýt

Bệnh bồ hóng (Black

Bệnh thối rễ (Root rot) Pythium sp; Fusarium sp Rễ ++

(*)+ ít; ++ trung bình; +++ nặng; ++++ rất nặng