Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên h5n1 phòng chống bệnh cúm gia cầm

Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất loại vaccine này edible vaccine đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

-

BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Huy Hàm

Thời gian thực hiện: 01/2007-06/2011

8908

Hà Nội, 2011

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong

lĩnh vực Nông nghiệp và PTNT đến 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br Ethidium Bromide

Gus -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase)

Hb Hemoglobin (lượng hemoglobin có trong một thể tích máu)

Hpt Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase

H/2 Môi trường Hutner/2

MS Murashige and Skoog

MSC Multi - Cloning Site

MCPA 2-methyl – 4 cholorophenoxy acetic acid

MCH Mean corpuscular hemoglobin - giá trị hemoglobin trung bìnhMCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration - nồng độ hemoglobin trung bìnhMCV Mean corpuscular volume - thể tích hồng cầu trung bình

MPV Mean platelet volume - thể tích trung bình của tiểu cầu

NAA 2- naphthalen-1-yl acetic acid

NOS Nopalin Sythetase

OD Optical Density (mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction

RBC Red blood cell - số lượng hồng cầu (đơn vị 1012tế bào/L)

RDW Red cell distribution width - độ phân bố về kích thước của hồng cầu

Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)

VIR Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)

WBC White blood cell - số lượng bạch cầu

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid

MỤC LỤC

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tính cấp thiết của đề tài 3

2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 5

2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới 5

2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam 7

2.3 Gen Hemagglutinin 8

2.4 Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng 11

2.4.1 Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen 11

2.4.2 Agrobacterium với quá trình chuyển gen vào thực vật 16

2.4.3 Nâng cao khả năng biểu hiện gen trong thực vật 19

Chương 3: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 Nội dung nghiên cứu 31

3.2 Vật liệu nghiên cứu 32

3.2.1 Vật liệu thực vật 32

3.2.2 Vật liệu di truyền 32

3.2.3 Các vật liệu khác 32

3.2.4 Hóa chất 32

3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.1 Phương pháp tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên và tạo vi sinh vật biểu hiện gen H5N1 trên bề mặt 36

3.3.2 Phương pháp tạo bèo tấm mang gen protein vỏ virus H5N1 40

3.3.3 Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 51

Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

NỘI DUNG A: TẠO DÒNG MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN 56

Nội dung 1: Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền 56

Nội dung 2: Xác định trình tự gen quan tâm, so sánh với các trình tự gen đã công bố trước đó, xác định những thay đổi về mặt cấu trúc gen 57

Nội dung 3: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên HA, NA của virus H5N1 trên cúm gia cầm tại Việt Nam 61

Nội dung 4: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên dạng đột biến mất đoạn hoặc gen dung hợp các đoạn peptid khác nhau hoặc các epitope khác nhau 63

4.1 Tách dòng gen HA gắn enzyme giới hạn nhận biết 63

4.2 Tách dòng gen HA1 gắn enzyme giới hạn nhận biết 64

4.3 Cải biến gen HA1 65

4.3.1 Cải biến vị trí MD2 trên đoạn gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 65 4.3.2 Cải biến vị trí MD5, MD3 trên gen HA1 bằng phương pháp Quickchange 67 4.3.3 Cải biến vị trí MD4 trên gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 68 4.3.4 Cải biến vị trí M2 trên đoạn gen HA1 sử dụng phương pháp OE-PCR kéo

dài các đoạn gối lên nhau 70

NỘI DUNG B TẠO VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GEN H5N1 TRÊN BỀ MẶT 73 Nội dung 5: Tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus H5N1

trong E.coli phục vụ mục đích phát triển kháng thể chuyên biệt với

các kháng nguyên của H5N1 73 NỘI DUNG C TẠO BÈO TẤM MANG GEN PROTEIN VỎ VIRUS H5N1 77 Nội dung 6: Lựa chọn, sưu tập, định danh, đánh giá khả năng sinh trưởng

phát triển của một số giống bèo tấm đáp ứng yêu cầu là cây chủ để sản

xuất protein tái tổ hợp 77 Nội dung 7: Nghiên cứu tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo

callus và tái sinh cây bèo tấm (L gibba, L minor, S polyrrhiza) 84 Nội dung 8: Tách chiết phân lập các promotor đặc hiệu ở bèo tấm 88

8.1 Tách dòng đoạn promoter từ loài bèo tấm S polyrrhiza DB2 888.2 Tách dòng đoạn promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna aequinoctialis

DB1 928.3.Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 đã cải biến - pPAM- HA1M 958.4 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA, HA1 đã cải biến với promoter bèotấm (pPAM-Sp-HA1) 97

Nội dung 9: Thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng

Agrobacterium và bằng súng bắn gen 101

9.1 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng súng bắn gen 1019.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium 1039.3 Chuyển vector tái tổ hợp chứa gen HA vào chủng A tumefaciens Kiểm

tra chủng 111

Nội dung 10: Thử nghiệm các chủng Agrobacterium để xác định được chủng thích hợp cho chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L gibba, L minor, S.

polyrrhiza 112

Nội dung 11: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và

nguyên cây ở L gibba, L minor, S polyrrhiza bằng súng bắn gen 114

11.1 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus 114

11.2 Ảnh hưởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện tạm thời

của gen gus 116

11.3 Ảnh hưởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển gen tạm

thời 118

11.4 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 120 11.5 Ảnh hưởng của kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus

và khả năng tái sinh 121

Nội dung 12 : Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và

nguyên cây ở L gibba, L minor, S polyrrhiza bằng A tumefaciens 122

12.1 Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP

thông qua vi khuẩn A tumefaciens 122

12.2 Kết quả nghiên cứu lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A tumefaciens 123

12.3 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 123

12.4 Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 124

12.5 Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 126

Nội dung 13 Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm 129

13.1 Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm thông qua A tumefaciens 129

13.2 Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen 130

Nội dung 14 Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng các phương pháp SHPT 131

14.1 Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số của ba loài bèo tấm L minor, L gibba, S polyrrhiza 131

14.2 Phân tích PCR sự có mặt của gen chuyển trong ba loài bèo tấm L gibba, L minor, S polyrrhiza chuyển gen 131

14.3 Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot 135

14.4 Phân tích Western blot 137

14.4.1 Kết quả điện di protein tổng số 138

14.4.2 Kết quả kiểm tra phản ứng lai miễn dịch với kháng thể H5 bằng kỹ thuật Western blot 138

Nội dung D Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 140

Nội dung 15 Khảo sát khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên trên gà 140

15.1 Thu mẫu máu 140

15.2 Kết quả đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên 142

Nội dung 16 Thử nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà trong thực tế 144

16.1 Kết quả phát hiện kháng thể kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI 148

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 148

KẾT LUẬN 148

KIẾN NGHỊ 149

CHƯƠNG 6: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 150

6.1 Kết quả về khoa học 150

6.2 Kết quả đào tạo 152

6.3 Kết quả nổi bật 153

6.4 Trình độ công nghệ 154

6.5 Khả năng áp dụng 154

6.6 Tình hình sử dụng kinh phí 154

6.7 Danh sách các công trình công bố 155

6.8 Hạn chế của đề tài 156

TÀI LIỆU THAM KHẢO 157

Tài liệu tiếng Việt 157

Tài liệu tiếng Anh 158

PHỤ LỤC 1 168

PHỤ LỤC 2 169

PHỤ LỤC 3 171

PHỤ LỤC 4 173

PHỤ LỤC 5 179

PHỤ LỤC 6 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 182

Bảng 2.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 14

Bảng 2.2 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 15

Bảng 2.3 Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và

virus H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005)

26

Bảng 3.1 Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào

đầu gen HA, HA1

33

Bảng 3.2 Trình tự các primer tạo đột biến điểm trên gen HA 33

Bảng 3.3 Trình tự các primer sử dụng nhân cấu trúc

CAMV35Sprom-GUS-NOSter

34

Bảng 3.4 Trình tự các primer sử dụng để phân lập promoter bèo tấm 34

Bảng 3.5 Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào

đầu promoter bèo tấm S polyrhyza

35

Bảng 3.6 Trình tự các primer sử dụng để kiểm tra trình tự các vị trí nối các

enzyme

35

Bảng 3.7 Trình tự cặp primer sử dụng để gắn gen HA vào vector biểu hiện 35

Bảng 3.8 Các chủng A tumefaciens và vector sử dụng cho nghiên cứu 41

Bảng 3.9 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 46

Bảng 4.1 Số trình tự H5 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 56

Bảng 4.2 Số trình tự N1 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 57

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng môi trường đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của các loài bèo tấm L minor, L gibba, S polyrrhiza

80

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của bèo tấm L minor, L gibba, S polyrrhiza

82

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng sinh trưởng của các

loài bèo tấm

84

Bảng 4.7 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với

Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam)

93

Bảng 4.8 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin với La-Ubi-10F 97

Bảng 4.9 Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP 116

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

cánh bèo tấm chuyển gen

119

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus

bèo tấm L minor chuyển gen

120

tạm thời ở cánh bèo tấm chuyển gen

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện tạm

thời của gen gus ở callus bèo S polyrrhiza chuyển gen

122

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm

thời ở bèo nguyên cây chuyển gen

123

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm

thời ở callus bèo S polyrrhiza chuyển gen

124

Bảng 4.16 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở

bèo nguyên cây

125

Bảng 4.17 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở

callus

125

Bảng 4.18 Ảnh hưởng kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 126

Bảng 4.19 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông

qua vi khuẩn A tumefaciens

127

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen

gus ở bèo SP

128

Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm

thời của gen gus ở SP

129

Bảng 4.22 Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen

gus ở bèo SP

130

Bảng 4.23 Tổng hợp số thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo

tấm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

133

Bảng 4.24 Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên HA1 vào bèo

tấm bằng súng bắn gen

135

Bảng 4.27 Bảng kết quả tổng hợp một số chỉ tiêu của máu 147

Hình 2.1 Cấu trúc protein Hemagglutinin 9

Hình 2.4 Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid (Lê Thị Thu Hiền, 2003) 17

Hình 3.1 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế các vector mang gen HA để chuyển vào

bèo tấm

36

Hình 4.1 Các dòng tái tổ hợp pCR2.1 mang gen HA của virus cúm gà và vịt

được cắt bằng enzyme EcoRV và HindIII.

62

Hình 4.3 Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA trên gel agarose 0,8 %. 64

Hình 4.4 Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA1 trên gel agarose 0,8%. 65

Hình 4.5 Sơ đồ một số vị trí cải biến trên gen HA1 (987 bp) 66

Hình 4.6 Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2 trên gel 0,8% agarose. 66

Hình 4.7 Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5 trên gel agarosre 2% 68

Hình 4.8 Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3 trên gel agarosre 2% 68

Hình 4.9 Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4 trên gel 0,8% 69

Hình 4.10 Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2 trên gel agarose 0,8% 70

Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1M

tại vùng cải biến

71

Hình 4.13 Kết quả kiểm tra vector pET22b(+)cắt bằng HindIII và NotI (giếng 1) và pCR2.1-H5 cắt bằng EcoRI (giếng 2).

75

Hình 4.14 Minh hoạ thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) 76

Hình 4.15 Nuôi gà thí nghiệm và gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1, và

lấy máu kiểm tra tối miễn dịch.

77

Hình 4.16 Lấy máu gà trước khi gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1 (trên

trái), sau đó tiêm vaccine H5N1 dưới da cổ để gây tối miễn dịch cho gà (trên

phải) và lấy máu gà 14 ngày tuổi trước khi tiêm vaccine

Hình 4.19 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin

của loài bèo tấm S.polyrrhiza (Mỹ) và vị trí các mồi

89

Hình 4.21 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn 91

Hình 4.22 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin

của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi

92

Hình 4.24 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế 94

Hình 4.25 Hình ảnh điện di sản phẩm promoter SpUbiquitin trên gel agarose

Hình 4.30 Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA1 trên gel agarose

Hình 4.32 Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 và pCAMBIA-Sp-HA1 104

Hình 4.34 Hình ảnh điện di kết quả thiết kế và kiểm tra SHA1N,

pJET-SHA1MN trên gel agarose 0,8%.

107

Hình 4.35 Hình ảnh điện di các sản phẩm trong quá trình thiết kế và kiểm tra 108

Hình 4.36 Hình ảnh điện di kết quả thiết kế Sp-HA1,

pCAMBIA-Sp-HA1Mtrên gel agarose 0,8%.

110

Hình 4.38 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên SP nguyên cây sau khi lây

nhiễm với các chủng A tumefaciens

113

Hình 4.39 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên callus SP sau khi lây nhiễm các

chủng vi khuẩn khác nhau

114

Hình 4.41 Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus ở

bèo SP chuyển gen

127

Hình 4.43 Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số tách từ bèo tấm S.

polyrrhiza chuyển gen trên gel agarose 0,8 %.

chuyển gen

135

Hình 4.51 Kết quả điện di protein tổng số các dòng bèo chuyển gen 138 Hình 4.52 Kết quả phân tích Western blot các dòng bèo chuyển gen 139 Hình 4.53 A Gà nuôi trong chuồng; B Cho gà ăn bèo chuyển gen 140

Hình 4.55 (A) Tế bào hồng cầu và bạch cầu Eosinophil; (B) Tế bào hồng cầu

và bạch cầu neutrophil; (C) Tế bào hồng cầu và bạch cầu lympho

144

Chương 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 thế giới chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Một trong những thành tựu đó là tạo

ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ Đến năm 2010 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đạt 148 triệu

ha Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (www.isaaa.org)

Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998)

Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein từ tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống đó là thực vật So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế hơn trong việc sản xuất protein tái tổ hợp Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Vaccine này có thể được sửdụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệthống màng nhầy và miễn dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003)

Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất loại vaccine này (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).Cúm gà (avian influenza-AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loại gia cầm, thủy cầm, các loại chim bị gây ra bởi virus cúm týp A, một trong 4 nhóm virus thuộc

họ Orthomyxoviridae Trong họ này có 4 nhóm: virus cúm týp A (influenza A virus);

virus cúm týp B (influenza B virus); virus cúm týp C (influenza C virus) và nhóm Thogotovirus Chỉ có virus cúm A và B là gây dịch cúm nguy hiểm, còn virus cúm C chỉ gây cảm cúm thông thường Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao và gây bệnh trên người trong những năm 1996-2008 Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên thế giới, trong đó có Việt Nam Cơ bản về cấu trúc virus cúm vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực,loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn

và khác với những biến chủng H5N1 trước đây Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, đặc biệt Ai Cập

và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Hulse-Pot et al., 2005, Subbarao, Luke, 2007, Zhao et al., 2008) Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, tái phát

vào năm 2004, 2005 Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay vẫn còn những ổ dịch nhỏ (www.cucthuy.gov.vn)

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền Nông nghiệp đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề

tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống

bệnh cúm ở gia cầm” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công

nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo giống bèo tấm mang gen biến nạp HA và NA có khả năng gây miễn dịch bệnh cúm gia cầm thông qua đường tiêu hoá

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là ba loài bèo tấm L gibba, L minor, S

polyrrhiza; gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1.

1.4 Phạm vi nghiên cứu

Các nghiên cứu tái sinh, tạo callus và chuyển gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1ở các loài bèo tấm L gibba, L minor, S polyrrhiza trong điều kiện phòng thí

nghiệm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh so với việc chữa bệnh Vì vậy việc phòng bệnh bằng vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng

và là mục tiêu hàng đầu của ngành bảo vệ sức khoẻ và thú y của các nước (Walmsley

& Arntzen, 2000) Tuy vậy, nhiều nước trong số các nước đang phát triển không có

đủ điều kiện để cung cấp đầy đủ vaccine để phòng ngừa các loại bệnh nguy hiểm nhất, phổ thông nhất cho dân mình Chỉ nhờ vào sự giúp đỡ của chương trình y tế thế giới, người dân các nước đang phát triển mới có thể tham gia chương trình tiêm chủng mởrộng gồm 6 loại vaccine Trong khi đó tại các nước phát triển, trẻ em được tiêm chủng phòng 10 loại bệnh nguy hiểm đã từ nhiều thập kỷ nay Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiện tượng trên là do giá thành vaccine sản xuất ra rất cao, không phù hợp với khả năng thanh toán của các nước đang phát triển (Walmsley

& Arntzen, 2000) Tương tự như vậy đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine cao, ngành chăn nuôi tại các nước đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các nước phát triển Vì vậy việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây Một trong những hướng nghiên cứu để giảm giá thành vaccine là

sử dụng vaccine dùng qua đường miệng thay thế cho vaccine tiêm (gọi tắt là vaccine uống) Vaccine uống có nhiều lợi thế hơn so với vaccine tiêm, như không phải sửdụng nước cất, kim tiêm, không cần cán bộ y tế có trình độ, không có nguy cơ lây nhiễm các bệnh qua đường máu Điều đó làm vaccine uống hấp dẫn hơn nhiều ở các nước nghèo, đặc biệt ở các vùng sâu, vùng xa Mặt khác, vaccine uống có một số ưu điểm so với vaccine tiêm có liên quan đến hệ miễn dịch màng nhầy Hệ màng nhầy (bao phủ các đường tiêu hoá, đường hô hấp, đường bài tiết ) trong cơ thể người và động vật chiếm một diện tích rất lớn (ở người lớn diện tích hệ màng nhầy lên đến trên

400 m2) Người ta đã nhận thấy rằng trong một số trường hợp sử dụng vaccine tiêm, kháng thể tạo thành trong máu nhưng lại không tìm thấy ở hệ màng nhầy Trong khi

đó màng nhầy lại là cửa ngõ xâm nhập vào cơ thể của nhiều tác nhân gây bệnh Nếu gây miễn dịch hệ thống màng nhầy, tác nhân gây bệnh sẽ bị chặn ngay lại khi xâm nhập vào cơ thể (Mestecky & et al, 2005)

Hướng tiếp theo có tiềm năng giảm giá thành vaccine là sử dụng thực vật

chuyển gen để sản xuất vaccine Có nhiều hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tếbào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men Ví dụ, hệ thống sản xuất vaccine sửdụng vi khuẩn có khả năng cho lượng protein cao nhưng vi khuẩn không có khả năng biến tính protein tạo thành bằng các phản ứng glycosit hoá, do đó hoạt tính của protein tạo thành bị hạn chế (Knusadi et al, 1997) Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sửdụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống đó là thực vật So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp Trước hết phải kể đến khả năng glycosit hoá protein, đó là một yếu tố rất quan trọng bởi vì các protein có khả năng gây miễn dịch đối với virus,

vi khuẩn thường là glycoprotein, nhóm glycosyl thường là yếu tố không thể thiếu được cho phản ứng tạo miễn dịch (Alkhatib et al, 1984) Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein tạo thành từ tế bào động vật bậc cao bởi thực vật thường không là vật chủ của các nguồn gây bệnh cho người và động vật (Ganz et al, 1996; Cramer et al, 1999) Cuối cùng là lợi thế về giá thành: Thực vật

có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc… So với việc nuôi cấy tế bào, chí phí đó hầu như không đáng kể Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật Vaccine tái tổ hợp

có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năngđưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003) ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Một trong những phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamine, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế, như kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason etal, 1998)

Người ta đã tạo ra giống "lúa vàng" để sử dụng như nguồn bổ sung vitamine Acho cơ thể Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một loạt các loài thực vật đã được nghiên cứu Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vaccine tái tổ

hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật đã gây miễn dịch hệ thống màng nhầy trên động vật (Mason et al, 1992) gây miễn dịch ở người tình nguyện (Tacket et al, 1998) Nhiều loại vaccine thú y cũng được quan tâm nghiên cứu

Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp các vaccine ởcác thực vật sau: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở lúa, thuốc lá (Tackabery

et al, 1999; Sardana et al, 2003); NVCP (virus Norwalk) ở khoai tây (Marson et al, 1996); Hemagglutinin (virus sởi) ở cà rốt (Bouche et al, 2003); HbsAg (viêm gan B)

ở khoai tây, rau diếp, chuối (Kapusta et al, 1999; Kong et al, 2001); độc tố gây bệnh

tả B (bệnh tả) ở cà chua (Jani et al, 2002); Protein F (virus hợp bào hô hấp) ở cà chua (Sandhu et al, 2000); LT-B (E coli) ở khoai tây, ngô (Haq et al, 1995; Chikwamba et

al, 2002); Protein S (virus đường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al, 2000); Protein L1 (papilloma virus người) ở khoai tây (Warzecha et al, 2003); kháng nguyên chống bệnh than ở thuốc lá (Aziz et al, 2002); Protein vỏ hantavirus ở khoai tây (Kehm et al, 2001) và Epitope VP1 (bệnh lở mồm long móng) ở khoai tây (Carrillo et al, 2001) Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới trong việc ứng dụng CNSH thực vật cho mọi mặt của đời sống

2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1

2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007) Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Nhiều công trình nghiên cứu về gen H5N1 và phát triển công nghệcũng như vaccine gây miễn dịch cho gia cầm được xúc tiến mạnh mẽ Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó

là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Capua & Alexander, 2008, Subbarao & Luke, 2007) Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay phôi gà (nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi Vì vậy loại

bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine

 Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng

Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa (Swayne, Suarez, 2000) Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine

sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng

có kháng nguyên NA dị chủng

 Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản

xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

+ Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia

cầm làm vector tái tổ hợp mang gen H5 và N1 phòng chống virus týp H5N1 và H7N1

(Quiao et al., 2006) Ví dụ, Hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5

lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ierland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi

+ Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách

chiết làm vaccine (Peyre et al., 2009).

 Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di

truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó

các gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Liu et

al., 2003, Tian et al., 2005) Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC)

 Vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine): Do hiện tượng kháng

kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng các vi sinh vật mới, ngoài vaccine tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới vaccine đường miệng (oral vaccine) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được ởthực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới trong công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và nghiên

cứu cây trồng chuyển gen (Lal et al., 2007).

Vaccine ăn được ở thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên

hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn Chúng tác động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào (Lê Trần Bình & Cao Huyền Trang, 2005) Vaccine này bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy Sản xuất vaccine ăn được có thể thực hiện theo quy trình sau đây:

- Lựa chọn gen cần được biểu hiện và đưa vào vector thích hợp;

- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;

- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau;

- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật;

- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật;

- Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới dạng thức ăn đã chế biến

Các thành tựu về công nghệ chuyển gen ở thực vật trong hướng nghiên cứu vaccine đường miệng: nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối

(Kumar et al., 2005), rau diếp (Marcondes & Hansen, 2008), vaccine chống bệnh đường ruột (Carol et al., 2007), vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật (Li et al, 2006), vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa (Takagi et al., 2005)

Tuy nhiên, nghiên cứu về sử dụng H5N1 làm vaccine ăn được còn rất hạn chế

(Khandelwaal et al., 2003)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam

Từ năm 2006 nhờ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng trên toàn quốc đã hạn chế đáng kể sự lây lan dịch bệnh cúm gà Nhu cầu sản xuất vaccine trở nên cấp bách hơn bao giờ hết

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA

và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổchức thế giới Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ Sinh học kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương, Công ty Thuốc thú y Trung ương II, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình, 2007) Đây là chủng vaccine được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và kiểm định sinh học quốc gia (Vương quốc Anh), thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi và vaccine tạo

ra dưới dạng vô hoạt nhũ đầu Kết quả là đã xây dựng được các quy trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm A/H5N1, kiểm nghiệm miễn dịch đạt chất lượng bằng phương pháp huyết thanh học và thử thách cường độc Ngoài ra, một số đề tài khác như nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus Và đặc biệt nghiên cứu các gen HA và các biến chủng H5N1 làm cơ sở để chế

tạo vaccine được tiến hành trên một số Viện nghiên cứu ở nước ta và trên thế giới (Lê

Trần Bình, 2007, Trần Quang Vui et al., 2008, Kodihalli et al., 1999).

2.3 Gen Hemagglutinin

Gen HA có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm: A/H1N1 có độ dài

1778 bp, ở A/H9N1 – 1714 bp, còn ở A/H5N1 từ 1704 đến 1707 bp Gen HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cầu có độ dài 568−569 amino acid Gen

HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha, chủng H5N1 (1996) ởQuảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003 Đó là các biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao

Hệ gen của virus biến đổi nhanh, trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra nhiều và sử dụng để phân định nhóm kháng nguyên, phân tuýp và phân tích mối quan

hệ tiến hóa Các chủng từ 1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các chủng từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên của A/H5N1 Cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C, D) trước 2002 không còn tồn tại,

mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ởgenotype Z, nhưng phân thành 2 nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam thuộc nhóm tiến hóa (clade) 1 Năm 2007 đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc Kiến

thuộc clade 2.3.4 ( Lê Thanh Hòa et al., 2008) Gen HA được phân lập từ chủng

A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang) có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng phân lập ở Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới

dòng Quảng Đông và clade 1 (Trần Quang Vui et al., 2008).

Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A Protein HA là một glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu

gà trong ống nghiệm (in vitro) Kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự

ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory antibody) Có 16 phân týp HA đã được phát hiện (H1-H16), ba phân týp (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Murphy & Webser, 1996) Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ

(Bender et al., 1999, Wagner et al., 2002)

Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ chuỗi HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) Các đơn phân liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là

chuỗi HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn

với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981, Wagner et al., 2002) Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa

sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài

vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002, Webser, 1998) Vị trí amino acid 226

(aa226) của chuỗi HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thểđặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là

Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đường hô

hấp của chim và cúm gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A) Ngoài ra, một số vịtrí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề

mặt màng tế bào chủ (Keawcharoen et al., 2005) Đặc biệt, một số chủng cường độc

A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) (Hui, 2008, Webser, 1998)

Hình 2.1 Cấu trúc protein Hemagglutinin

A: Dải biểu đồ protein bề mặt Hemagglutin của virus cúm H5 giới hạn bởi kháng thể F10 (màu đỏ) Hai chuỗi của HA là HA1 (màu vàng) và HA2 (màu xanh)B: Protein Hemagglutinin đại diện từ 1918 virus cúm Vị trí bám receptor là nơi protein cúm tấn công vào phổi con người

Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng được coi là chỉ

thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Keawcharoen et al.,

2005) Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng týp HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định độc lực của virus, là đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm,

cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Horimoto & Kawaoka, 2006,

Keawcharoen et al., 2005, Matrosovich et al., 1999) Hemagglutinin là polypeptide

gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 (hình 2.1) nối với nhau bằng một đoạn oligonucleotide ngắn, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trưng cho các týp H (H1-H16) trong quá

trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng (Vey et al., 1992) Chuỗi nối này cũng chính là

điểm cắt của protease tạo nên 2 phân đoạn HA rời nhau Motif của chuỗi nối oligonucleotide này chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtýp H và sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (Horimoto, Kawaoka, 1995) Đối với týp H5 cường độc, loại H5N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là TPQRERRKKR, loại H5N2: motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRKRKTR, trong khi đó, đối với subtýp H5 vô độc (hoặc nhược độc thấp), tất cả các loại H5N1, H5N2, H5N3, H4N6, và H1N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR (Horimoto, Kawaoka, 1995,

Zhou et al., 1999) Đối với chủng cường độc H7, motif này là P−K−G−R (Horimoto,

Kawaoka, 2006) Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh, mặc dù trên bề mặt virus có hai kháng nguyên glycoprotein là HA và NA nhưng chỉ có HA có khả năng gây đáp

ứng miễn dịch bảo hộ (Chen et al., 2004, Justerwicz et al., 1995) Để chứng minh có

điều đó, gần đây nhất, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo vaccine tái tổhợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với

gà thực nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60%

Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật

Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên HA ở lượng đáng kể được quan tâm nghiên cứu từ năm 2002 trở lại đây Nhiều loại protein, enzyme và kháng nguyên

đã biểu hiện thành công trong tế bào vi sinh vật và đã được áp dụng rộng rãi trong thực tế cuộc sống như dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng… Kháng nguyên HA cũng như các tiểu phần HA1, HA2 của một số virus cúm A như H1N1, H3N2, H7N9

và H5N1 đã được nghiên cứu biểu hiện trong tế bào vi sinh vật như E coli, Baculorvirus, nấm men P pastoris và S cerevisiiae (Yi Minh Xu et al., 2006) Việc

biểu hiện gen này trong thực vật đang được tiến hành nghiên cứu, tuy nhiên, có những kết quả trái ngược nhau được công bố Nghiên cứu của Bruchmüller và cộng

sự, 2007, cho thấy HA1 đã cải biến mã codon thích hợp với thực vật được biểu hiện cao trong cây đại mạch dưới sự điều khiển của promoter gliadin lúa mỳ Phân tích bằng Western blot khẳng định sự biểu hiện của HA1 trong hạt của 84 dòng chuyển gen HA1 Những nghiên cứu của D’Aoust và cộng sự, 2008, đã biểu hiện được gen

HA từ virus H5N1 (A/Indonesia/5/05) và H1N1 (A/New Caledonia/20/99) tạm thời

trong cây thuốc lá Nicotiana bethamiana Biểu hiện lượng lớn HA tích tụ trong dạng

hạt (virus like particles) vùng giữa các tế bào (apoplastic) ở cây thuốc lá cho hiệu suất đến 50mg/kg (Rybicki, 2010) Spitsin và các cộng sự, 2009, thử biểu hiện HA, HA1

từ chủng A/Vienam/1203/2004 vào thuốc lá nhưng kết quả lai miễn dịch cho thấy thí nghiệm chưa thành công Trong khi đó, Shoji và các cộng sự, 2009, đã biểu hiện thành công gen HA từ chủng A/Indonesia/05/05 sử dụng vector pGRD4 Ở Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đã thành công trên cây thuốc lá và đang được tiến

hành trên đối tượng thực vật như cây đậu tương (Nguyễn Thị Hiền et al., 2009, Bùi Phương Thảo et al., 2009).

Tạo vaccine thực vật là một hướng đi cần thiết nhưng cho đến nay vẫn đang còn nghiên cứu, chưa có vaccine thực vật mang gen HA được đưa vào sử dụng

2.4 Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng

2.4.1 Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen

2.4.1.1 Giới thiệu chung về cây bèo tấm

Phân bố của bèo tấm: Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật

thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt

của bèo tấm cũng ít hơn Trong các chi thuộc loài bèo tấm thì 2 chi (Spirodela,

Lemna) được phân bố khắp thế giới Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc Mỹ và Đông Nam Á Cùng với nghề trồng lúa

nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như: Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản Ở Việt Nam, đã phát hiện thấy có 3 loài

bèo tấm thuộc 2 chi khác nhau (Spirodela, Lemna) đó là loài L aequinoctialis, S

polyrrhiza và W globosa (Landolt, 1986) Hiện nay, các loài bèo này phân bố khá

phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và tập trung nhiều ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ

Đặc điểm hình thái bèo tấm: Lemnaceae thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ

nhất phần lớn có cả lá, rễ, hoa, quả, những cây trưởng thành không có thân cây Lá (cánh bèo) có kích thước khác nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài

Đặc điểm cánh bèo: Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là

“frond” (cánh bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hóa hạn chế Mức độ tổ

chức của mô cánh bèo trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella

và Wolffia Cánh bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có

định vị các gân lá, cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ

có 3 gân lá Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá Một số loài có cánh không dẹt do

có xoang khí lớn Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm

(S polyrrhiza, L trisulca) Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối

ưu Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia) Kích thước và hình dạng của

cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…(Landolt, 1986)

Đặc điểm rễ bèo: Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các loài bèo

tấm không giống nhau và phụ thuộc vào từng loài Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ

có một rễ, S polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm,

Landoltia có 2-3 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm

Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất khoáng, rễ sẽ dài hơn Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn và thậm chí có loại không hình thành rễ Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ (root cap), vùng mô phân sinh (meristematic region), vùng kéo dài (elongation zone), và vùng các tế bào thuần thục (zone of mature cells)

Hoa và quả bèo: Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ

Chúng thường hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát thấy Hoa của các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tuỳ thuộc vào loài Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất Các nhụy hoa thường ngắn và khó quan sát hơn Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp

vỏ ngoài khô, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường Quả bèo thường có dạng như một túi có răng cưa, đôi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ 1-6 hạt Hình 2.2 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm

Hình 2.2 Hoa của loài bèo Lemna gibba

Cây phân loại bèo tấm

Theo Landolt, 1986, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp

Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Woffiela với trên 40 loài khác nhau

Hình 2.3 Cây phân loại bèo tấm theo Landolt, 1986

Ông đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và kích thước của cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12 rễ; cánh bèo từ 10 mm trở lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)…

Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể và

vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm

gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia.

Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004, dựa trên sự so sánh trình tự đoạn intron tRNALeuUAA (trnL) và tRNAPheUAA (trnF) của bộ gen lục

lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae Hình 2.3

biểu thị cây phân loại bèo tấm

Hình thức sinh sản của bèo tấm: Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để

duy trì nòi giống: Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính Sinh sản vô tính chiếm ưu thế

so với sinh sản hữu tính Hình thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòi giống (Landolt, 1986).

Hệ gen của bèo tấm: Các nghiên cứu đối với hệ gen bèo tấm được tiến hành

từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước cho đến ngày nay Các kết quả cho thấy, bộgen bèo tấm giống với bộ gen của thực vật nói chung, bao gồm gen nhân và gen ngoài nhân

Bảng 2.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm

Bộ gen của bèo tấm có kích thước rất nhỏ, (lượng DNA trên 01 bộ nhiễm sắc

thể: (1C=0,6 pg DNA) trong khi đó ở các loài thực vật khác như Triticum

monococcum bộ gen lớn hơn nhiều (1C=6,23 pg) Kích thước gen nhân của các loài

bèo tấm là khác nhau, nhỏ nhất ở Spirodela và lớn nhất ở Wolffia Số lượng nhiễm

sắc thể ở các loài khác nhau cũng rất khác nhau từ 2n = 16 đến 2n = 126 Kích thước

bộ gen của một số loài bèo tấm so với các loài đối chứng được liệt kê trên bảng 2.1 (Landolt, 1986)

Gen ngoài nhân của bèo tấm bao gồm gen lục lạp và gen ty thể Gen lục lạp (cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Tháng 5

năm 2008, bộ gen lục lạp của Lemna minor đã giải trình tự hoàn chỉnh Bộ gen lục

lạp có cấu trúc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa protein, 30 tRNA gen và 4 rRNA gen (Mardanov, 2008)

Giá trị dinh dưỡng: Bèo tấm có chứa các chất dinh dưỡng với sự đa dạng về

cả thành phần và hàm lượng Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2… và các amino acid không thay thế trừ methionin Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao nhất Hầu hết các loài bèo tấm có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy (Landolt, 1986) Trong thời gian gần đây, đã có các nghiên cứu sử dụng

bèo tấm như là hệ thống sinh tổng hợp các chất thứ cấp, các sản phẩm mang lợi ích

cho người dân, các protein với hàm lượng lớn và hoạt tính sinh học cao (Les et al.,

2002) Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc biệt là nitơ) Thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng và các thành phần hữu cơ khác của bèo tấm được liệt kê ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô)

2.4.1.2 Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học

Trong các loài thực vật được nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài thuộc họ bèo tấm đang được đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng sinh khối nhanh Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đôi trọng lượng trong vòng 24 – 72 giờ Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với các loài thực vật khác Đối với cây ngô, từ 1 g chất khô ban đầu, sau một tuần không thể tạo ra lượng chất khô lớn hơn 2,3 kg Trong khi đó một số loài bèo tấm lại có thểtạo ra 64 g chất khô từ 1 g chất khô ban đầu sau 1 tuần (Landolt, 1986) Mặt khác hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao với sự đa dạng về thành phần các vitamin (A, B1, B2…), các amino acid không thay thế Riêng protein của bèo tấm

có thể đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khô tùy theo loài, tức là tỷ lệ tương đương với đậu tương Theo tính toán, chỉ cần 1−3 % tổng số protein nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đủ để bèo tấm được coi là hệ thống tái sinh hiệu quả Do những ưu điểm đó, trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất các hoạt chất sinh học từ bèo tấm Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các

loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt chất sinh học khác nhau, trong đó, có vacine (Yamamoto et al., 2001) Các loài thuộc họ bèo tấm

còn có khả năng chuyển gen sử dụng nguyên cây mà không cần nuôi cấy mô và vật liệu vô trùng Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học (www.lemnagene.com)

2.4.2 Agrobacterium với quá trình chuyển gen vào thực vật

Một trong những mục đích chủ yếu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ DNA tái tổ hợp là tạo ra các sản phẩm chuyển gen có giá trị thương mại cao Để

có thể tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học trong quy mô sản xuất lớn, một đòi hỏi cấp thiết là cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, ổn định (Bernard & Jack, 2006) Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào… So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp Trước hết, phải kể đến khả năng glycosit hóa các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao Thứ ba là lợi thế về giá thành: thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào

Agrobacterium là vi khuẩn đất được biết đến như một tác nhân gây bệnh ở

thực vật Chúng có khả năng gây nhiễm thực vật, tạo khối u ở các cây chủ, chủ yếu là

ở cây hai lá mầm Cơ chế gây bệnh cho thực vật của Agrobacterium đã được hiểu rõ

khi các nhà khoa học phát hiện ra sự tồn tại của Ti-plasmid trong vi khuẩn và việc chuyển gen từ Ti-plasmid này sang genome của thực vật (Tzfira, 2006) Trên cơ sởcấu trúc và chức năng của Ti-plasmid, các hướng nghiên cứu khai thác, sử dụng chúng làm vector đưa các gen mong muốn vào tế bào và mô thực vật đã được thực hiện Đến nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn này đã đạt được những thành tựu to lớn, đặc biệt trên đối tượng cây hai lá mầm (James, 2009)

Cấu tạo và chức năng của Ti-plasmid: Ti-plasmid là một cấu trúc di truyền

ngoài nhiễm sắc thể, có kích thước khoảng 200 kb Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập Ti-plasmid có

khả năng tạo khối u do mang các gen gây độc Ở các chủng Agrobacterium khác

nhau, Ti-plasmid đều có 4 vùng Trong đó, vùng T-DNA (DNA chuyển – transfer

DNA) là vùng duy nhất được chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium sang genome của

cây bị bệnh Vùng vir (virulence) đảm nhận chức năng lây nhiễm, làm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc tái bản plasmid (replication) và chuyển nạp (conjugative transfer)

Nghiên cứu vùng DNA ở các Ti-plasmid khác nhau, người ta thấy rằng DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn gọi là đoạn biên (T-DNA border sequence) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm

T-nhập của T-DNA vào tế bào thực vật Các phân tích trình tự gen trên T-DNA cho thấy chúng cũng mang các dấu hiệu khởi đầu phiên mã (hộp TATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA) Các gen tồn tại trên T-DNA được chia thành hai nhóm chính:

 Nhóm gen gây khối u mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình tổng hợp các phytohormon như auxin và cytokinin

 Nhóm gen mã hóa các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine cung cấp năng lượng cho vi khuẩn

Hình 2.4 Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid

Vùng vir trên Ti-plasmid dài khoảng 40kb, gồm có các đơn vị điều hòa (operon) (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, virH) Mỗi operon chứa nhiều gen với số lượng khác nhau nhưng chúng cùng giữ chức năng gây nhiễm Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T-DNA, giúp chúng tiếp cận

với genome của cây chủ Ngoài các gen trên vùng vir, các gen trên nhiễm sắc thể của

A tumefaciens cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của A tumefaciens vào thành tế bào thực vật (Tzfira, 2006).

Các loại vector Ti-plasmid: Các Ti-plasmid có kích thước quá lớn nên không

thể dùng làm vector, do vậy, các vector nhỏ hơn đã được thiết kế cho phù hợp với

thao tác in vitro Các vector này được thiết kế trên cơ sở của Ti-plasmid đã cắt bỏ các

gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết, chứa vùng tạo dòng đa năng (Multi Cloning Site – MCS) Có hai hệ thống vector Ti-plasmid chuyển gen hiệu quả: vector

liên hợp (co-integrate vector) và vector nhị thể (binary vector) (Walkerpeach et al.,

1994)

Vector liên hợp là loại vector Ti-plasmid cải biến đầu tiên được dùng để

chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tuy vector liên hợp cho phép

Tổng hợp opine

Vùng khởi đầu sao chép

Vùng khởi đầu tái bản

của Agrobacterium

Ti-plasmid

Biên phảiVùng chuyển nạp

Phân giải nopalin

Tổng hợp cytokininCác gen gây khối u

Tổng hợp auxin

Vùng T-DNABiên trái

Vùng gây độc(vir)

sự tái tổ hợp đặc hiệu vị trí song trình tự tương đồng rất dài giữa Ti-plasmid và

plasmid của E coli đã gây ra những khó khăn khi thiết kế và sử dụng, hiệu quả

chuyển gen thấp với số lượng các bản sao trong vi khuẩn rất ít, do vậy, ngày nay chúng không còn được sử dụng rộng rãi

Vector nhị thể: trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào genome thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển gen thực vật nhờ vector nhị thể trong đó vùng T-DNA và vùng VIR nằm trên hai

plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A tumefaciens Có hai loại vector

được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể: (1) Plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép

và có phổ vật chủ rộng chứa gen quan tâm trên T-DNA, đoạn biên phải và trái, chỉ thị

chọn lọc và sao chép trong E.coli và A tumefaciens, chỉ thị chọn lọc thực vật; (2) plasmid trợ giúp nằm trong A.tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và đoạn biên phải, trái (hình 2.5) (Hoekema et al.,

Ti-1983) Nhìn chung, quá trình biến nạp ở vector nhị thể diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ

được nhân lên trong E coli, sau đó được chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào A tumefaciens chứa sẵn Ti-plasmid trợ giúp; (ii) Tế bào thực vật được nuôi cấy đồng thời với A tumefaciens để chuyển T-DNA vào genome thực vật; (iii) Chọn

lọc tế bào thực vật được chuyển gen trong những điều kiện thích hợp

Hình 2.5 Sơ đồ vector nhị thể

Các Ti-plasmid thường được sử dụng trong công nghệ gen thực vật là những vector đơn giản mang các đặc tính chính: (i) Có khả năng sao chép độc lập và tích cực trong tế bào chủ; (ii) Có kích thước nhỏ, dễ nhận gen ngoại lai, dễ xâm nhập vào

tế bào và dễ sao chép; (iii) Mang chỉ thị chọn lọc/ sàng lọc giúp dễ dàng phát hiện các

tế bào tái tổ hợp chứa plasmid ở vi khuẩn cũng như trong thực vật; (iv) Tồn tại bền

vững trong tế bào chủ; (v) Mang các kết cấu gen có giá trị Ngoài ra, các gen chỉ thịcũng như các gen quan tâm cần được điều khiển biểu hiện bởi promoter và terminater thích hợp

Chỉ thị chọn lọc/sàng lọc: Các chỉ thị di truyền sử dụng trong công nghệ gen

thực vật thường có hai loại chính: (i) Chỉ thị chọn lọc (selectable markers): kháng lại một áp lực chọn lọc nhất định, cho phép chọn lọc các tế bào tái tổ hợp nhờ khả năng sinh trưởng được trên môi trường chứa chất kháng sinh/diệt cỏ; (ii) Chỉ thị sàng lọc(screenable markers): mã hóa cho các sản phẩm của gen với hoạt tính enzyme rất dễ phân tích Chỉ thị sàng lọc không chỉ giúp nhận biết các thể tế bào tái tổ hợp mà còn dự đoán được mức độ biểu hiện của gen quan tâm trong mô thực vật được chuyển gen

Promoter bao gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía trên đầu 5’ so với vị trí

khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS), đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen như enzyme RNA polymerase, các nhân tố phiên

mã (transcription factor – TF) Đây là thành phần không thể thiếu trong cấu trúc gen.Vì vậy, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen nói chung và

chuyển gen ở thực vật nói riêng (Lê Thị Thu Hiền et al., 2007)

Terminater: Terminater thường chứa đuôi polyA như AATTAA, hoặc

AACCAA giúp bảo vệ các phân tử RNA thông tin được bền vững hơn và tránh khỏi

sự phân hủy Hai terminater được sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là terminater của CAMV35S và NOS terminater có mặt trong nhiều sản phẩm chuyển gen

2.4.3 Nâng cao khả năng biểu hiện gen trong thực vật

2.4.3.1 Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật để nâng cao khả năng biểu hiện gen

Cấu trúc promoter

Gen cấu trúc có thể biểu hiện được thành protein cần sự có mặt của các trình

tự điều khiển thích hợp nằm ở những vị trí nhất định Trình tự tham gia tích cực vào quá trình điều khiển biểu hiện gen là trình tự khởi động (promoter) Promoter bao gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía trên đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS), đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờkhả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen như enzyme RNA polymerase, các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF) Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay

“promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal

promoter hay minimal promoter) và “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía trên TSS) (distal promoter) có thể được sử dụng Cả hai loại promoter gần và xa đều chứa rất nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hoà phiên mã

đặc hiệu tế bào, mô, cơ quan, giai đoạn phát triển và môi trường (Lê Thị Thu Hiền et

al., 2007).

Về mặt cấu trúc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc trưng có chức năng bám/gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên mã gen Các nhân tố điều hoà (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một sợi

với vùng mang mã của gen được gọi các nhân tố Cis (cis elements) Mỗi yếu tố được đặt tên dựa trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng Yếu tố cis cơ bản nhất là hộp

TATA (TATA box), được tìm thấy ở hầu hết các gen sinh vật nhân chuẩn, nằm ở vịtrí -30 (nằm về phía trước vị trí khởi đầu phiên mã (vị trí +1) 1 đoạn 30 nucleotide)

Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thường nằm ở quanh vị trí -10 Ở sinh vật nhân chuẩn

có các nhóm promoter tương ứng với ba loại enzyme RNA polymerase I, II và III Promoter nhóm II bao gồm các promoter của các gen hoạt hoá cho sự phiên mã mRNA và một số loại small RNA, U1, U2, U3… Cấu tạo promoter nhóm II có bốn thành phần: Tâm promoter, trình tự UP (upstream element), trình tự khởi đầu Inr, trình tự dowstream element (DE) Tâm promoter gồm các hộp TATA có vị trí từ -35 đến -25 Hộp TATA giúp RNA polymerase nhóm II nhận biết và gắn chính xác vào

vị trí khởi đầu phiên mã Trình tự UP ở vị trí trước TATA khoảng 25 bp, có chứa nhiều cặp G - C (hộp G - C) và trình tự CCAAT (hộp CAT) là vị trí tiếp xúc đầu tiên của RNA polymerase Trình tự dowstream element (DE) ở vị trí khoảng 27 - 50 sau hộp TATA Trình tự khởi đầu (initiator - Inr) nằm giữa hộp TATA và trình tự DE

Vai trò biểu hiện gen của promoter

Quá trình biểu hiện của một gen cấu trúc bao gồm: giai đoạn phiên mã, giai đoạn dịch mã và giai đoạn cải biến sau dịch mã Quá trình phiên mã (giai đoạn sơ khai đầu tiên để biểu hiện một gen thành protein), chịu sự điều khiển của nhiều yếu tố: promoter, các nhân tố phiên mã, các trình tự tăng cường, trình tự kết thúc (Wang

et al., 2003) Trong đó, đoạn promoter đóng vai trò chính trong quá trình biểu hiện

gen Về cơ bản, promoter đóng vai trò như một công tắc đóng mở gen Tất cả các gen đều cần có promoter để khởi động quá trình biểu hiện Promoter có rất nhiều module khác nhau hoạt động như các cảm biến (sensor) và cho phép chúng có thể phản ứng theo những cách mà đến nay chúng ta cũng chưa hoàn toàn hiểu rõ, đối với những tín hiệu khác nhau từ những gen khác hoặc từ môi trường, định rõ khi nào thì khởi động

và khởi động ở đâu với cường độ và thời gian như thế nào Trong những điều kiện nhất định, promoter có thể không hoạt động và khi đó thì gen hoàn toàn không được

khởi động Nói chung, đối với một gen bình thường trong một sinh vật, vai trò của promoter là cho phép gen hoạt động đúng trong các chu trình điều hoà hết sức phức tạp Promoter liên quan đến các gen thuộc từng sinh vật được thích ứng với gen đó trong khi toàn bộ các gen của sinh vật được thích ứng để tồn tại và hoạt động cùng nhau qua hàng triệu hay hàng trăm triệu năm

Phân loại promoter

Promoter có thể được chia làm hai loại chính: Promoter không đặc hiệu hay

promoter cơ định (constituve promoter) và promoter đặc hiệu với các yếu tố cis

chuyên biệt (specific promoter)

Promoter cơ định tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở hầu hết các

loại mô khác nhau trong nhiều giai đoạn phát triển của sinh vật CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện của RNA 35S được phân lập từ virus khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình của loại promoter này Promoter này có cấu tạo gồm 3 bộ phận chính: Vùng trung tâm (hộp TATA có vị trí

từ - 46 đến + 8) hai đoạn trình tự tăng cường (enhance) Trong thời gian gần đây, vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của CaMV

đã được nghiên cứu (Noad et al., 1997)

Trong hệ thống các promoter cơ định, promoter ubiquitin đóng một vai trò hết sức quan trọng Năm 1992, Christensen và cộng sự đã phát hiện ra 8 đến 10 locus mã hoá cho ubiquitin ở cây ngô Cả hai gen đặc tính Ubi-1 và Ubi-2 đều chứa một khung đọc mở bao gồm 1599 bp sắp xếp thành 7 chuỗi liên tiếp từ đầu đến cuối với đoạn lặp

lại có chiều dài 228 bp (Christensen et al., 1992) Vùng điều chỉnh (regulatory

region) là vùng điều điều khiển quá trình biểu hiện gen Ubi-1 ở cây ngô là đoạn trình

tự bắt đầu từ vị trí -899 bp từ đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã đến vị trí 1093 bp đầu 3’ của vị trí khởi đầu phiên mã Trình tự vùng điều chỉnh có kích thước khoảng 2

kb bao gồm:

 Hộp TATA nằm ở vị trí -30 về đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã

 Hai đoạn trình tự trùng khớp (overlaping sequence) có liên quan đến các yếu

tố sốc nhiệt nằm ở vị trí -214 đến -204 so với vị trí khởi đầu phiên mã Nhân tố sốc nhiệt của vùng điều chỉnh làm tăng khả năng biểu hiện của ubiquitin trong quá trình chống chịu lại với nhiệt độ

 Một đoạn trình tự exon không phiên mã có kích thước 83 bp nằm liền kề với vị trí khởi đầu phiên mã

 Một đoạn trình tự intron kích thước khoảng 1 kb kéo dài từ vị trí +84 đến vị trí +1093

Hình 2.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở ngô Promoter đặc hiệu: Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của

gen giới hạn ở một hoặc một vài mô hay một vài giai đoạn phát triển Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter hoạt động bình thường

ở một số mô nhất định trong khi ở các mô khác thì không hoặc chỉ hoạt động yếu (sựbiểu hiện yếu) Trong số các promoter đặc hiệu, có nhóm promoter biểu hiện đặc hiệu

mô (tissue specific promoter), biểu hiện đặc hiệu về thời gian, biểu hiện cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter)

Promoter đặc hiệu mô là những promoter chỉ điều khiển biểu hiện gen ở

những mô đặc hiệu, ví dụ promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật thì điều khiển biểu hiện gen ở bó mạch Promoter này chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT… và các trình tự đặc hiệu quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu bó mạch như hôp ASL, hộp GATA Thuộc nhóm promoter này, promoter điều khiển biểu hiện gen mã hoá sucrose synthase đặc hiệu ở bó mạch được biết đến rộng rãi nhất

Promoter đặc hiệu cảm ứng: Trong điều kiện stress (khô hạn, nhiệt độ khắc

nghiệt, oxy hoá cao…), các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ nhanh Do đó, vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen được đặc biệt chú ý Promoter điều khiển biểu hiện gen chống chịu có trình tự đặc trưng nGAAn gọi là HSE (heat shock element) Khi nhân tố phiên mã HSF (heat shock transcription factor) – protein nội

bào nhận biết được HSE chúng sẽ hoạt hoá promoter để biểu hiện gen HS (Amin et

al., 1988) Promoter điều khiển biểu hiện gen rbcS (ribulose – 1,5 – bisphosphate

carboxylase small subunit) cảm ứng ánh sáng ở nhóm cây hai lá mầm, chứa trên 30 vùng trình tự bảo thủ trong đó những vùng cảm ứng ánh sáng là hộp G, hộp I, GT – 1 (hộp II)… Hộp G có trình tự đặc trưng là CACGTG, hộp I có trình tự nhận biết là GATAAGR và trình tự ngược chiều của nó – YCTATC cũng được chú ý đặc biệt Đột biến xảy ra tại vùng này làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của gen rbcS khi có

ánh sáng (Weeks et al., 2007).

Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật

Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen nói chung và chuyển gen ở thực vật nói riêng Việc chuyển nạp gen ở các giống cây có ý nghĩa kinh tế thường rất khó vì vậy, cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gen chỉthị chọn lọc với các promoter khác nhau Nhiều promoter được dùng trong chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả Promoter 35S của virus khảm CaMV hoặc FiMV và promoter NOS thường được sử dụng Promoter 35S có tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vectơ chuyển gen

Các promoter cảm ứng có vai trò đối với quá trình biểu hiện các gen chuyển nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gen chống lại quá trình oxi hoá giúp cho cây chống lại các stress hiếu khí hay các gen kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt độ đểchọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hoá các chất dưới tác dụng của nhiệt Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu promoter

sốc nóng (Ainley et al., 1990), chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase (Back et al., 1991) và các promoter cảm ứng hormone (Yamaguchi-

Shinozaki, 1990)

Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệthống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gen và các chuỗi khởi động liên quan được mô tả Các gen này được thể hiện trong các loại mô hay trong các giai đoạn phát

triển khác nhau của cây như các gen thể hiện ở hạt phấn (Albani et al., 1991), ở hoa (Van De Meer et al., 1990), ở rễ (Departer et al., 1992) và ở hạt (Bustos et al., 1991)

Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật Polyubiquitin promoter được

phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô (Christensen et al., 1992), cây thuốc lá (Plesse et al., 2001), Arabidopsis (Callis et al., 1990), cây hướng dương (Binet et al., 1990), khoai tây (Garbarino et al., 1995), cà chua (Rollfinke et al., 1998), lúa (Lu et

al., 2008, Wang et al., 2003), mía đường (Wei et al., 2003) và đậu tương (Chiera et al., 2007) Đa số các promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với promoter

CaMV35S trong quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gen Do gen Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên, nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gen trong các loại thực vật chuyển gen đặc biệt là giữa các loài gần gũi Sự biểu hiện mạnh của promoter ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ yếu định vị trong vùng 5’

không dịch mã của gen ubiquitin (Lu et al., 2008, Sivamani et al., 2006) Các đoạn intron gần với bộ 3 khởi đầu dịch mã là những nhân tố cis quan trọng, là nguyên nhân

gây ra sự tăng cường gián tiếp có liên quan đến intron (intron-mediate enhancement –

IME) của quá trình biểu hiện gen ở thực vật (Callis et al., 1990) Ngày nay, Actin

promoter của lúa thường được sử dụng để biểu hiện gen ở cây một lá mầm (McElrroy

et al., 1995), Ubiquitin promoter được thử nghiệm trong quá trình điều khiển biểu

hiện gen ở cây ngô, lúa, đậu tương…(Hernandes-Garcia et al., 2009, Lu et al., 2008, Okubaca et al., 2003)

2.4.3.2 Cải biến gen theo mã codon đặc hiệu của thực vật

Cơ sở di truyền của việc cải biến gen

Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong các đối tượng sinh học thích hợp là vấn

đề chủ chốt trong công nghệ gen Tuy nhiên, các protein rất khó biểu hiện trong cơ thể khác loài gốc Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phân hóa ưu tiên sử dụng

mã di truyền (codon usage bias) ở các loài khác nhau là khác nhau

Chúng ta biết rằng mã di truyền (genetic code) của gen nhân bao gồm 64 bộ ba nucleotide (codon), trong đó có 61 bộ ba nucleotide (codon) để mã hóa cho 20 amino acid và ba bộ ba kết thúc Trừ Met và Trp, tất cả các amino acid đều được mã hóa bởi hai đến sáu codon khác nhau Các codon cùng mã hóa cho một amino acid được gọi

là codon đồng nghĩa (synomous codons) Các codon đồng nghĩa thường chỉ khác nhau ở vị trí nucleotide thứ ba Sự phân hóa về ưu tiên sử dụng mã di truyền là sựkhác nhau về tần số xuất hiện của các codon đồng nghĩa trong DNA genome của một sinh vật Trong quá trình dịch mã, các codon được ribosome “đọc” nhờ các RNA vận chuyển (tRNA) chứa đối mã (anticodon) bổ sung thích hợp Tần số sử dụng các codon khác nhau thay đổi đáng kể giữa các loài khác nhau, giữa các gen trong genome, giữa các protein biểu hiện mạnh hoặc yếu trong cùng một cơ thể sinh vật (ởsinh vật nhân chuẩn) và thậm chí trong cùng một operon (ở sinh vật nhân sơ)

(Gustafsson et al, 2004) Độ mạnh và chiều hướng của áp lực phân hóa đột biến

(mutational bias pressure) và áp lực tối ưu hóa hiệu quả dịch mã (selection for optimal translation efficiency) là hai nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng phân hóa

sử dụng mã di truyền (Wang, Roossinck, 2006) Áp lực phân bố đột biến ảnh hưởng

rõ rệt đến sự sử dụng codon ở virus Ở virus, hàm lượng GC trong genome có sự biếnđộng lớn giữa các loài khác nhau, dao động từ 27 đến 55% Chiều hướng của sự phân hóa đột biến về phía A/T hoặc G/C sẽ ảnh hưởng đến thành phần các base và qua đó ảnh hưởng tới sự phân hóa sử dụng codon của gen Ở những loài có hàm lượng AT trong genome cao (giàu AT), các đột biến loài thường có xu hướng GC->AT, do đó nucleotide ở vị trí thứ 3 của các codon thường là A hoặc T Ngược lại, ở những loài

có hàm lượng GC trong genome cao (giàu GC), các đột biến loài thường có xu thếxảy ra theo chiều ngược lại (AT->GC), vì thế các codon thường có nucleotide ở vị trí

thứ 3 là G hoặc C (Sharp et al., 2005).

Trong khi đó, áp lực chọn lọc đối với hiệu quả dịch mã lại là nguyên nhân của

sự ưu tiên sử dụng một bộ phận các codon đồng nghĩa, liên quan đến sự phân hóa sửdụng của các RNA vận chuyển cùng vận chuyển một amino acid (tRNA isoacceptors) trong tế bào (Wang & Roossinck, 2006) Nhiều nhóm nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan mật thiết giữa thành phần của các tRNA với thành phần mã di truyền của các gen trong một sinh vật như vi khuẩn, Drosophila (Higgs, 2008, Rocha, 2004)

Ở thực vật, sự phân hóa sử dụng mã di truyền đã được nghiên cứu từ khá lâu và khá chi tiết Nghiên cứu của Murray và các đồng tác giả (1989) trên các gen của 53 loài thực vật một lá mầm và 154 loài thực vật hai lá mầm đã chỉ ra rằng sự phân hóa

sử dụng mã di truyền giữa hai lớp này là khác nhau, ngoài Met và Tryp, trong tổng số

64 codon chứa 18 codon ưu tiên xuất hiện nhiều mã hóa cho 18 amino acid còn lại

đều có nucleotide cuối cùng là G/C (Murray et al., 1989) Phân tích 101 trình tự gen của cây ngô (Zea mays L.), Fennoy và Bailey-Serres (1993) đã chứng minh rằng ở

nhiều gen mã hóa cho các protein cảm ứng abscisic acid và các enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp anthocyanin, thành phần GC3chiếm tới trên 85% Ngoài ra, vùng mã hóa của các gen cảm ứng ánh sáng nằm trong các plastid lại chứa thành phần GC3tới trên 95%

Năm 2006, với một nghiên cứu trên quy mô lớn hơn thực hiện trên 12 loài thực vật (6 loài hai lá mầm, 5 loài một lá mầm và một vài loài tảo lục), Wang và Roossinck đã phác họa một bức tranh tương đối đầy đủ về sự phân hóa ưu tiên sửdụng mã di truyền dựa trên một số lượng gen rất lớn của 12 loài trên Nghiên cứu này

đã chỉ ra rằng ở những gen được biểu hiện mạnh, sự phân hóa sử dụng mã di truyền diễn ra rất sâu sắc Ví dụ, ở thực vật một lá mầm (ngô), khi xem xét 101 gen mã hóa các protein được biểu hiện mạnh, hai tác giả đã phát hiện ra %GC khi tính trong tất cảcác codon và tại các vị trí nucleotide thứ nhất và thứ ba của các codon đều cao hơn so với cả genome (lần lượt là 57,94%, 60,05% và 70,74%) Quan trọng hơn, nghiên cứu của Wang và Roossinck còn tính toán và đưa ra những giá trị tương đối của sự phân hóa sử dụng mã di truyền đối với từng codon, từ đó, tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu tối ưu mã di truyền sau này

Cũng như các loài thực vật một lá mầm khác, hàm lượng G/C trong gen bèo tấm

cũng chiếm một lượng lớn.Trong đó, 17/18 codon của loài bèo tấm Lemna minor có

khả năng mã hóa cao nhất cho 18 amino acid (trừ Met và Tryp) đều có tận cùng là G/C, thành phần GC3 chiếm đến 94% Ngoài Lemna minor, tác giả cũng nghiên cứu một số giống bèo tấm khác như Lemna gibba, Spirodela polyrrhiza, kết quả cũng

khẳng định rằng các codon có vị trí GC3 là những codon quyết định cho sự mã hóa

amino acid (Dickey et al., 2007)

Bảng 2.3 Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và virus

H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005)

H5N1

Bèo tấm

Lemna minor

154 loài thực vật

2 lá mầm

53 loài thực vật

0

Những phát hiện về sự phân hóa sử dụng mã di truyền đã đóng góp không nhỏvào việc nâng cao hiệu suất biểu hiện của các gen lạ/ ngoại lai trong các sinh vật khác, tạo ra các sinh vật chuyển gen hiệu quả Các vi khuẩn, virus có thành phần AT trong genome khá cao; trong khi đó, các gen của thực vật như bèo tấm, lúa, ngô…lại là các

gen giàu GC (Estruch et al., 1997, Schnepf et al., 1998) Nghiên cứu genome của 12 iridovirus cho thấy thành phần G+C chỉ từ 27 đến 55% (Chih-Tung Tsai et al., 2007)

Ngoài ra Zhou và cộng sự, 2005, cũng nghiên cứu về codon sử dụng trong virus H5N1 và các loài virus cúm A khác Phân tích 59 codon trong virus H5N1 và những gen mã hóa trong genome virus H5N1 cho thấy 18/18 codon mã hóa chiếm tỉ lệ cao nhất cho 18 amino acid (trừ Met và Tryp) trong virus H5N1 có kết thúc là A và T So sánh các codon sử dụng trong bèo tấm, trong các loài thực vật một, hai lá mầm và codon sử dụng trong virus H5N1 cho thấy sự khác biệt rõ rệt về việc sử dụng các codon này (Bảng 1.3) Trình tự mã hóa giàu AT trong gen khi được chuyển gen vào thực vật lại có thể được nhận biết như các vùng intron, các trình tự tương tự đuôi poly(A), các trình tự ATTTA, có khả năng khiến mRNA bị mất tính bền vững Do đó, hiệu suất biểu hiện của các gen trong tế bào thực vật thường rất kém Năm 1991, Perlak và các đồng tác giả đã khảo sát mức độ biểu hiện của các gen cryIA(b) và cryIA(c) ở các dạng không tối ưu mã di truyền (dạng tự nhiên), dạng sửa một trình tựhoàn toàn (sai khác 21% so với trình tự của dạng tự nhiên) trong quả cà chua và thuốc

lá Kết quả cho thấy, các cây được chuyển các gen đã được sửa trình tự một phần và được sửa trình tự hoàn toàn có mức độ biểu hiện protein tăng gấp 10 lần và 100 lần so với các cây chứa các gen tự nhiên Dựa trên cơ sở đó, việc tối ưu mã di truyền trước khi biểu hiện một gen ngoại lai trong một cơ thể sinh vật có sự phân hóa về sử dụng

mã di truyền khác với cơ thể nguồn gen đóng vai trò rất quan trọng, quyết định hiệu quả biểu hiện của gen chuyển trong cơ thể vật chủ mới

Các kỹ thuật tạo đột biến điểm

Do những khác biệt về sự phân hóa sử dụng mã di truyền ở các loài khác nhau

mà trong công tác chuyển gen từ một loài này sang một loài khác, việc tối ưu mã di truyền/ sửa một phần trình tự của gen chuyển sao cho phù hợp với vật chủ mới mà không thay đổi trình tự amino acid của protein được mã hóa đóng vai trò hết sức quan trọng Hiện nay, có hai kỹ thuật chính đang được áp dụng giúp sửa trình tự của một gen, đó là tổng hợp nhân tạo hoàn toàn một gen chứa tất cả các vị trí nucleotide cần sửa trình tự hoặc tạo đột biến điểm tại vị trí nucleotide của gen Ưu điểm của kỹ thuật tổng hợp nhân tạo hoàn toàn một gen là nhanh và tạo ra một gen mới có khả năng được biểu hiện rất mạnh trong vật chủ Tuy nhiên, tổng hợp nhân tạo hoàn toàn một gen lại khá tốn kém Kỹ thuật tạo đột biến điểm (site-directd mutagenesis), mặc dù phải thực hiện qua nhiều bước mới có thể chỉnh sửa trình tự tại tất cả các vị trí mong muốn, nhưng đây là kỹ thuật khá đơn giản, hầu hết chỉ sử dụng phương pháp khuếch đại chuỗi nhờ enzyme polymerase – PCR Nguyên lý chung, cơ bản của hầu hết các phương pháp tạo đột biến điểm là sử dụng một oligonucleotde (mồi) có trình tự bổ

sung với một phần của mạch khuôn DNA nhưng chứa một số vị trí bắt cặp sai

(mismatch) để tạo ra các vị trí đột biến mong muốn trên DNA (Cater, 1986, Wu et al.,

2005)

Trong những năm 1980, một trong những kỹ thuật tạo đột biến điểm là sử dụng các vector có khả năng tạo DNA sợi đơn như vector M13 (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể M13) Từ năm 1984 đến nay, cùng với sự phát triển của kỹ thuật PCR, các enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và các máy luân nhiệt, rất nhiều phương pháp gây đột biến điểm dựa trên PCR đã ra đời và khắc phục được những phức tạp khi thao tác trên vector M13 Chúng ta biết rằng sự bắt cặp sai tại một hoặc một vài điểm trên các mồi oligonucleotide với sợi DNA khuôn không ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình khuếch đại Không những thế, các phương pháp này còn mang rất nhiều ưu điểm, vượt trội hơn hẳn so với phương pháp gây đột biến dựa trên vector M13, nhưng thao tác đơn giản và nhanh chóng do sử dụng mạch khuôn là DNA sợi kép, có thể tạo đột biến tại bất kỳ vị trí nào tạo ra ít sai sót không mong muốn

Dựa trên nguyên lý tạo đột biến nhờ PCR, nhiều kỹ thuật đã được phát triển và ứng dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm Trong số đó, phương pháp tạo đột biến điểm nhờ Megaprimer và phương pháp tạo đột biến Quickchange là hai phương pháp được đánh giá là đơn giản và cho hiệu quả khá cao Phương pháp Megaprimer được Kammann và các đồng tác giả (1989) đề xuất và sau đó được nhiều nhóm nghiên cứu khác cải tiến là phương pháp bao gồm hai bước PCR sử dụng hai mồi sẽ gắn với đoạn DNA tại hai biên và một mồi gây đột biến ở bên trong Theo lý thuyết, mồi gây đột biến có thể có chiều hướng về bất kỳ mồi nào trong hai mồi tại biên Tuy nhiên, trong thực nghiệm chiều của mồi tạo đột biến thường hướng về mồi biên nào gần nó nhất sao cho chiều dài của Megaprimer là ngắn nhất Bước PCR đầu tiên được tiến hành với mồi gây đột biến, một mồi ở biên gần với mồi gây đột biến và khuôn DNA ban đầu Sản phẩm của phản ứng đầu tiên này là Megaprimer sợi kép được sử dụng trong bước PCR thứ hai cùng với mồi ở biên còn lại Sản phẩm cuối cùng là đoạn DNA sợi kép có chiều dài hoàn chỉnh chứa đoạn DNA mong muốn (Hình 2.7) (Ke & Madison,

1997, Tyagi et al., 2004).

Hạn chế lớn nhất của phương pháp này nằm ở nhiệt độ gắn mồi Người thiết kếcác mồi phải rất khéo léo tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi sao cho hai mồi ở biên phải có Tm rất khác nhau Nếu mồi biên thứ nhất có Tm thấp, nghĩa là phản ứng PCR thứ nhất được diễn ra với nhiệt độ gắn mồi thấp Sản phẩm Megaprimer tạo ra sau phản ứng này có kích thước lớn nên Tm sẽ cao Điều đó đồng nghĩa với việc cần thiết kế mồi biên thứ hai cũng có Tm cao tương ứng để hạn chế tạo

ra dimer mồi từ chính các Megaprimer thay vì sản phẩm DNA chứa đột biến mong