Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (+PA) sử dụng trong điều trị

Xuất phát từ thực tế đó, Phòng CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của Bộ KH&CN, chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước KC10-06/10 đã tiến hành ngh

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT

HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT

HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:

9 Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban chủ nhiệm chương trình KC.10/06-10, Văn phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước đã cấp kinh phí

9 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ

9 Các đơn vị phối hợp: Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sản phẩm y tế; Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương; Trung tâm phòng chống độc – Học viện Quân y; Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gene và Phòng Hóa sinh protein – Viện Công nghệ sinh học

9 Các cán bộ tham gia đề tài và một số cộng sự khác

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1 PGS TS Quyền Đình Thi Phòng CNSH Enzyme Chủ nhiệm đề tài

2 PGS TS Nông Văn Hải Phòng CN ADN ứng dụng Chủ nhiệm đề tài nhánh

3 PGS TS Hoàng Văn Lương Học viện Quân y Chủ nhiệm đề tài nhánh

5 ThS Nguyễn Sỹ Lê Thanh Phòng CNSH Enzyme Thành viên

11 và một số cộng sự khác

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Quyền Đình Thi

MỤC LỤC

BÁO CÁO TỔNG HỢP 1

MỞ ĐẦU 1

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị 2

1.1.1 Bệnh nghẽn mạch 2

1.1.2 Điều trị bệnh nghẽn mạch 3

Các thuốc điều trị thế hệ 1 3

Các thuốc điều trị thế hệ 2 4

Các thuốc điều trị thế hệ 3 4

1.2 Thuốc điều trị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme 6

1.3 Tình hình nghiên cứu SK 9

1.3.1 Giới thiệu chung về SK 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới 12

Nhân dòng và biểu hiện trong E coli 12

Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris 14

Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus 15

Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác 15

1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hiện tPA 17

1.4.1 Chất hoạt hóa plasminogen mô người 18

1.4.2 Vai trò của tPA trong quá trình làm tan máu đông 20

1.4.3 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 21

1.4.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22

1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài 22

2 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu và hóa chất 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

Các chủng liên cầu khuẩn 24

Các chủng vi sinh vật chủ, vector nhân dòng và biểu hiện 24

Mẫu mô và máu 24

Các dòng tế bào động vật chủ, vector biểu hiện 24

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25

Hóa chất 25

Thiết bị 26

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 27

2.1.4 Dung dịch và đệm 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật 28

Nuôi cấy 28

2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 29

Tinh sạch protein tái tổ hợp 29

Định tính SK 30

Đinh lượng SK bằng phương pháp so màu 30

Xây dựng đường nồng độ SK chuẩn 31

Loại bỏ và kiểm tra nội độc tố vi khuẩn 31

Điện di SDS-PAGE 31

Western blot 32

Nhận dạng protein 32

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính và độ bền SK 33

2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 33

Phân tích gene 33

Phản ứng PCR khuếch đại và dung hợp 34

Tách chiết DNA tổng số 34

Đọc trình tự và phân tích gene 34

Tinh sạch plasmid 35

Tinh sạch phân đoạn DNA 35

Điện di agarose 36

Biến nạp plasmid 36

2.2.4 Lên men và tạo chế phẩm SK thô và SK tinh sạch 37

2.2.5 Các phương pháp biểu hiện tPA ở tế bào động vật 38

Tách chiết RNA tổng số 38

RT-PCR để nhân cDNA 38

Tạo dòng và xác định trình tự gene 39

Thiết kế plasmid biểu hiện 39

Tinh chế vector biểu hiện (Kit Qiagen for maxi-prep) 40

Phần mềm phân tích DNA 40

Nuôi cấy tế bào CHO-S 41

Biểu hiện tPA ở tế bào CHO-S 41

Tinh sạch sơ bộ tPA từ E coli 42

Xác định hoạt tính tPA 42

Sơ chế tPA 42

Tinh chế tPA 43

2.2.6 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 44

2.2.7 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu huyết học, chức năng gan thận và các tác dụng phụ 47

3 NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 48

A NỘI DUNG (1+3+4): NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SK TÁI TỔ HỢP 48

3.1 Phân lập chủng gây tan huyết 48

3.2 Nhân dòng, phân tích gene sk từ S pyogenes và S equisimilis 52

3.3 Thiết kế, biểu hiện gene sk từ S pyogenes DT17 ở E coli 55

3.3.1 Thiết kế, biểu hiện gene sk trong pET22b + 55

Biểu hiện SK ở E coli BL21 55

Biểu hiện SK ở E coli BL21 (DE3) plysE và plysS 56

3.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp SK 58

Nhiệt độ sinh trưởng 59

Nhiệt độ sinh tổng hợp SK tối ưu 59

pH môi trường ban đầu tối ưu 60

Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 60

3.3.3 Tinh sạch và nhận dạng SK tái tổ hợp 61

Tinh sạch SK 61

Nhận dạng SK 61

3.3.4 Đánh giá tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp 65

Nhiệt độ phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ 65

pH tối ưu và độ bền pH 66

Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bền của SK tái tổ hợp 67

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên độ bền của SK tái tổ hợp 68

Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính của SK tái tổ hợp 69

Hoạt hóa SK 69

3.4 Biểu hiện đoạn msk từ S pyogenes trong E coli 70

3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện msk 70

3.4.2 Biểu hiện và tinh sạch mSK 71

Biểu hiện và tinh sạch mSK có đuôi 6xhis 71

Biểu hiện và tinh sạch mSK không có đuôi 6xhis 72

3.5 Biểu hiện gene msk từ S pyogenes DT17 ở B subtilis 73

3.5.1 Thiết kế cấu trúc biểu hiện acoAamyE-sk-T7 73

3.5.2 Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện msk 73

3.5.3 Biểu hiện và tinh sạch SK từ chủng B subtilis tái tổ hợp 74

3.5.4 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ B subtilis 75

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền SK 75

Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính SK 76

Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính SK 77

3.6 Biểu hiện gene sk từ S pyogenes DT17 ở Pichia pastoris 77

3.6.1 Nhân dòng phụ sk 77

3.6.2 Thiết kế plasmid pPSK 78

3.6.3 Biểu hiện SK ở P pastoris 79

3.6.4 Tối ưu các điều kiện biểu hiện 80

Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu 80

pH môi trường nuôi cấy tối ưu 81

Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 81

3.6.5 Tinh sạch SK từ P pastoris 81

3.6.6 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ P pastoris 83

Độ bền nhiệt độ 83

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền 83

Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 84

Ảnh hưởng của ion kim loại 85

3.7 Sản xuất chế phẩm SK 85

3.7.1 Lên men chủng E coli BL21 tái tổ hợp BLSK.2 85

3.7.2 Sản xuất SK-his + tái tổ hợp sạch 85

Thu dịch SK và loại bỏ nội độc tố 85

Tinh sạch SK 87

3.8 So sánh một số tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp với SK thương phẩm 89

So sánh hoạt tính riêng 89

So sánh độ bền nhiệt 89

B NỘI DUNG 2+3+4: NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM TPA TÁI TỔ HỢP 91

3.9 Nhân dòng và xác định trình tự gene mã hóa tPA người 91

3.9.1 Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa tPA người 91

RNA tổng số 91

cDNA mã hóa tPA 91

Tạo plasmid nhân dòng 91

Phân tích trình tự tPA 92

3.9.2 Sản xuất chế phẩm tPA tái tổ hợp 95

Chọn vector và dòng tế bào thích hợp 95

Quy trình nuôi cấy tế bào 96

Các plasmid biểu hiện tPA ở tế bào động vật 97

Dòng tế bào biểu hiện tPA 99

3.9.3 Sản xuất và tinh chế tPA ở quy mô phòng thí nghiệm 100

Nuôi cấy tế bào CHO-S để sản xuất tPA 100

tPA sơ chế 100

Tinh chế tPA 101

3.10 Thử nghiệm tác dụng phân giải huyết khối của tPA trên động vật thí nghiệm 102

3.10.1 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 102

Cho điểm thần kinh 102

Thời gian chuột vận động tự do trong vòng 5 phút 103

Thời gian chuột vận động trên trục quay Rota-rod 103

Đánh giá trí nhớ không gian kết hợp vận động bằng mê lộ nước 104

3.10.2 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu toàn thân, huyết học, chức năng gan thận và các tác dụng phụ 105

Chỉ tiêu toàn thân 106

Các chỉ số huyết học và sinh hóa máu 106

4 KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 107

4.1 Kết quả nổi bật 107

4.2 Công bố 111

Bài báo 111

Trình tự gene đã đăng ký GenBank 111

Đăng ký bản quyền 112

4.3 Đánh giá chung 112

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117

TÀI LIỆU THAM KHẢO 119

PHỤ LỤC 124

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

SK Streptokinase

v/v Volume/volume

w/v Weight/volume

và hiệu quả giá thành cũng như không bị hạn chế về mặt khai thác lâm sàng của nó so với các yếu tố hoạt hóa khác.

Mặt khác, ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu sản xuất dược phẩm còn nhiều hạn chế, nguồn nguyên liệu vẫn chủ yếu dựa vào việc nhập khẩu Do đó, việc áp dụng công nghệ sinh học, sinh học phân tử trong nghiên cứu tạo các chế phẩm y dược là một nhiệm vụ thiết yếu và có tính khả thi cao đối với tình hình thực tiễn ở nước ta Xuất phát từ thực tế đó, Phòng CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của Bộ KH&CN, chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước KC10-06/10 đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị

Bệnh tắc tĩnh mạch do yếu tố V: Yếu tố nguy cơ thông thường của tắc nghẽn tĩnh

mạch là xuất hiện yếu tố V Leiden, một biến thể của yếu tố V của quá trình đông máu Biến thể này bị bất hoạt rất chậm, giảm 10 lần so với nguyên thể Điều này làm cho nó tồn tại lâu hơn trong máu và làm cho máu ở tình trạng quá đông Một copy của gene

mã hóa yếu tố V Leiden sẽ làm tăng nguy cơ nghẽn mạch lên 4-8 lần, trong khi đó với

2 copy của gene này nguy cơ sẽ tăng tới 80 lần Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V Leiden chiếm 20-40% các bệnh nghẽn mạch và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân

cư [2]

Bệnh nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin có chức năng ức chế hoạt

động của một số các yếu tố đông máu như thrombin, các yếu tố IXa, Xa thông qua hình thành phức hợp bền vững với rất nhiều yếu tố khác nhau Heparin và heparan sulfat làm tăng hoạt tính của antithrombin lên gấp 1000 lần

Sự thiếu hụt antithrombin là một trong những nguyên nhân gây nên bệnh tắc nghẽn mạch Khoảng 2% số người bị chứng tắc nghẽn mạch được ghi nhận là thiếu antithrombin Tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng là 1/2000 đến 1/5000 Bệnh mang yếu

tố di truyền thể trội trên nhiễm sắc thể thông thường Khiếm khuyết do đột biến gene tác động tới quá trình tổng hợp hoặc ổn định yếu tố này Bệnh thường gặp là nghẽn mạch phổi và tĩnh mạch, ít thấy tắc nghẽn động mạch Chứng nghẽn mạch có thể xảy

ra một cách tự phát hoặc liên quan với phẫu thuật, chấn thương và thai nghén [2]

Tắc nghẽn động mạch: nguyên nhân có thể do xơ vỡ động mạch gây ra khi tăng

lượng mỡ máu Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi Khi mỡ và canxi lắng đọng làm dầy thành mạch, lúc này hình thành máu đông trên bề mặt của thành mạch bị biến dạng Đây là yếu tố kích hoạt cho con đường đông máu nội sinh

Con đường nội sinh được kích hoạt khi các yếu tố đông máu tiếp xúc với bề mặt điện tích âm Đây được gọi là pha tiếp xúc, là kết quả của tương tác với phospholipid của phần tử lipoprotein tuần hoàn như chylomicron và lipid phân tử thấp trong máu Đây là nền tảng của sự tiền nghẽn mạch do tăng mỡ máu gây nên và làm tiến triển xơ

Trước đây, bệnh nghẽn mạch được kiểm soát bằng sử dụng các chất kháng đông như heparin và coumarin để kìm hãm sự tạo thành fibrin Mặc dù có các chất kháng đông hóa học và các phương pháp phẫu thuật, bệnh tắc nghẽn mạch cấp tính vẫn còn

là nguyên nhân gây tử vong ở lứa tuổi trung niên và tuổi già

Khi nhận ra rằng sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống bởi một quá trình bao gồm sự chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin, một enzyme hoạt động, người ta đã nghĩ đến cách điều trị mới là sử dụng các chất hoạt hóa plasminogen (PA) Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng cách tiếp cận tốt nhất

để điều trị chứng nghẽn mạch (hòa tan huyết khối) là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin Các enzyme thường được sử dụng nhất trong cách điều trị này là streptokinase từ vi khuẩn và urokinase (uPA) từ nước tiểu của người Trong 20 năm gần đây, người ta còn sử dụng 3 enzyme phân giải cục nghẽn mới trong một số trường hợp là arvin (từ một loài rắn độc ở Mã Lai), reptilase (từ một loài rắn ở Nam Mỹ) và brinase (từ một loài nấm mốc

Aspergillus oryzae) [4]

Việc sử dụng và nghiên cứu thuốc làm tan huyết khối để điều trị các rối loạn huyết khối gây tắc mạch bắt đầu vào nǎm 1933 Các nghiên cứu tập trung vào tác dụng phân hủy fibrin của các chất phân lập từ cầu khuẩn tan huyết beta Tuy nhiên do số liệu về hiệu quả sử dụng thuốc thời gian đó không đầy đủ, nên việc dùng thuốc làm tan huyết khối bị hạn chế Dẫn liệu đầu tiên sử dụng trị liệu làm tan huyết khối để điều trị nhồi máu cơ tim (AMI) bắt đầu vào nǎm 1958 khi Fletcher sử dụng trị liệu streptokinase liều cao, kéo dài [5] Việc sử dụng các chất có bản chất protein để điều trị AMI có thể được phân thành 3 giai đoạn theo Bachmann [6] như sau:

Các thuốc điều trị thế hệ 1

Việc thử nghiệm điều trị AMI bằng SK lần đầu tiên được nhóm nghiên cứu của trường đại học St Louis, Mỹ thực hiện vào những năm cuối của thập kỷ 60 [5, 7, 8] Một vài năm sau, UK được phát hiện là một chất gây tan huyết và được chính Fletcher

và sau đó là Sasahara et al (1967) dùng điều trị tắc mạch phổi [9] Mối quan tâm về sử

4

dụng các thuốc làm tan huyết khối trên lâm sàng bị hạn chế cho tới cuối những nǎm

1970 vì còn nghi ngờ về nguy cơ chảy máu do trị liệu đem lại Khoảng những năm

1980, nhận thức về nguyên nhân gây tắc mạch vành là do các cục máu nghẽn được

Dewood et al (1980) đi tiên phong nghiên cứu và được Rentrop et al (1981) chứng

minh về tác dụng của SK trong thông tắc động mạch vành [10, 11] Thêm vào đó, khi

DeWood et al (1985) chứng minh tỉ lệ nút huyết khối trong 24 giờ đầu nhồi máu cơ

tim và đưa ra bằng chứng của "tái ngập máu tự động" trong những giờ sau nhồi máu, hội y học vẫn dè dặt thừa nhận vai trò của huyết khối động mạch vành trong việc xảy

ra nhồi máu cơ tim [12] Các nhà nghiên cứu khác cũng góp phần tạo bước ngoặt nghiên cứu trong giai đoạn đầu và giữa thập niên 80, chứng minh lợi ích của trị liệu làm tan huyết khối, mà hiện nay có vai trò cứu sống hàng nghìn người mỗi nǎm

Các thuốc điều trị thế hệ 2

Vào cuối những năm 1980, tPA và urokinase được nhân dòng [13], [14] và APSAC (anistreplase) được sinh tổng hợp [15] Cả ba loại thuốc này được thử nghiệm rộng rãi trên người Thời kỳ này vẫn được coi là khởi đầu của các cuộc điều trị qui mô lớn nhằm khám phá các chế độ điều trị khác nhau, bắt đầu với ISIS-2 một nghiên cứu quốc tế về di chứng nhồi máu cơ tim (ISSIS-2, 1988) Trong thời kỳ này, SK được so sánh với tPA [16, 17], APSAC, staphylokinase và urokinase [18, 19] cho thấy sự đặc hiệu fibrin khác nhau giữa các thuốc có bản chất protein này

Bên cạnh đó, hiệu quả của trị liệu làm tan huyết khối liên quan giữa thời điểm dùng thuốc với thời điểm khởi phát nhồi máu cơ tim cũng được nghiên cứu Thử nghiệm GISSI-1 (nghiên cứu về điều trị nhồi máu cơ tim của tập đoàn Gruppo Italiano) đã chứng minh tỉ lệ tử vong trong 21 ngày đầu giảm gần 50% ở bệnh nhân được điều trị bằng streptokinase tĩnh mạch ngay khi triệu chứng khởi phát Trong thử nghiệm GSSI được công bố năm 1986, 11.806 bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính được điều trị với streptokinase trong vòng 12 giờ đầu bằng đường tĩnh mạch và bằng placebo Tỷ lệ tử vong giảm đáng kể ở những bệnh nhân được điều trị bằng streptokinase trong vòng 6 giờ đầu Đặc biệt, ghi nhận tỷ lệ tử vong giảm tới 50% đối với bệnh nhận được điều trị trong vòng 1 giờ từ lúc bắt đầu triệu chứng [20]

Các thuốc điều trị thế hệ 3

Sau khi chứng minh nút huyết khối là trung gian xẩy ra nhồi máu cơ tim cấp (AMI), tính khả thi của việc dùng khẩn cấp streptokinase trong động mạch vành được chứng minh và mang lại tác dụng có lợi cho cơ tim bệnh nhân Thử nghiệm SK trong mạch vành ở Western Washington, đã chứng minh giá trị của việc trị liệu này [21, 22]

PA liên kết antifibrin hoặc kháng thể kháng tiểu cầu và các chất đặc hiệu cao với fibrin như staphylokinase và PA từ loài dơi quỷ đã được nhân dòng và thử nghiệm trên động vật, sau đó là trên người Những thể đột biến của tPA có thời gian bán phân hủy dài hơn như reteplase và tenectaplase (TNK-tPA) được tạo ra Những thử nghiệm lâm sàng tiếp theo sau đó với những thuốc làm tan huyết khối gồm có streptokinase (SK), activase (tPA), retavase (r-PA) và TNK-tPA ghi nhận có sự cải thiện về tỷ lệ sống sót

ở các bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính được điều trị tan huyết khối [24]

Cuối những nǎm 1980, các nhà khoa học đã sử dụng công nghệ sinh học và công nghệ tái tổ hợp DNA để tạo ra nhiều thuốc tan huyết khối đặc hiệu Tại Cuba, Trung tâm Công nghệ và kỹ thuật gene Cuban đã sản xuất streptokinase dưới tên thương mại

là Herberkinasa và đã tiến hành nhiều nghiên cứu điều trị thử nghiệm AMI Thử nghiệm đầu tiên được tiến hành vào 1992-1995 với 2923 bệnh nhân bị AMI Kết quả cho thấy tỷ lệ tử vong giảm 28,3% với 179 bệnh nhân được cứu sống thêm hàng năm Trong đó tỷ lệ chảy máu chỉ ghi nhận ở 9 bệnh nhân, chiếm khoảng 0,3% [27] Cũng trong thời kỳ này, các nhà ngiên cứu về tim mạch đã nhận thấy giá trị ngày càng tăng của việc trị liệu bằng thuốc kết hợp với các chất ức chế thrombin như hirudin, argatroban và chất ức chế thụ thể GpIIb/IIIa (các chất ức chế glycoprotein tiểu cầu) như các kháng thể đơn dòng abciximab và các chất ức chế dạng tổng hợp Một số thử nghiệm qui lâm sàng mô lớn được tiến hành trên các bệnh nhân phẫu thuật tim mở, ghép gan, chảy máu không kiểm soát và ung thư máu thể nguyên bào tủy ở qui mô nhỏ hơn

Theo Vyas et al (2007), trong số các chất có khả năng phân hủy huyết khối được

sử dụng điều trị thì dường như SK là được sử dụng thường xuyên nhất do giá thành thấp hơn so với tPA và UK Ngoài ra, việc lựa chọn chế phẩm điều trị còn phụ thuộc vào hàng loạt các yếu tố ngoài giá cả như các phản ứng phụ và mức độ nghiêm trọng của chúng, tốc độ đào thải, ái lực với fibrin, phản ứng miễn dịch v.v SK, một chất hoạt hóa plasminogen có hiệu lực cao, thời gian bán phân hủy trong huyết tương tương đối dài là một lợi thế cho việc lựa chọn để điều trị so với các loại thuốc khác [28]

6

Song do không đặc hiệu với fibrin nên việc sử dụng các liều điều trị hiệu quả lại thường gây ra hoạt hóa một cách hệ thống plasminogen và kết quả là gây chảy máu do phân hủy các yếu tố đông máu dưới tác dụng của plasmin trong hệ tuần hoàn Tuy nhiên, nếu tạo cho phân tử SK một ái lực với fibrin sẽ làm tăng đáng kể hiệu quả điều trị Một trong các giải pháp hữu hiệu được áp dụng là anisoyl hóa phức hợp chất hoạt hóa plasmin streptokinase (APSAC) với tên thương mại là Eminase của Tập đoàn thương mại Beecham Trong đó, gốc serine của plasmin, một vị trí quan trọng đối với phản ứng xúc tác, bị acyl hóa thuận nghịch Kết quả điều trị bằng APSAC là sự hoạt hóa plasminogen diễn ra chậm hơn do việc khử acyl cho serine trong phức hợp xảy ra rất chậm trong hệ thống mạch máu [15] Điều này cũng dẫn tới việc giảm lượng plasmin tự do trong hệ tuần hoàn và kết quả là quá trình thủy phân fibrin trở nên hiệu quả hơn với các liều điều trị thấp hơn

Rõ ràng, hiểu biết và chuyên môn trong dùng thuốc đã được mở ra trong giai đoạn chừng 15 nǎm và có thay đổi đáng kể trong điều trị và tiên lượng AMI

1.2 Thuốc điều trị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme

Có 5 thuốc tan huyết khối được phép dùng ở Mỹ: alteplase (tPA tái tổ hợp); streptokinase (SK), tách chiết từ cầu khuẩn tan máu beta; urokinase (UK), có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hoạt hóa plasminogen của mô người (tPA) gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành plasmin

Streptokinase (SK) là một loại thuốc rất hiệu quả và rẻ, do nó là một sản phẩm

của vi khuẩn SK bám vào plasminogen tạo nên phức enzyme Phức này xúc tác chuyển hóa plasminogen thành dạng hoạt động là plasmin có khả năng phân hủy fibrin làm tan huyết khối trong lòng mạch Nghiên cứu trên các bệnh nhân tình nguyện chỉ ra rằng, huyết khối tĩnh mạch bị hòa tan khi được tiêm streptokinase vào tĩnh mạch Do

đó, enzyme này được lựa chọn sử dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn tĩnh mạch sâu và tắc mạch phổi [29]

tPA, yếu tố hoạt hóa của tổ chức, được sản xuất bằng con đường tái tổ hợp cũng

rất hiệu quả nhưng lại rất đắt Nó không có vấn đề miễn dịch như đối với streptokinase Đầu tiên nó gắn với fibrin, sau đó phức này bán vào plasminogen tạo nên phức 3 và từ đó hoạt hóa plasminogen để phân hủy fibrin [30]

7

Urokinase phân cắt trực tiếp plasminogen tuần hoàn trong máu thành plasmin

thông quan cắt liên kết L-arginyl-L-valyl Urokinase an toàn hơn so với streptokinase, nhưng rất đắt do việc sản xuất và khai thác lâm sàng bị hạn chế Urokinase được dùng chủ yếu để điều trị huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch catheter, trong khi 3 thuốc khác được chỉ định điều trị AMI Do kết quả trực tiếp của việc dùng thuốc tan huyết khối nên tỉ lệ tử vong sau AMI giảm rõ rệt, và hiểu biết về dùng hợp lý thuốc phụ trợ khác nhau đã phát triển

Urokinase và streptokinase thuộc cùng loại thuốc, nhưng urokinase đắt hơn nhiều,

vì vậy streptokinase thường là thuốc được sử dụng hàng đầu để điều trị AMI Urokinase được dùng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu, và hay dùng nhất là tiêu hủy huyết khối tại chỗ (nghĩa là thông huyết khối bằng catheter IV) [31]

Altepase (tPA) theo lý thuyết có tác dụng là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (nghĩa

là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với fibrin) Plasmin được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy toàn thân Tuy nhiên, điều quan trọng là cần có suy nghĩ rằng hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối,

và với liều cao hơn vẫn ảnh hưởng tới toàn thân

Sử dụng tiến bộ công nghệ sinh học đã tạo ra alteplase, APSAC được triển khai để

cố gắng tránh tình trạng phân hủy toàn thân tiến triển nhanh sau khi dùng streptokinase APSAC chỉ là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh học tạo ra một phức streptokinase plasminogen chất này bị khử acyl hóa thành streptokinase chậm ở tốc độ có thể không gây tình trạng phân hủy Điều không may là liều APSAC cần thiết để làm tan huyết khối gây tình trạng phân hủy toàn thân [15]

Tenecteplase là chất hoạt hóa plasminogen dạng mô TNK tái tổ hợp đặc hiệu tiêu

fibrin, chúng có tác dụng tiêu huyết khối trên hệ thống phân hủy fibrin nội sinh để biến plasminogen thành plasmin Không giống streptokinase hoặc urokinase, phần lớn tác dụng của alteplase hoặc tenecteplase phụ thuộc vào sự có mặt fibrin Chúng chỉ chuyển hóa một lượng tối thiểu plasminogen thành plasmin khi không có fibrin Tenecteplase làm tǎng tính đặc hiệu fibrin so với alteplase, tuy nhiên ý nghĩa lâm sàng của đặc hiệu fibrin vẫn chưa được xác định [31]

Ngoài 5 thuốc như kể trên, hiện nay nattokinase cũng được ứng dụng rộng rãi để điều trị các trường hợp có trạng thái đông máu cao Nattokinase có các tác dụng hòa tan trực tiếp fibrin, ngăn cản sự đông máu và sự tạo thành huyết khối bằng cách làm tăng quá trình sản xuất plasmin và các yếu tố hòa tan cục nghẽn khác của cơ thể, bao

8

gồm urokinase nội sinh; kìm hãm ACE, enzyme chuyển hóa angiotensin, vì vậy làm giảm áp lực của máu Enzyme tự nhiên này có nhiều hứa hẹn trong việc điều trị các bệnh tim mạch Nattokinase được dùng như một chế độ bổ sung dinh dưỡng giúp duy trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị

và phòng ngừa các bệnh lý có liên quan tới huyết khối như viêm động-tĩnh mạch, bệnh tim thiếu máu, đau thắt ngực, suy giảm trí nhớ ở người già, đột quỵ… [32, 33]

Ngoài ra, một số thuốc khác đang trong giai đoạn thử nghiệm như arvin, brinase, reptilase v.v Arvin, brinase và reptilase được sử dụng kém thường xuyên hơn nhưng

có khả năng thay thế cho heparin như là chất kháng đông Tuy nhiên chúng chưa được chấp nhận rộng rãi do các nghiên cứu lâm sàng của chúng còn hạn chế

Reptilase, một enzyme có khả năng cắt chuỗi peptit A trên fibrinogen, được tách

chiết từ nọc rắn Nam Mỹ Bothrops atrox Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng

reptilase thay thế heparin hoặc discoumarol trong việc ngăn ngừa sự tái tạo huyết khối

ở các bệnh nhân trải qua phẫu thuật tĩnh mạch rất ít gây biến chứng chảy máu Enzyme này thủy phân trực tiếp fibrin và không có hoạt tính hoạt hóa plasminogen [3]

Brinase, một enzyme thủy phân fibrin giống plasmin, được tìm thấy trong dịch

chiết của mốc Aspergillus oryzae, có khả năng thủy phân fibrin và fibrinogen [4] Đã

có các nghiên cứu chỉ ra rằng các bệnh nhân bị tắc mạch có thể được phục hồi trong vài phút sau khi điều trị bằng brinase Các bất lợi của việc điều trị bằng brinase là trước đó phải sử dụng chất kìm hãm protease huyết tương và có các ảnh hưởng phụ khác như: chứng phù nề, hematoma và đau tại vùng được điều trị

Serrapeptase (Serratia peptidase), là một enzyme thủy phân fibrin do các chủng

vi khuẩn trong ruột Serratia E15 sinh ra Khi được uống dưới dạng viên không được

bảo vệ hoặc dưới dạng viên nang, enzyme này bị phá hủy bởi axit trong dạ dày Tuy nhiên, các viên thuốc có lớp bảo vệ cho phép enzyme đi qua dạ dày mà không bị thay đổi, và được hấp thụ vào ruột Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng serepeptase có tính thủy phân fibrin, kháng viêm và chống phù nề trong một số mô và rằng các ảnh hưởng kháng viêm của nó hiệu quả hơn so với các enzyme thủy phân protein khác Bên cạnh khả năng làm giảm viêm, nó còn có thể giảm đau bởi vì nó có khả năng ngăn chặn sự giải phóng các amin gây đau từ các mô sưng tấy Các bác sỹ ở khắp châu Âu

và châu Á đã ghi nhận tính kháng viêm và giảm đau của thuốc này và đang sử dụng như một chất thay thế cho salicylate Liều lượng của serapeptase cho một ngày là 10-

30 mg, chia làm 3 lần [34]

9

Boluoke là một sản phẩm mới (tên thương mại của Lumbrokinase) có thể hòa tan

huyết khối mà không có nguy cơ làm xuất huyết Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng các bệnh nhân sử dụng lumbrokinase trong một tháng thì bệnh được cải thiện đáng kể Bolouke rất an toàn và hiệu quả Một trong những thành phần của

Lumbrokinase là bột giun đất Lumbricus rubellus, enzyme thủy phân fibrin Do có ái

lực cao với fibrin nên Lumbrokinase khắc phục được những ảnh hưởng bất lợi gây chảy máu Chế phẩm này có thể có một ảnh hưởng đáng kể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh thiếu máu não cục bộ Bolouke có thể được áp dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh nhồi máu cơ tim, nhồi máu phổi, điếc và mù lòa do tắc mạch Boluoke rất

dễ sử dụng có thể được sử dụng trường diễn làm một tác nhân chống đông Boluoke không phản ứng ở trong dạ dày, ruột, nó có thể được sử dụng như là một chất thay thế đối với bệnh nhân không thể dùng aspirin Boluoke cũng có thể được sử dụng trong việc ngăn ngừa và điều trị tình trạng đông máu cao ở bệnh nhân mắc các bệnh mạn tính như bệnh tiểu đường, bệnh tim phổi, u ác tính, bệnh lupus ban đỏ, bệnh tăng hồng cầu, nghẽn mạch, viêm thận tiểu cầu, bệnh thiếu máu do chảy máu và bệnh gan Là thuốc chống đông máu và nghẽn mạch duy nhất dưới dạng thuốc uống mà có hoạt tính như urokinase và tPA, Boluoke có thể được áp dụng trong điều trị bệnh nghẽn mạch phối hợp với các thuốc chống đông máu khác Từ năm 1990, bệnh viện Xuanwu của trường y Jiangxi Medical College đã nghiên cứu phản ứng lâm sàng và đặc tính đông máu của 453 bệnh nhân bị bệnh thiếu máu não Kết quả chỉ ra rằng thuốc có hiệu quả với 93% bệnh nhân, trong đó, đáp ứng tốt đạt tỷ lệ 73% [35]

1.3 Tình hình nghiên cứu SK

Streptokinase (SK) (EC 3.4.99.22) là một protein ngoại bào do SK do các chủng

Streptococcus nhóm A, C và G sinh ra SK được coi là độc tố nguy hiểm của Streptococcus do nó tạo ra plasmin, một chất làm lan truyền vi khuẩn từ nơi tập trung

ban đầu thành tình trạng nhiễm trùng bởi hiện tượng tiêu sợi huyết và thoái hóa dịch ngoại bào và các cấu thành của màng cơ sở

Streptokinase tự nhiên gồm 440 amino acid, trong đó 26 amino acid đầu N là peptide tín hiệu sẽ bị cắt bỏ trong quá trình tiết protein ra ngoài môi trường thành protein trưởng thành với 414 amino acid, không có cầu nối disulfide Phân tử SK trưởng thành là một chuỗi đơn, khối lượng phân tử khoảng 47 kDa với điểm đẳng điện tại pH 4,7 và pH tối ưu là 7,3-7,6 [36], được chia thành 3 vùng: alpha, beta và gama Mỗi vùng đều liên kết với plasminogen, mặc dù không vùng nào có thể hoạt hóa

10

plasminogen một cách độc lập Vùng α (từ amino acid 1 đến 150), β (từ amino acid

151 đến 287) và γ (từ amino acid 288 đến 414) (hình 1.1) [37] Trong đó, theo Fabian

et al (1992), cấu trúc dạng xoắn α chiếm 17%, dạng dải β chiếm 28%, dạng vòng chiếm 21% và các cấu trúc ngẫu nhiên khoảng 34%

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử streptokinase

A: Cấu trúc 3D (SK (vàng + xanh) liên kết với plasmin (tím))[38];

B: Cấu trúc tinh thể vùng beta của SK [39]

Vùng bảo thủ cao α và γ (có độ tương đồng đến trên 85%) chiếm hầu hết các vị trí tiếp xúc với plasmin và có tác động hiệp lực trong hoạt hóa plasminogen

Vùng alpha nằm ở đầu N của phân tử streptokinase, chứa 1vòng di động duy nhất

do các gốc 45-70 tạo thành Vòng di động này được cho là không xuất hiện ở vùng tương ứng của các chất hoạt hóa plasminogen khác Vòng này có tác dụng nhận biết plasminogen, không có chức năng hình thành trung tâm hoạt động trong phức hợp chất hoạt hóa-cơ chất Song việc gắn kết này lại gây ra sự biến đổi của trung tâm hoạt động trong plasminogen [40]

Vùng β không tiếp xúc trực tiếp với vị trí hoạt động của plasmin, song nó lại cần thiết để hỗ trợ cắt ngắn phân tử plasminogen thông qua vòng hình kẹp tóc lộ trên bề mặt (vòng 250) được tạo giữa các gốc 251 và 262 (hình 1.1B) [39] Trong khi đó, vùng giữa amino acid 144 và 218 tạo thành vòng thứ hai (vòng 170) lại thể hiện sự không đồng nhất trong trình tự Nghiên cứu của Sergio và Kenneth (2005) chỉ ra rằng các chuỗi bên của các amino acid không bảo thủ nằm trong vòng 170 được định vị trên bề mặt, nằm cách xa nửa tiếp xúc với plasmin của SK, không có ảnh hưởng đến hoạt hóa plasminogen Điều này cho thấy rằng tính đa hình của SK không liên quan trực tiếp đến liên kết và hoạt hóa plasminogen, song thay vào đó, có thể quyết định đặc điểm sinh học liên quan đến bệnh lý của chủng vi sinh vật [39] Có thể khẳng định rằng, vùng cấu trúc β của phân tử streptokinase (SK) rất cần thiết cho việc hoạt hóa plasminogen và là một vùng có trình tự đa dạng liên quan đến sự viêm nhiễm và bệnh

11

tật của các chủng Streptococcus nhóm A Quá trình sinh đột biến của vùng đa hình này

không làm biến đổi khả năng hoạt hóa plasminogen của protein này mà có thể coi như

biến đổi chức năng đối với bệnh do Streptococcus gây nên [41]

Streptokinase có khả năng liên kết và hoạt hóa plasminogne người và có thể đóng

vai trò quan trọng trong độc tính của Streptococcus do tạo ra hoạt tính phân giải

protein trên bề mặt tế bào vi khuẩn và làm cho việc xâm nhập các tổ chức của vật chủ được dễ dàng hơn [37]

Từ những năm 1933, Tillet và Garner đã khám phá khả năng phân hủy huyết khối của SK và cho rằng nó có hoạt tính enzyme trực tiếp đối với fibrin và gọi là fibrinolysin [42] Song cho đến năm 1941, Milestone đã chứng minh được tác động gián tiếp của SK đối với fibrin thông qua việc hoạt hóa plasminogen - một chất ức chế quá trình đông máu [43] Năm 1945, Christensen sau khi nghiên cứu SK từ các dịch

chiết vi khuẩn Streptococcus đã chính thức đặt tên cho nó như được gọi ngày nay [44]

Cơ chế hoạt hóa và ức chế plasminogen trong quá trình phân hủy fibrin được mô

tả trong hình 1.2 [45, 46] Theo đó, các chất hoạt hóa (CHH) kết hợp với plasminogen tại vị trí liên kết tạo thành phức hợp plasminogen-CHH tạo thuận lợi cho phức hợp này sau đó liên kết với fibrin để phân hủy nó Ngược lại, các chất ức chế kết hợp với plasminogen tại vị trí liên kết chất ức chế để tạo thành phức hợp plasminogen-chất ức chế Phức hợp này không có khả năng liên kết với fibrin do vị trí liên kết đã bị chiếm mất, do vậy không thể phân hủy fibrin

Hình 1.2 Sự hoạt hóa và ức chế quá trình tan huyết

Streptokinase hoạt hóa plasminogen theo con đường gián tiếp như một chất hoạt hóa Ban đầu, SK liên kết với plasminogen theo tỷ lệ 1:1, tạo thành phức hợp đẳng phân tử ái lực cao (high-affinity equimolar complex) hay còn được gọi là phức hợp chất hoạt hóa [47] Do sự liên kết này, phức hợp tạo thành bị biến dạng và trở thành một enzyme với trung tâm hoạt động nằm trên nửa plasminogen Enzyme này sau đó

có khả năng cắt các liên kết peptide L-arginyl-L-valyl trên các phân tử plasminogen

Vùng liên kết

lysine

Phân hủy

Không phân hủy

Hoạt hóa

Vùng enzyme tiềm năng Aminocaproic acid

12

khác (giữa gốc 560 và 561) để tạo ra plasmin, một enzyme thuộc họ serine protease Các enzyme đã được hoạt hóa này tiếp đến có khả năng phân hủy fibrin thành các sản phẩm thoái hóa dạng hòa tan [47-50]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới

SK được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh nghẽn mạch Tuy nhiên SK được tách chiết từ những chủng tự nhiên gây bệnh cho con người và năng suất thấp là những

lý do chính để tiến hành nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp Có 3 loài được sử dụng

phổ biến trong việc nhân dòng và biểu hiện gene là Streptococcus pyogenes,

S equisimilis và S uberis Hiện có 142 trình tự gene mã hóa SK (sk) được đăng ký

trong GenBank, trong đó có 115 gene từ các chủng Streptococcus pyogenes, 23 gene

từ các chủng S equisimilis và 4 gene mã hóa SK từ các chủng S uberis

Nhân dòng và biểu hiện trong E coli

Năm 1984, Malke et al đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng

S equisimilis H46A, biểu hiện trong E coli và S sanguis thu được SK có đặc tính sinh

học như chủng tự nhiên Để biểu hiện trong E coli, tác giả đã sử dụng vector

pACYC184 và pBR322 Kết quả nghiên cứu cho thấy SK có mặt cả ngoại bào 17%, nội bào 52% và thể vùi 30% với hoạt tính thu được dao động từ 8 đến 100 U/ml dịch nổi môi trường

Năm 1989, Walter et al đã nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng S pyogenes type

1 và được Estrada et al (1992) biểu hiện trong E coli W3110 cho SK có hoạt tính như

SK tự nhiên Hiệu suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số [51]

Ko et al (1995) đã nhân dòng sk từ chủng S equisimilis và biểu hiện trong

E coli Họ đã thay thế trình tự peptide tín hiệu của SK bằng peptide tín hiệu ompA, sử

dụng vector biểu hiện pKK223-3 dưới sự kiểm soát của tac promoter làm vector biểu

hiện trong E coli JM109 Chủng tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong môi trường LB

thông thường ở 30°C Hoạt tính của dịch nuôi cấy đạt 5.000 U/ml sau 12 giờ cảm ứng bằng IPTG, trong đó, 95% SK biểu hiện được tiết ra ngoại bào và thể nội màng Đặc biệt, hoạt tính SK trong dịch nổi môi trường tăng mạnh sau 4 giờ cảm ứng và đạt cực

đại sau 10 giờ cảm ứng [52] Cũng vào năm này, Kubo et al đã nghiên cứu hoạt hóa

SK tái tổ hợp từ E coli Các tác giả đã xử lý bằng nhiệt độ để tái cuộn xoắn cấu trúc

cho SK bị biến tính do tác dụng của guanidine hydrochloride Hoạt hóa ở 50°C tỏ ra hiệu quả hơn so với hoạt hóa thông thường ở 25°C, tăng 10% hoạt tính enzyme và 25% hoạt tính riêng Các tác giả cũng nhận thấy rằng, hoạt tính enzyme tăng lên cùng với độ pha loãng dịch hồi tính [53]

13

Avilan et al (1997) đã nhân dòng gene sk từ chủng S equisimilis và biểu hiện trong

E coli JM105 Thu được SK tương ứng với SK tự nhiên Ba sản phẩm SK thu được là

các protein với khối lượng phân tử là 47,5; 45 và 33 kDa [54]

Johnsen et al (1999) nhân dòng SK từ chủng S uberis NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy SK của chủng này tương đồng khoảng 26% với SK của S pyogenes và S

equisimilis [55] Protein suy diễn có 286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25

amino acid So sánh trình tự amino acid với các SK từ S pyogenes và S equisimilis cho thấy SK từ S uberis thiếu các amino acid đầu C

Năm 1999, Caballero et al sử dụng vector pQE30 (Qiagen) để biểu hiện SK trong

E coli cho protein có hoạt tính tương đương với protein tự nhiên [56] Cũng trong thời

gian này, Pupo et al (1999) đã biểu hiện nội bào đối với gene sk từ S equisimilis sử

dụng vector biểu hiện pTrp tương tự như của Estrada Hiệu suất biểu hiện đạt 15% protein tổng số [57] Tuy hiệu suất biểu hiện thấp hơn so với Estrada (25% protein tổng số), song SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn

Để nghiên cứu sự khác biệt giữa các SK của S equisimilis được phân lập từ ngựa, lợn và người, Caballero et al (1999) đã nhân dòng và biểu hiện sk của các chủng vi khuẩn này trong E coli với vector pQE30 Kết quả cho thấy SK nguồn gốc từ ngựa

tương đồng ít với các SK từ lợn và người Trong khi đó, SK từ lợn được cho là có một phần cấu trúc và chức năng tương tự như của người [56] Họ cũng khám phá rằng tuy

có sự khác biệt như vậy, nhưng các SK này cùng có một cách thức tương tác với plasminogen như nhau và các plasminogen của người, ngựa, lợn đều bị cắt cùng tại một vị trí bảo thủ cao

Năm 2007, Reza et al đã sử dụng vector pGEX-4T-2 để biểu hiện SK trong

E coli với mức biểu hiện 50% protein tổng số Đây là vector sử dụng tac promoter và

mang gene mã hóa glutatione S transferase (GST) GST kết hợp với SK được cho là

làm tăng độ bền của SK Nhóm nghiên cứu đã biểu hiện trong 3 dòng tế bào E coli BL21 là E coli BL21 (DE3); E coli BL21 (DE3) plysS và E coli BL21 (DE3) CodonPlus Các dòng tế bào E coli BL21 này thiếu hụt các sản phẩm gene protease

trong bào tương như Lon, OmpT, DegP và HtpR với mục đích tạo năng suất biểu hiện

cao cho protein hội nhập Kết quả nghiên cứu cho thấy tế bào E coli BL21 (DE3)

plysS cho năng suất cao nhất tới 15000 U/ml dịch nuôi cấy [58]

Để nâng cao năng suất biểu hiện của chủng E coli tái tổ hợp, nhiều tác giả đã cải tiến điều kiện nuôi cấy Năm 1999, Zhang et al sử dụng nuôi lắc bổ sung dưỡng chất

để tăng năng suất biểu hiện SK trong E coli Năng suất biểu hiện đạt

14

12,9 g cho 20 lít dịch nuôi cấy (0,65 g/L) Mới đây, Goyal et al (2009) đã nghiên cứu

phương pháp nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất kết hợp với tối ưu các điều kiện nuôi cấy

để biểu hiện cao sản SK tái tổ hợp trong E coli [59] Các tác giả đã khảo sát nồng độ

oxy hòa tan, nguồn nitơ và pH môi trường đến sinh trưởng tế bào và biểu hiện nội bào

của SK trong E coli BL21 (DE3) Tăng nồng độ oxy hòa tan từ 30% lên 50% không

thấy có ảnh hưởng đáng kể tới nuôi lắc, song đối với nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất thì năng suất biểu hiện tăng vượt bậc, từ 188 mg/L lên 720 mg/L Việc bổ sung cao nấm men và tryptone vào môi trường nuôi cấy, đồng thời kiểm soát pH môi trường bằng NaOH cũng làm tăng đáng kể năng suất biểu hiện (gấp tới 2 lần) Tổng hợp các điều kiện nuôi cấy, năng suất biểu hiện đạt 1120 mg SK/L dịch nuôi cấy, tăng gấp 14 lần so với ban đầu Đây là số liệu cao nhất được báo cáo đến thời điểm hiện nay

Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris

Năm 1989, Hagenson et al đã biểu hiện sk trong nấm men, sử dụng promoter của alcohol oxidase từ P pastoris, cảm ứng bằng methanol Gene sk được hội nhập vào

genome của nấm men và nuôi biểu hiện cho năng suất 77 mg protein/L và hoạt tính

SK đạt 3000 U/ml [60]

Năm 2000, Pratap et al đã nhân dòng sk từ S equisimilis và biểu hiện trong Pichia

pastoris Họ đã sử dụng peptide tín hiệu của yếu tố α và oxidase promoter của chính

P pastoris để kiểm soát biểu hiện của cấu trúc hội nhập Các tác giả đã thu được SK

với khối lượng phân tử 55 kDa lớn hơn SK gốc chỉ 47 kDa song có hoạt tính tương đương với SK tự nhiên Thông thường, SK dễ dàng bị phân hủy trong môi trường sinh tổng hợp dưới tác dụng của các protease do trạng thái không gấp khúc của phân tử Pratap et al đã sử dụng phương pháp lai Western để nhận diện SK Kết quả cho thấy

SK có kích thước 55 kDa do bị glycosyl hóa trong tế bào chủ SK thu được có có ưu điểm là tăng độ bền nhiệt ở 25°C và 37°C và tăng độ bền từ 30-40% so với các dạng không bị glycosyl hóa trước tác động của các protease trong môi trường Hoạt tính SK đạt 3200 U/ml dịch nuôi cấy [61]

Năm 2009, Vellanki et al đã biểu hiện sk trong P pastoris Gene sk được nối ghép xuôi chiều với promoter của glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase và được đưa

vàp P pastoris Chủng tái tổ hợp được biểu hiện cho hoạt tính 1120 U/ml Các nguồn

nitơ, nguồn carbon được khảo sát sử dụng thiết kế thống kê Plackett–Burman cho thấy dextrose và peptone là nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp với chủng

P pastoris Các điều kiện tối ưu được dự đoán là 2,9% dextrose; 2,49% peptone;

15

pH 7,2; nhiệt độ 30,4°C và năng suất đạt 2136 U/ml Tuy nhiên các nghiên cứu thực tế

cho năng suất đạt 2089 U/ml, tăng 95% so với năng suất ban đầu [62]

Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus

Năm 1986, Klessen et al lại tiếp tục biểu hiện gene sk trong Bacillus subtilis, tuy

nhiên hoạt tính SK lại bị giảm ở cuối pha sinh trưởng do các protease của chính

B subtilis tiết ra làm bất hoạt [63]

Năm 1994, Wong et al đã sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biểu hiện trong chủng B subtilis WB600 là chủng đã đột biến mất 6 protease ngoại bào Các nhà

nghiên cứu thấy rằng trong quá trình tiết SK ra môi trường, 10-20% SK bị thoái hóa từ dạng 47 kDa thành dạng 44 kDa Dạng SK này có trình tự đầu N như nhau, song bị cắt ngắn 31 hoặc 32 gốc amino acid đầu C Điều này làm giảm hoạt tính sinh học của protein Nguyên nhân của sự thoái hóa được cho là do một số gốc amino acid kỵ nước trong phân tử SK là đích của chymotrypsin-một protease được tế bào tiết ra Để giải quyết vấn đề này, nhóm nghiên cứu đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamine tại

vị trí 29 được thay bằng lysine Kết quả thu được SK có hoạt tính tăng 2,5 lần [64]

Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác

Năm 1985, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng ery, chlo, tet) để biểu hiện

SK vào S sanguis (nhóm H) thu được protein có tính chất sinh học như SK tự nhiên

Tuy nhiên, khối lượng phân tử của protein thu được chỉ là 42 kDa, thấp hơn so với

SK tự nhiên có thể là kết quả của quá trình hậu dịch mã [65]

Năm 2004, Kumar và Singh đã sử dụng một dạng nấm men Sz Pombe bị đột biến

mất hoạt tính protese ngoại bào, một loài có nhiều tính chất như các tế bào nhân chuẩn bậc cao để biểu hiện SK Họ đã sử dụng promoter điều hòa bằng thiamine và peptide tín hiệu Plus pheromone của tế bào chủ Kết quả thu được SK hầu như không bị biến đổi và được tiết ngoại bào với hiệu suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy Hiệu suất biểu hiện đạt 24,5 mg/L và hoạt tính riêng là 1581 U/mg protein có thể so sánh

được với biểu hiện trong E coli và P pastoris [66]

Năm 2006, Sriraman et al đã sử dụng chủng Lactococcus lactis để biểu hiện gene

sk với promoter P170 SK thu được bị thủy phân do tác động của môi trường nuôi cấy,

vì vậy hiệu suất biểu hiện thấp Tác giả nhận thấy dưới điều kiện nuôi cấy ở pH thấp, trong môi trường có glucose, lactic acid sẽ tích tụ và làm gây đáp ứng kháng acid cho

tế bào Điều này ảnh hưởng tới khả năng sản xuất streptokinase tái tổ hợp Khi cải tiến điều kiện nuôi cấy, tăng pH và nồng độ phosphate ban đầu, hiệu suất sinh SK tăng 2,5 lần [67]

16

Năm 2007, Pimienta et al đã biểu hiện SK của chủng S equisimilis ATCC9542 trong Streptomyces lividans rất thành công SK thu được với hiệu suất cao và hoạt tính

tốt Các tác giả đã gắn gene sk với peptid tín hiệu của chất ức chế subtilisin từ chủng

Streptomyces venezuelae CBS762.70 (vsi) và peptide tín hiệu của xylanase C từ chủng Streptomyces lividans (xlnC) Kết quả là hiệu suất biểu hiện ở S lividans cao hơn khi

sử dụng peptide tín hiệu của vsi và đạt 15 mg SK/L dịch nuôi cấy Nhóm nghiên cứu

đã sử dụng sắc ký lỏng DEAE-sephacel để tinh sạch dịch nổi nuôi cấy, thu được hai dạng SK trưởng thành với kích thước là 44 kDa và 47 kDa có trình tự đầu N tương tự nhau Hoạt tính riêng của protein tinh sạch đạt 2661 U/mg protein [68]

Trong nước chưa có một công bố nào về nghiên cứu các chủng sinh tổng hợp streptokinase, mặc dù thế giới đã phát triển thành thuốc từ khoảng hai chục năm trở lại đây Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về SK tái tổ hợp ở Việt Nam

Trước đây, đã có một số đề tài nghiên cứu trong nước về việc đánh giá hiệu quả sử dụng thuốc SK để điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát

triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng dụng điều trị

bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng” (Sở

khoa học và Công nghệ Hải Phòng)

Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung (2003) đã nghiên cứu cách điều trị huyết khối trong tai biến mạch máu não Trong nghiên cứu này, các tác giả đã đưa ra công thức và phác đồ điều trị huyết khối Các thuốc làm phân hủy huyết khối đã được thành lập trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số tác động qua cơ chế kích hoạt plasmin và chính plasmin sẽ làm phân giải huyết khối Các thuốc ly giải huyết khối gồm streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA [69]

Năm 2004, Trần Minh Tâm et al đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Điều trị tiêu sợi

huyết bằng streptokinase trong nhồi máu cơ tim cấp” Tác giả đã nêu một số nhận xét

bước đầu về việc sử dụng thuốc streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị nhồi máu cơ tim ở BV đa khoa tỉnh Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 [70] Tiêu sợi huyết bằng streptokinase trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành công là 63% Theo dõi trong 30 ngày, bệnh nhân phục hồi tốt, ít bị biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận được

Các nghiên cứu khác liên quan tới các enzyme tương tự như tPA, nattokinase, urokinase, lumbrokinase cũng rất hạn chế Đa số là các nghiên cứu sử dụng các

17

enzyme này như thế nào trong điều trị bệnh nhồi máu như “Áp dụng thuốc rTPA trị

liệu bốn trường hợp thiếu máu não cấp tại bệnh viện Nhân dân Gia Định” của Phan

Công Tân, Nguyễn Cảnh Nam và Nguyễn Văn Mừng

Lê Thị Thu Hiền et al (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ bản (mã số 614206, Số:

1851/QĐ-BKHCN) “Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue plasminogen

activator, TPA) tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y-dược” trong thời gian 2006-2008

Đây là nhóm đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về sản xuất tPA

Nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Ngọc Dao (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm tương tự như Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có tên khoc

học Lumbricus rubellus) từ giun quế Việt Nam (tên khoa học Perionyx escavatus) có

tác dụng làm tan cục máu đông trong nghẽn mạch [71-73] Sau khi thử nghiệm trên động vật, chế phẩm đã được thử nghiệm trên 30 bệnh nhân tình nguyện tại Hà Nội bị tai biến mạch máu do viêm tắc động mạch đã cho kết quả tốt Nhóm nghiên cứu đã phát hiện loại giun quế nói trên tại Trung tâm dê thỏ Ba Vì (Hà Nội), có đặc điểm gần

giống loài giun mà Trung Quốc (Eisenia fetida), Nhật Bản (L rubellus), Hàn Quốc (L

rubellus) đang dùng để sản xuất Lumbrokinase Loài giun này được trung tâm nuôi

dùng làm thức ăn cung cấp đạm cho động vật Các nhà khoa học đã loại bỏ đất, cát, tạp chất ở giun rồi sau đó đưa vào sấy khô giun ở nhiệt độ thấp để không làm biến mất enzyme cần thiết Sau đó, giun được nghiền thành bột rồi pha chế với một số phụ gia

để cho thành phẩm dưới dạng bột [74]

Thời gian qua, nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Ngọc Dao cũng đang nghiên cứu tạo enzyme này bằng công nghệ tái tổ hợp gene để thu được enzyme tinh khiết hơn, thuận lợi cho việc làm thuốc chữa bệnh

Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã nhân dòng thành công gene mã hóa subtilisin

từ hai chủng Bacillus subtilis có độ tương đồng 99% với trình tự amino acid của một

enzyme khác đã được làm thuốc chống tắc nghẽn mạch máu là Nattokinase Trình tự

gene mã hóa subtilisin của hai chủng Bacillus subtilis phân lập ở Việt Nam đã được

đăng ký trên GenBank với mã số EF061457 và EF061456 lần lượt cho chủng G1 và

DR23 [75] Gene mã hóa subtilisin đã được biểu hiện thành công trong Bacillus

subtilis WB800 với một hệ promoter mạnh (chủng đã được chấp nhận đơn đăng ký

bản quyền tại Cục sở hữu trí tuệ với mã số đơn 1-2009-00749 SC)

1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hiện tPA

18

Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh của plasminogen trong máu Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu [76] Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [77] Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen

Ở người, gene mã hóa h-tPA là một gene đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 [78] Ở chuột, gene này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị trí 24p22 Cấu trúc và chức năng của gene mã hóa h-tPA được xác định bằng kết hợp

nhân bản in vitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập được các

dòng từ thư viện gene người Những dòng này được xác định bằng bản đồ enzyme hạn

chế, lai Southern và giải trình tự DNA [79, 80] Gene tPA dài 36.594 bp, bao gồm

32.720 bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenylate, có thêm 353 và 344 bp của hai đầu 5’ và 3’, 13 intron xen giữa 14 exon, kích thước trung bình của các exon là 914

bp, trong khi của intron từ 111 đến 14.257 bp [78, 81, 82]

Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc hai chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (chuỗi A, 39 kDa) được xác định ở đầu amino, còn chuỗi nhẹ (chuỗi B, 33 kDa) ở đầu carboxyl Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng

“ngón tay” (F, vùng finger ) gồm 47 aa ở vị trí 4-50, người ta cũng thấy cấu trúc tương

tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal growth factor region, EGF) ở vị trí 51-87; vùng thứ ba bao gồm hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1, kringle one region) ở vị trí 88-176, vùng kringle 2 (K2, kingle two region) ở vị trí 177-

262 Các cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase

và nhân tố XII [78, 80, 83, 84] Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm hoạt động (gồm 5 exon + 4 intron), vùng serine protease (P, serine protease domain) ở vị trí 267-527 và tương đồng với chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [84, 85]

19

Hình 1.3 Các vùng cấu trúc của tPA Hình 1.4 Cấu trúc h-tPA (Ny et al., 1984)

Các vùng này có thể nằm kế tiếp nhau hoặc được ngăn cách với nhau bởi các vùng nối ngắn Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả phân

tử Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu Hoạt tính này thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu tơ máu Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây

là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain Vùng kringle trong protease serine rất quan trọng trong mối tương tác protein - protein trong quá trình hoạt hóa plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin -thrombin Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa h-tPA và tơ máu [86] Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle 1

và kringle 2 có tính tương đồng cao Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [81]

Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn glycoprotein

có 530 aa, 32 aa trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg275 - Ile276 thành hai sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [78, 84, 87, 88]

Trong tự nhiên, h-tPA tồn tại ở dạng sợi đơn Dạng sợi đôi đã quan sát được trong nuôi cấy tế bào ung thư tế bào hắc tố ở người Nghiên cứu cho thấy h-tPA dạng một sợi hoạt động có hiệu quả hơn dạng hai sợi Điện di SDS (sodium dodecyl sulfate) cho

20

thấy, h-tPA dạng một sợi được chuyển thành dạng hai sợi trong quá trình phân giải

huyết khối [84] Theo Berg et al (1993), khi bị glycosyl hóa ở vị trí Asn184 sẽ gây ức

chế trung gian đối với plasmin để chuyển h-tPA từ phân tử dạng sợi đơn sang dạng sợi đôi, và khi glycosyl hóa ở vị trí Asn117 và Asn448 sẽ làm giảm kích thích hoạt hóa của h-tPA kết hợp với tơ máu và hoạt động phân giải huyết khối [89]

Hệ thống phân hủy fibrin là một hệ enzyme nội sinh hòa tan huyết khối trong mạch máu bằng plasmin, một enzyme không đặc hiệu, làm tiêu fibrin cũng như một số yếu tố đông máu Hoạt tính phân hủy fibrin được duy trì bình thường trong cân bằng nội môi bởi một số chất ức chế tuần hoàn Sử dụng thuốc tan huyết khối ngoại sinh làm hoạt hóa hệ thống tiêu fibrin bình thường qua nhiều con đường khác nhau, tất cả những con đường cuối cùng dẫn tới việc biến plasminogen thành plasmin, gây hủy huyết khối (Michael)

Plasmin được gan tạo ra dưới dạng không hoạt động là plasminogen Mặc dù plasminogen không thể phân cắt fibrin nhưng vẫn có một ái lực đối với fibrin và được kết hợp chặt chẽ vào huyết khối khi nó được hình thành trong máu Chất hoạt hóa plasminogen mô tPA chuyển plasminogen thành plasmin Chất này sau đó có tác dụng làm thủy phân fibrin Plasminogen được phóng thích vào máu bởi các tế bào nội mạc khỏe mạnh ngay cạnh nơi hình thành huyết khối, tPA hoạt hóa plasminogen thành plasmin để bắt đầu sự thủy phân fibrin Các chất hoạt hóa (activator) kết hợp với plasminogen tại vị trí liên kết tạo thành phức hợp plasmin-activator tạo thuận lợi cho phức hợp này sau đó liên kết với fibrin để phân hủy nó Ngược lại, các ức chế kết hợp với plasminogen tại vị trí liên kết với chất ức chế (inhibitor) tạo thành phức hợp Plasminogen-inhibitor Phức hợp này không có khả năng liên kết với fibrin do chất ức chế đã chiếm mất một trong các vị trí liên kết với fibrin

Hình 1.5 Quá trình phân hủy huyết khối Hình 1.6 Con đường phân giải huyết khối

(fibrin)

21

Plasmin tự do trong máu bị ức chế mạnh bởi α2-antiplasmin Plasminogen liên kết với cả fibrin lẫn fibrinogen nên nó cũng kết hợp trong huyết khối tPA và urokinase là các serine protease có khả năng chuyển plasminogen thành plasmin tPA bất hoạt được giải phóng khỏi các tế bào nội mạc của mạch máu khi bị thương, liên kết với fibrin và

bị hoạt hoá Trong khi đó, urokinase được các tế bào biểu mô trong các niệu quản sinh

ra dưới dạng tiền enzyme (prourokinase) Vai trò của urokinase là kích hoạt làm tan các cục fibrin có thể bị lắng trong lòng ống tPA hoạt động cắt plasminogen thành plasmin, chất này có khả năng phá hủy sợi fibrin thành các sản phẩm thoái hóa dạng hoà tan mà cả plasmin lẫn plasminogen đều không thể liên kết với chúng được

Plasmin phân cắt fibrin tạo ra các thành phần hoà tan trong máu Các phần này được gọi là sản phân phân hủy fibrin (fibrin degradation products, FDP) FDP còn có tác dụng cạnh tranh với thrombin, và vì vậy sẽ làm chậm sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin (làm chậm sự tạo thành huyết khối)

Bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator inhibitors, PAI) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm chậm quá trình phân giải tơ máu PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu cầu Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối Một vài α2-antiplasmin thường liên kết với nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu Cả tPA và uPA đều nhanh chóng được phân hủy bởi thận, một bộ phận của ngăn ngừa phân hủy huyết khối quá mức

Chất hoạt hóa plasminogen mô người đã được thương mại hóa với tên gọi Alteplase do Genentech sản xuất Đây là thuốc làm tan huyết khối đặc hiệu (nghĩa là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ máu) Dược phẩm này đã được

Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, FDA) công nhận như là một dạng thuốc chữa bệnh đột quỵ vào 1996 Về phương diện lâm sàng, h-tPA được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu và được lựa chọn để điều trị nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi, đột quỵ, tắc động mạch ngoại biên và các bệnh khác liên quan đến tan huyết khối Trong những năm từ cuối 1990 đến đầu những năm

2000, tỷ lệ bệnh nhân bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA chỉ chiếm 2% Khoảng 9

Những nỗ lực xây dựng quy trình đơn giản tạo h-tPA tái tổ hợp hiệu quả với giá

thành hạ từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E coli, rất được

quan tâm nghiên cứu Gene mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi

khuẩn E coli từ những năm 1983 [80] Trong nghiên cứu của Pennica et al (1983)

lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50-80 µg/L dịch nuôi, tương đương với

1500-2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/tế bào Gần đây, Zhu et al (2001) đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong E coli với hàm lượng chiếm 30% tổng số protein của vi

khuẩn [90]

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu gene/protein có giá trị sử dụng trong y dược, tiến tới biểu hiện sản xuất protein tái tổ hợp là rất cần thiết và mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gene từ các nguồn sinh vật khác nhau, trong đó có cả gene người để nghiên cứu ứng dụng sản xuất dược phẩm CNSH Trong đó, Viện CNSH đã thành công trong nghiên cứu tổng hợp Trihobakin, protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư cũng như thành công trong việc tinh chế protein bất hoạt ribosome (RIP) phân lập từ cây mướp đắng [91, 92] Cũng tại Viện CNSH, gene mã hóa interleukin-2 của người, tác nhân điều biến miễn dịch, được

sử dụng trong điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng đã được tách dòng

và biểu hiện [93, 94]; interleukin-2 của người rh-LL2MM bị đột biến cũng được biểu hiện thành công [95] Ngoài ra, các nhà khoa học tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM cũng đã triểu khai tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin của người ở

E coli [96] Bên cạnh đó, các nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp cũng được quan tâm

nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất h-tPA tái tổ hợp ở nước ta, vì vậy đề tài này sẽ làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất chất hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp

1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài

23

Trên cơ sở thu thập, phân tích và đánh giá các kết quả đã làm được của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, cũng như nhu cầu thực tiễn, đề tài đã được tiến hành với mục tiêu chính như sau:

- Tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp SK với năng suất cao và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất SK sạch đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam;

- Tạo dòng tế bào sinh tổng hợp tPA cao và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tPA sạch đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam

24

2 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu và hóa chất

Các chủng liên cầu khuẩn

Các chủng vi khuẩn gây tan huyết được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người tại Bệnh viện Quân đội 103 và Bệnh viện Việt Nam – Thụy Điển, Uông Bí, Quảng Ninh Các chủng từ động vật, từ sữa bò tại các trại chăn nuôi Đông Anh và Cầu Diễn

do Cục Thú y Hà Nội cung cấp Chủng Streptococcus equisimilis được mua từ Đức

(mã số AP 010935.1)

Các chủng vi sinh vật chủ, vector nhân dòng và biểu hiện

Chủng E coli DH5α dùng để nhân dòng gene với các plasmid pTZ57R/T và pJET1.2/blunt (Fermentas) Chủng E coli BL21, BL21 (DE3) plysE (Invitrogen) và

BL21 (DE3) plysS (Promega) được sử dụng để biểu hiện với vector pET22b+ và pET12a+ (Novagen) Chủng P pastoris GS115 (Invitrogen) được sử dụng để biểu hiện với vector pPICZαA (Invitrogen) Chủng B subtilis WB800 (Đức) dùng biểu

hiện với vector pAC7

Mẫu mô và máu

Phối hợp với Học viện Quân y, 10 bà mẹ tình nguyện cho mẫu máu và mô cuống rốn Hồ sơ xét nghiệm trước sinh được dùng làm cơ sở để chọn ra các bà mẹ khỏe mạnh, không có tiền sử bệnh tật làm đối tượng thu mẫu Các mẫu được thu mỗi khi bà

mẹ nhập viện sinh con Năm bà mẹ tình nguyện trong 10 trường hợp được lựa chọn cho mẫu máu (5 ml) và mô cuống rốn (2-3 g) bao gồm Nguyễn Thị Thu H, Trần Thu

Th, Nguyễn Thúy N, Nguyễn Hồng V và Lê Thu H Mẫu máu được chia vào các ống chứa chất chống đông, giữ ở -20°C Mẫu mô được cắt nhỏ và chia vào các ống 1,5 ml

và giữ trong nitơ lỏng Các mẫu trên được sử dụng làm nguồn nguyên liệu để tách RNA tổng số và phân lập gene mã hóa tPA

Các dòng tế bào động vật chủ, vector biểu hiện

Để biểu hiện tPA tái tổ hợp, dòng tế bào CHO-S (tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc, chinese hamster ovary, CHO, Invitrogen) được chọn, có nguồn gốc từ dòng CHO-K1, được chọn lọc theo hướng thích nghi linh hoạt trong các điều kiện nuôi khác nhau Ở điều kiện nuôi tĩnh trong môi trường bổ sung huyết thanh, tế bào CHO-S sống bám lớp mỏng trên bề mặt đĩa hoặc bình nuôi Khi chuyển sang điều

25

kiện nuôi lắc trong môi trường không có huyết thanh, tế bào sống ở dạng huyền phù Đây là một ưu thế quan trọng trong nghiên cứu sản xuất các protein tái tổ hợp do nó mang lại hiệu quả biểu hiện cao và giảm được chi phí cho môi trường nuôi cấy [97] Vector biểu hiện ở tế bào động vật được sử dụng gồm pcDNA3, pEGFP-C2, pSVL và biểu hiện pGEX6p1 được mua từ Amersham Biosciences

Amersham; Promoter SV40; Kháng sinh VK: Ampicilin; Kháng sinh TBDV: không có; Protein dung hợp: không có

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Cơ chất N (p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt (AAS), tPA chuẩn, plasminogen và streptokinase chuẩn từ Sigma; plasminogen human từ Merck Các hóa chất khác như bacto peptone, cao nấm men, sorbitol, glucose, glycerol, Triton X-100 đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp bởi các hãng tin cậy

Các bộ mồi dùng cho nhân dòng và biểu hiện (Invitrogen) được thống kê ở bảng

2.1 Cặp mồi khuếch đại gene sk từ chủng S pyogenes được thiết kế dựa trên các trình

tự gene sk đăng ký trong GenBank (A04926, A20006, AF104300, AF104301,

AM903378, AY234139, AY234140, AY234141, AY368335, CP000003, CP000017, CP000259, CP000260, E00522, NC006080, S46536, Z48617)

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi dùng trong nhân dòng và biểu hiện sk

26

Biểu hiện đoạn gene

msk có đuôi 6xhis với

Biểu hiện gene sk với

pPICZαA acoAF GCGAATTCTCAGTCAAACGATGCAG

acoAR AGCGCTCGCAGCCGCCGGTCCTGC

Promoter acoA và signal peptide amyE (acoE)

acoE-SKF GACCGGCGGCTGCGAGTGCTaaaaattacttatcttttgg

T7R GCGGATCCCAA AAA ACCCCTCAA GA

Cassette SK-terminater T7 (skT7)

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi dùng trong nhân dòng và biểu hiện tPA

GSTR CGGCCGCTCGAGTCGACCCG

Khuếch đại đoạn

gst từ pGEX6p1

Khuếch đại gene tPA full

Thiết bị

Máy quang phổ UV2500 (Labomed, Mỹ), máy đo pH (Metrohm, Thụy Sỹ), bộ xung điện (Biorad, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt ProvocellTM (Esco, Mỹ), máy li tâm lạnh nhỏ (Hettich, Đức), máy PCR (Eppendorf, Đức), hệ thống chụp ảnh gel-doc (Pharmacia, Mỹ), máy phân tích khối phổ Applied Biosystems QSTAR XL (Applied Biosystems, Canada), cùng một số thiết bị khác thuộc Phòng CNSH Enzyme, Phòng ADN Ứng dụng và Phòng TNTĐ Công nghệ gene, Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam

27

Môi trường LB gồm 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men, 1% (w/v) NaCl,

pH 7,5 Môi trường rắn được bổ sung 2% (w/v) agar Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid được bổ sung 100 µg/ml ampicillin, hoặc 10 µg/ml kanamycin

Môi trường SOC gồm 0,5% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) peptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4, 20 mM glucose

Môi trường YPG gồm 1% (w/v) cao nấm men, 4% (w/v) peptone, 2% glucose Môi trường rắn được bổ sung 2% (w/v) agar Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid có bổ sung 100 µg/ml zeocin Môi trường YPGS được bổ sung 1 M sorbitol Môi trường SPII: 10 ml T-base (gồm 2 g (NH4)2SO4, 18,3 g K2HPO4.3H2O, 6 g

KH2PO4, Na3-citrate), 200 µl 25% glucose, 100 µl 10% casamino acid, 100 µl 10% yeast extract, 35 µl 1 M MgCl2, 50 µl 0,1 M CaCl2

10x Bloting buffer 30 g Tris-base; 144,13 g glycin; bổ sung nước cho đủ 1 lít

1x Bloting + methanol 100 ml 10x Bloting buffer; 200 ml methanol; 700 ml nước đề ion

Dung dịch sữa gầy 5% sữa gầy pha trong 1x TBS

Dung dịch hiện màu 15 mg chất hiện màu hòa tan trong 5 ml methanol lạnh, sau đó

trộn với hỗn hợp gồm 25 ml 1x TBS và 15 µl H 2 O 2

Dung dịch 3 0,02% Na 2 S 2 O 3

Dung dịch 5 2% Na 2 CO 3 + 50 µl fomandehyde

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue, 30% (v/v) methanol, 10%

(v/v) acid acetic Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch nhuộm DNA 0,1 µg/ml ethidium bromide

Đệm 10x TBE 20 mM EDTA, 900 mM Tris-borate, pH 8

28

Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue, 0,09% xylene xyanol (FF), 60%

glycerol Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue, 50% glycerol pha trong đệm 1 M

Tris-HCl, pH 6,8 Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCL, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,8

Dung dịch A 30% acrylamide, 0,8% bis-acrylamide

tính

250 mM imidazole, đệm 1x tinh sạch không biến tính, pH 8

Đệm phá mẫu 6 M guanidine HCl, 500 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate,

pH 7,8 Đệm gắn kết biến tính 8 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate, pH 7,8 Đệm rửa biến tính 8 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate, pH 6 Đệm thôi mẫu biến tính 8 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM NaH 2 PO 4 , pH 4

Dung dịch imidazole 3 M imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate, pH 6 Kháng thể 1* Kháng thể kháng streptokinase pha loãng 500 lần trong 5% sữa

gầy Kháng thể 2 IIg pha loãng 10.000 lần trong 5% sữa gầy

29

Nuôi chủng tự nhiên: Các chủng Streptococcus được nuôi cấy trong dịch canh

trường Todd-Hewitt bổ sung 0,5% cao nấm men Nuôi lắc ở 37°C với 5% CO2 Dịch

tế bào được thu sau 16 giờ nuôi cấy

Biểu hiện SK trong E coli: Một khuẩn lạc E coli BL21 tái tổ hợp được nuôi trong

3 ml LB lỏng bổ sung 100 µg/ml ampicillin ở 37°C qua đêm Tiếp giống 1% trong

30 ml LB lỏng, lắc 200 rpm trong 2 giờ; bổ sung 1 mM IPTG để cảm ứng biểu hiện gene Thu mẫu tại các thời điểm khảo sát để chạy điện di protein và xác định hoạt tính

Biểu hiện SK trong P pastoris GS115: Các dòng nấm men P pastoris GS115 sau

khi kiểm tra gene chèn được nuôi trong môi trường BMGY lắc 200 rpm qua đêm ở 30°C cho đến khi OD600nm đạt 2-6 Ly tâm 3000 rpm trong 5 phút thu tế bào Hòa tế bào trong môi trường biểu hiện BMMY để OD600nm đạt 1 Tiếp tục lắc

200 rpm ở 30°C Bổ sung methanol đạt nồng độ cuối cùng 0,5% sau mỗi 24 giờ nuôi cấy Thu mẫu tại các thời điểm khảo sát để xác định hoạt tính

Biểu hiện SK trong B subtilis WB800: một khuẩn lạc B subtilis tái tổ hợp được

nuôi trong 3 ml LB lỏng bổ sung 10 µg/ml kanamycin ở 37°C qua đêm Tiếp giống 1% vào LB, lắc 200 rpm để OD600 nm đạt 3; bổ sung 0,5% (w/v) acetoin để cảm ứng biểu hiện gene Mẫu được thu sau 48 giờ cảm ứng để xác định hoạt tính

Tinh sạch protein tái tổ hợp

Tinh sạch qua cột sắc ký ion Ni 2+: cột resin gắn nickel chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp chứa liền 6 gốc histidine Trong đó, resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, có chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+ Cột resin-nickel có ái lực cao với các protein chứa 6 gốc histidine Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và His trong phân tử protein Tinh sạch protein được thực hiện dưới các điều kiện biến tính, không biến tính và hỗn hợp (Invitrogen, 2004)

Dịch nuôi biểu hiện SK ở nấm men và Bacilus được sử dụng trực tiếp để đưa lên cột; tế bào E coli được phá bằng dung dịch guanidine hoặc đệm gắn kết chứa

lysozyme (8 ml cho 50 ml dịch nuôi cấy) Cột 2 ml resin được cân bằng với đệm gắn kết phù hợp với điều kiện tinh sạch Dịch mẫu (8 ml) được đưa lên cột, ủ với resin trong cột khoảng 45 phút, lắc đảo nhẹ nhiều lần cho gắn kết tốt Dùng đệm phù hợp với từng điều kiện tinh sạch để rửa cột 4 lần với thể tích 8 ml Thôi mẫu bằng 8-12 ml đệm thôi mẫu (pH thấp hoặc muối imidazole) phù hợp với điều kiện tinh sạch (1 ml cho mỗi phân đoạn)

30

Tinh sạch bằng phương pháp hỗn hợp: các bước đầu thực hiện như với phương pháp biến tính, bước rửa cột được thực hiện với 2 loại đệm rửa Lần đầu rửa với đệm biến tính, lần thứ 2 rửa với đệm không biến tính Tiếp theo thực hiện như đối với phương pháp không biến tính

Tinh sạch protein qua cột lọc gel Bio-gel P100: Bio-gel P100 là những hạt

polyacrylamide trong đó phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang tạo thành sàng phân tử bởi hệ thống lỗ lưới xốp Dựa vào sự khác nhau về kích thước

và phân tử lượng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách Bio-gel P100 phân tách các protein có khối lượng phân tử từ 5-100 kDa

Cột có kích thước 2,6 x 30 cm được cân bằng với đệm 50 mM phosphate pH thích hợp với mẫu Tốc độ dòng chảy trong quá trình cho mẫu lên cột và thu mẫu là

25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml

Tinh sạch protein qua cột lọc gel Sephadex G75: gel Sephadex tạo thành do mạng

lưới chuỗi dextran liên kết với nhau Sephadex G75 phân tách các phân tử protein có khối lượng trong khoảng 1-50 kDa

Cột cũng có kích thước 2,6 x 30 cm được cân bằng với đệm 50 mM phosphate

pH 7,0 Tốc độ dòng chảy trong quá trình cho mẫu lên cột và thu mẫu là 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml

Hàm lượng protein trong các mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford [98]

Định tính SK

Hoạt tính SK được định tính theo Malke et al (1984) dựa vào việc xác định vòng

sáng phân giải casein của plasminogen được hoạt hóa trên môi trường thạch đĩa [99] Đĩa thạch (10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8; 88 mg NaCl; 80 mg agarose; 1 U plasminogen người; 100 mg sữa gầy) được đục lỗ đường kính 0,5 cm, đưa 30 µl dịch mẫu vào giếng, ủ 8-12 giờ ở 37°C Xem vòng phân giải quanh giếng

Đinh lượng SK bằng phương pháp so màu

Hoạt tính SK được định lượng thông qua plasmin thủy phân cơ chất

N (p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt (AAS), và được phát hiện ở bước

sóng 405 nm dựa theo phương pháp của Castellino et al (1976) và Hernandez et al

(1990) có điều chỉnh [100, 101]

Hỗn hợp phản ứng (10 µl protein trong đệm phosphate pH 7; 10 µl 50 mM HCl (pH 7,5); 0,05 unit plasminogen người) được ủ ở 37°C trong 30 phút Phản ứng

Tris-31

màu được bắt đầu khi bổ sung 40 µl dung dịch 1 mM AAS Sau 15 phút ủ ở 37°C, dừng phản ứng bằng 10 µl 0,4 N acetic acid, đo phổ hấp phụ tại bước sóng 405 nm Hoạt tính dịch mẫu được xác định dựa trên đường nồng độ chuẩn

Xây dựng đường nồng độ SK chuẩn

SK được hòa vào đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 với các nồng độ khác nhau từ 0-10 IU Môi trường được tạo ra như trong xác định hoạt tính, sau đó đo độ hấp phụ tại bước sóng 405 nm Độ hấp phụ và nồng độ SK chuẩn được xây dựng bằng chương trình Excel [36]

Loại bỏ và kiểm tra nội độc tố vi khuẩn

Nội độc tố vi khuẩn được loại bỏ bằng cách: tế bào tươi sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi được phá bằng siêu âm trong đệm Tris-HCl pH 8 Dịch phá siêu âm được ly tâm loại bỏ cặn tế bào, dịch nổi được bổ sung 1% Triton và ủ 30 phút ở 0°C, sau đó hỗn hợp được ủ tiếp ở 10 phút ở 30°C Ly tâm hỗn hợp 10 phút với 20000 g/phút Thu dịch nổi bằng cách hút thật nhẹ nhàng, và tiếp tục bổ sung 1% Triton và lặp lại thí nghiệp 5x, thu được dịch SK

Đánh giá tồn dư của nội độc tố vi khuẩn được thực hiện như sau:

Thuốc thử LAL: cho từ từ 1,8 ml nước BET (nước cất không có nội độc tố) vào

1 lọ, xoay tròn nhẹ nhàng trong khoảng 30 giây, tránh tạo bọt

Dung dịch nội độc tố chuẩn: Cho 5 ml nước BET vào 1 lọ nội độc tố chuẩn, lắc trộn trên máy trộn ít nhất 30 phút, để tạo thành dung dịch chuẩn gốc có nồng độ

10 EU/ml Từ dung dịch gốc chuẩn, pha với nước BET để có nồng độ 0,25 EU/ml (2λ)

Dung dịch thử: Giới hạn nội độc tố qui địch (ELC): 23,33 EU/ml của dung dịch

có chứa 100.000 U/ml Độ pha loãng tối đa (MVD) = ELC/λ=23,33/ 0,125 = 186,64 lần Cân chính xác khoảng 50 mg mẫu thử hòa tan trong 5 ml nước BET để thu được dung dịch có chứa 100.000 U/ml (dung dịch A) Lấy 0,1 ml dung dịch A + 0,9 ml nước BET = 1,0 ml ) (dung dịch B) Lấy 0,2 ml dung dịch B + 3 ml nước BET = 3,2

ml ) (dung dịch C) Tương đương pha loãng 160 lần

Dung dịch nội độc tố chuẩn trong mẫu thử: dung dịch thử ở nồng độ cuối cùng (dung dịch C)

Từ dung dịch nội độc tố chuẩn gốc 10 EU/ml pha loãng tương tự cách pha của dung dịch nội độc tố chuẩn

Điện di SDS-PAGE

Nhuộm gel bằng bạc: Cho 100 ml dung dịch 1, lắc trong 20 phút Sau đó cho

100 ml dung dịch 2 trong 10 phút Tiếp tục cho 100 ml nước cất trong 10 phút Cho

100 ml dung dịch 3 trong 1 phút Sau đó cho 100 ml nước cất trong 1 phút Cho 50 ml dung dịch 4 trong tối 20 phút Rửa bằng nước cất trong 1 phút Thực hiện phản ứng hiện màu bằng 100 ml dung dịch 5 đến khi hiện băng Cuối cùng, dừng phản ứng bằng dung dịch 6

Western blot

Chạy điện di protein (SDS-PAGE), sử dụng marker màu (thang protein chuẩn có màu) Cắt màng PVDF có kích thước bằng bản gel, ngâm màng và bộ chuyển màng trong dung dịch 1x Bloting + methanol lạnh 5 phút Chuyển protein từ bản gel lên màng PVDF bằng cách sắp xếp màng và bản gel theo thứ tự bản đen (-) + xốp + giấy thấm + gel + PVDF + giấy thấm + xốp + bản trắng (+), chạy 100 V trong 2 giờ, chạy trong lạnh Sau đó nhuộm màng PVDF bằng Ponceau để kiểm tra protein đã được chuyển lên màng chưa Rửa 3 lần bằng nước khử ion Phủ màng bằng dung dịch sữa gầy trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 4°C Rửa 3 lần bằng 1x TTBS, mỗi lần lắc trong 5-10 phút; hoặc rửa 2 lần, mỗi lần 10-15 phút Rửa tiếp bằng 1x TBS Nhuộm màng bằng

20 ml kháng thể 1 trong 2-3 giờ Rửa 2-3 lần màng bằng 1x TTBS, 5-10 phút mỗi lần Rửa tiếp 2-3 lần với 1x TBS, 5-10 phút mỗi lần Cuối cùng, hiện màu với dung dịch hiện màu đến khi nhìn rõ vạch (khoảng 15-30 phút)

Nhận dạng protein

Protein được nhận dạng bằng phương pháp sắc lý lỏng (nanoLC) kết hợp khối phổ liên tục (ESI-MS/MS), sử dụng phần mềm tìm kiếm Mascot v1.8 để nhận diện protein từ cơ sở dữ liệu (NCBInr, SwissProt) về trình tự gốc

Cách tiếp cận là (i) protein đích được cắt bằng trypsin để tạo thành các peptide nhỏ, (ii) sau đó hỗn hợp peptide được phân tách trên hệ sắc ký lỏng nanoLC, (iii) ion hóa bằng nguồn ESI (electrospray ionization), (iv) đo phổ khối trên máy khối phổ liên tục MS/MS và (v) sử dụng phần mềm tìm kiếm với thuật toán chuyên dụng để định danh và nhận dạng protein Phương pháp khối phổ cung cấp thông tin về cấu trúc bằng

33

cách ghi chép phổ các ion phân đoạn của một peptide Thông thường trước khi phân tích khối phổ, hỗn hợp peptide được phân tách bằng sắc ký để có thể đo được phổ của các peptide riêng biệt Các giá trị khối thu được, sau đó được so sánh với với các giá trị tính toán trên cơ sở dữ liệu để đưa ra kết quả chính xác nhất Sử dụng thuật toán Mowse để so sánh và đưa ra điểm số thích hợp với những kết quả xác định peptide chính xác nhất Đối với kết quả nhận diện mà các ion có điểm số ≥ 42 thì các peptide đưa ra được cho là giống nhau hoàn toàn hoặc có độ tương đồng cao (với mức ý nghĩa p<0,05)

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính và độ bền SK

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để biết SK hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ phản ứng nào,

SK trong đệm 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 được ủ với plasminogen 30 phút ở 4-50°C

rồi thực hiện phản ứng màu 15 phút để xác định hoạt tính

Ảnh hưởng của pH: Để biết SK hoạt động tốt nhất ở môi trường pH nào, SK được

ủ 60 phút trong các đệm 100 mM phosphate, 100 mM Tris-HCl với pH biến đổi từ 5 đến 10 rồi xác định hoạt tính

Ảnh hưởng của dung môi: Để nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ lên

hoạt tính, dịch SK trong đệm 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 được ủ 60 phút ở 37°C với 10-30% dung môi khác nhau rồi xác định hoạt tính

Ảnh hưởng của ion kim loại: Dịch SK trong đệm 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 được

ủ 60 phút ở 37°C với 2-10 mM ion kim loại rồi xác định hoạt tính

Ảnh hưởng của chất tẩy rửa: Dịch SK trong đệm 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 được

ủ 60 phút ở 37°C với 0,5-2% chất tẩy rửa rồi xác định hoạt tính SK còn lại

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền SK: Để nghiên cứu độ bền nhiệt của SK, dịch

SK trong đệm 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau và lấy mẫu xác định hoạt tính theo thời gian

Ảnh hưởng của pH lên độ bền SK: Để nghiên cứu độ bền pH SK, dịch SK trong

đệm pH tương ứng được ủ ở 37°C và lấy mẫu xác định hoạt tính theo thời gian

Các phương pháp sinh học phân tử chính được tham khảo theo Sambrook và Ruessell [102]

Phân tích gene

Các trình tự gene được khuếch đại, đọc trình tự, phân tích trình tự bằng chương trình DNAstar và so sánh với dữ liệu của GenBank bằng chương trình BLAST