Nghiên cứu ứng dụng polymer để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc...13 2.3.. Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN NGHIÊN CỨU DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO

CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 227.10 RD/ HĐ-KHCN CHỦ TRÌ THỰC HIỆN: Ths TRẦN YÊN THẢO

9162

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/ 2011

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN NGHIÊN CỨU DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO

CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC

Thực hiện theo Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ

sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

Số 227.10.RD/HĐ-KHCN ngày 16/03/2009 giữa

Bộ Công Thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu

Chủ trì thực hiện: ThS Trần Yên Thảo Tham gia thực hiện: Lê Thị Xuân Mai

Tô Thị Bích Loan Nguyễn Văn Việt Phạm Thị Sim Phan Phạm Như Liên Huỳnh Thị Trang Thuỳ

TP Hồ Chí Minh, tháng 12/ 2011

LỜI NÓI ĐẦU

Canh tác cây đậu tương và lạc hiện nay ở nước ta vẫn phụ thuộc vào phân bón hoá học N đắt tiền và có tiềm ẩn gây ô nhiễm môi trường Các chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có thể thay thế phân bón hoá học N cho cây, nhưng vẫn duy trì hoặc trong nhiều trường hợp tăng năng suất của cây Do đó, phát triển sản xuất các chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây là đòi hỏi cấp bách của sản xuất nông nghiệp Sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đến nay sử

dụng than bùn là chủ yếu do than bùn có khả năng bảo vệ tế bào Rhizobium tốt

và chế phẩm có thời gian bảo quản lâu hơn các dạng chế phẩm khác Tuy nhiên, đầu tư cho sản xuất cao hơn, qui trình sản xuất phức tạp hơn Hướng nghiên cứu này nhằm phát triển chế phẩm dạng dịch thể và bổ sung polymer như là chất bảo vệ tế bào để giúp tế bào vượt qua được các điều kiện môi trường không thuận lợi, và do đó tăng cường hiệu quả cố định N khi trời cung cấp cho cây Về mặt ứng dụng, mục tiêu của nghiên cứu nhằm thúc đẩy sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc theo hướng giảm đầu tư trang thiết bị cho sản xuất, giảm giá thành sản phẩm

Trong khuôn khổ đề tài này, mục tiêu nghiên cứu là xây dựng qui trình sản xuất, xác định chất lượng và xác định hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer

MỤC LỤC

Lời nói đầu i

Mục lục ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các biểu đồ và đồ thị vi

Danh mục các hình vii

Tóm tắt đề tài viii

Mở đầu 1

Chương 1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài .3

1.1.1 Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phổ biến 3

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt giống 5

1.1.3 Các đáp ứng sinh lý của tế bào đối với sự làm khô 7

1.1.4 Các phương pháp cải thiện sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt giống 8

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 10

Chương 2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.1 Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc 12

2.1.1 Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 12

2.1.2 Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm trên hạt đậu tương và hạt lạc 12

2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc 13

2.3 Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương và lạc 13

2.3.1 Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường nhân sinh khối 13

2.3.2 Xác định đường cong sinh trưởng của chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 14

2.3.3 Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer

cho cây đậu tương và cây lạc 14

2.4 Xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm vi khuẩn có sử dụng polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 14

2.5 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 18

Chương 3 Kết quả và bình luận 18

3.1 Kết quả nghiên cứu năm 2011 18

3.1.1 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer 18 3.1.2 Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 18

3.1.3 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 18

3.2 Kết quả nghiên cứu năm 2010 và 2011 20

3.2.1 Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc 20

a Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 20

b Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm trên hạt đậu tương và hạt lạc 22

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 23

3.2.3 Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương và lạc 24

a Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường nhân sinh khối .25

b Thời gian nhân sinh khối sản xuất chế phẩm 25

c Qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm 26

d Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer cho cây đậu tương và cây lạc 28

e Chi phí sản xuất 29

3.3 Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 30

3.4 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 33

Kết luận và kiến nghị 36

Tài liệu tham khảo 37 Phụ lục 44

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm vi sinh vật trong môi trường nhân sinh khối 26 Bảng 3.2 Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2010 29 Bảng 3.3 Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2011 29 Bảng 3.4 Chi phí sản xuất 30 Bảng 3.5 Hiệu quả cố định đạm đối với cây đậu tương khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer - Vụ Xuân Hè 2011 - Đồng Tháp 31 Bảng 3.6 Hiệu quả cố định đạm đối với cây lạc khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn

cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Trà Vinh 31 Bảng 3.7 Hiệu quả cố định đạm đối với đậu tương khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Đắc Nông 32 Bảng 3.8 Hiệu quả cố định đạm đối với cây lạc khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn

cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Đắc Nông 32 Bảng 3.9 Năng suất và phân tích hiệu quả kinh tế khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer đối với cây đậu tương và cây lạc 34 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của PVP đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của PVA đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS1

theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của PVP đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của PVA đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG

1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 45 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tăng trưởng của chủng VD-

RG 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 44

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của PVA đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 45 Bảng 3.22 Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của PVA đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45 Bảng 3.25 Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng

vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 46 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế bào/ml) 46 Bảng 3.27 Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 5oC (số lượng tế bào/ml).46 Bảng 3.28 Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế bào/ml) 47 Bảng 3.29 Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RG 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 5oC (số lượng tế bào/ml) 47 Bảng 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RS 1 trong môi trường có polymer sau thời gian bảo quản 3 tháng 47 Bảng 3.31 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định đạm VD-RG 1 trong môi trường có polymer sau thời gian bảo quản 3 tháng 48 Bảng 3.32 Sinh trưởng của chủng VD-RS 1 trong các môi trường nhân sinh khối có sử dụng polymer, bình lên men 5 lít (số tế bào/ml) 48 Bảng 3.33 Sinh trưởng của chủng VD-RG 1 trong các môi trường nhân sinh khối có sử dụng polymer, bình lên men 5 lít (số tế bào/ml) 48

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Biểu đồ 1 Số lượng tế bào của chủng VD-RS 1 trong các môi trường có polymer ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm sau 5 ngày nuôi cấy 21 Biểu đồ 2 Số lượng tế bào của chủng VD-RG 1 trong các môi trường có polymer ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm sau 7 ngày nuôi cấy 21 Biểu đồ 3 Ảnh hưởng của polymer và nồng độ đến tồn tại của VD-RS 1 trên hạt đậu tương 23 Biểu đồ 4 Ảnh hưởng của polymer và nồng độ đến tồn tại của VD-RG 1 trên hạt lạc 23 Biểu đồ 5 Ảnh hưởng của loại polymer và nhiệt độ đến tồn tại của VD-RS 1 và VD-RG 1 sau thời gian bảo quản 3 tháng 24

Đồ thị 1 Sinh trưởng của VD-RS 1 khi nhân sinh khối sản xuất chế phẩm cho cây đậu tương 26

Đồ thị 2 Sinh trưởng của VD-RG 1 khi nhân sinh khối sản xuất chế phẩm cho cây lạc 25

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Làm đất chuẩn bị thí nghiệm tại Đồng Tháp 49

Hình 2 Lấy mẫu nốt sần 49

Hình 3 Rễ đậu tương khi áp dụng phân bón N và khi sử dụng chế phẩm 49

Hình 4 Điểm thí nghiệm đậu tương tại Đồng Tháp 49

Hình 5 Năng suất quả đậu tương khi nhiễm chế phẩm và bón phân N 50

Hình 6 Cây lạc có nhiễm chế phẩm 50

Hình 7 Cây lạc không nhiễm chế phẩm 50

Hình 8 Chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có polymer 50

Hình 9 Bao bì hướng dẫn sử dụng sản phẩm 50

Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm 27

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng polymer thay thế than bùn để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc Các loại polymer và liều lượng khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng vả sự tồn tại

của tế bào Rhizobium trong môi trường nhân sinh khối và trên hạt Các polymer

và liều lượng được chọn lọc cho mục đích sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm sử dụng hai chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 là PVP (2%), Gum Arabic (1%)

và Xanthan Gum (0,5%) Hai qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm

có sử dụng polymer cho cây đậu tương và cây lạc đã được đề xuất Sản phẩm

sản xuất từ các qui trình này có số lượng tế bào Rhizobium cao, đạt 5x108– 2x109 tế bào/ml Vi sinh vật tạp nhiễm xuất hiện trong vài mẻ sản xuất nhưng

có số lượng thấp (<103 tế bào/ml), thời gian bảo quản đạt 3 tháng Kết quả tại 4 điểm thí nghiệm đồng ruộng ở Đồng Tháp (vụ Xuân Hè 2011), Trà Vinh (vụ Hè Thu 2011), Đắc Nông (vụ Hè Thu 2011) cho thấy chế phẩm có chất bảo vệ là các polymer làm tăng năng suất ở cây đậu tương và cây lạc Thí nghiệm đồng ruộng diện rộng phân tích hiệu quả kinh tế của chế phẩm đã thực hiện tại tỉnh Đồng Tháp trên diện tích 70.8 ha cây đậu tương với 118 hộ nông dân tham gia,

10 ha lạc với 15 hộ nông dân và một số điểm trình diễn tại tỉnh Đắc Nông Kết quả cho thấy lợi ích mang lại từ chế phẩm cao Đối với cây đậu tương, năng suất tăng từ 150 kg/ha đến 400 kg/ha, giảm sử dụng phân bón N 20-50 kg/ha, thu nhập tăng thêm từ sử dụng chế phẩm trung bình là 4.320.000đ/ha; đối với cây lạc, năng suất tăng 200-500 kg/ha, phân bón N tiết kiệm là 27-50 kgN/ha, thu nhập tăng thêm trung bình là 9.100.000đ/ha

MỞ ĐẦU

1 Cở sở pháp lý/xuất xứ của đề tài

- Cơ sở pháp lý: Hợp đồng số 227.10.RD/HĐ-KHCN “Đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ” giữa Bộ Công thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu

2 Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài

N là một trong các yếu tố cần thiết nhất cho tăng trưởng và phát triển của cây trồng Trong không khí có tới 80% N nhưng ở dạng N2 nên cây trồng không thể sử dụng được Cây trồng chủ yếu sử dụng N ở dạng ion amonium (NH4) hoặc dạng ion nitrat (N03) Trong khi công nghiệp sản xuất phân bón bằng con đường hoá học đòi hỏi nhiệt độ và áp suất rất cao thì trong tự nhiên một số vi khuẩn có khả năng cố định N2 trong không khí, cung cấp N trực tiếp cho cây

Đó là vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ đậu được gọi là các vi khuẩn nốt sần

hay là Rhizobium N từ cố định đạm cộng sinh thay đổi từ 2-284 kg N/ha/năm

đối với cây cỏ họ đậu (People and Baldock, 2001) và 0-271 kgN/ha/năm đối với cây họ đậu cho hạt (Unkovich et al., 1994; Evans et al., 2001) Các chế phẩm vi sinh vật do đó được nghiên cứu và áp dụng để giảm thiểu sự phụ thuộc vào các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp Áp dụng này có lợi ích rất lớn bởi vì giảm đầu tư và đất đai không bị ô nhiễm do sử dụng quá nhiều sản phẩm có nguồn gốc hoá học

Sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đến nay sử dụng than bùn

là chủ yếu do than bùn có khả năng bảo vệ tế bào Rhizobium tốt và chế phẩm có

thời gian bảo quản lâu hơn các dạng chế phẩm khác Tuy nhiên, đầu tư cho sản xuất cao hơn, qui trình sản xuất phức tạp hơn

Đề tài nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình sản xuất, xác định chất lượng chế phẩm và xác định hiệu quả cố định đạm ở điều kiện đồng ruộng của chế phẩm vi khuẩn cố định đạm dạng dịch thể có sử dụng polymer phục vụ sản xuất cây có dầu đậu tương và lạc

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm

vi khuẩn cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (loại polymer sử dụng, nhiệt độ) đến sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương

và cây lạc

Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương và cây lạc

Nội dung 4: Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở

điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.1.1 Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm phổ biến

Bảo vệ bằng agar: đây là dạng chế phẩm thương mại đầu tiên, sản xuất bởi

công ty Nitragin Co., Milwaukee, USA, dựa vào phát minh về cố định đạm sinh học của Hellriegel và Wilfarth vào năm 1886 Loại chế phẩm này đầu tiên được sản xuất trên gelatin, sau đó trên agar hoặc trên môi trường dinh dưỡng Sản phẩm là sinh khối trên bề mặt agar, dịch sinh khối sau đó được nhiễm trực tiếp vào hạt và đem gieo Phương pháp này rất thuận lợi Tuy nhiên một trở ngại quan trọng nhất của phương pháp này là tốc độ chết rất cao khi hạt bị khô ngay lập tức sau khi vi khuẩn nhiễm lên hạt (Brockwell, 1982)

Bảo vệ bằng đông khô: Đông khô là phương pháp dùng phổ biến để bảo quản

giống vi sinh vật nhưng lần đầu tiên nó được ứng dụng thương mại sản xuất chế phẩm đông khô bởi một công ty của Úc trong một thời gian ngắn trong năm

1958 (Brockwell, 1982) McLeod và Roughley (1961) nhận thấy chế phẩm này tạo nốt sần tốt trong điều kiện đồng ruộng nhưng dường như chỉ giới hạn trong các điều kiện thuận lợi mà thôi, bởi vì sự tồn tại trên hạt của dạng chế phẩm này kém (Vincent, 1965) Kremer và Peterson (1982) báo cáo rằng khi sử dụng dầu lạc và đậu tương thì sẽ cải thiện được sự tồn tại trên hạt của tế bào Công bố của nghiên cứu này là các tế bào rhizobium sẽ được bảo vệ, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ cao, khi pha chế phẩm đông khô với dầu

Bảo vệ bằng bao polymer: bảo vệ vi khuẩn bằng bao polymer là công nghệ tiên

tiến nhất sản xuất chế phẩm thời gian gần đây, đó là các vi khuẩn được bao trong viên hình nhộng nhỏ, hạt tròn hay là viên Hai loại polymer được thử nghiệm nhiều nhất là polyacrylamide và alginate Chế phẩm hình thành bằng cách trộn lẫn dịch vi khuẩn với hợp chất dạng gel trong một dung dịch polymer Các chất như cám hay là sét được trộn lẫn và sau đó tạo thành dạng viên Các viên sau đó làm khô và đóng gói (Bashan, 1986; Walter và Paau, 1993) Hạt

chứa tế bào rhizobium trong polyacrylamide (PER) (Dommergues et al., 1979)

có chất lượng tương đương với chế phẩm trên nền chất mang than bùn khi chúng được giữ trong điều kiện có ẩm độ phù hợp Các dạng chế phẩm tương tự làm với alginate (AER) hay là hỗn hợp xanthan và carob gum (XER) là các chế phẩm có chất lượng tương tự với PER trong dạng ướt sau 50 ngày bảo quản ở nhiệt độ 28°C Dạng chế phẩm khô PER, AER và XER thì có chất lượng kém hơn và không ổn định so với chế phẩm có chất mang than bùn ngay cả khi áp dụng trong đất hay là nhiễm lên hạt (Jung et al., 1982) Mặc dù dạng chế phẩm này có thể thay thế dạng chế phẩm than bùn nhưng chúng chỉ có kết quả tốt nhất trong điều kiện chúng được duy trì trong tình trạng “ướt” Sự làm khô gây

ra mất nước đáng kể tương tự trong trường hợp chế phẩm than bùn bị làm khô

nhưng số lượng tế bào trong sản phẩm giảm đi nhiều hơn (Date, 2001)

Bảo vệ bằng chất mang rắn: Chế phẩm trên nền chất mang rắn là dạng chế

phẩm chính trên thị trường các chế phẩm vi sinh Chế phẩm dạng này được tạo

ra trên nền chất mang rắn chủ yếu là than bùn mặc dù các chất mang khác cũng

được nghiên cứu là đất, sét, than đá, than, perlit, đá phosphate, bã mía, bùn bã

mía, vermiculite và các cây cối mục (Brockwell, 1982; Stephens và Rask,

2000, Albareda et al., 2008) Tuy nhiên than bùn được nghiên cứu nhiều nhất và

cũng được sử dụng thường xuyên hơn cả trong sản xuất chế phẩm Nhiều

nghiên cứu cho thấy than bùn giúp bảo vệ tế bào tốt hơn trong sản phẩm và trên

hạt so với các chất mang rắn khác bởi vì chúng giàu chất hữu cơ và khoáng chất

(Somasegaran và Hoben, 1994) Chất mang than bùn cũng phù hợp cho sản

xuất bởi vì chế phẩm đạt thời gian bảo quản 6 tháng (Roughley và Vincent,

1967) Thành phần lý hoá học của than bùn chất lượng tốt dùng cho sản xuất

thương mại được trình bày trong bảng 1 và 2

Bảng 1.1 Đặc trưng của than bùn dùng trong sản xuất thương mại tại Mỹ

Bảng 1.2 Đặc trưng than bùn dùng cho sản xuất thương mại tại Úc

Roughley (1970)

Chất lượng than bùn ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong sản phẩm và dẫn đến sự tồn tại của chúng trong suốt quá trình bảo quản Điểm đáng chú ý là thành phần hoá học của than bùn không luôn luôn xác định chất lượng chế phẩm làm từ chúng Than bùn chấp nhận cho sản xuất chỉ có thể dựa và các thử nghiệm sự phù hợp của nó đối với sự tăng trưởng và tồn tại đối với chủng

Rhizobium xác định Hơn nữa sự phù hợp này thì phụ thuộc vào nguồn than bùn

và mỗi mẻ sản xuất than bùn (Roughley và Vincent, 1967)

- Bảo vệ ở dạng dịch thể: dạng chế phẩm dịch thể cũng được nghiên cứu gần

đây Trong quá khứ dạng chế phẩm thương mại này không được chấp nhận nhiều bởi vì khó khăn trong việc quản lý chất lượng sau khi sản phẩm xuất xưởng (Brockwell, 1982) Hơn nữa, thời gian bảo quản ngắn và đòi hỏi bảo quản ở nhiệt độ thấp đã hạn chế việc sử dụng chế phẩm dạng lỏng (Stephens và Rask, 2000) Gần đây, sản phẩm dạng này khá phong phú trên thị trường với các công thức khác nhau, mỗi công thức là kết quả nghiên cứu và phát triển sản phẩm của từng nhà sản xuất Brockwell và Bottomley (1995) đã báo cáo sản phẩm dạng dịch được đóng gói trong lọ, có thể áp dụng cho nhiễm lên hạt hoặc

là pha loãng và tưới trực tiếp vào luống gieo hạt Singgleton và cộng sự (2002) nghiên cứu bổ sung vào chế phẩm một số hợp chất hoá học để tăng số lượng tế bào sống trên hạt sau khi nhiễm và phát triển chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương Nghiên cứu này đề cập đến polyvinylpyrrolidone (PVP), FeEDTA và glycerol Tuy nhiên sự tồn tại của tế bào trên hạt từ các công thức dịch thể được bảo quản theo thời gian thì giảm so với than bùn (Alabraeda et al 2008)

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt giống

Chế phẩm chứa vi khuẩn cố định đạm có thể được dùng bằng cách nhiễm lên hạt hoặc bón vào đất Chế phẩm có thể được sử dụng bằng cách nhiễm lên hạt ngay trước khi gieo hoặc được phủ bao bọc hạt trong vòng 1 tuần trước khi gieo Hạt đậu cũng có thể được nhiễm và bảo quản trước khi bán như một sản phẩm thương mại Sản phẩm này gọi là hạt giống nhiễm chế phẩm (pre-inoculated seed) Chế phẩm cũng được sử dụng theo cách nhiễm vi khuẩn vào trong đất sử dụng chế phẩm than bùn pha trong nước hoặc là sử dụng chế phẩm dạng dịch thể hay là dạng hạt Cả hai kỹ thuật nhiễm đều có ưu điểm và khuyết điểm Lựa chọn phương pháp nào thì phụ thuộc vào thiết bị, kích cỡ hạt, tính mỏng manh của mầm hạt Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc tối ưu hoá các

kỹ thuật này để cải thiện sự tồn tại của vi khuẩn và dẫn đến tăng hiệu quả cố

định đạm (Deaker, 2004)

Khi chế phẩm nhiễm lên hạt thì sự chết đi của tế bào rhizobium của tất cả

các giống xảy ra rất nhanh chóng, đặc biệt là khi các điều kiện môi trường

không thuận lợi (Bowen và Kenedy, 1959; Marshall, 1964; Diatloff, 1967; Brockwell et al 1987) Từ đầu thế kỷ 20, các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng tế

bào Rhizobium tồn tại kém trên hạt và vấn đề này được cải thiện một phần bằng

cách bảo quản chế phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp và bổ sung một số hợp chất (Fred et al 1932)

Số lượng tế bào sống trên hạt ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây

Roughley et al (1993) nhận thấy tế bào Rhizobium chết đi nhanh chóng trên hạt

lupin giữa lúc nhiễm chế phẩm vào hạt và lúc gieo Khi nhiễm số lượng tế bào

sống Bradyrhizobium trên 1 hạt là log105,15 nhưng chỉ còn 4,8% (log103,83) tế

bào còn lại trên hạt lúc gieo (sau 3,75 h sau khi nhiễm) và chỉ còn 0,83% (log103,07) sau 22,5 h trong đất, Khi tăng số lượng nhiễm vào hạt từ log104,27 lên 6,27 và 7,28 thì số lượng tế bào trên rễ, số nốt sần hình thành sớm và khối lượng nốt sần tăng đáng kể Họ khuyến cáo nhiễm log105,55 Rhizobium/hạt

Các tác giả kết luận rằng cần thiết nghiên cứu giảm tốc độ chết của tế bào

Rhizobium cần thiết có tiêu chuẩn mới và cao hơn đối với sản phẩm thương

mại Elegba và Rennie (1984) tìm ra rằng năng suất đậu tương tăng khi 106 tế bào được nhiễm lên 1 hạt so với liều lượng đã được khuyến cáo khi đó là 105 Tương tự như vậy, Hume và Blair (1992) báo cáo năng suất đậu tương tăng 15-25% khi tăng liều lượng nhiễm trên hạt từ log105,0 đến 6,0 Tăng số lượng tế bào trên hạt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành nốt sần và do đó tăng năng suất cây Tất cả các kết quả này chỉ ra rằng cần thiết tăng số lượng tế bào/hạt

Sự chết của tế bào trên hạt thông thường diễn ra ở tất cả quá trình nhiễm và

có 3 nguồn ảnh hưởng: sự làm khô (desiccation), bản chất độc tố của hạt và nhiệt độ bảo quản không thuận lợi (Vincent el al 1962; Date, 1968; Taylor and Lloyd, 1968; Thompson et al., 1975)

Sự làm khô là yếu tố chính xác định sự tồn tại kém trên hạt của các tế bào

(Vincent et al,, 1962; Thompson, 1988) Nghiên cứu về sự tồn tại của R leguminosarum bv Trifolii trên hạt thuỷ tinh ở điều kiện khô chỉ ra rằng quá

trình tế bào giảm đi trên hạt xảy ra ở 2 có hai giai đoạn (Vicent el al., 1962) Giai đoạn đầu là số lượng tế bào trên hạt giảm đi một cách nhanh chóng trong khoảng thời gian 0 và 24 h đồng thời với sự mất nước nhanh chóng thì giai đoạn tiếp theo là sự mất nước và số lượng tế bào chết đi giảm Tế bào tồn tại tốt nhất trên hạt khi ẩm độ tương đối 100% và không phát hiện tế bào sống trên hạt khi ẩm độ thấp hơn 60% sau khi nhiễm 27 giờ Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng

sự thích nghi với sự làm khô (desication) thay đổi tuỳ thuộc các chủng rhizobia khác nhasu Các chủng tăng trưởng chậm thì tồn tại tốt hơn trên hạt so với các chủng tăng trưởng nhanh Mary et al (1994) quan sát sự tồn tại tốt hơn trên tế

bào của Sinorhizobium trong suốt quá trình bảo quản ở điều kiện ẩm độ tương

đối từ 22% đến 67% so với từ 3% đến 83,5% Kiểu ảnh hưởng cũng tương tự

nhưng ở mức độ thấp hơn, đối với Bradyrhizobium (Boumahdi et al., 1999; Mary et al., 1994) và Azosprillum (Paul et al., 1993) Tốc độ làm ướt cũng là

yếu tố quan trọng đối với sự tồn tại của tế bào trên hạt Làm ướt nhanh chóng dẫn đến tính bất ổn của tế bào và kết quả là tế bào chết đi (Bushby et al., 1977; Salema et al., 1981) Kosanke et al (1991) chỉ ra rằng tốc độ tái làm ướt thấp sẽ

dẫn đến múc độ tồn tại trên hạt cao hơn ở S meliloti, Rhizobium leguminosarum, Pseudominas putida

Nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại trên hạt Nhiệt độ thấp (5°C) có lợi cho rhizobium sống trên hạt nhưng không thực tế (Date,1968) Vincent (1958) cho thấy tốc độ chết của clover rhizobia trên hạt thuỷ tinh giảm

đi khi nhiệt độ tăng lên từ 5 đến 26 và 37°C Bowen và Kennedy (1959) cho

thấy tính nhạy cảm của nhiều giống Rhizobium đối với nhiệt độ cao 40°C

Trong thực tế sức ép lớn nhất từ nhiệt độ là khi hạt được gieo trên bề mặt đất khô Đây là vấn đề đặt ra đối với các vùnh đất nhiệt đới nơi đó nhiệt độ thường vượt quá 40°C ở 5 cm bề mặt đất và 50°C ở 1 cm (Eaglesham và Ayanaba, 1984; Hafeez et al., 1991; Lal, 1993) Boonkerd et al (2001) khám phá ra rằng nhiệt độ thấp cũng ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào Tác giả thấy rằng quần thể rhizobia giảm do khô, nhiệt độ thấp và thiếu ẩm trong đất trong thời kỳ mùa

đông ở Thái lan Các chủng B.japonicum cộng sinh với đậu tương tìm thấy

trong mùa hè nhưng lại biến mất trong mùa đông

1.1.3 Các đáp ứng sinh lý của tế bào đối với sự làm khô

Dưới áp lực của sự thẩm thấu sự cân bằng nước giữa bên trong và bên ngoài tế bào đạt được nếu tế bào tích luỹ được các chất hoà tan tương thích hoặc là các chất bảo vệ thẩm thấu Các chất này bao gồm ion potassium, glutamate, glutamine, proline, quaternary amines (glycine bataine) và các loại đường trehalose, sucrose và glucosylglycerol Các chất hoà tan giúp duy trì tính ổn định protein trong suốt quá trình chịu áp lực thẩm thấu (Potts, 1994)

Trehalose: Trehalose tích luỹ trong các vi khuẩn bị áp lực thẩm thấu (Lesli et

al., 1995; Potts, 1994) và đặc biệt là đối với rhizobia (Breedveld et al., 1993; Streeter, 2003) Trehalose bảo vệ tế bào chống lại sự làm khô bằng cách duy trì

sự nguyên vẹn của màng tế bào trong quá trình làm khô và sau đó làm ướt (Leslie et al., 1994, 1995) và sự hiện diện của trehalose có thể giải thích cho sự tăng tính tồn tại của tế bào đối với sự làm khô trong suốt phase ổn định và khi

tế bào đối mặt với muối NaCl Gouffi et al (1998, 1999, 2000) tìm thấy rằng trehalose và succrose không không tích luỹ trong môi trường nhưng nó tổng hợp mới trong trong phase tăng trưởng sớm của vi khuẩn Nghiên cứu của Streeter J.G (2003) về ảnh hưởng của trehalose đối với sự tồn tại của

Bradyrhizobium japonicum trong suốt quá trình làm khô cho thấy trehaolose khi

được bổ sung vào môi trường tại thời điểm làm khô thì sự sống sót của tế bào được cải thiện nhưng thấp trong lúc khi nó được bổ sung vào quá trình sinh

trưởng thì khả năng chống chịu với sự làm khô tăng lên rất nhiều Nghiên cứu

của Gaber Zayed (2003) đối với Lactobacillus salivarus cho thấy trehalose

cũng làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn này khi đối mặt với quá trình đông khô và tác giả này cho rằng khả năng chuyển hoá trehalose bởi vi khuẩn này thì không liên quan đến khả năng kháng lại với quá trình làm khô mà có thể liên quan đến một cơ chế khác Có sự tương quan chặt chẽ giữa lượng trehalose

của tế bào Bradyrhizobium với sự sống sót của chúng trên hạt đậu tương

(Streeter J.G, 2007) Nghiên cứu này cho thấy một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại của Bradyrhizobium trên hạt cần quan tâm là các chủng khác nhau, nồng

độ muối và trehalose trong môi trường, độ ẩm tương đối trong đó cho rằng trehalose là yếu tố quan trọng Nghiên cứu gần đây của Xiaoyan Li và Xiguang Chen (2009) cho thấy sử dụng trehaolose như là một nguồn C và môi trường bảo vệ tế bào vi khuẩn lactic đã có lợi ích bảo vệ tế bào trong suốt quá trình bảo quản ở 40C

Sự tích luỹ exopolysaccharide: Rất nhiều vi khuẩn thường sinh ra và thường

sống giữa một nền exopolysaccharide (EPS) trong môi trường tự nhiên của chúng, ví dụ trong đất (Foster, 1991) và trong phổi (Roberson và Firestone, 1992) EPS có chức năng kết các tế bào với cơ chất, bảo vệ chúng chống lại sự thực bào, che đậy sự phát hiện kháng thể và chống lại sự phân huỷ tế bào bởi các vi khuẩn khác (Tease và Walker, 1987) Chức năng bảo vệ chống lại sức ép

bị khô (desiccation) thì chưa rõ và có một số các báo cáo trái ngược nhau

Pseudomonas spp sản xuất một số lượng lớn EPS khi phản ứng với sự làm khô

(desiccation) (Roberson và Firestone, 1992) Tuy nhiên, Hartel và Alexander

(1986) tìm ra các chủng Bradyrhizobium không sinh màng nhày thì lại kháng

tốt hơn đối với sự làm khô trong đất cát so với chủng sinh màng nhày

Thay đổi về hình thái tế bào: Bushby và Marshall (1977) chỉ ra rằng S

meliloti SU47 tiết ra các thành phần của tế bào khi chúng bị làm ướt (sau giai

đoạn làm khô), chỉ ra rằng cấu trúc vách tế bào có thể đã bị yếu đi trong suốt quá trình desiccation Feng et al (2002) đã quan sát sự thay đổi cấu trúc vách tế bào khi tế bào bị xử lý khô và bảo quản trong than bùn

1.4 Các phương pháp cải thiện sự sống sót của vi khuẩn cố định đạm trên hạt giống

Có nhiều loại chất đã được thử nghiệm với mục tiêu tăng cường sự tồn tại tế bào trên hạt

Đường, amino acid và hợp chất rượu đường

Trong các nghiên cứu ban đầu về các vi khuẩn đông khô, bản chất của môi trường huyền phù đã được xác nhận nó như là một sự trợ giúp quan trọng cho tế bào tồn tại (Heller, 1941; Annear, 1956, 1962; Vincent, 1958) Các nghiên cứu

mở rộng hơn nữa sử dụng các chất dinh dưỡng của vi khuẩn như là tác nhân gây huyền phù cho quá trình đông khô và bảo quản tế bào (Heller, 1941; Appleman

và Sears, 1944; Annear, 1956, 1962; Redway and Lapage, 1974; Dye,1982) Heller (1941) khảo sát các ảnh hưởng bảo vệ của các hợp chất kết tinh và các

chất keo trong quá trình khô của Streptococcus pyogenes C203 and Escherichia coli Sucrose là một tác nhân huyền phù tốt hơn so với glucose, xylose,

tryptophane, salicin, saline và nước đối với cả hai giống Heller kết luận rằng sự tồn tại thì liên quan đấn tính đồng hoá và hoà tan của hợp chất này Hơn nữa, Vincent (1958) báo cáo rằng 24–44% tế bào tồn tại khi tạo huyền phù tế bào trong dung dịch sucrose 10% trong khi đó chỉ có 1% tế bào tồn tại khi tạo huyền phù với nước Sucrose là tác nhân tạo huyền phù tốt hơn sorbitol, mannitol, lysine, amino acid mixtures, sữa và, dịch cao nấm men và manitol Sự tồn tại kém của tế bào rhizobia trên hạt và hạt thuỷ tinh đã được cải thiện bằng cách bổ sung sucrose McLeod và Roughley (1961) tìm ra rằng kết hợp 10% sucrose và dịch cao nấm men và manitol tăng tồn tại của tế bào trên hạt thuỷ tinh so với đối chứng không có dịch này Vincent et al (1962) chỉ ra rằng tồn

tại của dịch thể lỏng R leguminosarum bv trifolii trên hạt thuỷ tinh thì cao hơn

nhiều sau khi tạo huyền phù với maltose so với các đường khác, sorbitol và sodium chloride

Các polymer

Các polymer tự nhiên như là gum arabic đã được sử dụng như là các chất bám dính trong áp dụng các chế phẩm nhiễm cho cây họ đậu trong nông nghiệp Nhiều trong số các nghiên cứu về chất bám dính chú trọng đến khả năng của chúng trong việc duy trì sự sống của rhizobia trên hạt cây họ đậu (Scott, 1989) Gum arabic tăng cường sự tồn tại của rhizobia trên hạt cây họ đậu Vincent et al., (1962) phát hiện ra rằng gum arabic không chỉ bảo vệ tế bào chống lại sự làm khô mà còn làm cho tế bào tồn tại tốt hơn trên hạt so với maltose Điều này cho thấy có sự bảo vệ nào đấy chống lại các chất độc của hạt Methylcellulose,

là một ether cellulose vô cực, hoà tan trong nước thì được sử dụng rộng rãi hơn như là chất bám dính Methylcellulose sẵn có, chất lượng của nó tương đối ổn định do nó là một polymer bán tổng hợp và khá rẻ bởi vì được sử dụng ở liều lượng thấp (1.5% w/v) (Scott, 1989) Tuy nhiên, các kết quả báo cáo khác nhau

về sự bảo vệ tế bào bởi methylcellulose khi so sánh với gum arabic và nó thông thường kém hiệu quả hơn Lloy (1983) đã được cấp bằng phát minh cho công trình nghiên cứu về Polyvinylpyrrolidone (PVP) hoà tan trong nước như là tác nhân bao vào hạt PVP là một polymer tổng hợp được sản xuất bởi sự polymer hoá monomer vinylpyrrolidone PVP có thể bất hoạt các hợp chất độc hiện diện trong các chất tiết ra từ hạt trong quá trình hạt nẩy mầm PVP có khả năng giữ nước cao và dường như làm chậm đi quá trình khô của chế phẩm sau khi nhiễm vào hạt PVP có tính chất dính ổn định và tính chất này có khả năng làm tăng sự kết dính của tế bào và chế phẩm vào hạt PVP dường như tăng sự tồn tại của

Bradyrhizobium japonicum và ảnh hưởng này thì phụ thuộc vào nồng độ PVP

(Singleton et al., 2002) Singleton et al., (2002) xác định tồn tại của tế bào trên hạt đậu tương với các chủng khác nhau và chỉ rằng tốc độ tế bào sống giảm đi trên hạt thì khác nhau giữa các chủng và các công thức Như vậy, để sản xuất chế phẩm có chất lượng tốt thì chất mang phù hợp hoặc các chất bổ sung đối

với các chủng Rhizobium xác định cần được chọn lọc

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhà nước ta rất quan tâm đẩy mạnh các nghiên cứu, ứng dụng và phát triển công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông nghiệp và nông thôn, đặc biệt chú trọng đến phát triển công nghệ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp Bộ Khoa học và Công nghệ đã ban hành quyết định số 2025/QĐ-BKHCN vào ngày 13 tháng 9 năm 2006 về việc phê chuẩn về mục tiêu, nội dung và các dự kiến sản phẩm của Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-2010: “Nghiên cứu, ứng dụng và phát triển công nghệ phục vụ công nghiệp hóa,hiện đại hóa nông nghiệp và nông thônn” (KC.07/06-10) Trong quyết định này

có đề cặp đến việc nghiên cứu và chuyển giao công nghệ các loại phân bón vi sinh vật Một chương trình quốc gia quan trọng khác là “Nghiên cứu, phát triển

và ứng dụng công nghệ sinh học” theo quyết định số 2022/QĐ-BKHCN, ký ngày 13 tháng 9 năm 2006, phê chuẩn các nghiên cứu và ứng dụng các chủng vi sinh để sản xuất phân bón Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đang thực hiện “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020” trong đó có

kế hoạch hành động phát triển phân bón vi sinh vật cho cây trồng

Theo số liệu thống kê diện tích cây lạc và cây đậu tương hiện nay khoảng

450 ngàn ha nhưng đang trên đà phát triển, đặc biệt đối với cây đậu tương Diện tích trồng đậu tương tăng nhanh để đáp ứng nhu cầu vừa là cây có dầu vừa là cây phục vụ chăn nuôi Nhiệm vụ đã đặt ra bởi Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là phát triển 400 ngàn ha đậu tương đến năm 2010 Bên cạnh đó nhu cầu phát triển cây có dầu, đặc biệt là đậu tương và lạc rất lớn do nhu cầu phát triển công nghiệp dầu thực vật Hiện nay nghành dầu phải nhập 96% nguyên liệu, kim nghạch nhập khẩu rất lớn (700 triệu USD năm 2008) Điều này cho thấy tiềm năng thị trường lớn của các chế phẩm phân bón vi sinh Ngược lại, phát triển phân bón vi sinh có ảnh hưởng đến tăng sản lượng sản xuất cây có dầu như cây đậu tương và cây lạc do chúng giảm thiểu sử dụng phân bón hoá học, tăng năng suất cho cây

Tuy nhiên, tất cả diện tích gieo trồng hiện tại không áp dụng lợi ích của cố

định đạm sinh học thông qua áp dụng chế phẩm Rhizobium mà bón phân N hoá

học, với liều lượng trung bình từ 25-80 kgN/ha (Trần Yên Thảo, 2010) Thay thế phân bón N bằng chế phẩm vi sinh sẽ tiết kiệm cho nông dân Việt nam 100-

200 triệu đô la hàng năm, và cùng lúc sẽ thúc đẩy mở rộng sản xuất cây họ đậu

và tác động có lợi đối với môi trường

Các thí nghiệm về sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đậu tương thực hiện từ năm 1976 đến 2001 tại Miền Nam cho thấy đậu tương phản ứng tốt với việc nhiễm chế phẩm thông qua tăng năng suất Trung bình năng suất tăng 38% (59% tại Đồng bằng sông Cửu long, 16% tại Đông Nam bộ) Trong hầu hết các điểm, phân bón N tiết kiệm được là 40-60kgN/ha (Trần Yên Thảo, 2004) Tương tự đối với lạc, năng suất quả tăng 13.8-17.5% ở Miền Bắc (Ngô Thế Dân và cs, 2000) Hiệu quả kinh tế đã được tổng kết chi tiết trong báo cáo

dự án LWR2/98/27 Trong 23 thí nghiệm ở Miền nam, lợi ích kinh tế mang lại

là tăng lợi nhuận lên đến 760 đô la Úc/ha (trung bình tăng hơn 100 đô la Úc/ha)

do tăng năng suất và giảm sử dụng phân bón N hóa học Chế phẩm vi sinh này

đã tăng năng suất hạt lạc trồng trên đất chua Đồng bằng Sông Cửu Long trung bình là 42% so với không bón phân N và 28% so với bón phân N Đối với 13 thí nghiệm của đậu tương năng suất tăng trung bình là 19% so với không bón phân N, và năng suất tăng 40-50% trong một số thí nghiệm Mức độ lợi ích kinh

tế thì thay đổi phụ thuộc vào loại cây, vùng đất và lịch sử trồng trọt Không có trường hợp nào giảm năng suất khi thay phân đạm khoáng N bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm Kết quả các mô hình trình diễn đồng ruộng sử dụng các chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc từ năm 2007 đến 2010 tại

10 tỉnh trong nước cho thấytại tất cả các điểm trỉnh diễn, năng suất tăng khi áp dụng chế phẩm, trung bình đối với đậu tương là 460 kg/ha (18%), đối với lạc là

290 kg/ha (11%) Lợi nhuận tăng trung bình đối với đậu tương là 5.63 triệu đồng/ha, đối với lạc là 4.95 triệu đồng/ha Phân bón tiết kiệm được là từ 25-80 kgN/ha đối với đậu tương và 25-70 kg/ha đối với lạc Lợi nhuận tăng này chủ yếu là từ viêc giảm đầu tư phân bón hoá học N và tăng năng suất Do đó, cần thiết sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây đậu tương và lạc tại nước

ta

Cho đến nay chế phẩm vi khuẩn cố định đạm Rhizobium chưa được

thương mại hoá ở nước ta và chất mang rắn thường được lựa chọn trong các nghiên cứu phát triển sản phẩm Thí nghiệm đồng ruộng sử dụng chế phẩm dạng dung dịch có ứng dụng polymer là PVP cho thấy nốt sần, sinh khối cây và năng suất của đậu tương tăng so với đối chứng bón phân N hoá học và không có

sự khác biệt so với chế phẩm trên nền chất mang than bùn (Trần Yên Thảo et al 2002) Ngoài ra chúng tôi chưa tìm thấy các công trình nghiên cứu khác trong nước liên quan đến nội dung này

Polymer:

Các plymer sử dụng bao gồm các polymer tự nhiên (Gum Arabic, Xanthan Gum) và các polymer tổng hợp (polyvinyl pyrrolydine-PVP, polyvinylalcohol-PVA) Các polymer này được cung cấp bởi Trường Đại học Sydney, Úc Gum Arabic va Xanthan Gum là sản phẩm của Merck; PVA và PVP của Nippon Gohsei

Phương pháp nghiên cứu dưới đây được trình bày theo thứ tự nôi dung của đề tài

2.1 Phương pháp nghiên cứu lựa chọn các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc

- Thực hiện: hai chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường YEM có bổ sung các loại loại polymer và nồng độ như trên Theo dõi số lượng tế bào vi

khuẩn (số tế bào/ml) tại các thời điểm 1, 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi nuôi cấy Đối chứng là môi trường YEM dịch thể, không bổ sung polymer Môi trường xác

định số lượng vi khuẩn Rhizobium là mội trường YEMA có Congo Red là chất chỉ thị màu Xác định và đếm các khuẩn lạc Rhizobium đặc trưng trên môi

trường này

2.1.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của loại và hàm lượng các

polymer đến tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm trên hạt đậu

tương và hạt lạc

Từ kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của polymer đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn cố định đạm, các chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 được nuôi cấy trong các môi trường có các loại polymer khác nhau và ở các nồng độ thích hợp khác nhau Dịch sinh khối sau đó được nhiễm trên hạt đậu tương và hạt lạc Số lượng tế bào tồn tại trên hạt được theo dõi sau 24 giờ

Phương pháp xác định tế bào Rhizobium tồn tại trên hạt bao gồm khử

trùng hạt, nhiễm chế phẩm lên hạt và xác định số lượng tế bào theo phương pháp của Somasegaran, P., and Hoben, H J (1994)

2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại polymer và nhiệt độ đến

sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc

Ở nội dung nghiên cứu này các chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 được nuôi cấy trong các môi trường dịch thể khác nhau về loại polymer để tạo các chế phẩm vi khuẩn cố định đạm khác nhau Loại polymer và hàm lượng của chúng

được xác định ở nội dung 1

Các sản phẩm này sau đó được bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát (5oC) Theo dõi số lượng tế bào vi khuẩn của 2 chủng này theo thời gian tại 1,

7, 14, 21, 28 ngày và 2, 3 tháng Đối chứng là chế phẩm trên nền chất mang

than bùn Phương pháp xác định số lượng Rhizobium là phương pháp xác định

khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường YEM có bổ sung chỉ thị màu Congo Red

2.3 Phương pháp xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương và lạc

Dựa trên cơ sở đã có qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm trên nền chất mang rắn là than bùn, trong nôi dung nghiên cứu này các thí nghiệm được thực hiện theo qui trình đó và qui mô thực hiện nghiên cứu

là 5 lít chế phẩm/mẻ Qui trình chung bao gồm:

- Sản xuất giống: bao gồm hoạt hoá giống, nhân giống

- Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối

- Tạo sản phẩm

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm

2.3.1 Phương pháp xác định ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường nhân sinh khối

• Thời gian khử trùng 30 phút

• Thời gian khử trùng 45 phút Khử trùng lần 2 sau lần 1 là 8 giờ

Chế độ khử trùng: 121oC, 1 atm

- Thực hiện: Thực hiện các nghiệm thức khử trùng môi trường như trên 24 giờ sau khi môi trường được khử trùng, tiến hành xác định số tế bào vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường Mội trường nuôi cấy xác định tạp nhiễm là YEMA bổ sung Congo Red Đếm các khuẩn lạc tạp nhiễm, là tất cả các khuẩn lạc xuất hiện từ môi trường đã khử trùng Đối chứng là nước cất khử trùng

2.3.2 Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của chủng VD-RS 1

và VD-RG 1

Mục đích là để xác định thời gian nhân sinh khối sản xuất chế phẩm

Nuôi cấy hai chủng Rhizobium trong môi trường nhân sinh khối có bổ sung

polymer ở nồng độ đã được chọn lọc từ các nội dung nghiên cứu trên Sau thời gian nuôi cấy 1, 3, 5, 7, 8, 9 ngày, xác định số lượng tế bào tích luỹ trong môi trường Phương pháp xác định số lượng: phương pháp xác định khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường YEMA có bổ sung chỉ thị màu Congo Red

2.4 Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer cho cây đậu tương và cây lạc

Tiến hành sản xuất thử nghiệm, qui mô 5 lít/mẻ Xác định chất lượng của

từng mẻ sản xuất bao gồm xác định số tế bào Rhizobium sống và số tế bào tạp

nhiễm trong chế phẩm Sử dụng môi trường YEMA với chất chỉ thị màu Congo Red

2.5 Phương pháp xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm có sử dụng polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

Phương pháp xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm dựa vào nguyên tắc là nhiễm chế phẩm vào hạt, thực hiện trồng cây trong điều kiện đồng ruộng Xác định và so sánh nốt sần, sinh khối và năng suất giữa các nghiệm thức không nhiễm và nhiễm chế phẩm Phương pháp thực hiện trong

nghiên cứu này theo phương pháp của Somasegaran, P., and Hoben, H J (1994)

- Nghiệm thức thí nghiệm:

1 Đối chứng không bón phân N

2 Đối chứng có bón phân N

3 Chế phẩm trên nền chất mang than bùn (cho cây đậu tương hoặc cây lạc)

4 Chế phẩm dịch thể có sử dụng polymer (cho cây đậu tương hoặc cây lạc)

+ Bón phân N: áp dụng theo liều lượng được khuyến cáo cho nông dân tại địa phương

+ Nghiệm thức 3 và 4: không áp dụng phân bón N, áp dụng chế phẩm

- Bố trí thí nghiệm: bố trí theo khối, các nghiệm thức phân bố hoàn toàn ngẫu nhiên trên mỗi khối 4-5 lần lập lại Kích thước mỗi ô là 25-30m2

- Số thí nghiệm: 4 (2 cho đậu tương và 2 cho lạc)

- Địa điểm:

+ Đồng Tháp: hộ nông dân Huỳnh Văn Lộc Địa chỉ: ấp Phú Thạnh, xã

An Phú Thuận, huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp

+ Trà Vinh: hộ nông dân Thạch Sư, Ấp Huỳnh Đức, xã Long Sơn, huyện Cầu Ngang, tỉnh trà Vinh

- Kỹ thuật trồng, chăm sóc: Áp dụng qui trình trồng và chăm sóc theo khuyến cáo của khuyến nông địa phương cho nông dân, bao gồm giống, chế độ bón phân, khoảng cách trồng, chế độ tưới, bảo vệ thực vật và các khuyến cáo khác tuỳ thuộc địa phương

- Các chỉ tiêu theo dõi

+ Trọng lượng nốt sần

+ Năng suất sinh khối

+ Năng suất hạt (đậu tương), năng suất quả (lạc)

- Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu: theo phương pháp của Somasegaran, P., and Hoben, H J (1994)

2.6 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm

Hiệu quả kinh tế của sản phẩm được đánh giá thông qua việc so sánh năng suất và lợi nhuận thu được của việc áp dụng chế phẩm và đối chứng Hiệu quả kinh tế của sản phẩm được tính toán dựa vào các số liệu về năng suất của các thử nghiệm diện rộng trên đồng ruộng

- Nghiệm thức thí nghiệm:

1 Đối chứng có bón phân N

2 Chế phẩm dịch thể có sử dụng polymer (cho cây đậu tương hoặc lạc)

+ Bón phân N: áp dụng theo liều lượng của nông dân

+ Nghiệm thức 2: không áp dụng phân bón N, áp dụng chế phẩm

Các chế độ bón phân khác (P,K, vi lượng ) giống nhau ở mỗi điểm thí nghiệm

+ Tại các điểm trình diễn diện rộng tại Đồng Tháp: 2 nghiệm thức thí nghiệm (nhiễm và không nhiễm) được bố trí trên mỗi nửa ruộng thí nghiệm Diện tích ruộng thí nghiệm tuỳ thuộc vào diện tích của các hộ nông dân tham gia Trung bình diện tích một điểm trình diễn là 0,60 ha đối với cây đậu tương

và 0,67 ha đối với cây lạc

Hộ nông dân Trần Văn Phúc; Thôn 4 - Nam Dong

Hộ nông dân Nguyễn Ngọc Tuấn; Bon U1-Ea Tling – Cư Jut

Hộ nông dân Trần Văn Định; K5- Ea Tling – Cư Jut

• Lạc

Hộ nông dân Trần Văn Phúc ; Thôn 4 - Nam Dong

Hộ nông dân Nguyễn Thị Lụa; Thôn 4 - Nam Dong

- Thời gian:

+ Đồng Tháp: Vụ Xuân Hè 2011;

+ Đắc Nông: Vụ Hè Thu và Thu Đông 2011

- Áp dụng chế phẩm: nhiễm lên hạt, liều lượng 1 lít/ha

- Kỹ thuật trồng, chăm sóc: Áp dụng qui trình trồng và chăm sóc theo khuyến cáo của khuyến nông địa phương cho nông dân, bao gồm giống, chế độ bón phân, khoảng cách trồng, chế độ tưới, bảo vệ thực vật và các khuyến cáo khác tuỳ thuộc địa phương

- Các chỉ tiêu theo dõi

+ Năng suất hạt (đậu tương), năng suất quả (lạc)

- Phương pháp thu hoạch: thu hoạch toàn bộ ruộng thí nghiệm

Cán bộ khuyến nông tham gia: Đối với toàn bộ các thí nghiệm và trình diễn

đồng ruộng của đề tài, có sự tham gia thực hiện của cán bộ khuyến nông địa phương Các cán bộ khuyến nông này cùng làm việc với chủ nhiệm đề tài, cán

bộ thực hiện đề tài Cán bộ khuyến nông đã tham gia thảo luận thiết kế thí nghiệm, thảo luận cách thực hiện thí nghiệm cho phù hợp với điều kiện của địa phương, theo dõi thí nghiệm, thực hiện việc tổ chức nông dân trong các điểm trình diễn Các cán bộ khuyến nông chính tham gia đề tài bao gồm Tô Thị Bích Loan (Phó Giám đốc- TT Khuyến Nông Khuyến ngư tỉnh Đồng Tháp), Nguyễn Văn Đạt (Khuyến nông huyện Châu Thành, Đồng Tháp), Nguyễn Văn Việt (TT Khuyến Nông Khuyến ngư tỉnh Trà Vinh), Nguyễn Thị Sim (TT Khuyến Nông huyện Cư Jút, tỉnh Đắc Nông)

Xử lý thống kê: sử dụng phần mềm MSTATC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NĂM 2011

3.1.1 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer

Năm 2011, sản xuất 52 lít chế phẩm cho cây đậu tương và 20 lít chế phẩm cho cây lạc Bảng 3.3 chỉ ra kết quả đánh giá chất lượng của chế phẩm theo các mẻ sản xuất Kết quả cho thấy chất lượng sản phẩm ổn định qua các

mẻ sản xuất khác nhau Số lượng Rhizobium đạt 5x108 – 2,2x109 trong khi số lượng tế bào tạp nhiễm thấp, trong vài mẻ sản xuất xuất hiện tạp nhiễm nhưng với số lượng thấp (<103)

3.1.2 Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành để xác định hiệu quả của chế phẩm

Kết quả (bảng 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8) cho thấy ở tất cả các điểm thí nghiệm tại Đồng Tháp, Trà Vinh và Đắc Nông chế phẩm có chất bảo vệ là các polymer cho hiệu quả cố định đạm tương đương với chế phẩm trên nền chất mang than bùn Không có sự khác biệt thống kê giữa trọng lượng nốt sần, sinh khối và năng suất của cây đậu tương và cây lạc ở hai nghiệm thức này

Hiệu quả cố định đạm khi nhiễm chế phẩm vi khuẩn nốt sần biểu hiện qua các chỉ tiêu nốt sần, năng suất sinh khối và năng suất hạt Ở tất cả các thí nghiệm, nghiệm thức nhiễm với chế phẩm than bùn và polymer đều có kết quả tăng có ý nghĩa thống kê về trọng lượng nốt sần, sinh khối và năng suất hạt Trung bình, đối với cây đậu tương trọng lượng nốt sần tăng trung bình 78,6%, sinh khối tăng 38,9%, năng suất hạt tăng 19,6% Đối với cây lạc tăng theo thứ

tự là 75%, 24,9% và 12,4%

Sự trả lời đối với nhiễm chế phẩm cố định đạm có khác nhau tuỳ thuộc vào loại cây trồng và điểm thí nghiệm Đối với cây đậu tương tại Đồng Tháp, trọng lượng nốt sần tăng gần 2 lần so với đối chứng không sử dụng chế phẩm, sinh khối tăng 51,3% trong khi đó tại Đắc Nông nốt sần và sinh khối tăng ít hơn (63,7% và 23,1% theo thứ tự) Năng suất hạt, tuy nhiên tăng trung bình ở Đồng Tháp là 330 kg/ha, tại Đắc Nông là 480 kg/ha

3.1.3 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm

Kết quả thử nghiệm diện rộng (bảng 3.6) trên diện tích 70,8 ha trồng đậu tương với 118 hộ nông dân tham gia tại xã An Phú Thịnh, huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp cho thấy năng suất tăng trung bình 224 kg/ha, nông dân thu

nhập tăng thêm từ sự áp dụng chế phẩm trung bình là 4.295.000đ/ha Thu nhập tăng thêm này chủ yếu từ tăng năng suất và tiết kiệm được một phần phân bón

N Đối với cây lạc, trên diện tích 10 ha tại xã Bình Phú, huyện Tân Hồng, 15 nông dân tham gia thử nghiệm đã thu thêm được gần 3.000.000đ/ha nhờ áp dụng chế phẩm

Tại Đắc Nông, vụ Hè Thu 2011 mô hình trình diễn tại xã Nam Dong trên cây đậu tương nông dân thu nhập tăng thêm là 4.700.000đ/ha Tại vụ Thu Đông

2011, mặc dù bị ảnh hưởng nặng do mưa bão kéo dài, năng suất đậu tương thấp, dưới 2 tấn/ha nhưng nhờ áp dụng chế phẩm nông dân thu lợi thêm được trung bình khoảng 3.000.000đ/ha Đối với lạc, năng suất tăng cao, điểm 1 tăng 1 tấn/ha, điểm 2 tăng 1.5 tấn/ha đậu tươi Lợi nhuận thu được từ chế phẩm trung bình hơn 12.000.000đ/ha

Tại Đắc Nông các điểm trình diễn đối với cây đậu tương và cây lạc nông dân không sử dụng phân bón N khi áp dụng chế phẩm Chính vì lý do này có lẽ trừ hai điểm trình diễn ở vụ Thu Đông đối với cây đậu tương do bị ảnh hưởng của thời tiết xấu, năng suất thu hoạch thấp, còn các điểm khác lợi nhuận thu được từ chế phẩm rất cao Lượng phân bón N tiết kiệm được là 50 kg/N

Tại Đồng Tháp, trung bình nông dân sử dụng 40-50 kg N/ha đối với cây đậu tương và khi sử dụng chế phẩm nông dân sử dụng trung bình 20 kgN/ha Lượng phân bón do đó tiết kiệm trung bình 20-30 kgN/ha Đối với cây lạc, nông dân sử dụng trung bình 28 kgN/ha khi áp dụng chế phẩm và đối với ruộng đối chứng nông dân sử dụng 55 kgN/ha Phân bón N tiết kiệm được là 27 kgN/ha