Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym lignin peroxidase và laccase từ vi sinh vật tổ hợp để ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

hoạch đạt được 1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo chủng giống vi sinh vật tái tổ hợp bằng công nghệ gen để sản xuất enzym phân hủy lignin.. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại: a Hiệu

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công

nghệ chế biến đến năm 2010

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

LỜI CẢM ƠN

Tập thể cán bộ thực hiện Đề tài ĐT.07.08/CNSHCB xin chân thành cảm ơn

Bộ Công thương, Văn phòng và Ban chủ nhiệm “Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020”

đã tin tưởng giao nhiệm vụ thực hiện đề tài

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã thường xuyên quan tâm, chỉ đạo sâu sát và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Chúng tôi xin cảm ơn sự hợp tác chặt chẽ, có trách nhiệm và hiệu quả của các cơ quan, đơn vị phối hợp trong và ngoài Viện Công nghệ sinh học, sự lao động tận tâm và sáng tạo của các cán bộ tham gia thực hiện đề tài

Tập thể cán bộ nghiên cứu

TẬP THỂ CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

ĐT.07.08/CNSHCB

1 TS Phạm Thị Bích Hợp Chủ nhiệm đề tài Viện CN sinh học

2 TS Nguyễn Phương Nhuệ Thư ký đề tài Viện CN sinh học

3 TS Phí Quyết Tiến Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

4 TS Hồ Tuyên Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

5 TS Lê Thị Thu Hồng Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

6 ThS NCS Nguyễn Văn Hiếu Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

7 ThS.NCS Phan Thị Hồng Thảo Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

8 ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

9 ThS Phạm Thanh Huyền Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

10 CN Nguyễn Thanh Ngọc Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

11 KS Vũ VănLợi Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

12 KS Đỗ Tất Thịnh Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

13 ThS Cao Văn Sơn Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

14 KS Lương Thị Hồng Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

15 KS Phạm Đức Thắng Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

16 KS Hy Tuấn Anh Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

17 KS Đỗ Thanh Tú Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

18 KS Dương Ngọc Kiên Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

19 KS Lã Thị Cúc Nghiên cứu viên Viện CN Giấy-Xenlulô

20 ThS Nguyễn Thị Hồng Liên Nghiên cứu viên Viện CN sinh học

VIỆN KH&CN VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

phamhop@ibt.ac.vn;

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 5, ngách 106/2 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

E-mail: tnhai@hn.vnn.vn

Website: http:/www.ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Trương Nam Hải

Số tài khoản: 931.01.064

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Công thương

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

1 4777/QĐ-BCT,

ngày 01/9/2008

Quyết định về việc giao nhiệm

Công văn chuyển kinh phí còn

dư năm 2008 tại kho bạc sang năm 2009

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

và khử màu nước thải sản xuất bột giấy

- 15 bảng số liệu; 05 đồ thị; 05 sơ đồ quy trình

- 02 bài báo trong Tạp chí Hóa học và

Tc Công nghệ sinh học

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Chủ nhiệm đề tài

Nghiên cứu quy trình công nghệ lên men vi sinh vật sản xuất enzym lignin peroxidase và laccase

Tổng hợp số liệu Viết báo cáo khoa học

Viết báo cáo tổng kết

- 08 bảng số liệu; 16 hình

và đồ thị; 02

sơ đồ quy trình

- 03 báo cáo định kỳ

- 05 bài báo khoa học

- Hồ sơ tổng kết nghiệm thu cấp cơ sở

và cấp Nhà nước

2 TS Nguyễn

Phương Nhuệ

NP Nhuệ, Phạm Thanh Huyền, PTH Thảo, ĐT Thịnh

Thư ký đề tài

Nghiên cứu đặc điểm sinh học

và bảo quản một số chủng vi sinh vật tự nhiên sinh enzym laccase được sử dụng

- 13 bảng số liệu

- 18 hình và

đồ thị

làm nguồn gen

3 ThS Phan Thị

Hồng Thảo

PTH Thảo, NV Hiếu, VV Lợi,

PT Huyền, ĐT Thịnh

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và môi trường lên men thích hợp cho các chủng VSV sinh enzym LiP

- 02 bảng số liệu

- 10 hình và

đồ thị

- 01 bài báo (Tạp chí CN sinh học)

4 TS Phí Quyết

Tiến PQ Tiến, VV Lợi, PTH Thảo Tạo chủng tái tổ hợp sinh

isoenzym lignin peroxidase

- Tạo được 01 chủng tái tổ hợp sinh isoenzym lignin peroxidase

- 01 bài báo (Tạp chí CN sinh học)

5 TS Lê Thị Thu

Hồng LTT Hồng, Nguyễn Thanh

Ngọc

Tạo chủng tái tổ hợp sinh enzym laccase

- Tạo được 01 chủng tái tổ hợp sinh enzym laccase

- 01 bài báo (Tạp chí CN sinh học)

6 ThS NCS

Nguyễn Văn

Hiếu

NV Hiếu, ĐT Thịnh, VV Lợi

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và môi trường lên men thích hợp cho các chủng VSV sinh enzym laccase

- 06 bảng số liệu

- 01 quy trình công nghệ lên men sinh tổng hợp enzym lignin peroxidase

- 01 quy trình công nghệ lên men sinh tổng hợp enzym laccase

8 ThS Vũ Thị

Hạnh Nguyên VTH Nguyên, PTH Thảo, VV Đánh giá chất lượng enzym

- 04 bảng số liệu

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzym phân hủy lignin trong tẩy trắng bột giấy

- 07 bảng số liệu

- 01 đồ thị

- 01 bài báo (Tạp chí CN sinh học)

10 KS Lương Thị

Hồng LT Hồng, Phạm Đức Thắng Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm

enzym phân hủy lignin trong khử màu nước thải bột giấy

- 08 bảng số liệu

- 04 đồ thị

- 02 bài báo (Tc Hóa học

và Tc CN sinh học)

1 Nội dung: Trao đổi kinh nghiệm

về công nghệ phân hủy sinh học

lignocellulose

Kinh phí: 53 triệu đồng

Địa điểm: Đại học Công nghệ

Suranaree, Nakhon Ratchasima,

Thái Lan

Số đoàn: 01

Nội dung: Trao đổi kinh nghiệm

về công nghệ phân hủy sinh học lignocellulose

Thời gian: 05 ngày Kinh phí: 53 triệu đồng

Địa điểm: ĐH Công nghệ Suranaree, Nakhon Ratchasima, Thái Lan

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm ) Ghi chú*

Không có

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế Thực tế

hoạch đạt được

1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo

chủng giống vi sinh vật tái tổ

hợp bằng công nghệ gen để

sản xuất enzym phân hủy

lignin

1/ 2008 đến 6/ 2009

05/2009

1/2008-Phí Quyết Tiến, Lê Thị Thu Hồng, Nguyễn Phương Nhuệ, Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Thanh Ngọc,

Vũ Văn Lợi 1.1 CV1 Tuyển chọn chủng vi sinh

vật tự nhiên có hoạt tính enzym

lignin peroxidase làm nguồn

gen

5/2009

1.2 CV2 Tuyển chọn chủng vi sinh

vật tự nhiên có hoạt tính enzym

laccase làm nguồn gen

5/2009

1.3 CV3 Nhân dòng gen lip mã

hóa cho 1-2 isoenzym của

lignin peroxidase

5/2009

1.4 CV4 Tạo chủng vi sinh vật tái

tổ hợp mang gen mã hóa cho

1-2 isoenzym của lignin

peroxidase Sàng lọc chủng tái

tổ hợp có khả năng biểu hiện

isoenzym lignin peroxidase cao

06/2010

1.5 CV5 Nhân dòng gen mã hóa

cho laccase

12/2009

1.6 CV 6 Tạo chủng vi sinh vật tái

tổ hợp mang gen mã hóa cho

laccase Sàng lọc chủng tái tổ

hợp có khả năng biểu hiện

enzym laccase cao

8/2008 đến 06/2010

Phạm Thị Bích Hợp, Hồ Tuyên, Nguyễn Văn

(quy mô phòng thí nghiệm) Hồng Thảo,

Phạm Thanh Huyền, Vũ Văn Lợi, Đỗ Tất Thịnh 2.1 CV1 Nghiên cứu khả năng

biểu hiện isoenzym LiP của

chủng tái tổ hợp trong bình tam

2.3 CV3 Tối ưu hóa môi trường

lên men sự phát triển và sinh

isoenzym LiP của chủng tái tổ

hợp

06/2010

2.4 CV4 Nghiên cứu động thái lên

men sinh tổng hợp isoenzym

LiP trên quy mô bình tam giác

06/2010

2.5 CV5 Nghiên cứu động thái lên

men sinh tổng hợp isoenzym

LiP trong hệ thống lên men quy

mô 7,5 lit.

06/2010

2.6 CV6 Xây dựng quy trình công

nghệ lên men sản xuất

isoenzym LiP quy mô 7,5 lit.

8/2008 đến 06/2010

Phạm Thị Bích Hợp, Hồ Tuyên, Nguyễn Văn Hiếu, Phan Thị Hồng Thảo, Phạm Thanh Huyền, Vũ Văn Lợi 3.1 CV1 Nghiên cứu khả năng

biểu hiện enzym laccase của

12/2009

chủng tái tổ hợp trong bình tam

3.3 CV3 Tối ưu hóa môi trường

lên men sự phát triển và sinh

laccaza của chủng tái tổ hợp.

06/2010

3.4 CV4 Nghiên cứu động thái lên

men sinh tổng hợp enzym

laccase tái tổ hợp trên quy mô

bình tam giác

06/2010

3.5 CV5 Nghiên cứu động thái lên

men sinh tổng hợp enzym

laccase tái tổ hợp trong hệ

thống lên men quy mô 7,5 lit.

06/2010

3.6 Xây dựng quy trình công nghệ

lên men sản xuất enzym laccase

tái tổ hợp quy mô 7,5 lit.

7/2010

4 Nội dung 4: Nghiên cứu ứng

dụng enzym phân hủy lignin

(lignin peroxidase, laccase )

trong tẩy trắng bột giấy

6/2008 đến 11/2009

6/2009 đến 06/2010

Cao Văn Sơn,

Hy Tuấn Anh,

Đỗ Thanh Tú, Dương Ngọc Kiên, Lã Thị Cúc, Phan Thị Hồng Thảo,

Vũ Văn Lợi 4.1 CV1 Nghiên cứu thành phần

hóa học và lý học của nguyên

liệu gỗ keo tai tượng.

5/2009

4.2 CV2 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân hủy lignin để tiền

xử lý dăm mảnh trong quá trình

sản xuất bột cơ học.

06/2010

4.3 CV3 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân hủy lignin để tiền

xử lý dăm mảnh trong quá trình

nấu bột sunphat

06/2010

4.4 CV4 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân hủy lignin trong

quá trình tẩy trắng bột giấy.

06/2010

5 Nội dung 5: Nghiên cứu ứng

dụng enzym phân hủy lignin

trong khử màu nước thải

chứa lignin và dẫn xuất

6/2008 đến 11/2009

6/2009 đến 06/2010

Lương Thị Hồng, Phạm Đức Thắng, Phan Thị Hồng Thảo, Vũ Văn Lợi

5.1 CV1 Xác định tính chất lý-hóa

đặc trưng của nước thải rửa bột

giấy sau nấu dùng cho tẩy

trắng

5/2009

5.2 CV2 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân huỷ lignin để xử lý

nước thải rửa bột giấy sau nấu

06/2010

5.3 CV3 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân huỷ lignin kết hợp

với biện pháp hóa học để xử lý

nước thải rửa bột giấy sau nấu

06/2010

5.4 CV4 Nghiên cứu ứng dụng

enzym phân huỷ lignin kết hợp

với biện pháp sinh học kỵ khí

để xử lý nước thải rửa bột giấy

sau nấu.

06/2010

5.5 CV5 Nghiên cứu sử dụng

enzym phân huỷ lignin kết hợp

với biện pháp sinh học hiếu khí

để xử lý nước thải rửa bột giấy

8/2009 đến 06/2010

Vũ Thị Hạnh Nguyên, Phan Thị Hồng Thảo, Vũ Văn Lợi

6.1 CV1 Phân tích đánh giá chất

lượng của enzym lignin

peroxidase (hoạt tính trong dịch

06/2010

lên men, hoạt tính riêng, độ bền

nhiệt, độ bền với pH) sau khi

thu hồi.

6.2 CV2 Phân tích đánh giá hoạt

tính của chế phẩm enzym lignin

peroxidase theo thời gian bảo

quản

06/2010

6.3 CV3 Phân tích đánh giá chất

lượng enzym laccase (hoạt tính

trong dịch lên men, hoạt tính

riêng, độ bền nhiệt, độ bền với

pH, điều kiện và thời gian bảo

quản)

06/2010

6.4 Phân tích đánh giá hoạt tính của

chế phẩm enzym laccase theo

thời gian bảo quản

06/2010

7 Nội dung 7: Đánh giá hiệu

quả kinh tế.

6/2009 đến 12/2009

6/2009 đến 08/2010

Phạm Thị Bích Hợp, Hồ Tuyên, Phan Thị Hồng Thảo, Cao Văn Sơn, Lương Thị Hồng

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1000 nkat/l dịch lên

06 chủng được định tên; hoạt tính 800-1000 nkat/l dịch lên men.

01 chủng, hoạt tính

8777 nkat/l dịch lên men

300 nkat/l dịch lên men

02 chủng được định tên; hoạt tính 2200 -

3100 nkat/l dịch lên men

01 chủng, hoạt tính

3641 nkat/l dịch lên men

Thực tế đạt được

1 Qui trình công nghệ sản

xuất chế phẩm enzym

lignin peroxidase tái tổ

hợp bằng lên men vi sinh

enzym vào tiền xử lý dăm mảnh bột giấy có chất lượng tương đương nhưng giảm được 10% lượng kiềm Bột giấy có

độ trắng và chất lượng tương đương với bột tẩy theo quy trình ECF, nhưng mức dùng clo hoạt tính giảm 20%

4 Kết quả ứng dụng enzym

lignin peroxidase và

laccase trong khử màu

nước thải và dẫn xuất

Bảng số liệu - 08 bảng số

liệu; 04 đồ thị;

02 sơ đồ quy trình.

Thử nghiệm

ở quy mô phòng thí nghiệm Giảm được

độ màu của nước thải 10- 15% so với

xử lý bằng phương pháp khác.

học

- Tạp chí CN sinh học

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

Viện CN Giấy

và Xenluylô,

59 Vũ Trọng Phụng, Thanh Xuân, Hà Nội

- Ngâm ủ dăm mảnh nguyên liệu với enzyme theo quy trình sulfate giảm 10% lượng kiềm

- Xử lý bột giấy với enzym trước các giai đoạn tẩy trắng ECF cho phép giảm 20% mức dùng chlorin dioxit Bột sau tẩy trắng

có chất lượng tương đương với bột giấy tiêu chuẩn

2 Thử nghiện chế phẩm

enzym trong khử màu

nước thải rửa bột giấy

06/2009 đến 4/2010

Viện CN Giấy

và Xenluylô,

59 Vũ Trọng Phụng, Thanh Xuân, Hà Nội

Xử lý nước thải rửa bột giấy bằng enzym cho kết quả: độ màu giảm 73,3%, COD giảm 23,3%, BOD

giảm 53,8% và hàm lượng lignin giảm 62% so với đối chứng

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

- Đã thành lập được bộ sưu tập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh lignin peroxidase và laccase, phù hợp với phạm vi ứng dụng của đề tài

- Đã làm chủ được công nghệ tạo chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp enzym cao

để có thể đưa vào ứng dụng (quy mô phòng thí nghiệm)

- Đã làm chủ được quy trình công nghệ lên men sản xuất các enzym tái tổ hợp, các quy trình thử nghiệm trong tẩy trắng bột giấy và xử lý nước thải rửa bột giấy

- Bước đầu thử nghiệm có hiệu quả trong tẩy trắng bột giấy và xử lý nước thải nghành giấy ở quy mô nhỏ, làm giảm lượng hóa chất sử dụng trong sản xuất, nghĩa là giảm lượng xả thải hóa chất độc hại ra môi trường

- Đã nâng cao được trình độ cán bộ trong nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzym để tiến tới sản xuất enzym ở quy mô lớn hơn

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Công nghiệp giấy vốn là một trong những ngành sản xuất gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu sử dụng enzym phân hủy lignin trong xử lý nguyên liệu gỗ, tẩy trắng bột giấy và

xử lý nước thải rửa bột giấy Cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu vấn đề này, và chưa có doanh nghiệp nào sử dụng enzym trong sản xuất bột giấy Tích hợp sử dụng enzym trong công nghiệp giấy góp phần giảm lượng hóa chất sử dụng trong sản xuất, nghĩa là giảm hóa chất độc hại trong nước thải, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:

I Báo cáo định kỳ

Lần 1 11/5/2009 Đề tài triển khai theo đúng

tiến độ Lần 2 7/12/2009 Đề tài triển khai theo đúng

tiến độ Lần 3 15/6/2010 Đề tài triển khai theo đúng

Chủ tịch Hội đồng:

PGS.TS Quyền Đình Thi

IV Nghiệm thu cấp Nhà nước 19/ 8/ 2011 Hội đồng nghiệm thu cấp Nhà

nước đánh giá đạt loại Khá (điểm trung bình 80,43) Chủ tịch Hội đồng:

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC

2 Công nghiệp giấy và ô nhiễm môi trường nước 5 2.1 Các nguồn nước thải từ nhà máy sản xuất bột giấy và giấy 5 2.2 Những tiến bộ trong công nghệ tẩy trắng bột giấy 7

3.1 Quy mô sản xuất bột giấy và giấy ở Việt Nam 8 3.2 Những công nghệ sản xuất giấy đang được áp dụng ở Việt

Nam

9

5 Ứng dụng enzym vi sinh vật trong công nghiệp giấy 12

1 Nội dung 1

1.1 Vật liệu và chủng giống vi sinh vật

18

18

1.3 Tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh enzym lignin peroxidase 22 1.4 Tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh laccase 25

2 Nội dung 2 và 3

2.1 Vật liệu và môi trường nuôi cấy

28

28

2.2 Nghiên cứu khả năng biểu hiện LiP H8 và LAC1 trong bình

5.2 Phân tích, đánh giá chất lượng sản phẩm laccase 46

1.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng phân hủy

lignin

48

1.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật tự nhiên có hoạt tính enzym LiP

và laccase làm nguồn gen

49

1.3 Tạo chủng tái tổ hợp sinh lignin peroxidase H8 57 1.4 Tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh laccase 67

Nội dung 2

2.1 Nghiên cứu khả năng biểu hiện isoenzym LiP của chủng tái tổ

hợp trong bình tam giác

84

85

2.2 Nghiên cứu môi trường và chế độ cảm ứng cho sự phát triển và

sinh LiP H8 của chủng C131

87

2.3 Tối ưu hóa môi trường lên men sinh LiP H8 tái tổ hợp 90

2.5 Động thái lên men trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lít 94 2.6 Quy trình sản xuất lignin peroxidase tái tổ hợp quy mô phòng

thí nghiệm

96

Nội dung 3

3.1 Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển và sinh

enzym laccase của chủng tái tổ hợp PpLAC

3.4 Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất laccase tái tổ

hợp quy mô bình lên men 7,5 lít

4.2 Nghiên cứu ứng dụng enzym phân hủy lignin trong xử lý

nguyên liệu dăm mảnh gỗ

127

4.3 Nghiên cứu ứng dụng enzym phân huỷ lignin vào trong các

giai đoạn tẩy trắng bột hoá học

thải rửa bột giấy sau nấu

146

5.4 Xác định thời gian xử lý enzym thích hợp 148 5.5 Nghiên cứu ứng dụng enzym kết hợp với xử lý hoá lý 149

5.6 Khảo sát khả năng kết hợp enzym với quy trình kỵ khí trong

xử lý nước thải rửa bột giấy

150

5.7 Nghiên cứu sử dụng enzym kết hợp với biện pháp sinh học

hiếu khí để xử lý nước thải

153

5.8 Quy trình thử nghiệm ứng dụng enzym lignin peroxidase và

laccase trong khử màu nước thải rửa bột giấy

7.2 Đánh giá tính khả thi kinh tế-kỹ thuật khi ứng dụng enzym vào

giai đoạn tiền xử lý dăm mảnh và tẩy trắng bột giấy trong quá trình

sản xuất giấy

179

7.3 Đánh giá hiệu quả kinh tế-kỹ thuật sử dụng enzym cho xử lý

nước thải giấy

786

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Chú thích

2,4-DCP 2,4-dichlorophenol

ADN Axit deoxyribonucleic

AOX1 Alcohol oxidase gene

APMP Alkaline peroxide mechanical pulp

ARN Axit ribonucleic

ATP Adenosine triphosphate

BMG Môi trường BMG (Xem “Vật liệu và phương pháp nghiên

cứu”) BMGY Môi trường BMGY (Xem VL&PP)

BMM Môi trường BMM (Xem VL&PP)

BMMY Môi trường BMMY (Xem VL&PP)

BOD Biological oxygen demand

BSA Bovine serum albumin

CAI Tần số mã bộ ba phù hợp

CFU Cell formation unit

CIAP Calf intestine alkaline phosphatase

CMC Carboxylmethyl cellulose

COD Chemical oxygen demand

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DTPA Diethylenetriamine penta-acetic acid (pentetic acid)

ECF Elemental chlorine free

EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

LiP Lignin peroxidase

LiP H8 Lignin peroxidase H8 (isozyme)

MD Môi trường MD (Xem VL&PP)

MM Môi trường MM (Xem VL&PP)

MnP Manganese peroxidase

PCR Polymerase chain reaction

pI Isoelectric point

RBBR Remazol Brilliant Blue R

rpm Revolution per minute

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium dodecyl

TAE Tris acetate EDTA

TAPPI Technical Association of Pulp and Paper Industry

TCF Totally chlorine free

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH MỤC BẢNG

1.1 Đặc điểm nuôi cấy của một số chủng xạ khuẩn 50 1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzym phân huỷ lignin của một số

1.7 So sánh mức độ phù hợp mã bộ ba của gen mlac1 và lac1 để

biểu hiện trong nấm men P pastoris

3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh laccase của chủng PpLAC trên

các môi trường nghiên cứu

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và biểu

hiện laccase của chủng tái tổ hợp

Thành phần môi trường BMGY tối ưu cho lên men sinh

laccase của chủng PpLAC

113

114

3.6 Động thái lên men sinh laccase của chủng PpLAC 115 4.1 Thành phần hóa học của gỗ keo tai tượng 126 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzym LiP H8 và LAC1 trong giảm

4.5 Ảnh hưởng của quá trình xử lý enzym tới tính chất cơ lý của

bột cơ học APMP

132

4.6 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzym tới độ trắng và tính

chất cơ lý của bột giấy

6.3 Biến động của hoạt tính LiP khi bổ sung veratryl alcohol và

glycerol trong quá trình bảo quản

7.5 Chi phí hoá chất cho môi trường lên men quy mô 80 lít 177 7.6 Vật tư tiêu hao khi lên men quy mô 80 lít 178 7.7 Điện nước và nhân công cho lên men quy mô 80 lít 178 7.8 Ước tính giá thành sản xuất bột giấy bằng phương pháp

7.10 Đánh giá sơ bột vật tư hoá chất trên một tấn bột giấy APMP 182 7.11 So sánh công nghệ sản xuất bột APMP thông thường và

7.15 So sánh các phương pháp xử lý màu nước thải rửa bột giấy

thông thường và phương pháp có sử dụng enzym

188

DANH MỤC HÌNH

1.1 Khả năng phân giải RBBR và Guaiacol của một số chủng

nấm

49

1.2 Khả năng phân huỷ guaiacol và RBBR của xạ khuẩn 49

1.3 Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng HX 10.7 52

1.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại từ DNA tổng số của

chủng HX10.7

54

1.6 Sợi nấm CP22N1 trên môi trường nước chiết khoai tây 55

1.7 Sợi nấm CP2N3 dưới kính hiển vi Olympus 55

1.9 Một số đặc điểm của hệ sợi nấm đảm Basidiomyces 56

1.10 Điện di kiểm tra RNA tổng số của nấm đảm 58

1.11 Điện di kiểm tra cDNA đã tổng hợp được từ RNA tổng số

1.13 Điện di kiểm tra vector tách dòng có gắn sản phẩm PCR đã

tinh sạch pCR2.1::mlipH8 và pCR2.1::lipH8

60

1.14 So sánh trình tự axit amin của LiP H8 từ chủng P

chrysosporium 36210 với các chủng P chrysosporium

1.16 Điện di kiểm tra vector biểu hiện pPIC9::mlipH8 64

1.17 Điện di kiểm tra sự có mặt của gen mlipH8 với khuôn

DNA là bộ gen của nấm men P pastoris tái tổ hợp

1.20 So sánh trình tự gen sau khi tối ưu hóa và trình tự gen mã

hóa cho laccase từ chủng C unicolor FCL 139

73

1.21

1.22

So sánh trình tự protein mã hóa bởi gen mlac1 trước và sau

khi cải biến

So sánh hàm lượng GC trung bình trong gen lac1 trước và

sau khi cải biến

73

74

1.23 So sánh chỉ số phù hợp CAI giữa gen lac1 ban đầu và sau

khi cải biến

1.27 Kết quả tách DNA hệ gen nấm men tái tổ hợp 79

1.28 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen lac1 trong hệ gen nấm

1.30 Hoạt tính của laccase tái tổ hợp của các chủng tuyển chọn 82

2.1 Kết quả điện di LiP H8 của một số chủng đại diện 86

2.2 Biểu hiện LiP H8 của chủng C131 trong một số môi

2.5 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và nồng độ pepton

đến sinh trưởng và sinh LiP H8 của chủng C131

91

2.6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng biểu

hiện LiP H8 của chủng C131

92

2.7 Động thái quá trình lên men sinh LiP H8 của chủng

C131 trong bình tam giác

93

2.8 Động thái quá trình lên men sinh LiP H8 của chủng 94

3.1 Khả năng biểu hiện laccase trong các môi trường khác

nhau của chủng PpLAC

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và nồng độ pepton

đến khả năng sinh laccase của chủng PpLAC

113

3.5 Động thái lên men sinh laccase của chủng PpLAC trong

bình Bioflo 110 trong môi trường BMGY và môi trường

muối khoáng

116

3.6 Động thái lên men sinh laccase của chủng PpLAC trong

môi trường BMGY

117

4.1 Mức độ phân hủy lignin trong dăm mảnh bởi enzym 129 5.1 Ảnh hưởng của mức dùng enzym tới hiệu suất xử lý 147 5.2 Kết quả xử lý enzym theo thời gian 148 5.3 Kết quả xử lý nước thải bằng enzym sau 72 giờ 149 6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính LiP 164

6.3 Ảnh hưởng của pH đệm tới hoạt tính của LiP H8 165 6.4 Biến động của hoạt tính LiP H8 trong quá trình bảo quản 167 6.5 Biến động của hoạt tính LiP H8 trong quá trình bảo quản

có bổ sung glycerol

168

6.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền hoạt tính của laccase 170 6.7 Ảnh hưởng của pH đệm đến hoạt tính laccase 171 6.8 Hoạt tính laccase trong quá trình bảo quản ở 4ºC 172 6.9 Hoạt tính laccase trong quá trình bảo quản ở 0o

Trong hoạt động công nghiệp nói chung, sản xuất bột giấy và giấy tiêu thụ nước nhiều nhất, và đứng thứ ba (sau công nghiệp hóa chất và thép) về thải khí gây hiệu ứng nhà kính Quá trình chế biến từ gỗ thành giấy trắng phải qua nhiều công đoạn xử lý bằng hóa chất, trong đó sử dụng các tác nhân oxy hóa chứa clo để tẩy trắng bột giấy Vì vậy, nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo rất độc hại được tạo ra và đi vào nước xả thải, khiến cho công nghiệp giấy cũng

là một ngành sản xuất có thể gây ô nhiễm môi trường nặng nề

Ở Việt Nam, ngành công nghiệp giấy còn phát triển chậm so với thế giới cả về trình độ và quy mô sản xuất Cả nước có khoảng 300 doanh nghiệp, chủ yếu là các doanh nghiệp vừa và nhỏ, trình độ công nghệ lạc hậu Tổng sản lượng bột giấy và giấy là xấp xỉ 787.000 tấn/ năm Nhiều sản phẩm giấy với chất lượng cao phải nhập khẩu với số lượng khoảng 500.000 tấn/ năm Trong

vào năm 2010 và 1.800.000 tấn vào năm 2020, nghĩa là cần có sự gia tăng sản xuất gấp 2 ÷ 3 lần Điều này đồng nghĩa với gia tăng nguy cơ gây ô nhiễm môi trường trầm trọng hơn mức hiện nay, nếu như phát triển sản xuất không

đi kèm với áp dụng các công nghệ thân thiện với môi trường và tăng cường giám sát việc xử lý chất thải của nhà máy

Trong những năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất giấy được quan tâm nghiên cứu nhằm xây dựng các quy trình thân thiện với môi trường hơn Các enzyme phân hủy lignin có nguồn gốc từ vi sinh vật như laccase, lignin peroxidase, mangan peroxidase và một số loại khác có thể được tích hợp vào quá trình sản xuất nhằm giảm sử dụng hóa chất và nâng cao chất lượng của bột giấy tẩy trắng Tính khả thi của công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp cho phép cải thiện quá trình sản xuất enzyme nhờ tăng hiệu suất sinh tổng hợp, tăng hiệu suất thu hồi enzyme do giảm hoặc loại bỏ các phản ứng phụ và tăng cường chức năng hoạt động của enzyme, ví dụ cải thiện tính

ổn định của hoạt tính v.v

Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme lignin peroxidase và laccase từ vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy” với mong muốn góp phần vào sự phát triển của công nghiệp sản xuất enzyme và đặc biệt là phát triển ứng dụng enzyme trong công nghiệp sản xuất bột giấy ở nước ta Các nội dung chính của đề tài là tạo chủng

vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp hai enzyme lignin peroxidase và laccase; nghiên cứu xây dựng quy trình lên men sản xuất enzyme và thử nghiệm sử dụng enzyme trong tẩy trắng bột giấy và xử lý nước thải rửa bột giấy ở quy

mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1 LIGNIN

1.1 Lignin trong tự nhiên

Trong thành phần của gỗ bao gồm nhiều hợp chất, chủ yếu là các chất trích ly, hydratcacbon và lignin Các thành phần này được phân bố không đều nhau, tùy thuộc vào các mô và bộ phận của cây Từ "lignin" có nguồn gốc từ

tiếng Latin lignum, nghĩa là "gỗ"

Lignin là polyme phenylpropanoid phức tạp, được cấu trúc từ ba rượu thơm coniferyl, sinapsyl và p-coumaryl Các tiền chất này tạo nên các tiểu

đơn vị (subunit) guaiacyl-, syringyl- và p-hydroxyphenyl- của phân tử lignin

Phân tử lignin được mô tả có dạng lưới ba chiều ngẫu nhiên với những đơn vị được kết nối rất phức tạp (hình 1) Lignin là một trong số những vật liệu sinh học phong phú nhất trên trái đất, chỉ đứng sau cellulose và hemicellulose và chiếm 15 ÷ 25% sinh khối khô của thực vật Đại phân tử này đóng vai trò rất quan trọng đối với cây Lignin tạo độ cứng cho cây, làm giảm sự thẩm thấu của nước qua thành tế bào mô xylem, bảo đảm vận chuyển nước và dinh dưỡng trong cây Lignin còn ngăn cản sự xâm nhập của các enzyme phân hủy qua thành tế bào thực vật, nhờ đó bảo vệ cây khỏi bị phân hủy Khi cây chết

đi, lignin bị phân hủy chậm nhất so với các thành phần khác của cây và nhả dần cacbon vào môi trường tự nhiên

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc phân tử lignin.

Các kiểu liên kết chính là: aryl glycerol-β-aryl ether (1-2, 2-3, 4-5, 6-7, 7-8); benzyl aryl ether (15-16); phenylcoumaran (3-4); biphenyl (5-6, 11-12); 1,2- diarylpropane (8-9); diaryl ether (8-10) (Nguồn: Saul et al., Enzymatic bleaching

of wood pulp.)

1.2 Giá trị sử dụng của lignin

Trong nhiều thế kỷ, con người coi gỗ càng có nhiều lignin thì càng có giá trị sử dụng cao, vì gỗ càng chắc và dùng được trong nhiều việc Lignin cũng cháy rất hiệu quả nên gỗ có hàm lượng lignin cao thường được coi là nhiên liệu Lignin tách ra từ gỗ có thể sử dụng trong nhiều việc như làm tác nhân tạo nhũ tương, chất kết dính hoặc chất phân tán, có thể dùng sản xuất sơn hoặc làm đường Vì thế, nhiều cơ sở sản xuất bột giấy và chế biến gỗ coi lignin là sản phẩm phụ có giá trị và bán lignin cho các ngành sản xuất khác Lignin quan trọng đối với cây và hữu ích đối với con người như vậy, nhưng trong giấy thì lignin là thành phần không mong muốn và cần phải loại bỏ, vì

lignin làm cho giấy có màu vàng và giòn, khó lưu trữ được lâu Để thực hiện việc này, thông thường dăm mảnh nguyên liệu gỗ được nấu với hóa chất ở nhiệt độ nhất định nhằm hòa tan lignin và một số chất hữu cơ Bột giấy sau khi nấu có màu sẫm của các hợp chất lignin biến tính còn lẫn trong đó, do vậy cần phải tẩy trắng bằng hóa chất như clo, dioxit clo và xút

2 CÔNG NGHIỆP GIẤY VÀ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG NƯỚC

2.1 Các nguồn nước thải từ nhà máy sản xuất bột giấy và giấy

Sản xuất bột giấy và giấy là ngành công nghiệp tiêu thụ một lượng lớn nguyên liệu thực vật và nước Nước thải từ nhà máy gồm 3 dòng chính như sau:

- Dòng thải từ quá trình nấu và rửa sau nấu chứa phần lớn các chất hữu cơ hòa tan, các hóa chất nấu và một phần xơ sợi Dòng thải có màu tối sẫm nên thường gọi là “dịch đen” Dịch đen có hàm lượng chất khô khoảng 25 ÷ 35%,

tỷ lệ giữa chất hữu cơ và chất vô cơ vào khoảng 70/30

- Dòng thải từ công đoạn tẩy trắng của các nhà máy sản xuất bột giấy bằng phương pháp hóa học và bán hóa học thường chứa các hợp chất hữu cơ, lignin hòa tan và hợp chất tạo thành của những chất đó với chất tẩy ở dạng độc hại,

có khả năng tích tụ sinh học trong cơ thể sống như các hợp chất clo hữu cơ (AOX)

- Dòng thải từ quá trình nghiền bột và xeo giấy chủ yếu chứa xơ sợi mịn, bột giấy ở dạng lơ lửng và các chất phụ gia như nhựa thông, phẩm màu, cao lanh v.v

Nước thải sau nấu và rửa bột giấy

Bột giấy hóa học dùng được sản xuất bằng cách nấu dăm mảnh nguyên liệu thực vật với hóa chất ở điều kiện và nhiệt độ nhất định Quá trình nấu sẽ hòa tan lignin và một số chất hữu cơ, phần còn lại là bột giấy gồm cellulose

và một phần hemicellulose Ở các nhà máy sản xuất bột giấy có hệ thống thu

được rửa bằng nước với lượng sử dụng từ 20 ÷ 60 m3

cho một tấn bột giấy (chưa tẩy trắng), phụ thuộc vào trình độ công nghệ của nhà máy

Các chất hữu cơ có trong dịch đen chủ yếu là các sản phẩm phân huỷ lignin, hydroxy axit mạch thẳng, axit bay hơi, ete hòa tan không bay hơi bao gồm phenol, chất thơm có độ trùng hợp thấp, axit béo, nhựa và một số hợp chất khác Tính chất hóa lý của dịch đen, tỷ lệ các chất vô cơ và hữu cơ cũng như tỷ lệ giữa các nhóm chất hữu cơ trong dịch đen phụ thuộc vào nguyên liệu cũng như chế độ công nghệ nấu bột giấy

Quá trình nấu gỗ đã phân giải và chuyển vào dịch đen khoảng 10% cellulose; 23 ÷ 26% lignin; 8% pentozan; 7% hexozan và tất cả các chất nhựa khoảng 4% so với khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối

Hàm lượng lignin trong dịch đen chiếm khoảng 50% các hợp chất hữu

cơ, là hỗn hợp các chất thơm với phân tử lượng khác nhau Khoảng 70 ÷ 80% lignin kiềm ở dạng keo hòa tan, có thể kết tủa được thành dạng bột xốp có màu vàng hoặc nâu trong môi trường axit Còn lại 20 ÷ 30% có phân tử lượng thấp được gọi là lignin hòa tan, là phần không kết tủa được khi pH thay đổi Lignin và các dẫn xuất là nguyên nhân chính làm cho nước thải ngành giấy có

độ màu rất cao, và nếu xả thẳng vào môi trường nước sẽ gây ô nhiễm trầm trọng [Dashtban et al., 2010; Pokhrel and Viraraghavan, 2004; Raj et al., 2007; Sakar et al., 1994]

Từ dịch đen có thể thu hồi hóa chất và chế biến thành các sản phẩm hữu ích như: than hoạt tính, phân bón hóa học, phụ gia làm đường, keo dán, thuốc nhuộm, axit hữu cơ v.v

Nước thải từ quá trình tẩy trắng bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy, clo vốn được coi là tác nhân tẩy trắng hiệu quả nhất nên được sử dụng rộng rãi và liên tục cho tới cuối thế kỷ

20 Các loại bột giấy sau tẩy bằng clo thường có độ trắng và độ bền cơ lý cao

do tác động khử lignin có tính chọn lọc tốt của clo và các hợp chất của nó

Tuy nhiên, nước thải rửa bột giấy sau nấu và tẩy trắng có độ màu rất cao do chứa lignin và các dẫn xuất của lignin ở dạng trùng ngưng và clo hóa, ví dụ 2,3,7,8-tetra chloro dibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD), 2,3,7,8-tetra chloro dibenzo furan (2,3,7,8-TCDF), pentachlorophenol v.v Đây là những hợp chất rất độc hại đối với hệ sinh thái dưới nước và sức khỏe con người nhưng lại khó bị phân hủy Đã có nhiều tài liệu thống kê sự gia tăng các bệnh như hen suyễn, bệnh phổi, ung thư, rối loạn hocmon, dị ứng v.v trong những công nhân ngành sản xuất giấy và cộng đồng dân cư sống gần nhà máy giấy Sự quan tâm của toàn xã hội tới môi trường và những quy định ngày càng chặt chẽ về tiêu chuẩn xả thải là áp lực khiến cho ngành sản xuất giấy phải liên tục cải tiến quy trình để hạn chế, thậm chí tiến tới bỏ sử dụng hóa chất độc hại trong tẩy trắng bột giấy

2.2 Những tiến bộ trong công nghệ tẩy trắng bột giấy

Năm 1970 đánh dấu một bước thay đổi lớn trong công nghệ tẩy trắng bằng việc lần đầu tiên giai đoạn clo hóa được thay thế hoàn toàn bằng giai đoạn tách loại lignin bằng oxy-kiềm Cải tiến này đã làm giảm đáng kể tính độc hại cũng như lượng thải của các hợp chất clo hữu cơ (AOX) có trong nước thải Bắt đầu từ năm 1985, những tiến bộ trong công nghệ nấu cho bột giấy có trị số kappa khá thấp mà chất lượng vẫn đảm bảo Bột sau nấu được khử lignin bằng oxy-kiềm và kết hợp với một số giai đoạn tẩy bằng dioxit clo, hình thành quy trình tẩy trắng không sử dụng clo nguyên tố (Elemental Chlorine Free, ECF) Ngày nay, công nghệ ECF đã trở thành công nghệ được phổ biến rộng rãi trên thế giới với nhiều quy trình tiên tiến và hiệu quả Theo thống kê, tính tới năm 2004, sản lượng bột Kraft tẩy trắng bằng công nghệ ECF chiếm tới 75% sản lượng bột hóa học tẩy trắng trên thế giới

Trong những năm gần đây đã có những nghiên cứu triển khai các công nghệ tẩy trắng bột không sử dụng clo và các hợp chất của clo (Totally