Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus viêm não nhật bản ở các vùng địa lý khác nhau của việt nam và ấn độ

Nghiên cứu về dịch tễ phân tử của một số chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam cho thấy: Các chủng virus VNNB phân lập từ muỗi, từ bệnh nhân trước năm 1990 thuộc nhóm genotype 3.. Nghiên

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ

TÊN NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VỀ GEN CỦA VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN Ở CÁC VÙNG ĐỊA LÝ KHÁC NHAU CỦA VIỆT NAM VÀ ẤN ĐỘ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS TS PHAN THỊ NGÀ

Hà Nội - 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƢ

TÊN NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VỀ GEN CỦA VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN Ở CÁC VÙNG ĐỊA LÝ KHÁC NHAU CỦA VIỆT NAM VÀ ẤN ĐỘ

BỘ Y TÊ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

1 Tên đề tài, dự án: “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus Viêm

não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”

Mã số: 36/2008/HĐ - NĐT

Thuộc: Đề tài hợp tác quốc tế về Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thư

2 Thời gian thực hiện : 01/2008- 11/2010

3 Tổ chức chủ trì: Bộ Y tế

4 Cơ quan chủ quản: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

5 Tác giả thực hiện đề tài trên gồm những người có tên trong danh sách sau:

Số

TT

Chức danh khoa học, học vị,

1 PGS TS Phan Thị Ngà Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

2 PGS TS Nguyễn Trần Hiển Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

3 BS Đỗ Phương Loan Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

4 CN Nguyễn Viết Hoàng Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

5 KS Bùi Minh Trang Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

6 CN Lê Thị Hiền Thu Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

7 Ths Hoàng Minh Đức Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

8 TS Nguyễn Thị Lan Anh Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ

9 TS Vũ Thị Quế Hương Viện Pasteur TP HCM

10 ThS Huỳnh Thị Kim Loan Viện Pasteur TP HCM

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì đề tài

PGS TS Phan Thị Ngà PGS TS Đặng Đức Anh

BỘ Y TÊ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THAM GIA

ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

1 Tên đề tài, dự án: “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus Viêm

não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”

4 Cơ quan chủ quản: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

5 Tác giả tham gia đề tài trên gồm những người có tên trong danh sách sau:

Số

TT

Chức danh khoa học, học vị,

1 Ths Tống Thị Hà Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

2 Ths Trần Thị Nguyệt Lan Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

3 Ths Đặng Thu Thảo Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

4 TS Nguyễn Thị Thùy Dương Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

5 BS Nguyễn Thị Kim Khánh Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

6 Ths Lại Thị Minh Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

7 Ths Nguyễn Hoàng Lê Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

8 CN Nguyễn Thị Yên Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

9 BS Đặng Thanh Minh Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang

10 BS Lâm Văn Tuấn Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang

11 Ths Nguyễn Thị Hiển Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Bắc Giang

12 TS Đặng Đình Thoảng Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Hà Nam

13 Ths Lê Phụng Đại Trung Tâm Y tế dự phòng tỉnh Thanh Hoá

14 CN Phan Thị Tuyết Nga Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên

15 BS Đỗ Thị Tam Giang Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên

16 GS TS Đặng Tuấn Đạt Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên

17 BS Nguyễn Thị Nam Liên Bệnh viện đa khoa Trung ương Huế

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì đề tài

PGS TS Phan Thị Ngà PGS TS Đặng Đức Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài ……… 3

1.1.1 Sự lan rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý …… 3

1.1.2 Dịch tễ học phân tử sự xuất hiện virus VNNB ở khu vực châu Á …… 10

1.1.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu trên thế giới ……… 13

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài ……… 16

1.2.1 Bệnh VNNB và véc- tơ truyền VNNB tại Việt Nam ……… 16

1.2.2 Tình hình nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt Nam 18

1.2.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu virus VNNB ở Việt Nam ……… 20

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 21

2.1 Vật liệu, trang thiết bị hóa chất sử dụng cho nghiên cứu……… 21

2.1.1 Dụng cụ, trang thiết bị……… 21

2.1.2 Hóa chất, sinh phẩm……… ……… 21

2.1.3 Trình tự nucleotide vùng gen E…….……… 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu ……….……… 24

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thực hiện mục tiêu 1: “Xác định đặc điểm

các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ” 24

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu phân tích để thực hiện mục tiêu 2: “Xác

định sự liên quan giữa những biến thể genotype khác nhau”……… 39 2.2.3 Nghiên cứu phân tích để thực hiện mục tiêu 3: “Xác định sự thay đổi

genotype virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở hai nước (Ấn Độ và

Việt Nam)”………

41

2.2.4 Nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu phân tích để thực hiện mục

tiêu 4: “Xác định sự tác động qua lại giữa virus và véc-tơ”……… 43

3.1 Xác định đặc điểm các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam

3.2 Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác

nhau của virus VNNB ở Việt Nam ……… 52 3.2.1 So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự các chủng virus VNNB phân lập từ

3.2.2 So sánh cặp và sắp xếp đa trình tự các chủng virus VNNB phân lập từ

3.3 Xác định sự thay đổi trong genotype của virus VNNB ở một số vùng

dịch khác nhau ở hai nước (Ấn Độ và Việt Nam) ……… 57 3.3.1 Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau

4.1 Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định đặc điểm genotype của

virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ……… 73 4.1.1 Bàn luận về phương pháp sử dụng để xác định đặc điểm genotype của

virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ……… 73 4.1.2 Bàn luận về kết quả xác định đặc điểm genotype của virus VNNB lưu

hành ở Việt Nam và Ấn Độ……… 77 4.2 Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự liên quan di truyền

giữa những biến thể genotype khác nhau ở Việt Nam 82 4.2.1 Bàn luận về phương pháp xác định sự liên quan di truyền giữa những

biến thể genotype khác nhau ở Việt Nam……… 82 4.2.2 Bàn luận về kết quả xác định sự liên quan di truyền giữa những biến

thể genotype khác nhau ở Việt Nam……… 83 4.3 Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự thay đổi của virus

VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam……… 88 4.3.1 Bàn luận về phương pháp xác định sự thay đổi của virus VNNB ở

một số vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam……… 88 4.3.2 Bàn luận về kết quả xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số

vùng dịch khác nhau ở Ấn Độ và Việt Nam……… 89 4.4 Bàn luận về phương pháp và kết quả xác định sự tác động qua lại giữa

5.2 Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác

5.3 Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở

hai nước (Ấn Độ và Việt Nam)……… 99

5.4 Xác định sự tác động qua lại giữa virus và véc-tơ……… 99

6 Kiến nghị……… 100

6.1 Sử dụng chủng sản xuất vaccin phòng bệnh VNNB……… 100

6.2 Ứng dụng qui trình chẩn đoán và nghiên cứu virus VNNB……… 100

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú giải tiếng Anh Chú giải tiếng Việt

Arbo virus Arthropod borne virus Virus truyền do côn trùng tiết túc BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò

CDC Center for Disease Control

and Prevention

Trung tâm kiểm soát bệnh dịch

ELISA Enzyme Linked

Immunosorbent Assay

Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym

EMEM Eagle Minimum Essential

Nucleotide/bp base pair Cặp bazơ

PBS Phosphate-buffered saline Đệm muối phốt phát

PBS- T Phosphate-buffered saline –

Tween

Đệm muối phốt phát có Tween

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

PFU Plaque Forming Unit Đơn vị tạo đám hoại tử

RT - PCR Reverse Transcriptase

polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại chuỗi sao chép ngược

RdRP RNA dependent RNA

polymerase

ARN polymerase phụ thuộc ARN

Rnase H ARNase Inhibitor Enzym ức chế ARNase

RTse Reverse Transcriptase Enzym sao chép ngược

Tế bào BHK21 Baby Hamster Kidney cells Tế bào có nguồn gốc thận chuột

Hamster mới đẻ

Tế bào RD18 Rhabdomyosarcoma Tế bào ung thư có nguồn gốc từ

nguyên bào cơ vân

xanh châu Phi

VNNB/JE Japanese encephalitis Viêm não Nhật Bản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin về các chủng virus VNNB được sử dụng để so sánh

trình tự vùng gen E và xây dựng cây phả hệ ……… 23 Bảng 3.1 Phân lập và định loại virus VNNB ở Việt Nam, 2005-2009… 45 Bảng 3.2 Các chủng virus VNNB ở Việt Nam dùng để giải trình tự gen

Bảng 3.3 Xác định genotype virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong

các năm từ 1986-2007 ở Việt Nam (dựa trên trình tự một phần

Bảng 3.4 Xác định genotype virus VNNB phân lập từ muỗi, lợn trong

các năm từ 1993-2007 ở Việt Nam(dựa trên trình tự một phần

Bảng 3.5 Phân lập virus VNNB ở Ấn Độ từ muỗi 2006-2009 ………… 50 Bảng 3.6 Các chủng virus VNNB ở Ấn Độ sử dụng trong nghiên cứu… 51 Bảng 3.7 Xác định genotype virus VNNB phân lập từ người, muỗi

trong các năm 1956-2005 ở Ấn Độ (dựa trên trình tự toàn bộ

Bảng 3.8 Tỷ lệ sự tương đồng về nucleotide của một số chủng virus

VNNB phân lập từ người, 1986-2007 ……… 52 Bảng 3.9 Tỷ lệ sự tương đồng về nucleotide của 19 chủng virus VNNB

phân lập từ muỗi, lợn, 1993-2007 ……… 54 Bảng 3.10 Thông tin về số đăng ký trình tự nucleotide vùng gen E của

32 chủng virus VNNB trong ngân hàng gen quốc tế ………… 56 Bảng 3.11 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide vùng gen E của các

chủng virus VNNB cùng genotype phân lập ở Việt Nam

1986-2007 ……… 57 Bảng 3.12 Thông tin về kết quả thiết kế mồi để giải trình tự genome của

virus VNNB genotype 1 ……… 60 Bảng 3.13 Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của toàn bộ

genome của chủng có ký hiệu 90VN70 so với chủng

Bảng 3.14 Đặc điểm các acid amin thay thế của chủng virus VNNB có

ký hiệu 90VN70 so sánh với chủng Consensus ……… 64 Bảng 3.15 Sự tương đồng về nucleotide vùng gen E của các chủng virus

VNNB genotype 1 phân lập từ người ở Việt Nam 1990 và Trung Quốc trong các năm 2006-2009 ……… 66 Bảng 3.16 Sự tương đồng về nucleotide vùng gen E của 12 chủng virus

VNNB phân lập ở Ấn Độ trong khoảng thời gian 1956-2005 67 Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm xác định sự nhậy cảm của muỗi với véc-

Bảng 3.18 So sánh trình tự nucleotide toàn bộ vùng gen E của mẫu gốc

chủng Nakayama với mẫu virus nhân lên ở Culex

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc gen của Flavivius và sự phiên mã………… 5 Hình 1.2 Bản đồ xuất hiện và lan rộng virus VNNB ở một số nước…… 9 Hình 1.3 Sự phân bố 8 tiểu phân nhóm của genotype 1 virus VNNB… 11 Hình 1.4 Sự chuyển đổi kháng thể kháng virus VNNB trong quần thể

lợn và kết quả phân lập được virus VNNB từ máu lợn ở Hà

Hình 2.1 Quy trình phân lập và phát hiện virus VNNB ……… 27 Hình 2.2 Tóm tắt sơ đồ thực hiện giải trình tự gen virus ……… 34 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình xây dựng cây phát sinh loài (cây di truyền)… 41 Hình 3.1 Cây di truyền của các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

nucleotide toàn bộ gen E, của virus VNNB ở bệnh nhân,

Hình 3.2 Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

nucleotide toàn bộ gen E, của virus VNNB ở muỗi, lợn,

Hình 3.3 Xác định các phân nhóm virus VNNB genotype 1 lưu hành ở

muỗi và lợn tại Việt Nam, 2001-2007 ……… 58 Hình 3.4 Mô phỏng cấu trúc genome virus VNNB và vị trí thiết kế mồi 59 Hình 3.5 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được tổng hợp từ các cặp

mồi thiết kế đặc hiệu với virus VNNB ……… 61 Hình 3.6 Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

nucleotide genome chủng có ký hiệu 90VN70 và một số chủng virus VNNB khác ……… 62 Hình 3.7 Cây di truyền phả hệ các chủng virus VNNB dựa trên trình tự

toàn bộ vùng gen E của một số chủng virus VNNB phân lập ở

Ấn Độ, 1956-2005 ……… 68 Hình 3.8 Xác định sự nhạy cảm của vỉrus VNNB ở muỗi thực nghiệm

bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu gen E ………… 70 Hình 4.1 Bản đồ địa lý và địa điểm thu thập muỗi để phân lập ở Ấn Độ 79 Hình 4.2 Đường di cư của chim từ châu Á tới Đại Tây Dương………… 85

MỞ ĐẦU

Theo bảng phân loại năm 1990, virus viêm não Nhật Bản (VNNB)

thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae Virus VNNB chỉ có một type huyết

thanh duy nhất nhưng có 5 genotype, sự phân bố của các genotype cũng khác nhau tuỳ theo từng vùng địa lý Nghiên cứu về dịch tễ phân tử của một

số chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam cho thấy: Các chủng virus VNNB phân lập từ muỗi, từ bệnh nhân trước năm 1990 thuộc nhóm genotype 3 Những nghiên cứu mới về dịch tễ phân tử các chủng virus VNNB phân lập ở miền Bắc Việt Nam cho thấy có sự xuất hiện virus VNNB genotype 1 trong số các chủng virus phân lập từ muỗi, từ lợn trong những năm đầu thế kỷ 21 Ngược lại ở Ấn Độ, chỉ có virus VNNB genotype 3 lưu hành, cho đến nay vẫn chưa phát hiện được virus VNNB genotype khác Mặt khác những chủng virus VNNB phân lập và giải mã trình tự vùng gen E ở

Ấn Độ chủ yếu là những chủng virus VNNB genotype 3 phân lập từ bệnh nhân [67], [72], [93] Nghiên cứu dịch tễ phân tử các chủng virus VNNB phân lập ở Ấn Độ trong các nghiên cứu trước đây xác định các chủng virus VNNB genotype 3 phân lập chủ yếu từ bệnh nhân, nhưng tạo thành hai phân nhóm của genotype 3, có sự xuất hiện virus VNNB thuộc các phân nhóm genotype 3 ở tiểu lục địa Ấn Độ [80], [81], [91] Do vậy, cần có sự tiếp tục giám sát các chủng virus VNNB ở Ấn Độ để có thông tin về sự lưu hành của các chủng virus “địa phương” Với sự xuất hiện của các chủng “mới” cho thấy cần có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của các chủng virus VNNB lưu hành ở một số nước trong khu vực châu Á, đặc biệt những nghiên cứu đặc điểm về gen của các chủng virus VNNB ở những nước vùng Nam Á như

Ấn Độ với những nước vùng Đông Nam Á như Việt Nam Hiện tại, có ít nhất 3 giả thiết về sự mới xuất hiện của virus VNNB genotype 1 ở Nhật Bản,

Triều Tiên, Việt Nam hoặc sự xuất hiện các chủng mới “địa phương” đó là: (1) Do chim di cư mang virus từ vùng này sang vùng khác; (2) Sự tương tác giữa muỗi và virus VNNB xảy ra ở những vùng địa lý nhất định đã tạo ra một genotype mới; (3) Do thay đổi môi trường sinh thái

Trên thực tế bằng chứng khoa học để chứng minh cho giả thiết thứ nhất “Do chim di cư mang virus từ vùng này sang vùng khác” tuy chưa phân lập được virus VNNB từ chim di cư, nhưng có bằng chứng về mặt huyết thanh học đã làm sáng tỏ cho giả thiết này [47] Còn giả thiết thứ ba là “Do thay đổi môi trường sinh thái”, đây là một vấn đề đã có nhiều bằng chứng khoa học chỉ ra sự liên quan về thay đổi môi trường và bệnh dịch [8], [22],

67], [99], [100] Do vậy, “Hợp tác nghiên cứu đặc điểm về gen của virus

viêm não Nhật Bản ở các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam và Ấn Độ”

để phân tích cũng như tìm bằng chứng khoa học cho giả thiết thứ hai “Sự tương tác giữa muỗi và virus VNNB xảy ra ở những vùng địa lý nhất định đã tạo ra một genotype mới”, nhằm làm sáng tỏ sự mới xuất hiện của các genotype virus VNNB ở những vùng địa lý mới, định hướng trong phòng

bệnh

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

1 Xác định đặc điểm các genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ;

2 Xác định sự liên quan di truyền giữa những biến thể genotype khác nhau ở Việt Nam;

3 Xác định sự thay đổi của virus VNNB ở một số vùng dịch khác nhau ở hai nước (Ấn Độ và Việt Nam);

4 Xác định sự tác động qua lại giữa virus và vec-tơ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

1.1.1 Sự lan rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý

1.1.1.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh VNNB là bệnh viêm não cấp tính, với triệu chứng lâm sàng đa dạng, tác nhân gây bệnh là virus VNNB, một loại virus Arbo do muỗi truyền Theo bảng phân loại cũ trước những năm 1970, virus VNNB thuộc

họ Togaviridae, thuộc nhóm B các Flavivirus Theo cách phân loại mới (thập kỷ 90) virus VNNB thuộc họ Flaviviridae, là một trong 5 họ lớn của virus Arbo Họ Flaviviridae gồm có 3 chi (Genera) được phân loại dựa vào

một trong những cơ sở hình thái học hoặc cấu trúc vật liệu di truyền hoặc liên quan tính kháng nguyên, đó là các chi Hepacivirus, chi Flavivirus và chi Pestivirus Riêng chi Flavivirus được chia thành 7 phức hệ huyết thanh học, gần một nửa trong số các virus này gây bệnh cho người Những virus gây bệnh cho người thuộc 1 trong 3 phức hệ: phức hệ Tây sông Nil, phức hệ Dengue và phức hệ viêm não do ve; còn virus Sốt vàng chưa được xếp là một phức hệ kháng nguyên, mặc dù nó là chủng virus đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu trong chi Flavivirus Phân loại bằng huyết thanh học, chi Flavivirus được chia ra thành những phân nhóm nhỏ Virus VNNB thuộc về phân nhóm virus Tây sông Nil, cùng phân nhóm với các virus viêm não thung lũng Murray, virus viêm não St Louis [5], [47], [60]

Nghiên cứu siêu cấu trúc virus VNNB bằng kính hiển vi điện tử xác định hạt virus có dạng hình cầu, capsid đối xứng hình khối, đường kính hạt virus 40 - 50 nm, có vỏ bọc là màng lipid kép Vật liệu di truyền của virus VNNB là ARN sợi đơn dương, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus,

chiếm khoảng 6 % trọng lượng của virion Chiều dài sợi ARN của virus VNNB là 10.976 nucleotide (bp) tương ứng với 3.432 acid amin (a.a), mã hoá cho 10 loại protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc [15], [16], [20]

Đặc điểm của các protein cấu trúc (structural protein):

- Protein màng - Membrane (M) còn gọi là V1.Glycoprotein membrane (prM) – glycoprotein màng có trọng lượng  26 kD

- Protein lõi - Nuleocapsid (C) còn gọi là V2 Protein lõi là protein cơ bản, trọng lượng 11kD Protein C gấp vào trong một nhị hợp kết thành khối với mỗi một đơn thể có chứa 4 hình xoắn alpha

- Protein vỏ bao - Envelop (E) còn gọi là V3 Glycoprotein Envelope (E) có trọng lượng  53 kD, là protein chủ yếu trên bề mặt của virus VNNB, là những receptor kết hợp trung gian và làm biến đổi màng, là kháng nguyên tạo kháng thể trung hoà và kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu Những nghiên cứu trước đây cho thấy protein vỏ bao đóng vai trò quan trọng cho sự xâm nhiễm của virus VNNB và sự khác nhau về độc lực của virus VNNB trong tự nhiên

Đặc điểm protein phi cấu trúc NS (non-structural protein): Có 7 protein

phi cấu trúc với ký hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5

- Protein NS1 là glycoprotein rất kỵ nước, trọng lượng khoảng 46 kD, trong giai đoạn nhiễm virus, NS1 là kháng nguyên kích thích sự đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ để kháng lại protein này

- Protein NS2a & NS2b: Protein NS2a nhỏ khoảng 22 kD là protein kỵ nước, còn protein NS2b cũng rất nhỏ khoảng 14 kD

- Protein NS3 rất lớn khoảng 70kD là protein có nhiều chức năng, giúp cho sự xâm nhiễm và sự nhân lên của ARN virus trong tế bào vật chủ

- Protein NS4a và NS4b rất nhỏ (khoảng 16 kD và 27 kD, tương ứng),

là protein kỵ nước

- Protein NS5 rất lớn khoảng 103kD, rất bền vững, là protein có nhiều chức năng với enzym methyltransferase (MTase) và hoạt tính RdRP (RNA dependent RNA polymerase)

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc gen của Flavivirus và sự phiên mã [60]

Mỗi một loại protein sẽ tương ứng với một loại kháng nguyên virus VNNB Có ba loại kháng nguyên của virus VNNB được quan tâm và có tên

gọi theo phương pháp In-vitro phát hiện ra nó đó là: Kháng nguyên ngưng

kết hồng cầu, kháng nguyên trung hoà, đây là một glycoprotein trên bề mặt hạt virus (mã hoá bởi vùng gen E), là những kháng nguyên kích thích cơ thể tạo kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hoà, nói một cách khác đây chính là kháng nguyên kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo vệ; Kháng nguyên kết hợp bổ thể NS1, là một kháng nguyên kết hợp bổ thể

ở dạng hoà tan hoặc kết hợp với thành phần màng nhưng không kết hợp với hạt virus (virion), nó đóng vai trò bảo vệ hạt virus Các nghiên cứu cho thấy virus VNNB có tính kháng nguyên chung với những virus cùng chi Flavivirus (genus) Tùy từng loại kỹ thuật có thể xác định phản ứng chéo hoặc tính đặc hiệu của kháng nguyên Ví dụ nếu sử dụng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu để xác định virus VNNB, nó sẽ có phản ứng chéo rộng với các virus trong phân nhóm virus Tây sông Nil, với các virus Dengue trong phân nhóm virus Dengue; Nhưng nếu sử dụng kỹ thuật MAC-ELISA thì ít có phản ứng chéo với những virus thuộc phân nhóm virus Dengue, nhưng có thể có phản ứng chéo ở mức độ thấp với những virus cùng phân nhóm với virus Tây sông Nil [1], [5], [60]

1.1.1.2 Véc-tơ, ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên

Bệnh VNNB do muỗi truyền, các loài muỗi Culex được xác định là

véc-tơ truyền virus VNNB Bệnh chỉ xuất hiện ở người khi có điều kiện sinh thái thích hợp, virus VNNB không truyền từ người sang người mà qua trung gian muỗi đốt Chu trình sinh thái của virus VNNB trong tự nhiên là liên tục, đối với các vùng nhiệt đới bệnh VNNB xuất hiện rải rác quanh năm, nhưng đối với những vùng ôn đới hoặc cận nhiệt đới thì dịch VNNB thường xảy ra vào mùa hè Cho đến nay, có nhiều bằng chứng khoa học cho thấy virus VNNB lưu hành trong một vùng địa lý được xác định do tồn tại trong tự

nhiên ở muỗi véc-tơ với nghiên cứu xác định muỗi Culex truyền virus

VNNB sang thế hệ sau qua trứng, hoặc do chim di cư mang virus từ nơi khác đến qua bằng chứng có kháng thể kháng virus VNNB từ chim và phân lập được virus VNNB từ một số loài dơi di cư [40], [54], [55], [73], [77]

Virus VNNB đã được phân lập từ khoảng 30 loài muỗi thuộc 5 giống

Culex, Anopheles, Aedes, Mansonia và Amergeres; trong đó Culex (Cx), đặc

biệt là Cx Tritaeniorhynchus đã được chứng minh là véc-tơ chính truyền virus VNNB, còn một số loại muỗi khác như Anopheles, Aedes tuy phân lập

được virus VNNB từ chúng nhưng có thể là do những loài muỗi này bị nhiễm virus VNNB khi hút máu động vật trong giai đoạn nhiễm virus huyết Theo y văn, virus VNNB thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở 270

C–

300 C, mỗi lần muỗi đốt có tới 100.000 MLD (liều chí tử tối thiểu) đối với chuột nhắt Đây cũng chính là cơ sở để xác định hiệu lực của vắc-xin khi tiêm cho người phải tạo ra được hiệu giá kháng thể trung hoà phải đạt trên 1/10, là ngưỡng hiệu giá kháng thể để có thể bảo vệ khi bị muỗi véc-tơ mang virus đốt Nghiên cứu cho thấy, sự nhân lên của virus VNNB trong muỗi liên quan đến nhiệt độ, dưới 200C sự nhân lên của virus VNNB bị chậm hoặc ngừng lại, nên bệnh VNNB thường xuất hiện về mùa hè ở các vùng cận nhiệt đới, đó là khoảng thời gian thích hợp cho virus nhân lên trong cơ thể muỗi và cũng là thời gian chỉ số mật độ muỗi cao nhất trong năm [1], [8], [58] Còn ở các nước vùng nhiệt đới, các trường hợp VNNB thường tản phát xuất hiện quanh năm Đối với một vùng lưu hành virus VNNB, có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xẩy ra dịch như mối quan hệ giữa véc-tơ và

ổ chứa, mật độ véc-tơ, khả năng truyền virus của véc-tơ, tập quán sinh hoạt của dân cư, việc sử dụng vắc-xin VNNB để phòng bệnh [88], [89], [94] Với kết quả nghiên cứu đã phân lập được virus VNNB từ ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên như một số loài chim, muỗi và nhiều loài động vật máu nóng khác đặc biệt là lợn - vật chủ khuếch đại mầm bệnh [8], [30], [66], [83], [92], [101] Như vậy, sự lưu hành của virus VNNB trong tự nhiên ở động vật có xương sống hoang dại hoặc động vật nuôi trong nhà và muỗi hút máu

là chu trình liên tục, nên không thể thanh toán được bệnh VNNB như một số loại bệnh khác (bại liệt, đậu mùa ) chỉ có vật chủ duy nhất là người, mà chỉ

có thể khống chế và kiểm soát bệnh VNNB bằng các chương trình vắc-xin

dự phòng rộng rãi trong vùng lưu hành dịch, đặc biệt cho đối tượng trẻ em dưới 15 tuổi [2], [9], [13], [51], [67].

1.1.1.3 Sự lan rộng và xuất hiện của genotyp mới virus VNNB ở một số vùng địa lý trên thế giới

Bệnh viêm não do virus VNNB được ghi nhận ở Nhật Bản từ những năm 1870, nhưng mãi đến năm 1935, chủng virus VNNB đầu tiên mới được phân lập từ bệnh nhân - chủng Nakayama, đây là chủng virus VNNB đầu tiên được phát hiện (Prototype) thuộc genotype 3 Theo thời gian, virus VNNB từ Nhật Bản có thể qua những phương tiện vận chuyển hoặc chim di

cư đã lan rộng từ nước này sang nước khác Tuy nhiên, có thể liên quan đến điều kiện sinh thái, véc-tơ truyền bệnh mà virus VNNB đã xuất hiện và được ghi nhận ở hầu hết các nước châu Á trong khoảng thời gian 1950 –

1990 với sự lan truyền rộng rãi ở những nước như Trung Quốc, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn đông, hầu hết các nước ở Đông Nam châu Á và Ấn Độ Ngoài ra, trong những năm cuối của thế kỷ 20 có sự xuất hiện virus VNNB ở miền Bắc nước Úc, vùng trước đây không có bệnh dịch này như quần đảo thuộc eo biển Torres cách xa lục địa Australia [17], [23], [98] Cho đến nay, chưa phát hiện được sự lưu hành của virus VNNB ở những châu lục khác như châu Âu, châu Phi, Châu Mỹ Chính vì vậy, người dân ở những châu lục này khi đến châu Á, đặc biệt đến những vùng lưu hành virus VNNB đều được khuyến cáo nên tiêm phòng vắc-xin VNNB [40], [69], [88], [89], 92]

Mặc dù chủng virus VNNB đầu tiên được phát hiện là virus VNNB genotype 3, nhưng hơn nửa thế kỷ phát tán ra những vùng địa lý mới, cho đến nay đã xác định virus VNNB có 5 genotype Tuy nhiên, sự lưu hành của

5 genotype virus VNNB khác nhau tùy từng nước, tuỳ khoảng thời gian, có nước chỉ lưu hành một loại genotype virus VNNB, nhưng có nước phát hiện

có sự lưu hành 2 hoặc 3 genotype virus VNNB như Indonesia lưu hành 3 genotype khác nhau của virus VNNB [11], [15], [24], [39], [53], [90], [98] Đây là minh chứng cho thấy có thể do sự thay đổi về môi trường sinh thái,

sự tương tác giữa muỗi và virus VNNB ở những vùng địa lý nhất định, trong một điều kiện nào đó đã tạo ra một genotype mới, hoặc có sự xâm nhập của genotype mới do chim di cư Ở Nhật Bản, nơi phát hiện virus VNNB đầu tiên, trong khoảng thời gian 60 năm từ 1935 đến 1994 (khoảng 60 năm), các chủng virus VNNB phân lập được từ bệnh nhân, từ muỗi, lợn ở Nhật Bản đều thuộc genotype 3 [39], [41], [79], [80], [91]

Hình 1.2 Bản đồ xuất hiện và lan rộng virus VNNB ở một số nước [1]

1.1.2 Dịch tễ học phân tử sự xuất hiện virus VNNB ở khu vực châu Á

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB được thực hiện từ những năm đầu 1990 với những phân tích về sự phát triển, tiến hoá của virus VNNB dựa vào cấu trúc vùng gen Pr M của virus VNNB của nhóm tác giả nghiên cứu ở Indonesia [24], [25], [27], [46], [53] Tuy nhiên, đây là vùng gen có độ dài khoảng 500 bp và tương đối ổn định, nên khi nghiên cứu về sự tiến hoá của virus VNNB có thể sẽ bị hạn chế nếu sử dụng vùng gen này Nên vùng gen E với độ dài 1500 bp, là vùng không ổn định có thể liên quan đến độc lực và tính gây nhiễm của virus, được cho là vùng gen lý tưởng để nghiên cứu sự tiến hoá của virus VNNB [31], [42], [44], [63], [80]

Virus VNNB có 5 genotype, tính chất gây bệnh cũng khác nhau đối với từng genotype Trước những năm 1990, các chủng virus VNNB phân lập

từ bệnh nhân ở nhiều nước trong khu vực châu Á chủ yếu là các chủng virus VNNB thuộc genotype 3; Các chủng virus VNNB genotype 2 chỉ được phân lập ở Malaysia, Indonesia và gần đây mới xuất hiện ở Úc; còn virus VNNB genotype 1 được phân lập ở Thái Lan, nhưng chủ yếu từ muỗi và lợn Đối với virus VNNB genotype 4 và 5, vai trò gây bệnh chưa được xác định rõ ràng và cho đến nay hai genotype này mới được phân lập từ muỗi và chim ở Singapore, Malaysia, Indonesia Những chủng virus VNNB genotype 4 phân lập được từ muỗi ở Indonesia, thực nghiệm cho thấy độc lực thấp hơn so độc lực của chủng virus VNNB genotype 3 Vì chưa phân lập được virus VNNB genotype 4, nên có giả thiết nếu virus VNNB genotype 4 có thể sẽ gây bệnh không trầm trọng như virus VNNB genotype 3 [25], [26], [38], [67], [80]

Sau năm 1990, sự xuất hiện virus VNNB genotype 1 ở một số nước bắc

Á được ghi nhận lần đầu tiên ở Nam Triều Tiên, Nhật Bản vào năm 1994, đó

là những chủng virus genotype 1 được phân lập từ muỗi [52], [62], [80] Nghiên cứu hồi cứu về dịch tễ phân tử các chủng virus VNNB phân lập ở Trung Quốc từ 1949 đến 2005 cũng đã phát hiện virus VNNB genotype 1 lưu hành ở Trung Quốc từ những năm 1979 ở muỗi [3], [14], [50] Nhưng chưa có số liệu nghiên cứu hồi cứu về các chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam, để xác định xem liệu các chủng virus VNNB genotype 1 phát hiện trong những năm 2001 – 2002 có phải là những chủng virus VNNB genotype 1 đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam, hay trước đó đã có sự lưu hành của virus VNNB genotype 1 nhưng chưa được phát hiện?

I

II

III IV V VI VII VIII

0.02

Hình 1.3 Sự phân bố 8 tiểu phân nhóm của genotype 1 virus VNNB [61]

Tuy mới xuất hiện và lan rộng trong những năm gần đây, nghiên cứu phân tích trình tự nucleotide vùng gen E của các chủng virus VNNB

genotype 1, xác định virus VNNB genotype 1 có hai phân nhóm (cluster) A

và B; Trong phân nhóm A có 8 tiểu phân nhóm và tiểu phân nhóm thứ 8 thuộc genotype 1 cũng được phát hiện gần đây ở Nhật Bản Mặc dù có sự xuất hiện của virus VNNB genotype 1 ở một số vùng địa lý trong những năm gần đây, nhưng virus VNNB genotype 1 chủ yếu được phát hiện ở những nước vùng Bắc Á như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc và đông Nam châu Á như Việt Nam, chưa thấy có sự xuất hiện virus VNNB genotype 1 ở các nước vùng Nam Á như Ấn Độ, Malaysia [81], [90], [96]

Nghiên cứu sinh học phân tử virus VNNB được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm trong nhiều thập kỷ qua đã làm phong phú số lượng các vùng gen của virus VNNB đã được giải mã và đăng ký trong ngân hàng gen Hơn thế nữa, nghiên cứu giải mã toàn bộ gen của một chủng virus VNNB cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện, đăng ký trong ngân hàng gen Tuy nhiên, kết quả giải mã toàn bộ vật liệu di truyền của các chủng virus VNNB phân lập từ người đã công bố trong ngân hàng gen chủ yếu là các chủng virus VNNB genotype 3 như chủng Nakayama, Beijing -1 Cho đến nay, chưa có công bố nào trong ngân hàng gen về kết quả giải

mã gen đối với virus VNNB genotype 1 phân lập từ bệnh nhân để có thể giải thích cho giả thiết virus VNNB genotype 1 thích ứng với muỗi, lợn hơn là người [80] Vì số lượng các chủng virus VNNB genotype 1 phân lập từ bệnh nhân rất ít, cho đến nay, mới có 5 chủng virus VNNB genotype 1 được phân lập ở bệnh nhân Thái Lan trong những năm 1980, những nghiên cứu gần đây của các tác giả Nhật Bản tuy có phát hiện được dấu vết vật liệu di truyền của virus VNNB genotype 1 từ dịch não tuỷ của bệnh nhân, nhưng vẫn chưa phân lập được virus VNNB genotype 1 từ bệnh nhân [48], [67], [91] Theo số liệu tra cứu trong ngân hàng gen và công bố quốc tế, virus VNNB genotype 1 cũng được phân lập từ dịch não tuỷ của bệnh nhân năm

2009 ở Trung Quốc, cho thấy virus VNNB genotype 1 cũng thích ứng trên người và gây bệnh như virus VNNB genotype 3 [48], [67], [92], [93]

1.1.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu trên thế giới

Kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển từ năm 1983, Mullis K B

và cộng sự đã đưa ra nguyên lý kỹ thuật PCR và chính thức công bố vào tháng 10 năm 1985 Phát minh này đã trở thành một cuộc cách mạng lớn trong khoa học kỹ thuật và rất nhanh chóng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực Vi sinh Y học với hàng loạt các công bố về phát hiện và phát triển những enzyme mới để ứng dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử và phát triển kỹ thuật mới cho nghiên cứu định lượng cũng như định tính sản phẩm tổng hợp cuả kỹ thuật PCR Về nguyên lý, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại trong ống nghiệm một đoạn ADN đã được biết trình tự hai đầu ADN gồm 3 giai đoạn chuyển đổi: (1) Làm biến tính sợi kép ADN; (2) Gắn sợi đơn ADN với 1 cặp mồi đặc hiệu; (3) Kéo dài chuỗi mồi bằng enzyme polymerase [46], [57], [102] Với chu trình được lặp lại rất nhiều lần, ADN được khuếch đại theo cấp số nhân Nên kỹ thuật PCR có độ nhậy rất cao Về nguyên bản gốc, kỹ thuật PCR là khuếch đại một đoạn ADN, nhưng đối với các virus có vật liệu di truyền là ARN như virus VNNB, phương pháp này lại không thể áp dụng trực tiếp cho sự nhân lên của ARN được Vì vậy, kỹ thuật PCR đã cải biên thành kỹ thuật RT-PCR trong đó ARN của virus được chuyển đổi thành ADN bổ trợ - complementary DNA được gọi là cDNA Như vậy, ARN nguyên bản của virus được chuyển thành cDNA là một sợi đơn ADN bổ trợ Vì phản ứng PCR bao gồm cả hai giai đoạn sao chép ngược và tổng hợp ADN, nên được gọi là phản ứng chuỗi sao chép ngược - reverse transcriptase polymerase chain reaction - gọi tắt là RT-PCR, thực chất là một sự cải biên từ kỹ thuật PCR

Với kỹ thuật RT-PCR, nếu quá trình thực hiện được chia làm hai giai đoạn: giai đoạn sao chép ngược để tổng hợp cDNA sử dụng mồi ngược và giai đoạn PCR Mỗi một giai đoạn sử dụng một ống nghiệm riêng biệt với những thành phần cần thiết và chu trình nhiệt riêng, được gọi là kỹ thuật RT-PCR gián tiếp (hay còn gọi là kỹ thuật RT-PCR hai bước hay hai ống nghiệm) Ưu điểm của kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật RT-PCR trực tiếp, nhưng khả năng dương tính giả cao hơn kỹ thuật RT-PCR trực tiếp

do dễ bị lây nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm nếu không kiểm soát tốt các giai đoạn và môi trường để thực hiện kỹ thuật RT-PCR Do vậy, kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có hiệu quả hơn so với kỹ thuật RT-PCR gián tiếp, vì nó

sẽ làm giảm tối đa khả năng tạp nhiễm hoặc kết quả dương tính giả Để thực hiện kỹ thuật, tất cả các thành phần cần thiết cho cả hai quá trình sao chép ngược và PCR được cho vào một ống nghiệm, thực hiện trong một lần duy nhất, chu trình nhiệt không bị ngắt quãng Một trong hai đoạn mồi sử dụng cho quá trình sao chép ngược được sử dụng cho PCR [15], [35], [47]

Sản phẩm khuếch đại của phản ứng RT-PCR được khẳng định và kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di trên gel agarose Cho đến nay có nhiều loại thuốc nhuộm đã được nghiên cứu để ứng dụng cho việc phát hiện sản phẩm PCR như Ethidium bromide, SYBR Green, FABIO , nhưng Ethidium bromide vẫn là loại thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi vì sự đơn giản, dễ thực hiện Nhưng nó là một chất gây ung thư tiềm tàng, nên vấn đề

an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm cần được coi trọng để tránh làm ô nhiễm môi trường và người thực hiện kỹ thuật với chất gây ung thư tiềm tàng này [47]

Đối với virus có vật liệu di truyền là ARN, để thực hiện được kỹ thuật RT-PCR, việc chuẩn bị mẫu ARN của virus cũng rất quan trọng Có nhiều

kỹ thuật tách chiết vật liệu di truyền của virus, nhưng có thể phân chia thành hai nhóm kỹ thuật cơ bản: (1) Nhóm tách chiết ARN bằng hoá học; (2) Nhóm tách chiết ARN bằng cột Spin column [46] Trước đây, hầu hết các kỹ thuật PCR, vật liệu di truyền thường được tách chiết bằng hoá chất theo phương pháp phenol – chloroform (trong các thường quy khác sử dụng chloroform – butanol) Khi sử dụng phenol để chiết xuất ARN, Trizol LS là một dung môi có phenol và guanidine isothiocyanate, giữ cho ARN được nguyên vẹn trong lúc mẫu được làm đồng nhất, được ly giải, các tế bào bị phá vỡ và các thành phần của tế bào bị làm tan rã Khi cho thêm chloroform

và ly tâm, tách hỗn dịch trên thành 3 lớp rất rõ: ARN nguyên vẹn ở trong pha nước trên cùng, protein và ADN của tế bào nằm trong lớp giữa hoặc lớp dung môi bên dưới Sau khi chuyển pha nước sang một ống nghiệm khác, ARN sẽ được tủa bằng isopropyl – alcohol và ethanol 75 % Phương pháp này ít tốn kém nhưng cần có khoảng 3 - 4 giờ mới hoàn thiện giai đoạn tách chiết Mặt khác việc tách chiết ARN theo phương pháp này chỉ có được lượng ARN đủ cho một lần phản ứng, số lượng mẫu dùng để tách chiết ARN cần rất nhiều, ít nhất là 0,5 ml; nên khi cần thực hiện lại kỹ thuật rất mất thời gian cũng như tính khả thi (vì có thể không còn mẫu) [67] Những nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm tách chiết ARN của nhiều hãng trên thế giới đã cho phép rút ngắn thời gian tách chiết ARN xuống còn khoảng 20 phút, thao tác kỹ thuật đơn giản, không phải tiếp xúc với những hoá chất độc hại, đáp ứng rất nhanh trong chẩn đoán phát hiện sớm tác nhân gây bệnh Hơn thế nữa, một lần tách chiết mẫu, chỉ sử dụng 1/10 hoặc 1/5 lượng ARN đã tách chiết cho một phản ứng RT-PCR, lượng còn lại được lưu giữ cho những xét nghiệm lặp lại nếu cần thiết vì ARN tách chiết theo phương pháp này khi lưu

giữ ở - 20oC có chất lượng không thay đổi trong thời gian 1 năm Chính vì vậy, phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi, đặc biệt thích ứng với những mẫu có lượng ARN < 50 ng, tuy nhiên giá thành cao hơn so với phương pháp sử dụng hoá chất [4], [10], [61] ARN của virus không bền vững ở điều kiện tự nhiên, ARN của virus trong mẫu xét nghiệm có thể bị tiêu huỷ theo thời gian ngay ở điều kiện –700C; Khi đông tan băng mẫu nhiều lần có thể làm vật liệu di truyền của virus bị phân đoạn, làm giảm độ nhậy của kỹ thuật PCR Nên tất cả các quá trình thúc đẩy sự thoái hoá ARN của virus cần được loại bỏ trong quá trình thực hiện kỹ thuật tách chiết [46]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

1.2.1 Bệnh VNNB và véc-tơ truyền VNNB tại Việt Nam

1.2.1.1 Tình hình bệnh VNNB ở Việt Nam

Theo các y văn cho thấy, bệnh VNNB được ghi nhận ở Việt Nam từ năm 1952 với những phát hiện bệnh từ những người lính Âu-Phi trong chiến tranh ở Việt Nam [1], [5] Bằng nghiên cứu giám sát huyết thanh học, vụ dịch viêm não mùa hè năm 1959 ở Miền Bắc đã được xác định là do virus VNNB và chủng virus VNNB đầu tiên được phân lập từ bệnh nhân năm

1960 có ký hiệu HN60 Do điều kiện địa lý và sinh thái khác nhau, các trường hợp VNNB thường được ghi nhận ở khắp các vùng nông thôn thuộc các tỉnh đồng bằng, miền núi, trung du; Ở những vùng cận nhiệt đới như miền Bắc và miền Trung, dịch VNNB thường xẩy ra về mùa hè, còn ở vùng nhiệt đới như miền Nam và Tây Nguyên các trường hợp VNNB được ghi nhận rải rác quanh năm Các ổ dịch phần lớn tập trung tại các vùng đồng bằng trồng lúa nước hoặc vùng bán sơn địa, sự lan rộng của virus VNNB đến những vùng địa lý mới ở miền Bắc Việt Nam đã được ghi nhận trong thập kỷ gần đây như ở Hà Giang, Điện Biên [1], [6], [7], [12], [13]

Trước những năm 2000, số các trường hợp nghi ngờ VNNB khoảng

2000 – 3000 trường hợp/năm Với nỗ lực kiểm soát và khống chế bệnh VNNB bằng vắc-xin do Việt Nam sản xuất của chương trình tiêm chủng mở rộng cho trẻ em từ 1 – 5 tuổi từ năm 1997, số các trường hợp nghi ngờ VNNB ở Việt Nam đã giảm Trong những năm gần đây chỉ còn khoảng

1200 – 1500 trường hợp/năm được ghi nhận Việc cung cấp vắc-xin phòng VNNB trong chương trình tiêm chủng mở rộng chủ yếu là 3 liều cơ bản, còn tiêm nhắc lại sau 3 – 4 năm tuỳ thuộc vào điều kiện kinh tế cũng như ý thức phòng VNNB cho trẻ em của từng gia đình Do vậy, sau tiêm vắc-xin VNNB 5 – 7 năm, có một số trẻ em vẫn bị mắc VNNB [2], [13], [51] Cho thấy, để khống chế bệnh VNNB trong tương lai ở Việt Nam, cần có chính sách hỗ trợ tiêm phòng vắc-xin VNNB đầy đủ các liều cơ bản và các liều củng cố cho đến khi trẻ 15 tuổi như lịch tiêm phòng vắc-xin đã được khuyến cáo của nhà sản xuất [8], [40], [92]

1.2.1.2 Các loài muỗi Culex truyền VNNB đã được phát hiện ở Việt Nam

Cho đến nay, đã xác định virus VNNB được phân lập từ một số loài

muỗi Culex như Cx Tritaeniorhynchus, Cx Vishnui, Cx Gelidus, Cx Quinquefaciatus Mặt khác, các nghiên cứu thực nghiệm ở Việt Nam đã

chứng minh virus VNNB được truyền sang thế hệ khác qua trứng muỗi ở

loài Cx Tritaeniorhynchus [1] Nghiên cứu xác định sự chuyển đổi kháng

thể kháng virus VNNB trong quần thể lợn quanh năm, đặc biệt đã phân lập được virus VNNB từ máu lợn trong mùa đông, xác định có sự tồn tại của virus VNNB qua mùa đông ở muỗi tại miền Bắc Việt Nam [6], [8], [13]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Hình 1.4 Sự chuyển đổi kháng thể kháng virus VNNB trong quần thể lợn

và kết quả phân lập được virus VNNB từ máu lợn, Hà Tây 2001–2003 [8]

Trên thực tế dịch VNNB thường xảy ra ở miền Bắc trong các tháng hè

do có liên quan với mật độ các loài muỗi Cx Tritaeniorhynchus, Cx Vishnui, Cx Gelidus rất cao trong các tháng 4, 5 và 6 [8], [13], [57] Nghiên

cứu cho thấy, ở miền Bắc, miền Trung, virus VNNB chủ yếu được phân lập

từ các loài muỗi Cx Tritaeniorhynchus, Cx Vishnui, Cx Gelidus, nhưng ở

miền Nam và Tây Nguyên, ngoài các véc-tơ này, virus VNNB còn được

truyền bởi các loài muỗi Cx Quinquefaciatus, Cx Fatigan [11], [13], [14]

Như vậy, có thể còn có loài muỗi khác cũng là véc-tơ truyền virus VNNB ở Việt Nam vẫn chưa được phát hiện

1.2.2 Tình hình nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt Nam

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt Nam chưa được quan tâm trước những năm 1990, sau những năm 1990, nghiên cứu dịch tễ

sinh học phân tử virus VNNB được thực hiện với sự xác định trình tự nucleotide vùng gen C, vùng gen M của các chủng virus VNNB phân lập ở miền Bắc và miền Nam trong các năm 1964 – 1988 Kết quả đã xác định các chủng virus VNNB phân lập trong khoảng thời gian này từ bệnh nhân, muỗi, lợn, chim đều thuộc nhóm genotype 3, chúng có họ hàng với chủng Nakayama của Nhật Bản và Beijing-1 của Trung Quốc Tuy nhiên những chủng virus này tạo thành 2 phân nhóm nhỏ tách biệt giữa các chủng phân lập ở miền Bắc với các chủng phân lập ở miền Nam 39] Một số nghiên cứu khác về sinh học phân tử của virus VNNB cũng được thực hiện, nhưng chủ yếu là so sánh sự tương đồng về vật liệu di truyền của các các chủng sản xuất vắc-xin với các chủng tự nhiên như so sánh sự tương đồng về nucleotide và axit amin của chủng Nakayama với chủng phân lập từ bệnh nhân năm 1993 (cùng nhóm genotype 3), hoặc phát hiện có sự xuất hiện genotype 1 ở miền Bắc Việt Nam từ muỗi và lợn trong những năm đầu thế

kỷ 21 [67] Do vậy, cần có nghiên cứu mang tính tổng thể về dịch tễ học phân tử của virus VNNB ở Việt Nam, đặc biệt xác định thời điểm xuất hiện

và lưu hành của virus VNNB genotyp 1 ở Việt Nam Mặt khác, cho đến nay nghiên cứu giải mã toàn bộ vật liệu di truyền của một chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam, đặc biệt là virus VNNB genotype 1 là những nghiên cứu cần được thực hiện

Việc phân lập virus VNNB từ não tử thi có thể đạt kết quả dương tính khoảng 30 %, nhưng theo các quy định về y đức trong nghiên cứu, việc có mẫu não tử thi để phân lập virus VNNB là không khả thi; Mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân HCNC trong giai đoạn cấp khả năng thu thập được, nhưng tỷ

lệ phân lập được virus VNNB từ dịch não tuỷ của bệnh nhân thường ít đạt kết quả [1], [9], [51] Nên việc phân lập virus VNNB genotype 1 từ muỗi và

lợn để phát hiện sự lưu hành của genotype này ở những vùng địa lý mới sẽ mang tính khả thi cao Chính vì vậy, để xác định sự lưu hành của virus VNNB genotype 1 ở những vùng địa lý mới ở Việt Nam, đặc biệt là ở Ấn

Độ nơi chưa phát hiện được genotype 1, việc phân lập virus VNNB từ các mẫu muỗi thu thập ở một số vùng địa lý của Ấn Độ là lựa chọn của nhóm nghiên cứu ở Ấn Độ trong hợp tác nghiên cứu này

1.2.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu virus VNNB ở Việt Nam

Kỹ thuật sinh học phân tử đã được đưa vào ứng dụng trong nghiên cứu từ những năm đầu của thập kỷ 90 ở Việt Nam trong nhiều lĩnh vực và hiện nay kỹ thuật này đã trở thành thường quy của nhiều phòng thí nghiệm

để ứng dụng trong chẩn đoán xác định một số bệnh di truyền cũng như một

số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm Trong lĩnh vực virus VNNB, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu về virus VNNB đã được thực hiện từ những năm đầu 1990 với sự hợp tác của Viện Pasteur Paris [39] Tiếp sau đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đã được phát triển mạnh mẽ hơn với sự hợp tác của Viện Y học Lâm sàng Nhiệt Đới, Trường Đại học Nagasaki Nhật Bản; Trung tâm kiểm soát bệnh tật Fort Collins, Hoa Kỳ và Viện Pasteur Paris [11], [21] [61] Trên cơ sở này, đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về sinh học phân tử không những chỉ liên quan đến lĩnh vực virus VNNB mà còn liên quan đến những virus Arbo mới xuất hiện ở Việt Nam [10], [21], [67]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, trang thiết bị hoá chất sử dụng cho nghiên cứu

2.1.1 Dụng cu, trang thiết bị

Sử dụng pipet nhựa 10 ml, 5 ml vô trùng, trợ pipet, pipet bán tự động một kênh, pipet tip có lọc vô trùng các loại; chai nuôi cấy tế bào 25cm2

Sử dụng một số trang thiết bị như tủ an toàn sinh học cấp II, tủ nuôi cấy 28oC, máy đọc ELISA nhãn hiệu Biotek – ELX808 của Mỹ, máy PCR của Eppendor, máy Sequencing CEQTM 8000 của hãng Beckman Counter, máy GelDOC, máy ly tâm hút chân không của Eppendorf, máy ly tâm lạnh Eppendorf, tủ - 800C…

2.1.2 Hóa chất, sinh phẩm

Tế bào Aedes albopictus dòng C6/36 do Viện Y học Nhiệt Đới Trường

đại học Nagasaki cung cấp, môi trường DMEM, MEM của hãng Sigma, huyết thanh bào thai bê của hãng Gibco

Các sinh phẩm và hoá chất cần thiết cho kỹ thuật ELISA Sandwich để phát hiện virus hoặc kháng nguyên virus VNNB do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Bộ sinh phẩm tách chiết ARN (QIAamp viral ARN extraction kit của hãng QIAGEN); Bộ sinh phẩm tinh sạch ADN củaQIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN; Bộ sinh phẩm Sequencing (DTCS Quick Strart Kit);

Bộ sinh phẩm để giải trình tự gen DTCS Quick Start kit, Seakem LE Agarose của hãng Cambrex, Ethidium bromide của hãng Sigma, dung dịch TBE x 10 của hãng Sigma…

Mồi đặc hiệu virus VNNB [67]: Cặp mồi đặc hiệu virus VNNB vùng gen E có ký hiệu JEV-Ef: 5’GGCAGAAAGCAAAACAAAAG3’ (vị trí:

390 - 410) và JEV-Er: 3’TCACAAACCACCACGGAAGT5’ (vị trí: 2306 - 2426); Các mồi được thiết kế trong toàn bộ genome của virus VNNB dựa trên phần mềm thiết kế mồi Oligo 7.0 trong phân tích cấu trúc, thiết kế các mồi bên trong từng vùng gen, tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và các thành phần phản ứng PCR cho 11 vùng gen của virus VNNB [59], [65], [87] Trình tự mồi để giải mã toàn bộ genome của virus VNNB bao gồm các cặp mồi đặc hiệu vùng gen E, C/PreM, NS 5’/3’ và 3’UTR

Muỗi “sạch”: Culex tritaeniorhynchus, Aedes albopictus của Trung

Tâm nghiên cứu về Côn trùng Y học Ấn Độ, nguồn máu “sạch” được cung cấp từ Trung tâm truyền máu Ấn Độ, phòng nuôi muỗi thực nghiệm cho nghiên cứu của đề tài ở Ấn Độ Các nguyên vật liệu cần thiết khác

Bảng 2.1 Thông tin về các chủng virus VNNB được sử dụng

để so sánh trình tự vùng gen E và xây dựng cây phả hệ

Chủng Năm Quốc gia Genotype Loại bệnh

phẩm

Số đăng ký GenBank

3 JKT7003 1981 Indonesia G4 Muỗi AY184212

4 VN-118 1979 Việt Nam G3 Muỗi U70420

5 Beijing 1949 Trung quốc G3 Não tử thi AY243844

6 Nakayama 1935 Nhật Bản G3 Não tử thi S75726

7 Kamiyama 1966 Nhật Bản G3 Não tử thi S47265

8 JEV/sw/Mie

/40/2004

9 K94P05 1994 Triều Tiên G1 Muỗi AF045551

10 KV1899 1999 Triều Tiên G1 HT lợn AY316157

12 SH17M-07 2007 Trung Quốc G1 Muỗi EU429297

13 GZ56 2006 Trung Quốc G1 Dịch não tuỷ HM366552

14 YN135 2008 Trung Quốc G1 Máu HM366549

15 LX10P-09 2009 Trung Quốc G1 Dịch não tuỷ HM204528

16 LX29P-09 2009 Trung Quốc G1 Dịch não tuỷ HM204529

17 LY5P-09 2009 Trung Quốc G1 Dịch não tuỷ HM204530

19 P20778 1958 Ấn Độ G3 Não tử thi Z34096

21 GP 78 1978 Ấn Độ G3 Não tử thi AF075732

22 782219 1978b Ấn Độ G3 Não tử thi U70402

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu thực hiện mục tiêu 1: “Xác định đặc điểm các

genotype của virus VNNB lưu hành ở Việt Nam và Ấn Độ”

Sử dụng các chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam trong từ 1986 đến 2007 từ muỗi, lợn và bệnh nhân (chưa giải mã vùng gen E) Đối với một

số chủng virus VNNB ở Việt Nam, Ấn Độ đã giải mã, đăng ký trong ngân

hàng gen cũng được sử dụng để phân tích [3], [11], [61], [67], [81], [91]

2.2.1.1 Kỹ thuật lấy mẫu, sàng lọc để phân lập virus VNNB từ muỗi, lợn,

bệnh nhân ở Việt Nam (phía Ấn Độ thực hiện nghiên cứu hồi cứu

và tiến cứu để thu thập muỗi ở 6 vùng địa lý khác nhau)

a) Quy trình lấy máu lợn, sàng lọc để phân lập virus

- Thời gian lấy mẫu: từ tháng 3 đến tháng 7;

- Địa điểm lấy mẫu: Hà Tây, Long An, Cần Thơ, Tây Nguyên;

- Mỗi tháng chọn 2 đàn lợn 2 tháng tuổi (khoảng 10 con) nuôi ở vùng lưu

hành virus VNNB

- Lấy máu lợn 4 lần/tháng: định kỳ tuần/lần

- Dùng kim lấy máu tĩnh mạch tai lợn, chia ra 2 ống nghiệm: 1 ống nghiệm đựng máu để ở 40

C, 1 ống nghiệm đựng máu để ở - 800C Tách huyết thanh ở ống nghiệm để ở 40C để kiểm tra kháng thể kháng virus VNNB bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu Chọn mẫu máu tương ứng lưu

ở - 800C, đó là những mẫu không có kháng thể kháng virus VNNB (trước

sự chuyển đổi kháng thể) để phân lập virus

- Số lượng mẫu thu thập để sàng lọc: 800 mẫu

b) Thu thập mẫu muỗi

- Địa điểm thu thập muỗi: Một số tỉnh ở miền Bắc, tỉnh Quảng Bình (miền Trung), tỉnh Gia lai, Kon Tum, Đắc lắc (Tây Nguyên), tỉnh Long An, Cần

Thơ (miền Nam)