Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm

Các ứng dụng của vi sinh vật bao gồm: sản xuất enzyme, thực phẩm chức năng, thực phẩm lên men, vaccine tái tổ hợp, dược phẩm, mỹ phẩm, thuốc trừ sâu, hóa chất, công nghệ khai khoáng, bảo

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

-

NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN

BẢO TỒN VÀ LƯU GIỮ NGUỒN GEN VI SINH VẬT

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chủ nhiệm: PGS TS Vũ Nguyên Thành

Hà nội, 12/2010

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

-

NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN

BẢO TỒN VÀ LƯU GIỮ NGUỒN GEN VI SINH VẬT

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Thực hiện theo Hợp đồng số 06.10.QG/HĐ-KHCN, ngày 05 tháng 5 năm 2010 giữa Bộ Công Thương và Viện Công nghiệp Thực phẩm

Chủ nhiệm: PGS TS Vũ Nguyên Thành

Cộng tác viên ThS Nguyễn Thuý Hường

TS Nguyễn La Anh ThS Nguyễn thị Hương Giang ThS Đinh thị Mỹ Hằng

ThS Khuất Thị Thủy ThS Nguyễn Thanh Thủy ThS Đặng Thu Hương ThS Lê Thùy Mai

CN Phạm thị Hoà

CN Đào Anh Hải

KS Nguyễn Minh Thu

CN Dương Minh Khải

Hà nội, 12/2010

MỞ ĐẦU

Trong công nghệ sinh học, ứng dụng vi sinh vật chiếm tỷ trọng lớn nhất Các ứng dụng của vi sinh vật bao gồm: sản xuất enzyme, thực phẩm chức năng, thực phẩm lên men, vaccine tái tổ hợp, dược phẩm, mỹ phẩm, thuốc trừ sâu, hóa chất, công nghệ khai khoáng, bảo vệ môi trường Ứng dụng rộng rãi của vi sinh vật xuất phát từ tính đa dạng vốn có của vi sinh vật Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và có một hệ vi sinh vật vô cùng phong phú Nền văn hóa và kỹ nghệ lên men lâu đời đã góp phần sàng lọc những vi sinh vật tiềm năng cho công nghệ sinh học

Hiện tại Viện Công nghiệp Thực phẩm đang bảo tồn và lưu giữ một nguồn gen quan trọng cho công nghiệp thực phẩm với trên 1000 chủng vi sinh vật có các ứng dụng khác nhau từ lên men rượu, bia, cồn, bánh mỳ, sản xuất axit lactic, axetic, chuyển hóa chất thơm, lipid, sinh kháng sinh, enzyme cho tới các ứng dụng trong bảo vệ môi trường, thức

ăn gia súc, diệt trừ sâu bệnh Đây là thành quả lao động của nhiều thế hệ các nhà khoa học công tác tại Viện cũng như đóng góp của các nhà khoa học trong và ngoài nước thông qua hợp tác khoa học công nghệ trong nhiều thập kỷ qua Mục tiêu của đề tài là duy trì và phát triển nguồn gen vi sinh vật hiện có nhằm tạo cơ sở hạ tầng phục vụ phát triển công nghệ sinh học của đất nước

Nhiệm vụ “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm” là một trong những nỗ lực của Chính phủ Việt Nam nhằm tạo nền tảng và phát triển ngành công nghệ Sinh học của Việt Nam với những nội dung chính sau đây:

- Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm

- Bảo tồn và lưu giữ

- Đánh giá nguồn gen

- Xây dựng cơ sở dữ liệu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 3 

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT 6 

TÓM TẮT NHIỆM VỤ 7 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 8 

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 8 

1.1.1 Ngoài nước 8 

1.1.2 Trong nước 11 

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 13 

2.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 13 

2.1.1 Bảo quản vi sinh vật trong nitơ lỏng 13 

2.1.2 Bảo quản bằng phương pháp đông khô 15 

2.1.3 Bảo quản vi sinh vật bằng L-drying 17 

2.1.4 Phương pháp bảo quản bằng L-drying đối với nấm mốc có bào tử 18 

2.1.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu cho các chủng nấm mốc không bào tử 18 

2.1.6 Môi trường nuôi cấy và bảo quản giống 19 

2.1.7 Kiểm tra sinh hóa của vi khuẩn 21 

2.1.8 Đánh giá khả năng lên men ở nhiệt độ cao của nấm men 22 

2.1.9 Đánh giá khả năng tạo các hợp chất bay hơi của nấm men 23 

2.1.10 Xác định khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 23 

2.1.11 Khả năng nhạy cảm với protease của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 23 

2.1.12 Phương pháp tách chiết bacteriocin từ chủng L plantarum CNTP 6529 24 

2.1.13 Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của bacteriocin 24 

2.1.14 Khảo sát khả năng sinh phytase bền nhiệt của các chủng nấm mốc và sự có mặt của gen mã hóa phytase 25 

2.1.15 Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự DNA 27 

2.1.16 Tách dòng và thể hiện gen mã hóa xylanase từ Aureobasidium pullulans 28 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN 30 

3.1 Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen 30 

3.1.1 Phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu truyền thống của một số địa phương của Việt Nam 30 

3.1.2 Phân lập một số chủng nấm men đen nhóm Moniliella 33 

3.1.3 Thu thập các chủng vi khuẩn lactic 35 

3.2 Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen 36 

3.2.1 Bảo tồn lưu giữ nguồn gen giống nấm men 36 

3.2.2 Bảo tồn lưu giữ nguồn gen giống nấm mốc 42 

3.2.3 Bảo tồn lưu giữ nguồn gen giống vi khuẩn 49 

3.3 Đánh giá nguồn gen 50 

3.3.1 Khả năng sinh trưởng và tạo cồn của nấm men ở nhiệt độ cao 50 

3.3.2 Đánh giá khả năng tạo hợp chất bay hơi của một số chủng nấm men 52 

3.3.3 Hoạt tính amylase của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men 54 

3.3.4 Phân loại 10 chủng nấm mốc phân lập từ bánh men bằng giải trình tự ITS 55 

3.3.5 Khả năng sinh phytase bền nhiệt và sự có mặt gen phyA ở các chủng nấm mốc 58 

3.3.6 Đánh giá nguồn gen của các chủng vi khuẩn lactic 65 

3.3.7 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của các chủng vi khuẩn lactic 66 

3.3.8 Tính mẫn cảm của bacteriocin với enzym phân hủy protein 68 

3.3.9 Tách chiết và thu hồi bacteriocin của chủng CNTP6529 69 

3.3.10 Phân loại định tên một số chủng vi khuẩn lactic 70 

3.3.11 Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa endo-1,4-beta-xylanase từ nấm men Aureobasidium pullulans var melanigenum 71 

3.4 Xây dựng cơ sở dữ liệu - Data Bank 78 

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 

Kết luận 141 

Kiến nghị 141 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 

PHỤ LỤC 144 

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

2D – Two dimensional (hai chiều)

ATCC – American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ)

CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan)

CMC - Carboxymethyl cellulose

CNTP – Sưu tập giống vi sinh vật Viện Công nghiệp Thực phẩm

DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Sưu tập giống vi sinh vật và mô CHLB Đức)

FIRI – Food Industries Research Institute (Viện Công nghiệp Thực phẩm)

h – hour (giờ)

JCM – Japan Collection of Microorganisms (Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản)

JICA - Japan International Cooperation Agency

MALDI-TOF – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (kỹ thuật khối phổ peptid dựa trên sự ion hóa bằng tia laser)

NMR - Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NRRL - Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD – Optical Density (mật độ quang)

PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di polyacrylamide)

DGGE - Denaturing gradient gel electrophoresis

rDNA - Ribosomal DNA

rRNA - Ribosomal RNA

PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

PDA – Potato Dextrose Agar

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phương pháp cắt hạn chế)

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate

SEM – Scanning Electron Microscope (kính hiển vi điện tử quét)

T – Type strain (chủng chuẩn)

U – Unit (đơn vị)

TÓM TẮT NHIỆM VỤ

Điều tra, khảo sát và thu thập nguồn gen

- Thu thập, tiếp nhận được 80 chủng vi sinh vật, trong đó có 41 chủng nấm men đen,

23 chủng nấm mốc từ bánh men, 16 chủng vi khuẩn lactic

Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen

- Bảo tồn an toàn 1139 và 80 chủng mới bổ sung chủ yếu bằng đông khô và trong nitơ lỏng Trong đó: L-drying bổ sung 120 chủng, duy trì trong ni tơ lỏng trên 900 chủng, cấy truyền 120 chủng, bảo quản trong paraffin 50 chủng

Đánh giá nguồn gen

- Khả năng sinh trưởng, tạo cồn, tạo hương của 10 chủng nấm men ở nhiệt độ cao

- Hoạt tính amylase của 17 chủng nấm mốc phân lập từ bánh men, định tên 10 chủng bằng giải trình tự ITS

- Đánh giá khả năng sinh phytase bền nhiệt và sự có mặt của gen mã hóa ở 17 chủng nấm mốc, phân loại định tên 9 chủng

- Đánh giá đặc tính của 16 chủng vi khuẩn lactic bao gồm khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau, tính mẫn cảm của bacteriocin với enzym phân hủy protein, định tên 5 chủng bằng giải trình tự 16S rDNA

- Tách chiết và thu hồi bacteriocin của chủng CNTP 6529

- Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa endo-1,4-beta-xylanase từ nấm men

Aureobasidium pullulans var melanigenum

Xây dựng cơ sở dữ liệu

- Bổ sung cơ sở dữ liệu cho 70 chủng

Sưu tập, tuyển chọn các gen quý đã biết cũng như những gen mới chưa được nghiên cứu

Từ sản xuất và môi trường thiên nhiên Đối với nguồn gen Vi sinh vật, mối quan tâm hàng đầu là những gen có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học Một vài ví dụ

có thể liệt kê là: gene mã hoá enzyme chịu nhiệt (trên 90C) từ vi sinh vật sống trong suối nước nóng, các enzyme hoạt động tốt ở nhiệt độ thấp từ các vi sinh vật Châu Nam cực, các gen sinh kháng sinh mới, các gen điều khiển quá trình sinh tổng hợp chất mầu

Astaxanthin từ Xanthophyllomyces dendrorhous làm tăng chất lượng màu của cá hồi,

enzyme thuỷ phân lignin cho công nghiệp giấy, hệ cytochrom P-450 trong chuyển hoá thuốc và các hợp chất thơm Những gen này một khi được ứng dụng sẽ tạo đột phá mới trong công nghệ Một trong những hướng phát triển của vài năm gần đây là việc sưu tập

và thiết lập các ngân hàng gen tổng thể từ môi trường Theo đó, toàn bộ DNA từ môi trường thiên nhiên (đất, nước, chất hữu cơ…) sẽ được phân lập và biến nạp vào các vector lưu trữ Từ thư viện này các dòng gen quan tâm có thể được tách dòng và thể hiện Điều đáng lưu ý là trong những năm gần đây các nước phát triển đặc biệt quan tâm tới nguồn gen với những tiềm năng hầu như chưa được khai phá của những quốc gia đang phát triển tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Các mạng lưới như Asian Culture Collection Network hay BioNET-INTERNATIONAL là ví dụ của những cố gắng nhằm tận dụng khai phá nguồn gen này Đây cũng là cơ hội cho các quốc gia như Việt Nam tham gia, tiếp cận với công nghệ cao trong lĩnh vực vi sinh

Nghiên cứu đặc tính sinh học, và đánh giá nguồn gen

Việc lưu giữ nguồn gen sẽ trở nên vô nghĩa nếu không được nghiên cứu và đánh giá Những gen vi sinh vật được chọn lọc sẽ trở thành vật liệu tạo ra những gen mới với ứng dụng mới hoặc hoàn hảo hơn Công việc đánh giá ban đầu bao gồm việc phân loại định

tên Vi sinh vật thông qua các đặc điểm hình thái, sinh lý Tại sưu tập giống Nhật bản (JCM), Hà lan (CBS), Mỹ (ATCC) việc định tên một chủng giống với ví dụ nấm men cần thực hiện trên dưới 60 test sinh lý, sinh hoá Ngoài ra còn cần phải phân tích các đặc điểm thành phần % G+C và A+T, loại CoQ, thành phần thành tế bào Hiện nay các sưu tập kể trên còn ứng dụng phương pháp đọc trình tự các gen 18S rRNA, 26SrRNA, ITS cho việc phân loại và định tên Tiếp theo sau là việc đánh giá các đặc tính sinh học của gen quan tâm Tại sưu tập giống DSMZ của Đức với những gen mã hoá protein hay enzyme ngoài việc đánh giá hoạt lực, những protein, enzyme này sẽ được tinh sạch bằng 2D SDS-PAGE sau đó phân tích bằng MALDI-TOF để đối chiếu với ngân hàng dữ liệu

và định tên protein Trong trường hợp quan tâm hơn, các đoạn trình tự axít amin có thể được giải trình tự, dựa trên kết quả đó gen có thể được tách dòng, đọc trình tự Protein có thể được thể hiện, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc bằng NMR hay X-ray Tất cả thông tin thu thập sẽ được lưu trữ vào ngân hàng dữ liệu và các gen quý được bảo quản phục vụ nghiên cứu khi cần thiết

Các công cụ mới như chip DNA cũng bắt đầu được sử dụng Với một chip thông thường hiện nay tới 150,000 mẫu dò có thể được kết gắn Với mật độ gen lớn như vậy có thể xác định sự thể hiện của toàn bộ các gen trong cơ thể hoặc sự có mặt của bất kỳ vi sinh vật nào trong mẫu phẩm

Lưu giữ và bảo tồn nguồn gen

Do hiểu biết của con người về hoạt động của các gen phần nào còn hạn chế, việc lưu giữ và bảo tồn những gen quý một cách đơn giản và hiệu quả nhất vẫn được thực hiện thông qua việc bảo tồn và lưu giữ cơ thể chủ mang những gen đó Với những gen đã được nghiên cứu kỹ và/hoặc có nhu cầu sử dụng thường xuyên, chúng có thể được giữ trong những vector tách dòng, trong tiêu bản DNA, và thậm chí dưới dạng số liệu máy tính (cho những gen ngắn, có thể tổng hợp dễ dàng) Các kỹ thuật bảo quản tế bào chủ thông dụng nhất là đông khô, lạnh sâu, và trong Nitơ lỏng Tại các sưu tập quốc gia của

Mỹ (ATCC), Hà lan (CBS), Đức (DSMZ) giống được lưu giữ đồng thời bởi nhiều phương pháp, nhưng phương pháp bảo quản trong Nitơ lỏng vẫn là chủ đạo Sử dụng Nitơ lỏng có thể bảo quản hầu như tất cả các chủng vi sinh vật Phương pháp này có chi phí cao nhưng an toàn và bảo đảm giữ vững các đặc tính ban đầu Phương pháp đông khô là một phương pháp rất thuận tiện Giống sau khi đông khô có thể lưu giữ tới vài chục năm mà không phải quan tâm gì nhiều Do nằm trong các ống thuỷ tinh đã hàn kín

và trong chân không nên nguy cơ lây nhiễm là không thể xảy ra Nhược điểm chính là không phải vi sinh vật nào cũng có thể bảo quản được bằng phương pháp này Ngoài ra các phương pháp khác như cấy truyền, bảo quản trong parafin, bảo quản trong cát vẫn còn được sử dụng trong một số ít trường hợp, chủ yếu cho những đối tượng đang trong quá trình nghiên cứu Như vậy để bảo đảm lưu giữ nguồn gen một cách an toàn cần thiết

Nghiên cứu phát triển nguồn gen

Những gen quý hiếm luôn là đối tượng được quan tâm đặc biệt cho nghiên cứu phát triển Trong một số ít trường hợp những gen này có thể được trực tiếp thể hiện (gene expression) và phục vụ trong sản xuất Với đa số trường hợp còn lại, nguồn gen sưu tập được sẽ dùng làm vật liệu để tạo những gen mới phù hợp hơn với yêu cầu công nghệ

Một minh chứng cụ thể là gen mã hoá protein diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã được ứng dụng đưa vào thực vật để tạo khả năng tự kháng côn trùng và

đó có lẽ cũng là ứng dụng lớn nhất của kỹ thuật gen trong tạo giống cây trồng Một gen

kinh điển khác là gen mã hoá DNA-polymerase từ vi sinh vật Thermus aquaticus Gen này được tách dòng và thể hiện để tạo enzyme Taq DNA polymerase cần thiết cho phản

ứng PCR Chính gen vi sinh vật này đã góp phần tạo nên cuộc cách mạng công nghệ sinh học ngày nay Một trong những hướng phát triển mới trong thời gian gần đây là ứng dụng Metagenomics với việc thu thập sàng lọc toàn bộ DNA có trong mẫu phẩm mà không thông qua phân lập vi sinh vật Với Metagenomics người ta có thể khai thác đa dạng thiên nhiên triệt để hơn vì cho tới nay theo ước tính chỉ có khoảng 0.1-1% vi sinh vật trong thiên nhiên là có thể nuôi cấy được

Phát triển cơ sở dữ liệu về nguồn gen

Việc phát triển cơ sở dữ liệu là một trong những công việc được quan tâm đặc biệt nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu cũng như quảng bá Nội dung thông tin của nguồn gen thường bao gồm: nguồn gốc, phương pháp lưu giữ, trình tự DNA, trình tự axit amin, đặc tính sinh học, ứng dụng, tài liệu liên quan, bản quyền Tư liệu có thể dưới dạng văn bản in ấn hoặc thông tin điện tử Trong thời gian gần đây, do tốc độ phát triển quá nhanh của cơ sở dữ liệu, một số sưu tập như ATCC (Mỹ) đã bỏ dần dạng văn bản in ấn và tập trung chủ yếu vào văn bản điện tử Thông thường các cơ sở dữ liệu đều được kết nối với mạng internet, tuy nhiên chỉ một phần thông tin được công bố rộng rãi, phần còn lại được phân quyền và bảo mật nghiêm ngặt

Đào tạo và nâng cao trình độ chuyên môn

Các sưu tập trong thời gian gần đây thường đòi hỏi đào tạo nhân lực với những nội dung chính sau: phân loại vi sinh vật, sinh học phân tử, xây dựng và quản lý cơ sở dữ liệu Một trong những hướng phát triển nguồn nhân lực trong các sưu tập là sự chuyên môn hoá cao độ Một nhân viên thường chỉ đảm nhiệm một nhóm đối tượng rất nhỏ nhưng về trình độ họ lại cũng thường là những chuyên gia hàng đầu về lĩnh vực mình đảm nhiệm Điều này đã giúp các sưu tập nâng cao hiệu quả công việc và khả năng cạnh tranh

Hiện nay Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp Thực phẩm lưu giữ 1139 chủng Các chủng trong sưu tập có nhiều đặc tính quý hiếm như khả năng sinh các enzyme thuỷ phân protein, tinh bột, celluloza ở các chế độ khác nhau, các vi sinh vật sinh axít hữu cơ, vitamin, axít amin, kháng sinh, protein diệt côn trùng, chất mầu thực phẩm, biến đổi chất thơm Một lượng lớn các chủng đã và đang được sử dụng trong lên men bia, rượu, tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học tại nhiều địa phương trong cả nước

Do điều kiện kinh phí còn hạn hẹp sưu tập giống mới chỉ tạm dừng lại ở công tác lưu giữ và bảo quản giống là chính Các kỹ thuật được đưa vào sử dụng trong bảo quản bao gồm bảo quản trong nitơ lỏng, bảo quản đông khô, lạnh sâu, trong cát, bằng paraffin và cấy truyền Công tác đánh giá nguồn gen mới chỉ được thực hiện sơ bộ, thông qua các đặc tính và thể hiện bên ngoài Thông tin về sưu tập giống chưa đầy đủ, cục bộ

Tuy nhiên, hiện nay nhu cầu cũng như lượng giống cung cấp được cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ ngày càng tăng đi đôi với sự tăng trưởng của nền kinh tế Nhu cầu giống phục vụ nghiên cứu ứng dụng cũng tăng lên do yêu cầu của kinh tế xã hội Sự phát triển

nhiều hướng nghiên cứu và phát triển mới Đòi hỏi về sự đa dạng của nguồn gen trong sưu tập do vậy cũng trở nên rất cấp thiết Sưu tập gen là một trong những nền móng cơ bản của Công nghệ Sinh học Để phát triển Công nghệ Sinh học việc củng cố và phát triển các Sưu tập gen giống vi sinh vật cần nhận được sự quan tâm đúng mức và kịp thời

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.1.1 Bảo quản vi sinh vật trong nitơ lỏng

Ngoài các phương pháp bảo quản như cấy truyền, bảo quản trong cát, bảo quản dưới paraffin, bảo quản lạnh sâu, bảo quản đông khô, trong năm 2010, bảo tồn gen Vi sinh vật Công nghiệp thực phẩm bảo quản lưu giữ các chủng vi sinh vật trong nitơ lỏng và coi đây

là biện pháp chủ đạo Việc bảo quản được thực hiện bảo quản được tiến hành theo quy trình sau:

Chuẩn bị dụng cụ

Lựa chọn loại ống hút bằng chất liệu polypropylene (có thể sử dụng loại ống hút sữa, nước hoa quả), cắt ngắn thành từng đoạn 2-3 cm Dùng panh kẹp chặt một đầu và hàn bằng ngọn lửa Đặt ống vào hộp và hấp vô trùng Hấp vô trùng các ống nút xoáy chuyên dụng cho bảo quản nitơ lỏng (không dùng các loại khác vì nếu hở vì ống có thể bị nổ khi lấy ra từ nitơ lỏng)

Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy sinh khối và kiểm tra độ phần trăm sống sót của mẫu giống là môi trường nuôi cấy chọn lọc Cân và hoà tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho Phân phối môi trường vào các bình tam giác Đậy nút bông, khử trùng

ở điều kiện phù hợp cho từng loại môi trường Môi trường bảo vệ có tỷ lệ sữa tách bơ 10% (w/v), hoặc glycerol 10% (v/v), hoặc dimethyl sulfoxide (DMSO) 5% (v/v) Môi trường bảo vệ cần được tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur, hoặc màng lọc vi khuẩn hoặc ở 121C trong 15 phút

Chuẩn bị mẫu giống

Một mẫu giống vật liệu cần bảo quản lặp lại không ít hơn ba lần Không được chọn những khuẩn lạc riêng biệt trong các lần cấy chuyển làm giống (tránh đột biến sinh trưởng) Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu thuần Người lấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu Trong quá trình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu phải đảm bảo tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài và đảm bảo được tính nguyên trạng ban đầu

Chuẩn bị dịch huyền phù theo 2 cách

(a) – Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu giống nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng: Các mẫu giống được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng thích hợp Sau khi tế bào phát triển tốt, ổn định (pha sinh trưởng), thu sinh khối vi sinh vật để tiến hành bảo

glycerol hoặc 5% (v/v) DMSO hoặc 10% (w/v) sữa tách bơ vào mỗi ống thạch nghiêng Dùng dụng cụ vô trùng đánh tan toàn bộ sinh khối trên bề mặt thạch nghiêng vào môi trường, sau đó hút toàn bộ dịch huyền phù tế bào, đảm bảo mật độ tế bào ít nhất là 108 tế bào/ml Dùng pipet vô trùng phân 200 l của dịch huyền phù tế bào vào ống polypropylene đã thanh trùng và hàn một đầu Kẹp đầu còn lại và hàn bằng ngọn lửa Đặt ampul trong tủ lạnh 5 C trong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tế bào và môi trường

(b) – Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu giống nuôi cấy trên môi trường dịch thể:

Các mẫu giống được nuôi cấy trên môi trường dịch thể thích hợp Sau khi tế bào phát triển tốt, ổn định, tiến hành bảo quản bằng nitơ lỏng Dùng pipet vô trùng bổ sung một lượng 20% (v/v) glycerol hoặc 10% (v/v) DMSO hoặc 20% sữa tách bơ đã khử trùng bằng thể tích của dịch vi sinh vật để đạt nồng độ glycerol cuối cùng 10% (v/v) hoặc

DMSO 5% (v/v) hoặc sữa tách bơ 10% (w/v) Lắc nhẹ để thu được dịch huyền phù tế bào

đồng đều, đảm bảo mật độ tế bào ít nhất là 108 tế bào/ml Dùng pipet vô trùng phân 200

l của dịch huyền phù tế bào vào ống polypropylene đã thanh trùng và hàn một đầu Kẹp đầu còn lại và hàn bằng ngọn lửa Đặt 3 – 4 ống vào các ampul chuyên dụng, vặn thật chặt (nếu hở có thể nổ ống) và đặt trong tủ lạnh 5C trong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tế bào và môi trường

Quá trình bảo quản bằng nitơ lỏng

Đặt ống polypropylen vào các ống nút xoáy chịu lạnh, để trong hộp sau đó đặt vào buồng làm lạnh của máy làm lạnh và làm lạnh tới -35C trong 1h Nhanh chóng chuyển hộp chứa giống đến vị trí bảo quản cuối cùng trong bình nitơ lỏng (nhiệt độ từ -156C đến -196C)

Ghi chú: Cần đi găng tay poleyolefin khi thao tác để tránh bị bỏng tay

Kiểm tra giống

Định kỳ hàng năm kiểm tra độ sống sót và đặc tính sinh học của giống Chỉ cho phép

giữ lại các giống có độ sống sót và có hoạt tính sinh học ổn định như giống gốc Dùng môi trường nuôi cấy chọn lọc là môi trường để kiểm tra Môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho Sau đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh

đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở những điều kiện phù hợp Để nguội môi trường đến 50C rồi phân phối vào các đĩa petri vô trùng Thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng Nước muối sinh lý (NaCl 0.85%), không chứa các hợp chất nitơ, sau khi khử trùng có độ pH là 7.0 được sử dụng làm dịch pha loãng Phân phối dịch pha loãng vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml Làm nút bông và khử trùng ở 1 atm (121C) trong 30 phút Nếu

45-chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 10C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị

Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột,

nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng

Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào

Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra ra khỏi bình nitơ lỏng, cho băng tan tự nhiên (trong điều kiện phòng thử nghiệm) Lau bên ngoài của ống bằng gạc vô trùng có thấm etanol 70% (v/v) Cắt ống polypropylen trong điều kiện vô trùng Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút 0.1 ml dịch huyền phù trong ống nghiệm cho vào 9.9 ml dịch pha loãng, tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha loãng Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây Tiếp tục pha loãng tới

Chuẩn bị môi trường đông khô

Dung dịch A: Sữa tách béo – 10 g; nước – 95 ml Hòa tan sữa tách béo bằng nước

ấm, sau đó lọc qua bông để loại bỏ cặn sữa vón Dịch sữa được thanh trùng ở nhiệt độ

110 ºC trong 10 phút và được nhúng ngay vào nước lạnh sau khi hấp thanh trùng và sau

đó được ủ ở 37 ºC qua đêm Dịch sữa đã ủ qua đêm được thanh trùng lần 2 ở 110 ºC trong 10 phút sau đó nhanh chóng được nhúng vào nước lạnh

Dung dịch B: Monosodium glutamate – 1 g; nước – 5 ml Hòa tan đều dịch sau đó thanh trùng ở 121 ºC, thời gian 15 phút

Chuẩn bị ampul

Ampul được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường

Chuẩn bị dịch tế bào

Dịch tế bào được chuẩn bị bằng cách cho 2 ml dịch môi trường đông khô vào ống giống thạch nghiêng, sau đó dùng pipette Pasteur khuấy nhẹ tạo dịch huyền phù tế bào

Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:

Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet Pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô Mẫu ống đông khô được để trong tủ -40 C tới -80 ºC ít nhất trong thời gian 6 giờ

Bước tiền đông khô

Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước đã ở dạng đá Trước khi tiến hành đông khô, mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng ít nhất 4 giờ

Tạo chỗ thắt trên ống đông khô

Sau bước tiền đông khô, ampul được thắt Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn Lưu ý, khi thắt ống đông khô luôn cho khoảng cách chỗ thắt là 1 – 1.5 cm

và đường kính 2 mm

Hậu đông khô

Mẫu đông khô sau khi được thắt lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1% Thời gian cho bước này tối thiểu chạy máy liên tục trong 3 giờ và áp suất cao nhất là 6×10-1 mbar

Hàn ống đông khô

Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận Luôn theo dõi áp suất xem áp suất có tăng không, nếu áp suất tăng cần ngừng cắt và kiểm tra sau đó phải chạy máy tối thiểu 1 giờ đến khi áp suất giảm xuống dưới 6x10-1 mbar trước khi thực hiện lại thao tác hàn ống đông khô

Kiểm tra độ chân không của ống đông khô

Sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm

2.1.3 Bảo quản vi sinh vật bằng L-drying

Chuẩn bị chủng giống

Chủng giống vi sinh vật được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi sinh vật trong môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log

Chuẩn bị môi trường

Chuẩn bị dịch chứa 3 g sodium glutamate monohydrate, 1.5g ribitol, 0.05g L-cystein hydrochloride monohydrate, 100 ml 0.1M potassium phosphate buffer pH 7.0 Hút 3 ml chia ra các ống nút xoáy hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121 ºC trong 15 phút

Chuẩn bị ampul

Ampul được rửa sạch sau đó ngâm qua đêm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông Ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường

Hàn ống đông khô

Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận Luôn theo dõi áp suất xem áp suất có tăng không, nếu áp suất tăng cần ngừng cắt và kiểm tra sau đó phải chạy máy tối thiểu 1 giờ đến khi áp suất giảm xuống dưới 6×10-1 mbar trước khi thực hiện lại thao tác hàn ống đông khô

Kiểm tra độ chân không của ống lỏng khô

Sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm

2.1.4 Phương pháp bảo quản bằng L-drying đối với nấm mốc có bào tử

Chuẩn bị dịch bảo quản

- Pha 3 g Sodium L (+) glutamate monohydrate vào 100 ml đệm 0.1M potassium photphate pH 7.0 Chia vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml và hấp ở 121C trong

20 phút Bảo quản trong tủ lạnh đến khi dùng

cách dịch bảo quản khoảng 15 mm Tiến hành thắt ống bảo quản sao cho nút bông

sau khi cắt nút bông sẽ ở lại trong ống Cắm ống bảo quản vào máy đông khô và chạy khoảng 4h đến khi ống khô và nhiệt độ bẫy lạnh đạt -80C áp suất 4,5 × 10-2

mbar Cắt ống, kiểm tra độ chân không Mỗi chủng sử dụng khoảng 5-10 ống

2.1.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu cho các chủng nấm mốc không bào tử

Việc bảo quản lạnh sâu cho các chủng nấm mốc không sinh bào tử được thực hiện theo các bước như sau:

- Chuẩn bị đĩa petri chứa 15 ml PDA

- Cấy giống lên đĩa và nuôi ở 30C trong 3-7 ngày tới khi giống mọc tốt

- Chuẩn bị dịch glycerol 10%, chia vào các ống bản quản loại 2 ml, mỗi ống chứa

1ml môi trường Đặt vào hộp chuyên dụng và hấp thanh trùng ở 121C trong 20

phút Hấp kèm dao mổ, mỗi chủng 1 dao

- Cắt giống trên thạch đĩa 5×5 mm, mỗi ống từ 3-5 miếng thạch Mỗi chủng bảo

quản 5 ống

- Đặt các ống bảo quản và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó chuyển vào bảo

quản ở -80C

Giống có thể được bảo quản 4-5 năm nếu không gặp các sự cố như mất điện ngắn hoặc

dài hạn làm thay đổi nhiệt độ trong tủ

2.1.6 Môi trường nuôi cấy và bảo quản giống

Môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar)

Cao thịt bò (beef extract) 3 g

Chỉnh về pH 7.0, thanh trùng 121C/15 phút

Môi trường Corynebacterium Agar

Casein peptone tryptic digest 10 g

Cao nấm men (Yeast extract) 5 g

Môi trường Trypticase Soy Yeast Extract Agar

Cao thịt (beef extract) 10 g

Cao nấm men (yeast extract) 5 g

K2HPO4 2 g Sodium acetate 5 g

Môi trường PDA

Dùng 300 g khoai tây gọt vỏ, thái chỉ, rửa sạch, thêm 1.4 lít nước, ninh trong 2 giờ Thu lấy 1 lít dịch, thêm 20 g glucose, 20 g agar, khuấy đều, đun sôi trong 5 phút, chia vào các ống nghiệm, hấp thanh trùng 121C/20 phút Để nghiêng môi trường, chờ nguội rồi bảo quản trong tủ 4C

2.1.7 Kiểm tra sinh hóa của vi khuẩn

Thử nghiệm urease

Môi trường urea lỏng Ure broth, chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu pH 6.8 - 8.4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống 3 ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn

và ủ ở 37C trong 48 giờ Phản ứng âm tính môi trường không chuyển sang màu đỏ, phản ứng dương tính môi trường chuyển màu đỏ

Thử nghiệm khả năng sinh H2S

Các môi trường có thể được sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S là KIA (Kligle Iron Agar), TSI (Triple Sugar IronAgar) Tất cả các môi trường này được hấp khử trùng ở 121C trong 15 phút và phân phối vào ống nghiệm làm ống thạch nghiêng Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sâu vào phần đáy của ống thạch

nghiêng, ống thạch đứng hoặc cấy lên mặt đĩa Petri Chủng dương tính là chủng làm đen môi trường

Thử nghiệm tính di động

Sử dụng môi trường thạch mềm 0,5% agar Môi trường được đun tan phân phối thành dung tích 5 ml vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 121C trong 15 phút Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18-24 giờ trên môi trường KIA hay môi trường thích hợp khác Chủng được cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xiên vào môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2 cm Các ống môi trường được ủ ở 37C trong 24 - 48 giờ, nếu (-) thì đươc ủ tiếp ở 21 - 25C đến 5 ngày Thử nghiệm là (+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh; là (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong

Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Cấy vi khuẩn đã được làm thuần vào môi trường MR-VP, ủ ở 37.0 + 1.0C trong 48+

2 giờ Nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl Red vào môi trường cấy Phản ứng dương tính khi hỗn hợp chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi môi trường không đổi màu

Thử nghiệm VP (Voges- Proskauer)

Cấy vi khuẩn đã được làm thuần vào môi trường MR-VP, ủ ở 37.0 + 1.0C trong 48+2 giờ Thêm 0.6 ml α-naphtol và 0.2 ml KOH 40%, lắc đều để yên trong 2 giờ Phản

ứng dương tính nếu màu hồng eosin xuất hiện E coli cho phản ứng VP âm tính (không

có sự xuất hiện màu trong ống nghiệm)

Thử nghiệm lysin decarbonxylase

Cấy khuẩn lạc đã được làm thuần vào môi trường LDC, ủ ở 37.0  1.0C trong 48  3 giờ, nhưng phải kiểm tra sau 24 h Nếu môi trường LDC giữ nguyên màu tím phản ứng là dương tính Phản ứng âm tính khi môi trường chuyển sang màu vàng

2.1.8 Đánh giá khả năng lên men ở nhiệt độ cao của nấm men

Đánh giá khả năng phát triển ở nhiệt độ cao

Nấm men được cấy ra ống thạch nghiêng trên môi trường Malt-glucose agar Hòa 1 vòng que cấy sinh khối vào 1 ml nước cất đã thanh trùng Hút 0.2 ml giống dạng lỏng cho vào lỗ của đĩa in dấu bằng inox đã thanh trùng Đánh dấu các chủng lên trên đĩa môi trường thạch nuôi cấy nấm men Malt-glucose 2Bx Nuôi cấy ở các nhiệt độ 37C, 38C, 39C, 40C, 41C, 42C, 43C và đánh giá kết quả sau 48 giờ

Đánh giá khả năng lên men tạo cồn ở nhiệt độ cao

Chủng giống được hoạt hóa trên môi trường ống thạch nghiêng chứa Malt-glucose agar và cấy truyền một vòng que cấy vào 4 ml môi trường lỏng (glucose 10%, yeast extract 0.5%) Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở nhiệt độ 28C bổ sung 36 ml môi trường lên men (glucose 20%, yeast extract 0.5%) và ủ ở các nhiệt độ 38C, 39C, 40C, 41C, 42C Sau 36 giờ lên men nồng độ cồn được xác định bằng máy cất Ebuliometer (Dujardin-Salleron Model 360) và lượng đường sót được xác định bằng khúc xạ kế

2.1.9 Đánh giá khả năng tạo các hợp chất bay hơi của nấm men

Nấm men được nuôi cấy ở 28C trong môi trường gạo đồ đã được thủy phân nhờ enzyme amylase Sau 3 này lên men, dịch lên men được thu nhận bằng cách lọc qua giấy lọc Mẫu được phân tích sử dụng GC trên máy Agilent - Mỹ Cột sử dụng là CV20, Detector FID, chế độ chạy: 50C đẳng nhiệt 1 phút nâng đến 180C đẳng nhiệt 2 phút với tốc độ 10/phút) Các chất chuẩn được sử dụng làm tham chiếu

2.1.10 Xác định khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Dịch nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm tách sinh khối Hút dịch với thể tích nhất định (25µl) vào đĩa thạch agar có chứa sẵn vi sinh vật chỉ thị, để 4C 4 giờ để mẫu khuếch tán đều Nuôi cấy đĩa ở 30C cho chủng vi sinh vật chỉ thị phát triển Đo vòng vô khuẩn

quanh các giếng nếu có Giống chỉ thị Lactobacillus plantarum JCM 1149 (trừ các trường

hợp khác, sự dụng chủng kiểm định khác sẽ được nêu tên)

2.1.11 Khả năng nhạy cảm với protease của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

Các chủng vi khuẩn đã lựa chọn, được nuôi cấy trên môi trường MRS, dịch ly tâm thu được điều chỉnh về pH=6.5, xử lý dịch ly tâm với các enzyme (nồng độ 0.5 mg ml-1) theo tỉ lệ 1:1 (dịch ly tâm : enzyme phân huỷ protein) Các mẫu đối chứng âm là chỉ có các enzym, mẫu đối chứng dương là dịch nuôi cấy vi khuẩn với đệm photphat theo tỷ lệ (1:1) Các mẫu thí nghiệm được ủ ở 30oC trong 2 giờ, dừng phản ứng (làm biến tính enzym) ở 100C trong 5 phút, tiến hành thử hoạt tính bacteriocin theo phương khuếch tán trên thạch Sự nhạy cảm với enzyme được đánh giá nhờ vào vòng vô khuẩn Nếu Không xuất hiện vòng vô khuẩn trong mẫu thí nghiệm (vòng vô khuẩn = 0 mm) hoặc làm giảm hoạt tính so với mẫu đối chứng, có thể kết luận trong mẫu thí nghiệm có bacteriocin Các enzyme sử dụng trong thí nghiệm này gồm: proteinase, papain, bromelin papain, bromelin papain, bromelin pha trong đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7.0; trypsin pha trong đệm 40 mM Tris-HCl, pH 8.2; pepsin pha trong đệm 0.002 N HCl; α-chymotrypsin pha trong 20 mM Tris-HCl, pH 8.0

2.1.12 Phương pháp tách chiết bacteriocin từ chủng L plantarum CNTP 6529

Dịch canh trường vi khuẩn lactic được điều chỉnh pH 6,5 và gia nhiệt 60C trong 30 phút nhằm bất hoạt các enzyme protease có trong môi trường (bacteriocin chịu nhiệt nên không bị bất hoạt ở điều kiện này) Trong quá trình này bacteriocin được hấp phụ vào bề mặt tế bào Ly tâm thu sinh khối, rửa bằng 5 mM Natri hydrogen photphat Sau đó hòa lại sinh khối trong 100 mM NaCl pH 2 trong 1 giờ tại 4C có khuấy nhẹ, để phản hấp phụ bacteriocin vào dịch lỏng Sau đó, ly tâm và lấy phần dịch trong đó có chứa bacteriocin Dịch thu được được làm sạch bằng tách chiết qua Sep-Pak Plus C18 cartridge, Waters, Millipore Corp theo phương pháp SPE (solid phase extraction) Sau đó, sử dụng phương pháp tách bằng HPLC cột C18 pha ngược Dung dịch A là acetonitrile (0 – 100%), dung dịch B là nước (Super Q) có chứa 0,1% axit trifloroacetic Chạy theo gradient Tốc độ bơm là 2ml/ phút

Xác định hoạt tính bacteriocin và các phân đoạn tách chiết bacteriocin từ chủng L plantarum CNTP6529 sử dụng chủng chỉ thị L plantarum NFRI 7305

Hàm lượng protein được xác định dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử Folin-Ciocalteu Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Dựa theo đường cong chuẩn của protein chuẩn BSA (Bovine Serum Albumin) với thuốc thử này, có thể tính được lượng protein trong mẫu nghiên cứu (Lowry, 1951)

2.1.13 Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của bacteriocin

Bacteriocin làm sạch được phân tách bằng điện di Tricine SDS-PAGE với thang chuẩn là protein có kích thước 1423 – 26625 Da Gel được nhuộm bạc sử dụng kit 2D-Silver Stain II (Daiichi pure Chemicals, Japan); hoặc nhuộm bằng Commassie Blue

Chủng tham chiếu là L plantarum NFRI 7305

Peptid đã được làm sạch ở các bước trên được thẩm thấu qua màng Immobilon – P Transfer Membrane để phân lập peptid Sau đó peptid được xử lý bằng phương pháp Edman degradation Tiếp theo mẫu được sử dụng để đọc trình từ amino - acid từ đầu N bằng nguyên tắc tách từng gốc amino acid từ N-terminus của peptid và xác định amino acid bằng HPLC nghịch pha

2.1.14 Khảo sát khả năng sinh phytase bền nhiệt của các chủng nấm mốc và sự có

mặt của gen mã hóa phytase

Các cặp mồi sử dụng cho PCR được sử dụng trong khảo sát bao gồm:

Tách chiết ADN genome của Aspergillus

Nấm mốc được nuôi cấy trên Malt agar 2% trong 3-5 ngày ở 30C Bào tử được thu bằng

2 ml Tween 80 0,1% Sau đó, 0.5 ml dịch bào tử được chuyển vào bình tam giác chứa 10 ml YM

và nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 30C trong khoảng 8-16 giờ (đảm bảo bào tử mới chỉ nhú mầm,

chưa mọc dài thành sợi và kết vào nhau) Sau đó chuyển 1 ml mầm bào tử vào ống Eppendorf 1.5 ml và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút Sinh khối được rửa bằng nước cất thanh trùng

và bổ sung 0,75 ml 2 SSC, vortex rồi ủ ở 99C trong 20 phút Chuyển toàn bộ dịch và tế bào sang ống Eppendorf mới và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía trên Sinh khối được rửa bằng nước cất, sau đó bổ sung 100 µl phenol/chloroform, 100 µl hạt thuỷ tinh và

100 µl nước Sinh khối được đồng hóa trên máy phá tế bào Biospec ở chế độ tối đa trong 2 phút Hỗn hợp được ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút Dịch nổi phía trên được dùng trực tiếp

làm khuôn cho PCR Trong trường hợp nấm men, việc tách chiết ADN được thực hiện tương tự

như trên nhưng bỏ qua qua giai đoạn kích hoạt nảy mầm bào tử

Xác định hoạt tính phytase

Hoạt tính phytase được xác định theo phương pháp của Shimizu và cộng sự đề xuất năm

1992 Lượng Pvc giải phóng dưới tác động của phytase được xác định bằng dung dịch thử màu

(1) Phytic acid + H2O → myo-inositol (phosphate)n + Pvc

(2) myo-Inositol (phosphate)n + H2O → myo-inositol + Pvc

(3) Pvc+ ammonium molybdate → 12-molybdophosphoric acid

(4)12-molybdophosphoric acid + H2SO4 / ascorbic acid→ molybdenum blue

Dung dịch thử mầu

Là dung dịch có chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate - ((NH4)6Mo7O2)4 + 5,5% H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O ) Dung dịch

thử mầu được pha và sử dụng trong ngày

Cách pha dung dịch thuốc thử

Pha dung dịch A: Để pha 240 ml dung dịch A cần 14 ml dung dịch H2SO4 95% và 226

ml nước cất Đổ từ từ H2SO4 vào nước cất, sau đó để nguội ta thu được dung dịch H2SO4 5.5%

Bổ sung vào 240 ml dung dịch axit trên 3,823 g muối amonium molypdate, hoà tan hoàn toàn sẽ được dung dịch A

Pha dung dịch B: Cân chính xác 0,494 g FeSO4.7H2O hoà tan vào 10 ml nước sẽ thu được dung dịch B có chứa FeSO4.7H2O 2,7% (Lưu ý: dung dịch B chỉ được pha trước khi sử dụng vì để lâu Fe2+ sẽ bị oxy hoá thành Fe3+)

Sau khi có dung dịch A và dung dịch B, trộn đều 4 lần thể tích A cộng 1 lần thể tích B Sau đó để hỗn hợp ổn định sau khoảng 1 giờ khi dung dịch trong suốt không màu thì sử dụng được

Dung dịch cơ chất

Là dung dịch có chứa 3 mM phytate-Na trong đệm axetate-Na 0,1M pH 5,0

Cách pha dung dịch cơ chất

Cân 0,277 g muối phytate-Na pha trong 10 ml nước cất ta thu được dung dịch gốc phytate-Na có nồng độ 30 mM Từ dung dịch này pha loãng 10 lần với dung dịch đệm axetate-

Na 0,1M (pH 5,0) để thu được dung dịch cơ chất mong muốn

Cách tiến hành phản ứng enzyme thực hiện như sau

Mẫu thí nghiệm: 0,2 ml dịch enzyme + 0,2 ml dịch cơ chất (3 mM phytate-Na trong đệm

Na-axetate 0.1M pH 5,0) ủ 50C trong 20 phút, sau đó bổ sung 0,4 ml TCA (trichloroacetic acid) 15% để dừng phản ứng, tiếp theo bổ sung 0.8 ml thuốc thử, để phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bước sóng 700 nm

Mẫu đối chứng: 0,2 ml dịch enzyme + 0,4 ml TCA 15% nhằm bất hoạt enzyme, sau đó +

0,2 ml dịch cơ chất (3 mM phytate-Na trong đệm axetate-Na 0.1M pH 5,0) ủ ở 50C trong 20 phút, tiếp theo bổ sung 0,8 ml thuốc thử phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bước sóng 700 nm

Xác định đồ thị chuẩn phospho

Dung dịch NaH2PO4 được sử dụng làm chuẩn phospho Cân chính xác 1,38 g NaH2PO4hoà tan vào 100 ml nước cất thu được dung dịch NaH2PO4 0,1M (tương đương 0,1 M Pvc = 100 mM) từ dung dịch gốc này ta pha loãng thành các nồng độ như sau: 0; 0,5; 0,75;1,0; 1,5; 2,0

mM Từ mỗi độ pha loãng này lấy ra 0,2 ml để thử phản ứng màu bằng cách bổ sung thêm 0,2ml phytate – Na 0,4 ml TCA, ủ 20 phút tại 50C rồi bổ sung thêm 0,8 ml thuốc thử màu và xác định màu tại OD 700 nm kết quả mô tả qua bảng 1

Bảng 1 Tương quan giữa hàm lượng Pvc và OD 700 nm

OD 700nm

Dựa trên phương pháp toán học này chúng tôi đã xử lý kết quả bằng phần mềm Excel và

đã thu được đồ thị chuẩn và hàm hồi qui như sau:

Hình 1 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc

Đồ thị đường chuẩn có dạng y = 0,642x – 0,01 với độ chính xác R> 99% Như vậy mức

độ liên hệ giữa x và y là rất chặt chẽ, kết quả đo được là đáng tin cậy Một đơn vị hoạt tính (IU)

được tính là lượng Pvc (μmol) giải phóng trong 1 phút bởi 1 ml enzyme ở điều kiện thử

2.1.15 Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự DNA

Vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, xử lý bằng 2SSC, phá tế bào bằng hạt thủy tinh ADN được tách chiết bằng phenol-chloroform và sử dụng làm khuôn cho PCR Với nấm men và nấm mốc, phân đoạn ITS-D1/D2 được khuyếch đại sử dụng cặp mồi ITS1 và NL4 trên máy GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) Điều kiện nhiệt cho PCR như sau: giai đoạn biến tính ban đầu ở 94C trong 30 giây sau

đó là 35 chu kỳ nhiệt ở 94 C trong 30 giây, 52 C trong 40 giây và 72 C trong 60 giây Giai đọan kéo dài cuối cùng được thực hiện ở 72C trong 7 phút Sản phẩm PCR được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen) Tương tự như vậy, với vi khuẩn các mồi 10F

(AGTTTGATCCTGGCTC) và 1540R (AGGAGGT GATCCAGCC) để khuếch đại gen

Việc giải trình tự DNA được thực hiện sử dụng các mồi đã công bố là ITS1, ITS4 (với nấm mốc), NL1, NL4 (với nấm men) (Kurtzman & Robnett, 1998; Esteve-Zarzoso, 1999), 10F hoặc 350R (với vi khuẩn) (Sata và cs., 2002) Thiết bị giải trình tự DNA sequencer 377 của Applied Biosystems được sử dụng Để phân tích phả hệ, trình tự DNA được so sánh với các trình tự đã có trong GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm nucleotide-nucleotide BLAST của National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997) Những trình tự gần nhất được xử lý bằng BioEdit (Hall, 1999) và so sánh sử dụng ClustalX version 1.81 (Thompson et al., 1997) Giá trị phạt cho gap cố định và gap trôi tương ứng là 10 và 0.2 Cây phả hệ được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa các trình tự theo phương pháp Kimura (Kimura, 1980) và sử dụng thuật toán neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987) trong ClustalX Phân tích bootstraps được thực hiện thông qua 1000 nhóm ngẫu nhiên (Felsenstein, 1985) Cây phả hệ được dựng sử dụng phần mềm TreeExplorer

2.1.16 Tách dòng và thể hiện gen mã hóa xylanase từ Aureobasidium pullulans

Chủng vi khuẩn E coli DH5 nhận được từ Sưu tập giống Viện CNTP sử dụng trong công đoạn nhân dòng gene Nấm men P pastoris X-33 và P pastoris KM71H phục vụ

biểu hiện gene được mua từ hãng Invitrogene

Các môi trường sử dụng phục vụ tách dòng và thể hiện gen gen

YM: 0,3% malt extract; 0,3% yeast extract; 0,5% peptone; 1% glucose

LB: 0,5% yeast extract; 1% tryptone; 1% NaCl, pH 7

LB-Ampicillin: LB có bổ sung 100 mg/l ampicillin

LB low salt: 0,5% yeast extract; 1% tryptone; 0,5% NaCl, pH 7

LB-Zeocin: LB low salt bổ sung 25 - 100 mg/l zeocin

YPD: 1% yeast extract, 2% Bacto pepton, 2% glucose

YPDS: 1% yeast extract, 2% Bacto pepton, 2% Glucoza, 1M Sorbitol

YPDS-Zeocin: YPDS có bổ sung 100 mg/l zeocin

Dung dịch đệm

2SSC: 0,3 M NaCl; 0,03 M CH3COONa; pH 7

Sol I: Tris-HCl 25 mM, pH 8; EDTA 10 mM, pH 8; glucose 50 mM

Sol II: NaOH 0,2M; SDS 1%

Sol III: CH3COOK 3M; axit axetic 11,5%; CH3COONa 3 M

Phenol/chloroform: 50 ml phenol, 49 ml chloroform, 1 ml isoamylalcohol, 0,1 g hydroxyquinonline, bão hoà trong 100 ml TE

TE: Tris-HCl 1M, pH 8; EDTA 0,5 M, pH 8

50 TAE: 24,2 g Tris-bazơ; 5,71 ml axit axetic; 10 ml EDTA 0,5 M, pH 8; dẫn nước cất đến 100 ml

Loading dye: 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen cyanol FF; 30% glycerol

đá 7 phút Bổ sung tiếp 150 l Sol III, đảo nhanh rồi ủ trong đá 5 phút, hỗn dịch sẽ kết tủa trắng Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C Thu dịch nổi và chuyển sang ống Eppendorf 1,5 mới Sau đó bổ sung 600 ml dung dịch phenol/chloroform, trộn đều và ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút để loại protein và DNA nhiễm sắc thể Hút pha dịch lỏng ở bên trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới và lặp lại bước trên với 450 ml hỗn hợp chloroform/isoamylacohol (24:1) Tủa dịch thu được với 2 lần thể tích cồn lạnh 99,5%, để dung dịch kết tủa trong khoảng

20 phút Thu tủa DNA bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Phần kết tủa được rửa lại bằng cồn lạnh 70% và thu lại bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó làm khô tủa cồn bằng máy Speed Vac Hòa tan DNA plasmid vào 30 - 40 ml dung dịch TE ARN lẫn trong sản phẩm tách chiết DNA được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase (100 g/ml), ủ hỗn hợp trong 30 phút ở 37C DNA plasmid đã tách chiết được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,8%

Đệm 10x của T4 DNA ligase: 1 l

T4 DNA ligase 400 U/ml: 1 l

Vector: 4 l

DNA: 4 l

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22C trong 16 giờ

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

3.1 Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen

Trong năm 2010 Bảo tồn gen Vi sinh vật Công nghiệp Thực phẩm đã thu thập và tiếp nhận 80 chủng vi sinh vật, trong đó có 41 chủng nấm men đen, 23 chủng nấm mốc từ bánh men, 16 chủng vi khuẩn lactic

3.1.1 Phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu truyền thống của một số địa phương của Việt Nam

Trong sản xuất rượu truyền thống của Việt Nam, bánh men đóng vai trò quan trọng, quyết định năng suất và chất lượng rượu Mỗi địa phương khác nhau bánh men được chuẩn bị những theo những công thức khác nhau và với men gốc của riêng mình Với truyền thống văn hóa lâu đời và đa sắc tộc, sự đa dạng của hệ vi sinh vật trong bánh men

ở Việt Nam là rất lớn Với mong muốn bảo tồn sự đa dạng sinh học của mỗi làng nghề,

hệ vi sinh vật trong bánh men tham gia vào quá trình thủy phân tinh bột thành đường và lên men đường thành rượu được phân lập, tuyển chọn và lưu giữ Bánh men từ một số địa phương khác nhau được tiến hành phân lập trên môi trường PCA và môi trường malt glucose 2Bx Kết quả được ghi ở bảng 2

Bảng 2 Nấm mốc và giả men phân lập từ bánh men của một số địa phương

1 Hải Hậu, Nam Định 0 2,7 × 10 5 3,3 × 10 4 4,6 × 10 6 1,3 × 10 5

2 Lâm Tiên, Ninh Bình 0 3,1 × 10 3 1,8 × 10 4 2,5 × 10 4 4,4 × 10 5

đường hóa là Mucor, Rhizopus, Saccharomycopsis và nấm men lên men rượu S cerevisiae có mặt ở tất cả các mẫu Nhóm nấm mốc Aspergillus chỉ được phát hiện ở hai mẫu bao gồm men Mai Hạ (Hòa Bình) và men Tứ Quí (An Giang) Kết quả này cũng

trùng lặp với công bố của các tác giả Lương Đức Phẩm (2009), Lee và Fujio (1997) hệ vi

sinh vật trong bánh men Việt Nam chủ yếu thuộc các chi: Rhizopus, Mucor, Saccharomycopsis, Aspergillus và Saccharomyces

Các chủng nấm mốc Aspergillus, Mucor, Rhizopus và giả nấm men Saccharomycopsis có vai trò quan trọng trong bánh men nhờ khả năng sinh tổng hợp

enzyme amylase và glucoamylase cao Để thu thập các chủng vi sinh vật có nguồn gen quí hiếm thuộc đối tượng cần bảo tồn lưu giữ Khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase

và glucoamylase của các chủng phân lập được đánh giá dựa trên vòng tròn không bắt mầu với iot trên môi trường có chứa 1% tinh bột tan, ủ 30C, trong 24 giờ Đường kính vòng tròn không bắt mầu với thuốc thử iot càng lớn, khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase càng lớn Dựa trên kích thước vòng phân giải tinh bột các chủng sau đây được lựa chọn để lưu giữ

Bảng 3 Danh sách các chủng vi sinh vật có nguồn gen quí hiếm cần bảo tồn lưu trữ

TT Tên chủng Ký hiệu chủng

Đường kính vòng thủy phân, mm

Nguồn bánh men

1 Saccharomycopsis sp GĐE1 24 Gò Đen - Long An

2 Saccharomycopsis sp E2 23 Hải Hậu - Nam Định

3 Saccharomycopsis sp E4 21 Lâm Tiên - Ninh Bình

4 Saccharomycopsis sp MHE 13 Mai Hạ - Hòa Bình

6 Saccharomycopsis sp BGE3 21 Văn Hương - Bắc Giang

11 Rhizopus sp BGR2 23 Văn Hương - Bắc Giang

Từ 14 mẫu bánh men từ các địa phương khác nhau, sau khi đánh giá khả năng sinh enzyme amylase đã chọn được 23 chủng có đường kính vòng không bắt mầu với iot từ 13

- 29 mm, bao gồm 6 chủng Saccharomycopsis sp, 5 chủng Rhizopus sp, 10 chủng Mucor

sp, 1 chủng A niger và 1 chủng A oryzae Từ 23 chủng sơ tuyển, đã chọn ra 17 chủng có đường kính vòng phân giải tinh bột từ 20 - 29mm bao gồm: 4 chủng Saccharomycopsis

kí hiệu GĐE1, E2, BG3 và E4; 3 chủng Rhizopus sp kí hiệu GDDR1, BGR2 và R9; 8 chủng Mucor sp kí hiệu: BNM, TQM1, TQM3, GĐM, M6, M7, M8 và M12; 1 chủng A niger kí hiệu An và 1 chủng A oryzae kí hiệu Ao Những chủng này được bảo quản và bổ

sung vào sưu tập giống như một nguồn gen quý cho các nghiên cứu tiếp theo

Bảng 4 Danh sách các chủng phân lập từ bánh men rượu truyền thống được bảo quản bổ

sung vào sưu tập giống

TT Ký hiệu chủng Nguồn bánh men

3.1.2 Phân lập một số chủng nấm men đen nhóm Moniliella

Trong những năm trước đây, chúng tôi đã thông báo về nhiều tính năng ứng dụng đang được phát triển của nấm men đen Đó là những khả năng như chuyển hóa dầu thầu dầu thành tinh dầu đào, khả năng tổng hợp pullulan, tích lũy erythritol Ngoài

Aureobasidium pullulans, những nấm men đen khác không thực sự phổ biến trong thiên

nhiên Nhằm tìm kiếm những chủng giống mới có tính năng công nghệ vượt trội so với chủng hiện có, Bộ môn Vi sinh, Viện CNTP đang tiếp tục phân lập chọn lọc nấm men thuộc nhóm này từ các nguồn khác nhau Trong thời gian qua chúng tôi đã phân lập bổ sung được 41 chủng từ các mẫu hoa quả, đất, dụng cụ gia đình Danh sách các chủng được liệt kê trong bảng 5

Bảng 5 Danh sách các chủng nấm men đen thu thập được năm 2010

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm thu thập

1 TBY211-2 Chợ Trường Yên , NB

2 TBY 325 Mỗ Lao, Hà Đông

3 TBY 217 TrườngYên,Ninh Bình

5 XTY 108 Trường Yên , Ninh Bình

6 TBY 121 Viện công nghiệp thực phẩm

7 TBY 30-1 Cù lao Chàm, Quảng Nam

8 TBY 368-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn

9 TBY 342 Tân Hưng- Gia Lộc- HD

10 TBY 78 Trường Yên , Ninh Bình

11 TBY76 Trường Yên , Ninh Bình

12 TBY83 Trường Yên , Ninh Bình

13 TBY38-8 Trường Yên , Ninh Bình

14 TBY 388-3 Chợ Yên Phúc, Hà Đông

15 TBY 367 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn

16 TBY 384-2 Chợ Vạn Phúc, Hà Đông

17 TBY 385-3 Chợ Vạn Phúc, Hà Đông

18 TBY 370-1 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn

19 TBY 202-2 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

20 TBY 201-2 Chợ TrườngYên , Ninh Bình

21 TBY 388-2 Chợ Yên Phúc, Hà Đông

22 TBY 368-1 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn

23 TBY 365-2 Chợ Đông Kinh, Lạng Sơn

24 TBY 38-4 Trường Yên , Ninh Bình

25 TBY 237-2 Trường Yên , Ninh Bình

26 TBY 237-1 Trường Yên , Ninh Bình

27 TBY 204-3 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

28 TBY 370-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn

29 TBY 384-1 Chợ Vạn Phúc, Hà Đông

30 TBY 38-6 Trường Yên , Ninh Bình

31 TBY 38-7 Trường Yên , Ninh Bình

32 TBY 198-2 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

33 TBY 210-2 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

34 TBY 197-2 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

35 TBY 197-5 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

36 TBY 202-3 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

37 TBY 246-1 TrườngYên,Ninh Bình

38 TBY 360 Chợ Hoàng Ngân, Nam Định

39 TBY 209-2 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm thu thập

40 TBY 209-1 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

41 TBY201-4 Chợ Trường Yên , Ninh Bình

3.1.3 Thu thập các chủng vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có mặt ở rất nhiều nơi trong tự nhiên, đặc biệt là trong thực phẩm lên men, trong cơ thể động thực vật và trong cơ thể con người Nhiều loại vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin Tính đa dạng và khả năng tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men giàu dinh dưỡng đã được công bố trong nhiều công trình nghiên cứu Những năm gần đây, vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ngày càng được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm hơn với hy vọng tìm được các chủng, loài mới tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mới, hướng tới những ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, đồ hộp, sữa tươi, nước giải khát và nhiều các sản phẩm lên men và không lên men khác Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi đã tiến hành phân lập các mẫu

sữa bò tươi, mẫu nem chua và phân lập được 16 chủng vi khuẩn lactic Kết quả được thể

hiện ở bảng 6

Bảng 6 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ các nguồn

khác nhau

TT Ký hiệu Nguồn Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào

1 CNTP 6529 Nem chua Thanh Hóa Tròn, hơi lồi, trắng Trực khuẩn

2 CNTP 6530 Nem chua Thanh Hóa Tròn lồi, trắng Trực khuẩn

3 CNTP 6531 Sữa tươi Phù Đổng Tròn, đầu nhọn, trắng Cầu chuỗi

4 CNTP 6532 Sữa tươi Phù Đổng Tròn lồi, vàng nhạt Cầu chuỗi

5 CNTP 6533 Sữa tươi Phù Đổng Tròn, bẹt, vàng nhạt Cầu chuỗi

6 CNTP 6534 Nem chua Phùng Tròn lồi, trắng sữa Cầu chuỗi

7 CNTP 6535 Nem chua Tròn lồi, trắng sữa Cầu chuỗi

8 CNTP 6536 Nem chua Tròn lồi, trắng sữa Cầu chuỗi

9 CNTP 6537 Sữa tươi Phù Đổng Tròn lồi, trắng sữa Cầu chuỗi

10 CNTP 6538 Nem chua Tứ Liên Tròn lồi, trắng sữa Trực khuẩn

11 CNTP 6539 Nem chua Tròn lồi, trắng sữa Cầu chuỗi

12 CNTP 6540 Sữa tươi Ba Vì Tròn bẹt, vàng nhạt Cầu chuỗi

TT Ký hiệu Nguồn Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào

14 CNTP 6542 Nem chua Phùng Tròn lồi, trắng sữa Trực khuẩn

15 CNTP 6543 Sữa tươi Phù Đổng Tròn lồi, vàng nhạt Cầu chuỗi

16 CNTP 6544 Nem chua Phùng Tròn lồi, trắng sữa Trực khuẩn

3.2 Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen

Trong năm 2010, chúng tôi tiếp tục bảo tồn 1139 chủng giống chính thức của sưu tập (trong đó có 171 chủng từ quỹ gen của Viện Rượu Bia Nước giải khát), và những chủng mới thu thập trong năm 2010

Hiện nay chúng tôi định hướng chuyển việc bảo quản phần lớn sưu tập giống bằng phương pháp đông khô và lạnh sâu Những kỹ thuật khác như cấy truyền, bảo quản trong parafin, trong cát chỉ là những phương pháp hỗ trợ Hiện tại có trên 900 chủng đã được bảo quản trong nitơ lỏng và 767 chủng đã được bảo quản bằng đông khô hoặc L-drying (phương pháp tương đương đông khô) Bảo quản trong paraffin 50 chủng Cấy truyền được thực hiện với 120 chủng, chủ yếu phục vụ nhu cầu nghiên cứu thường xuyên

Bảo quản vi sinh vật trong nitơ lỏng là kỹ thuật bảo quản an toàn nhất hiện nay Ưu điểm của kỹ thuật là cho phép bảo quản tất cả các vi sinh vật trong thời gian dài (một vài chục năm) và không làm ảnh hưởng tới sức sống cũng như trạng thái của chủng giống Hiện nay Bảo tồn gen đã bảo quản được trên 900 chủng trong nitơ lỏng Phương pháp bảo quản sử dụng các ống nhỏ bằng polypropylene hàn kín bằng ngọn lửa được áp dụng

vì giá thành thấp và độ tiện dụng cao Kỹ thuật này hiện cũng đang được áp dụng tại sưu tập giống CBS (Hà Lan) Quy trình bảo quản bằng ni tơ lỏng được trình bày cụ thể trong phần phương pháp

Trong quá trình thực hiện chúng tôi gặp phải một số khó khăn về nguồn cung cấp ni

tơ lỏng thường xuyên Trung bình cứ 2 tuần phải bổ sung ni tơ một lần và không phải cơ

sở sản xuất ni tơ nào cũng có thể đảm bảo việc cung cấp theo đúng định kỳ Để khắc phục khó khăn chúng tôi phải liên hệ đồng thời với nhiều cơ quan, tuy vậy rủi ro tiềm ẩn

về nguồn ni tơ vẫn khá cao Ngoài ra, quỹ gen chỉ có 01 bình chứa ni tơ và hiện dung tích sử dụng đã gần tới ngưỡng

3.2.1 Bảo tồn lưu giữ nguồn gen giống nấm men

Nấm men là nhóm vi sinh vật lớn nhất trong sưu tập Các chủng được bảo quản trong nitơ lỏng, bảo quản đông khô, lạnh sâu và một số trong parafin Tình trạng phát triển của giống được kiểm tra định kỳ Kết quả được trình bày trong các bảng dưới đây

Bảng 7 Danh sách 120 chủng nấm men bảo quản trong parafin lỏng

TT Ký hiệu

chủng Tên khoa học TT

Ký hiệu chủng Tên khoa học

TT Ký hiệu

chủng Tên khoa học TT

Ký hiệu chủng Tên khoa học

51 CNTP 720 S mikatae 111 CNTP 783 Pseudozyma aphidis

52 CNTP 721 S mikatae 112 CNTP 784 Pseudozyma aphidis

Bảng 8 Kiểm tra khả năng phát triển của các chủng bảo quản lạnh sâu

TT Ký hiệu chủng Tên khoa học Khả năng phát triển

Trước bảo quản Sau bảo quản

Bảng 9 Danh sách và sức sống của các chủng bảo quản đông khô và trong nitơ lỏng

TT Ký hiệu chủng Tên khoa học Tình trạng giống

Ghi chú: PTBT – Phát triển bình thường

Bảng 10 Tình trạng giống bảo quản bằng phương pháp đông khô của các chủng nấm

men tiếp nhận từ Viện Rượu Bia

TT Ký hiệu chủng Tình trạng giống TT Ký hiệu chủng Tình trạng giống