Nghiên cứu rong biển việt nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit (carrageenan fucoidan, alginat canxi)

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga 2008 - 2010 NGHIÊN CỨU RONG BIỂN VIỆT NAM VÀ XÂY D

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ (Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga)

(2008 - 2010)

NGHIÊN CỨU RONG BIỂN VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG

TỔ HỢP CÔNG NGHỆ THU NHẬN CÁC POLYSACARIT (CARRAGEENAN, FUCOIDAN, ALGINAT CANXI)

Cơ quan chủ trì: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chủ nhiệm Nhiệm vụ: PGS.TS Bùi Minh Lý

Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010)

8822

Nha Trang 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ (Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga)

(2008 - 2010)

NGHIÊN CỨU RONG BIỂN VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG

TỔ HỢP CÔNG NGHỆ THU NHẬN CÁC POLYSACARIT (CARRAGEENAN, FUCOIDAN, ALGINAT CANXI)

Cơ quan chủ trì: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chủ nhiệm Nhiệm vụ: PGS.TS Bùi Minh Lý

Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010)

Xác nhận của cơ quan chủ trì Chủ nhiệm Nhiệm vụ

PGS.TS Bùi Minh Lý Nha Trang 2010

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

(Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga)

(2008 - 2010) Thông tin chung về Nhiệm vụ:

Tên Nhiệm vụ: Nghiên cứu rong biển Việt Nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu

nhận các polysacarit (Carrageenan, fucoidan, alginat canxi)

Thời gian thực hiện: 24 tháng

Từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010

Họ và tên chủ nhiệm phía Việt Nam: Bùi Minh Lý

Cơ quan chủ trì Việt Nam: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Họ và tên chủ nhiệm đối tác nước ngoài: Podkorytova A V

Học hàm, học vị, chuyên môn: GS.TSKH Hóa học

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp, Trưởng phòng Hóa sinh và Công nghệ Chế biến cá, động vật thân mềm và rong biển- Viện Nghiên cứu Thủy sản và Hải Dương học- Bộ Nông nghiệp- L.B.Nga (VNIRO)

Địa chỉ: 17 Ul Krasnoselskaya, Moskva, 107140, Russia

Xuất xứ thỏa thuận đã có với đối tác nước ngoài

1 Thời gian ký kết thỏa thuận: 09/2006

2 Cấp ký kết thỏa thuận:

- Về phía đối tác Nga do Viện trưởng TSKH Boris N.Kotenev

- Về phía đối tác Việt Nam do Viện trưởng PGS.TS Bùi Minh Lý

3 Các nội dung thỏa thuận chính:

- Phát triển tiềm năng và đảm bảo việc sử dụng hợp lý nguồn lợi rong biển Việt Nam;

- Xây dựng các công nghệ hiện đại khai thác và sử dụng tối ưu các nguồn lợi đó

- Nghiên cứu hóa sinh rong biển và cấu trúc các polysacarit chiết tách từ chúng

- Xây dựng công nghệ phức hợp chế biến rong biển

- Chế tạo các dịch keo (hydrocolloid) với các tính chất mới, xây dựng tổ hợp

sinh- dược học sản xuất các dịch keo rong biển

DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ

Viện KH&CNVN

Chủ trì nhiệm vụ

nghệ tách chiết thu nhận caragenan, alginat canxi

nghệ tách chiết thu nhận fucoidan

nghệ tách chiết thu nhận polysaccarit từ rong biển

học, công nghệ tách chiết

nhận polysaccarit rong biển

nhận polysaccarit rong biển

Tham gia đề xuất các nội dung nghiên cứu thực hiện tại Nha Trang và Moskva

14 GS.TSKH Kadnikova I

A

cứu thực hiện tại Nha Trang

và Moskva

chiết thu nhận các sản phẩm polysaccarit từ rong biển Việt Nam

chất lượng polysacarit từ rong biển do Việt Nam cung cấp

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ BIẾN ALGINOPHYTES

VÀ CARRAGEENOPHYTES TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC

1

PHẦN IICÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14

2.1 Các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu cơ bản quá trình tích

lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit ở những giai đoạn phát

triển khác nhau của cây rong

14

2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng cho việc xây dựng quy trình xử

lý và bảo quản rong nguyên liệu

2.3.6 Xác định hàm lượng laminaran trong rong 21

2.3.7 Xác định thành phần đường đơn của polysacarit của rong biển 22

2.3.8 Phân tích hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng Hg, As, Cd

và Pb trong fucoidan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử-lò graphite-chất cải biến hóa học (CM-GF-AAS)

2.4 Các phương pháp sử dụng cho nghiên cứu cơ bản cấu trúc hóa học của

các polysacarit chiết tử 05 loài rong biển

2.4.4.1 Xác định hàm lượng sulfat trong polysacarit 26

2.4.4.2 Xác định thành phần monosacarit trong carrageenan 26

2.4.4.3 Phân tích thành phần monosacarit trong fucoidan 27

2.5 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận các polysacarit 28

2.5.2 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận alginat

canxi

30

2.5.3 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận fucoidan 31

PHẦN IIIKẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

32

3.1 Kết quả nghiên cứu cơ bản quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp

các polysacarit ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cây rong

3.1.3 Khảo sát sự biến động sinh lượng và quá trình tích lũy

alginat, manitol và fucoidan ở một số loài rong nâu

38

3.2.1 Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý sau thu hoạch đến chất

lượng của rong nguyên liệu

43

3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước rửa rong sau thu hoạch và

thời gian bảo quản rong khô đến sự biến đổi thành phần hóa học và vi sinh của rong nguyên liệu

45

3.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học của 2 loài rong

carrageenophytes và 3 loài rong alginophytess

56

3.4 Kết quả nghiên cứu cơ bản về cấu trúc hóa học của các polysacarit

chiết từ 05 loài rong biển

3.4.1.5 Phổ ESI-MS 69

3.4.2 Đặc điểm cấu trúc của alginat chiết từ 03 loài rong nâu 70

3.4.3.1 Đặc điểm cấu trúc của fucoidan chiết từ loài rong nâu

3.4.3.3 Cấu trúc fucoidan của loài rong S.swartzii 87

3.5.1.1 Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật của rong nguyên liệu 96

3.5.1.4 Thành phần hóa học của carrageenan 98

3.5.1.5 Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận carrageenan

tự nhiên (tủa bằng EtOH)

99

3.5.1.6 Quy trình công nghệ sản xuất carageenan tự nhiên

(tủa bằng EtOH) từ rong đỏ K.alvarezii và K.striatum được trồng tại Việt Nam theo định hướng sử dụng làm chất phụ gia cho thực phẩm với chức năng tạo đông, tạo keo và chất có hoạt tính sinh học

101

3.5.1.7 Quy trình công nghệ sản xuất κ-carrageenan (tủa

bằng KCl) từ rong đỏ K.alvarezii và K.striatum được trồng ở Việt Nam theo định hướng sử dụng làm chất phụ gia cho thực phẩm với chức năng tạo đông, tạo keo và chất có hoạt tính sinh học

104

3.5.1.8 Quy trình công nghệ sản xuất κ-carrageenan bán tinh

chế

107

3.5.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận alginat

canxi từ rong nâu

109

3.5.2.1 Xác định chất lượng rong nguyên liệu 109

3.5.2.2 Tìm điều kiện tối ưu xử lý rong nguyên liệu 110

3.5.2.3 Tìm điều kiện tối ưu chiết alginat 113

3.5.2.4 Tìm điều kiện chiết alginat tối ưu từ bã thải rong nâu 113

3.5.2.5 Tìm điều kiện chiết alginat tối ưu từ rong nâu 115

3.5.2.6 Tìm điều kiện tối ưu để chuyển NaAlg về Ca(Alg) 2 117

3.5.2.7 Tìm điều kiện tẩy trắng Ca(Alg) 2 tối ưu 118

3.5.2.8 Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong

nâu quy mô pilốt

118

3.5.2.9 Dây chuyền công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong

nâu quy mô pilốt

119

3.5.2.10 Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã

thải rong nâu quy mô pilốt

120

3.5.2.11 Dây chuyền công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã

thải rong nâu quy mô pilốt

121

3.5.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất fucoidan 122

3.5.3.2 Xác định chất lượng rong nguyên liệu 123

3.5.3.3 Xác định điều kiện tối ưu chiết fucoidan 124

3.5.3.4 Loại alginat và các chất khoáng ra khỏi dịch chiết

fucoidan

125

3.5.3.6 Dây chuyền công nghệ sản xuất fucoidan từ rong nâu

quy mô pilốt

128

3.6.1 Tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của sản phẩm carrageenan thu

nhận từ rong đỏ Việt Nam

129

3.6.2 Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt

Nam

136

3.6.3 Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm canxi alginat thu nhận từ rong

nâu Việt Nam

143

PHẦN IVKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

149

CÁC TỪ VIẾT TẮT

13CNMR - phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon-13

1HNMR - phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

3,6 AG - 3,6-anhydro galactose

AOAC – Journal of the Association of Official Agricultural Chemists

BDH, UK - hãng BDH cuả Anh Quốc

BGBL - Brilliant Green Bile Lactose Broth - môi trường nuôi cấy BGBL

CFU - colon forming unit - khuẩn lạc

CM-GF-AAS – Chemical modifier-Graphit furnace-Atomic absorption spectrometry CR-500DX - thiết bị đo lưu biến

DRBC Agar - Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

DNP International Co., Inc - công ty Mỹ chuyên cung cấp polysaccarit

DW – Dried weight (trọng lượng khô)

EC Broth - Môi trường canh Escherichia coli Broth

ESI-MS - khối phổ kế nguồn ion phun điện tử sương mù

FL5 - phân đoạn laminaran số 5

FT-IR - phổ hồng ngoại biến đổi Furrier

Fuc,Xyl,Rha,Man,Glc,Gal - đường đơn fucose, rhamnose, mannose, glucose, galactose

G - guluronic

G6M - 6-methyl galactopyranosyl

GC-FID-Sắc ký khí đêtectơ ion ngọn lửa-Gas chromatography-Flame Ionization detector GF/D - màng lọc hãng GF

GM - block mannuronic với guluronic axit

Halg - axit alginic

IUPAC - International Union of Pure Ananlytical Chemicals and Applied Chemistry

- Liên hiệp Quốc tế Hóa Tinh khiết và Hóa Ứng dụng

KDa - kilo Danton

KHTN và CNQG - Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia

MS-ESI - khối phổ kế nguồn ion phun điện tử sương mù

NITRA - Nhatrang Institute of Technology Research and Application

- Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang NMR - cộng hưởng từ hạt nhân

PCA - plate count agar - môi trường nuôi cấy PCA

PDA - Môi trường thạch Potato Dextrose Agar

PIBOC - Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

- Viện Sinh học và Hóa hữu cơ Thái Bình Dương

PTFE - polytetra flor ethylen

SDA - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar

SDB - Môi trường canh Sabouraud Dextrose Agar

SPW - Saline Pepton Water - môi trường nuôi cấy SPW

SRC - semi-refined carrageenan

T.Đ.T.T - tốc độ tăng trọng

TCVN - tiêu chuẩn Việt Nam

TFA - triflo axetic

TINRO – Pacific Scientific Research Fisheries Center

TSA - Trypton Soya Agar - môi trường nuôi cấy TSA

UV-VIS - thiết bị quang phổ vùng cực tím - khả kiến

VKHK - vi khuẩn hiếu khí

VNIRO – Russian Federal Institute of Fisheries and Oceanography

VRB - Violet Red Bile Agar - môi trường nuôi cấyVRB

VSV - Vi sinh vật

VSVHK vinh vật hiếu khí

WW - trọng lượng rong ướt

2 Bảng 1.2 Alginophyte resources (tonnens dry weight; 2001) 4

3 Bảng 2.1 Các điều kiện đo quang phổ hấp thụ nguyên tử GF-AAS sử

dụng ống graphite phủ lớp graphite xử lý nhiệt cùng với đĩa đệm (platform)

23

4 Bảng 2.2 Chương trình nhiệt độ của lò graphite 23

5 Bảng 2.3 Chương trình nhiệt độ của lò vi sóng: Ram to temperature

control

24

6 Bảng 2.4 Các chất cải biến hóa học và nồng độ sử dụng 25

7 Bảng 3.1 Tốc độ tăng trọng %/ngày của các dòng rong K.alvarezii và

K.striatum

32

8 Bảng 3.2 Sự biến đổi của polysacarit và tính chất gel của chúng theo

thời gian nuôi trồng tại mùa nhiệt độ thấp (từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau)

34

9 Bảng 3.3 Sự biến đổi của polysacarit và tính chất gel của chúng theo

thời gian nuôi trồng mùa nhiệt độ cao (từ tháng 4 đến tháng 9)

35

10 Bảng 3.4 Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời

gian nuôi trồng

35

11 Bảng 3.5 Hàm lượng manitol biến đổi theo tháng của 03 loài rong

nâu vùng biển Khanh Hòa

41

12 Bảng 3.6 Hàm lượng alginat biến đổi theo tháng của 03 loài rong

nâu vùng biển Khánh Hòa

41

13 Bảng 3.7 Hàm lượng fucoidan biến đổi theo tháng của 03 loài rong

nâu vùng biển Khánh Hòa

42

14 Bảng 3.8 Thời gian các bãi rong có thể bắt đầu khai thác 42

15 Bảng 3.9 Sự biến đổi của độ nhớt, hiệu suất alginat và hiệu suất

fucoidan của rong nâu theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm

44

16 Bảng 3.10 Sự biến đổi của độ nhớt và hiệu suất carrageenan của rong

đỏ theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm

44

17 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời gian và phương pháp bảo quản lên độ

ẩm của rong nguyên liệu

46

18 Bảng 3.12 Sự biển đổi thành phần carbohydrate phụ thuộc vào thời 47

gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu

19 Bảng 3.13 Sự biển đổi thành phần protein phụ thuộc vào thời gian và

cách thức bảo quản

48

20 Bảng 3.14 Sự biển đổi hàm lượng carrageenan phụ thuộc vào thời

gian và cách thức bảo quản

49

21 Bảng 3.15 Sự biến đổi hàm lượng alginat phụ thuộc vào thời gian

cách thức bảo quản

50

22 Bảng 3.16 Biến đổi hàm lượng tổng vi sinh vật hiếu khí phụ thuộc vào

thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu

51

23 Bảng 3.17 Biến đổi hàm lượng tổng nấm men và nấm mốc phụ thuộc

vào thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu

52

24 Bảng 3.18 Biến đổi hàm lượng Coliform tổng số phụ thuộc vào thời

gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu

52

25 Bảng 3.19 Biến đổi hàm lượng E.coli tổng số phụ thuộc vào thời gian

và cách thức bảo quản rong nguyên liệu

53

26 Bảng 3.20 Thành phần hóa học chính của các loài rong đỏ 58

27 Bảng 3.21 Thành phần đường đơn của polysacarit rong đỏ 58

28 Bảng 3.22 Thành phần hóa học chính của các loài rong nâu 58

29 Bảng 3.23 Thành phần đường đơn của polysacarit rong nâu 58

30 Bảng 3.24 Tính chất lý hóa của polysacarit chiết từ loài rong

Kappaphycus alvarezii có xử lý kiềm

59

31 Bảng 3.25 Tính chất lý hóa của polysacarit chiết từ loài rong

Kappaphycus striatum

59

32 Bảng 3.26 Polysacarit chiết từ loài rong Kappaphycus alvarezii (2) và

K.striatum (1) không xử lý kiềm

60

33 Bảng 3.27 Thành phần hóa học và tính chất lý hóa của alginat canxi

chiết từ rong nâu

60

34 Bảng 3.28 Thành phần hóa học của fucoidan chiết từ 03 loài rong nâu 61

35 Bảng 3.29 Chỉ tiêu chất lượng một số sản phẩm fucoidan nước ngoài 62

36 Bảng 3.30 Kết quả đo trọng lượng phân tử (M w ) trung bình của

carrageenan chiết từ hai loài rong K.alvarezii và K.striatum bằng phương pháp tán xạ ánh sáng (LS)

63

37 Bảng 3.31 Kết quả phân tích thành phần hoá học 64

38 Bảng 3.32 Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các

liên kết trong phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan

65

39 Bảng 3.32 Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các

liên kết trong phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan

68

40 Bảng 3.34 Tương quan rút ra từ phổ COSY 68

41 Bảng 3.35 Độ dịch chuyển hóa học của 1 H NMR đo tại 80 0 C 69

42 Bảng 3.36 Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của mẫu 70

43 Bảng 3.37 Một số dao động đặc trưng của gốc M và G trong vùng

750-950 cm -1

71

44 Bảng 3.38 Hiệu suất tách phân đoạn của các mẫu natri alginat 72

45 Bảng 3.39 Một số vân phổ chính trong vùng “vân tay” trên phổ hồng

ngoại của các phân đoạn natri alginat thủy phân

73

46 Bảng 3.40 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của 13 C trong các phân

đọan F1, F2 và F3

74

47 Bảng 3.41 Đặc điểm cấu trúc của axit alginic của 03 loài rong nâu 75

48 Bảng 3.42 Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan chiết từ

rong Turbinaria ornata

76

49 Bảng 3.43 Thành phần đường trong phân tích methyl hóa 02 phân

đoạn fucoidan chiết từ loài rong Turbinaria ornata

52 Bảng 3.46 Các mảnh MS/MS nhiều lần của fucoidan F-20 90

53 Bảng 3.47 Hợp phần của các mảnh ion con từ ion mẹ m/z 448 91

54 Bảng 3.48 Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 97

55 Bảng 3.49 Thành phần hóa học cơ bản của rong đỏ thuộc chi

Kappaphycus

97

56 Bảng 3.50 Hiệu suất các loại carrageenan khác nhau theo phần trăm

khối lượng cân từ rong thuộc chi Kappaphycus

97

57 Bảng 3.51 Tính chất vật lý của gel 2% dung dịch carrageenan được

tách ra từ rong đỏ thuộc chi Kappaphycus

98

58 Bảng 3.52 Thành phần hóa học của các chất chiết và carrageenan

được tách từ rong đỏ thuộc chi Kappaphycus

98

59 Bảng 3.53 Ảnh hưởng của điều kiện xử lý đến sức đông (1,5% + 0,2%

KCl) và độ truyền qua của carrageenan

100

60 Bảng 3.54 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến sức đông (1,5% trong

0,2% KCl) và độ nhớt của carrageenan chiết từ loài rong K.alvarezii - Khánh Hội - Ninh Thuận

100

61 Bảng 3.55 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất carrageenan

từ rong K.alvarezii - Khánh Hội - Ninh Thuận

101

62 Bảng 3.56 Ảnh hưởng của điều kiện xử lý kiềm lên tính chất hóa lý của

carrgeenan chiết từ rong K.alvarezii

108

63 Bảng 3.57 Thành phần hóa học và tính chất vật lý của carrageenan 108

64 Bảng 3.58 Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 109

65 Bảng 3.59 Thành phần hóa học của rong nâu và bã thải rong nâu

trong quy trình sản suất fucoidan

110

66 Bảng 3.60 Ảnh hưởng của điều kiện tiền xử lý lên hiệu suất,độ nhớt

(mCps) và màu của alginat

69 Bảng 3.63 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết lên hiệu suất

chiết của alginat

74 Bảng 3.68 Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào của fucoidan được tách

chiết từ một số loài rong nâu thuộc vùng biển phía Nam Việt Nam

123

75 Bảng 3.69 Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 123

76 Bảng 3.70 Thành phần hóa học chính của các loài rong nâu 124

77 Bảng 3.71 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ rong

nước lên khả năng chiết fucoidan

125

78 Bảng 3.72 Sự biến đổi thành phần hóa học chính của tủa vào nồng độ

tác nhân kết tủa EtOH

126

79 Bảng 3.73 Hàm lượng fucoidan, alginat và kim loại nặng trong kết tủa

thu được từ dung dịch cô đặc bằng chưng cất

126

80 Bảng 3.74 Hàm lượng fucoidan, alginat và kim loại nặng trong tủa thu

được từ dung dịch cô đặc bằng lọc rây phân tử

127

DANH MỤC HÌNH

1 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và tách phân đoạn laminaran 22

2 Hình 3.1 Tốc độ tăng trọng %/ngày của các loài rong K striatum

(dòng màu nâu và màu xanh) và K alvarezii

33

3 Hình 3.2 Hiệu suất carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác

36

4 Hình 3.3 Hiệu suất carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp)với các biện pháp xử lý khác

36

5 Hình 3.4 Sức đông carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

6 Hình 3.5 Sức đông carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

7 Hình 3.6 Độ nhớt carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

8 Hình 3.7 Độ nhớt carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

9 Hình 3.8 Hiệu suất carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

10 Hình 3.9 Hiệu suất carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

36

11 Hình 3.10 Sức đông carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

37

12 Hình 3.11 Sức đông carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

37

13 Hình 3.12 Độ nhớt carrageenan từ K alvarezii qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

37

14 Hình 3.13 Độ nhớt carrageenan từ K striatum qua thời gian trồng

(mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau

37

15 Hình 3.14 Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời gian

nuôi trồng tại mùa nhiệt độ thấp

37

16 Hình 3.15 Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời gian

nuôi trồng tại mùa nhiệt độ cao

37

17 Hình 3.16 Biến động sinh lượng tổng trung bình và riêng cho từng loài

rong Mơ ở Bãi Nam

rong Mơ ở Sông Lô

20 Hình 3.19 So sánh biến động sinh lượng trung bình của rong Mơ ở 4

bãi rong Sông Lô, Hòn Chồng, Bãi Nam và rạn ngầm Grand Bank trong năm 2008

24 Hình 3.23 Sự biến đổi của độ nhớt và hiệu suất alginat của rong nâu

theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm

44

25 Hình 3.24 Sự biến đổi hiệu suất fucoidan của rong nâu theo phương

pháp làm khô nhanh và làm khô chậm

44

26 Hình 3.25 Sự thay đổi của độ ẩm của rong đỏ theo thời gian và phương

pháp bảo quản

46

27 Hình 3.26 Sự thay đổi của độ ẩm của rong nâu theo thời gian và

phương pháp bảo quản

46

28 Hình 3.27 Sự biển đổi carbon hydrate của rong đỏ theo thời gian và

phương pháp bảo quản

47

29 Hình 3.28 Sự biển đổi carbohydrate của rong nâu theo thời gian và

phương pháp bảo quản

37 Hình 3.36 Sắc ký đồ của các gốc đường đơn chuẩn chạy trên máy sắc

ký lỏng HPLC IC-5000 Biotronic, Shimpack ISA-07/S2504 (0,4x25cm)

57

38 Hình 3.37 Phổ IR của carrageenan chiết từ rong K alvarezii 64

39 Hình 3.38 Phổ IR của carrageenan chiết từ rong K striatum 65

40 Hình 3.39 Phổ 13 C NMR của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 66

41 Hình 3.40 Phổ 13 C NMR của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 66

43 Hình 3.42 Phổ H 1 -H 1 COSYcủa mẫu đo tại 80 0 C 67

44 Hình 3.43 Phổ 1 H- 1 H TOCSY của mẫu đo tại 80 0 C 68

45 Hình 3.44 Phổ ESI-MS của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 69

47 Hình 3.46 Phổ hồng ngoại của alginat tách chiết từ loài rong

49 Hình 3.48 Phổ H 1 -NMR của phân đoạn 1,0N-fucoidan 78

50 Hình 3.49 Sắc ký đồ GLC phân tích thành phần đường trung tính 80

51 Hình 3.50 Phổ hồng ngoại của phân đoạn fucoidan F 20 của loài rong

55 Hình 3.54 Phổ ESI-MS của mẫu oligo-F 20 của loài rong S.polycystum 85

56 Hình 3.55 Cấu trúc (a) và sơ đồ phân mảnh (b) của một đoạn trong

phân đoạn F-20 của mẫu fucoidan được tách chiết từ loài rong S polycystum

86

57 Hình 3.56 Phổ IR của phân đoạn fucoidan F-20 chiết từ rong nâu

S.swartzii

88

58 Hình 3.57 Phổ C 13 -NMR của phân đoạn fucoidan F-20 từ rong nâu

S.swartzii được đo trong nước nặng

89

59 Hình 3.58 Phổ H 1 -NMR của phân đoạn fucoidan F-20 từ rong nâu

S.swartzii được đo trong nước nặng

89

60 Hình 3.59 Phổ H-H COSY của phân đoạn fucoidan F-20 phân lập từ

rong nâu S.swartzii đo trong nước nặng

89

61 Hình 3.60 Phổ HSQC của phân đoạn fucoidan F-20 phân lập từ rong

nâu S.swartzii đo trong nước nặng

89

63 Hình 3.62 Sơ đồ phân mảnh của fucoidan từ F-20 94

64 Hình 3.63 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất carrageenan tự nhiên từ

rong K.alvarezii và K.striatum bằng phương pháp kết tủa với cồn ethylic

103

65 Hình 3.64 Sơ đồ quy trình công nghệ tách chiết carrageenan từ rong

biển bằng phương pháp kết tủa với KCl

105

66 Hình 3.65 Quy trình thu nhận carrageenan bằng xử lý kiềm

dung dịch chiết từ rong K.alvarezii

109

67 Hình 3.66 Biểu đồ ảnh hưởng của pH và thời gian chiết lên hiệu suất

thu hồi alginat từ bã thải rong nâu

114

68 Hình 3.67 Biểu đồ biến đổi hiệu suất chiết alginat phụ thuộc vào thời

gian chiết

115

69 Hình 3.68 Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong nâu 120

70 Hình 3.69 Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã thải rong

nâu

121

71 Hình 3.70 Sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất fucoidan từ rong nâu 128

MỞ ĐẦU

Với tổng chiều dài bờ biển nhiệt đới trên 3.600 km nước ta có một nguồn lợi lớn rong biển cho phép sản xuất ra nhiều loại polysacarit quý giá, trong đó có 3 sản phẩm polysacarit hiện đang được thị trường thế giới đặc biệt quan tâm Đó là carrageenan, fucoidan và alginat canxi đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và trong các lĩnh vực y học khác nhau Carrageenan thể hiện nhiều tính chất đặc biệt: iota carrageenan tạo gel trong suốt, đàn hồi khi có mặt muối canxi, trong khi kappa tạo gel

có độ cứng cao với muối kali, nhưng với muối Ca nó lại tạo gel giòn, còn lambda thì không tạo gel mà tạo dung dịch độ nhớt cao Fucoidan có tính năng kháng u, chống huyết khối, tăng cường khả năng miễn dịch, chống viêm nhiễm Alginat canxi được biết như một vật liệu trung gian lý tưởng để cố định các loại enzym khác nhau hoặc chuyển đổi thành các muối kim loại khác nhau, đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi với giá trị gia tăng trong công nghệ thực phẩm, sinh học và y học

Trong nhiệm vụ hợp tác nghiên cứu theo Nghị định thư này, cùng với các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Thủy sản và Hải dương học L.B.Nga chúng tôi đã nghiên cứu rong biển Việt Nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit carrageennan, fucoidan và alginat canxi, với các nội dung chính như sau:

- Thu mẫu, nghiên cứu quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit

ở những giai đoạn phát triển khác nhau của 5 loài rong nguyên liệu, xử lý và bảo quản chúng

- Nghiên cứu thành phần hóa học của 2 loài rong đỏ và 3 loài rong nâu Việt Nam, các đặc tính cấu trúc và các tính chất lý-hóa của các polysacarit được tách chiết từ chúng

- Nghiên cứu thiết lập quy trình công nghệ thu nhận carrageenan từ loài rong đỏ

Kappaphycus được nuôi trồng tại Việt nam

- Nghiên cứu xây dựng công nghệ phức hợp thu nhận fucoidan và alginat canxi từ rong Mơ Việt nam

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho các sản phẩm carrageenan, fucoidan

và alginat canxi thu được

Kết quả nghiên cứu thu được trong quá trình thực hiện Nhiệm vụ đã cho thấy các quy trình công nghệ thu nhận carrageenan, fucoidan và alginat canxi từ rong biển Việt Nam mà chúng tôi đã áp dụng đều là những công nghệ tiên tiến, cho phép không sử dụng đến hầu hết các hóa chất tẩy màu, trợ lắng và xử lý nguyên liệu, trong khi chỉ sử dụng lượng tối thiểu những vật liệu rẻ tiền sẵn có trong nước và không gây ô nhiễm đối với môi trường như Ca(OH)2 và CaCl2 Trong các công nghệ này chúng tôi đã sử dụng màng siêu lọc để cô đặc và làm sạch các polysacarit trước khi tủa ở nhiệt độ phòng, mà hầu như không sử dụng đến các hóa chất và không gây ô nhiễm môi trường, nhờ vậy chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm tăng lên đáng kể Kết quả thu được tạo điều kiện cho việc xây dựng các tổ hợp sinh-dược học sản xuất các sản phẩm polysacarit có hoạt tính sinh học khác nhau.Các sản phẩm polysacarit thu được đã đạt tiêu chẩn chất lượng cơ sở tương đương với các sản phẩm do Viện VNIRO và công ty DNP sản xuất

PHẦN I

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ BIẾN ALGINOPHYTES VÀ

CARRAGEENOPHYTES TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC

Công nghiệp rong biển sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị hàng

năm được ước tính đạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD Trong đó các sản phẩm thực phẩm chức năng

mà loài người tiêu thụ đóng góp cỡ 5 tỷ USD Các hợp chất chiết từ rong hydrocolloids-được ghi nhận chiếm một phần lớn của tỷ USD còn lại, trong khi phần còn lại với lượng nhỏ hơn được dành cho các ứng dụng khác như phân bón và phụ gia thức ăn gia súc Hàng năm công nghiệp sử dụng 7,5- 8 triệu tấn rong tươi nhưng chỉ khoảng 10% là từ nguồn lợi tự nhiên còn hơn 90% là nhờ canh tác Việc trồng rong đã được mở rộng rất nhanh do nhu cầu đã vượt quá khả năng cung cấp từ nguồn lợi tự nhiên [80]

Rong biển có thể được xếp vào 3 nhóm lớn dựa trên sắc tố của chúng: nâu (Phaeophyta), đỏ (Rhodophyta) và lục (Chlorophyta)

Rong biển đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ 14 ở Nhật Bản, thế kỷ thứ

16 ở Trung Quốc và gần đây nữa là ở Hàn Quốc Trung Quốc là nước sản xuất rong biển

có thể ăn được lớn nhất thế giới, sản lượng hàng năm đạt cỡ 5 triệu tấn rong tươi

Laminaria japonica (Kombu) Hàn Quốc trồng cỡ 800.000 tấn tươi Undaria pinnatifida

(Wakame) Sản lượng của Nhật Bản là cỡ 600.000 tấn tươi (Porphyra, Kombu,

Wakame)

Các loài rong đỏ và nâu khác được sử dụng để sản xuất ba loại keo (hydrocolloids): agar, alginate và carrageenan Một hydrocolloid (hydrocoloit) là một chất không kết tinh với phân tử rất lớn và khi hòa tan trong nước cho ra một dung dịch quánh đặc (viscous)

Ngày nay, hàng năm gần một triệu tấn rong tươi được thu hoạch để chiết xuất ra

3 loại hydrocolloids kể trên Tổng sản lượng hydrocolloids là vào cỡ 55.000 tấn với giá trị 585 triệu USD

Alginat được sản xuất (213 triệu USD) bằng cách chiết chúng từ rong nâu khai thác tự nhiên Trồng rong nâu là quá đắt để cung cấp nguyên liệu thô cho những ứng dụng công nghiệp

Ngoài alginat, rong nâu còn chứa fucoidan và laminaran, là những polysacarit sinh học với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn nhờ đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng Laminarans đóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu, chúng có hoạt tính kháng đông cục máu và ung thư Fucoidans là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học đa dạng và đặc thù của nó như khả năng tăng cường hệ miễn dịch, kháng đông tụ, chống viêm nhiễm, kháng viruts và ung thư [49] Agar được sản xuất (132 triệu USD) chủ yếu từ các loài rong thuộc 2 chi

có vùng biển nước ấm với giá nhân công thấp

Món rong biển sử dụng bổ xung vào thức ăn gia súc đã được sản xuất ở Norway

từ những năm 60 Gần 50.000 tấn rong tươi đã được thu hoạch hàng năm để cho ra 10.000 tấn món rong biển và bán được khoảng 5 triệu USD

Việc sử dụng phân bón rong biển đã tồn tại từ thế kỷ thứ 19 Trong năm 1991, có khoảng 10.000 tấn dịch chiết rong biển với giá trị 5 triệu USD đã được tiêu thụ Tuy nhiên, thị trường đã tăng gấp đôi trong 10 năm lại đây

Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa (mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”, “extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tượng tự, thường có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloids được chiết từ rong biển

Trong những năm gần đây một số dự án lớn tập trung nghiên cứu khả năng sử dụng rong biển như một nguồn nhiên liệu gián tiếp Các kết quả chỉ ra sự cần thiết nghiên cứu và phát triển thêm, nó là một dự án dài hơi và hiện tại là chưa kinh tế

Có một số tiềm năng sử dụng rong biển trong xử lý nước thải Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như: Zn và Cd từ nước bị ô nhiễm Trên thế giới các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tổng hợp thử các polysacarit giống keo rong biển Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một sản phẩm nào tổng hợp ra có được tính chất keo cũng như độ nhớt tương tự các keo rong biển tự nhiên

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

™ Carrageenan được chiết xuất từ các loài rong carrageenophytes Hàng năm

trên thế giới thu hoạch được cỡ 120.000 tấn rong Kappaphycus alvarezii khô chủ yếu là

từ Philipine, Indonesia, Tanzania (Zanzibar) Cũng từ các nước trên, sản lượng thu

hoạch rong Eucheuma denticulatum là 30.000 tấn khô/năm, rong Betaphycus gelatinum

khoảng 300 tấn khô/năm được thu hoạch ở đảo Hải Nam-Trung Quốc

Bảng 1.1 Sản lượng rong carrageenophytes (tấn khô) thu hoạch trên thế giới năm 2001

(Nguồn thông tin: H Porse, CP Kelco ApS, 2002, pers.comm.)

Chondrus crispus được thu hoạch chủ yếu ở Canada, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ

Đào Nha và Hàn Quốc với sản lượng khoảng 3.900 tấn khô/năm

Gigartina skottsbergii được thu hoạch chủ yếu ở Chile và một lượng nhỏ ở

Morocco, Mexico và Peru với sản lượng 15.500 tấn khô/năm (bảng 1.1) [80]

- Các loại carrageenan khác nhau về cấu trúc hóa học và tính chất, chính vì vậy

mà chúng có những ứng dụng khác nhau Các carrageenan có giá trị thương mại nhất là iota, kappa và lambda Cấu trúc hóa học của 3 loại carrageenan được chỉ ra dưới đây cho thấy tính chất của các dạng carrageenan phụ thuộc trực tiếp vào số lượng và vị trí của nhóm sunfat trong đơn nguyên disacarit

Trong phương pháp thứ 2, không phải chiết carrageenan ra khỏi rong Trong quá

trình chiết rong trong dung dịch kiềm, carrageenan và các chất không hòa tan được giữ

lại trong bã rong Phần còn lại không tan này chứa lượng lớn carrageenan và cellulose,

sau đó được sấy khô và bán như là carrageenan bán tinh chế (semirefined carrageenan-

SRC) Do không đòi hỏi phải thu hồi carrageenan từ dung dịch nên quá trình là ngắn

hơn và rẻ hơn nhiều

Mới đây Karuppanan và cs 2005 [67] đã đưa ra một phương pháp cho phép thu

nhận đồng thời carrageenan và dung dịch làm phân bón lá trực tiếp từ rong

Kappaphycus alvarezii tươi Bản chất của phương pháp là thay vì sấy khô rong sau khi

thu hoạch một cách bình thường thì người ta cho nghiền rong tươi, ép lấy dịch làm phân

bón cây, phần bã còn lại được sử dụng làm nguyên liệu hảo hạng để sản xuất κ-carrageenan Phương pháp cho phép rút ngắn tối đa thời gian sấy khô rong và loại hầu

hết nước chỉ để lại một lượng ẩm nhỏ, trong khi κ-carrageenan không bị mất theo vào

dịch ép, đồng thời nguyên liệu dưới dạng bã rong gọn nhẹ, dễ vận chuyển, it màu hơn và

chứa hàm lượng κ-carrageenan nhiều hơn từ 1,5- 2 lần so với phương pháp sấy khô

thông thường

™ Alginat và fucoidans được sản xuất từ rong nâu Hàng năm trên thế giới thu

hoạch được cỡ 126.500 tấn rong nâu khô Trong đó, sản lượng Ascophyllum là cỡ

20.000 tấn khô đến từ Ireland, Noway, France; sản lượng Durvillaea là 4.500 tấn khô

đến từ Australia và Chile; Ecklonia là 500 tấn khô đến từ South Africa; Laminaria là

30.500 tấn khô từ Châu Mỹ; Macrocystis là 35.000 tấn khô đến từ USA, Mexico và

Chile; Sargassum và Turbinaria là 10.000 tấn khô đến từ India, Indonesia, Philipine và

Việt Nam

Bảng 1.2 chỉ ra sản lượng ước tính thu hoạch các alginophyte, tất cả theo tấn rong

khô; được gộp lại vào trong các vùng địa lý rộng [80]

Bảng 1.2 Alginophyte resources (tonnens dry weight; 2001)

Alginat là muối của axit alginic, một polysacacrit mạch thẳng, được tạo thành từ

hai monome là axit β-D-mannuronic (ký hiệu là M) và axit α-L-glucuronic (ký hiệu là

G) được nối với nhau qua liên kết glycosit (1-4) Trong phân tử alginat các gốc axit này

có thể kết hợp với nhau tạo thành các block kiểu M-block, G-block và MG-block Thành phần và cấu trúc của các block này ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất alginat

O H O

MG-Block Các ứng dụng của alginat dựa trên ba tính chất chính Trước tiên là khả năng của chúng khi hòa tan trong nước, làm đặc quánh dung dịch thu được (mô tả một cách kỹ thuật hơn là khả năng của chúng làm tăng độ nhớt của dung dịch nước) Thứ 2 là khả năng tạo gel của chúng, gel tạo thành khi một muối caxi được đưa vào trong dung dịch nước alginat natri Tính chất thứ 3 của alginat là khả năng tạo màng (film) của alginat natri hoặc canxi và sợi của alginat

Alginat được sử dụng trong in vải dệt (chiếm 50%) công nghiệp thực phẩm, cố định xúc tác sinh học (cố định enzym) trong y khoa và dược, giấy, que hàn, chất kết dính cho thức ăn thủy sản, tác nhân nhả chậm

Alginat có ở thành tế bào của rong nâu dưới dạng các muối canxi, magie và natri Các muối canxi và magie không tan trong nước Lý do căn bản đằng sau việc chiết alginat từ rong biển là chuyển hóa tất cả muối alginat về dạng muối natri, hòa tan trong nước và loại bỏ cặn rong biển bằng lọc, sau đó alginat cần được thu hồi từ dung dịch nước Có hai con đường thu hồi alginat

Con đường thứ nhất là thêm axit để tạo thành gel axit alginic không tan trong nước và tách nó dưới dạng rắn ra khỏi nước Alginic axit được tách ra dưới dạng gel mềm và một phần lượng nước cần phải được loại khỏi chúng Sau công đoạn này cồn được đưa vào axit alginic, tiếp theo là cacbonat natri để chuyển hóa axit alginic về alginat natri Alginat natri không hòa tan trong hỗn hợp cồn-nước nên có thể tách chúng

ra khỏi hỗn hợp, làm khô, nghiền đến kích thước hạt thích hợp phụ thuộc vào từng ứng dụng riêng của nó

Con đường thứ 2 thu hồi alginat natri là thêm vào dung dịch chiết ban đầu một muối canxi Nó tác dụng tạo thành gel alginat canxi với một kết cấu dạng sợi, không hòa tan trong nước và có thể tách ra khỏi chúng Alginat canxi tách ra nằm lơ lửng trong nước và axit được thêm vào để chuyển hóa thành alginic axit Axit alginic dạng sợi này được tách ra rất dễ và đặt vào trong một máy trộn hình cầu (planetary type mixer) với cồn và cacbonat natri được đưa từ từ vào bột nhão cho đến khi tất cả axit alginic được chuyển hóa về alginat natri, bột alginat natri đôi khi còn được ép thành những viên nhỏ sau đó sấy và nghiền mịn

Để chiết rút alginat, rong biển được cắt nhỏ và khuấy với một dung dịch kiềm nóng mà thường là cacbonat natri tại nhiệt độ 60-700C trong khoảng 2-2,5 giờ thu được một huyền phù đặc Các cặn không tan đòi hỏi phải được loại bỏ khỏi dung dịch Vì dung dịch là quá đặc nên để có thể lọc được cần phải pha loãng nó với một lượng lớn nước Sau khi pha loãng, dung dịch được ép qua một lớp vải lọc trong một máy ép lọc Tuy nhiên, các hạt cặn không tan là rất mịn và có thể làm tắc rất nhanh vải lọc Cho nên trước khi bắt đầu lọc cần phải đưa bột trợ lọc diatomit vào, nó giữ lại hầu hết các hạt mịn khỏi bề mặt của vải lọc và làm thuận tiện cho việc lọc Tuy nhiên, trong công nghệ chiết rút alginat từ rong biển ngày nay cũng đã có một số cải tiến Chẳng hạn người ta

đã phát hiện ra rằng các loài rong Alginophytes ngoài alginat, fucoidan và laminaran

chúng còn có chứa một lượng lớn axit mannuronic có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch,

vì vậy đã xuất hiện công nghệ chiết rút alginat kết hợp với việc thu hồi một lượng đáng

kể mannuronic, bằng cách thay đổi pH phù hợp với quá trình xử lý trước khi chiết [100] Năm 2005 các nhà khoa học L.B Nga đã đưa ra một quy trình công nghệ phức hợp chế biến rong nâu cho phép thu nhận đồng thời các chế phẩm riêng biệt, đó là các axit (alginic, polymannuronic), các polysacarit trung tính (fucoidan, laminaran) và các chế phẩm làm giàu của các chất có hoạt tính sinh học trọng lượng phân tử thấp [101] Quy trình bao gồm các bước sau: 1) Xử lý rong với cồn để thu nhận các hợp chất trọng lượng phân tử thấp tan trong cồn và bã rong không tan; 2) Tách phân đoạn cồn; 3) Phân đoạn cồn được cho bay hơi để thu dung dịch làm giàu chứa các hợp chất trọng lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học; 4) Chiết bã rong đầu tiên với một dung dịch nước ở pH<6, để thu được một dịch chiết lần đầu với nước và bã rong lần 2 không tan; 5) Cô đặc dịch chiết nước lần 1 và chỉnh pH dung dịch chiết về 5÷8 ta nhận được phân đoạn chứa hỗn hợp laminaran và fucoidan, tủa với cồn sau đó tách riêng fucoidan và laminaran; 6) Chiết bã rong biển lần 2 với nước và bã rong biển lần 3 không tan Cô đặc dung dịch chiết lần 2 và sấy khô ta thu được một phân đoạn polysacarit thứ 2 chứa hỗn hợp laminaran, fucoidan và polymannuronic acid Chỉnh pH về 2,5 để kết tủa axit mannuronic còn lại fucoidan và laminaran tan trong nước Trung hòa dung dịch còn lại sau khi tách tủa và tách tủa với cồn ta thu được phân đoạn polysacarit thứ 2 có chứa fucoidan và laminran; 7) Xử lý bã rong lần 3 với NaHCO3 sau đó kết tủa với cồn ta thu được axit alginic

Ngày nay, trong công nghiệp thực phẩm cũng như trong y học người ta sử dụng enzym ngày càng nhiều Rất nhiều các quá trình tổng hợp và biến đổi hóa học đã được thực hiện với sự có mặt của enzym Chẳng hạn người ta sử dụng men để biến glucoza thành fructoza, sản xuất L-amino axit sử dụng trong chế biến thực phẩm, tổng hợp penicilin loại mới sau khi thủy phân penicilin G, điều trị các vết thương lâu lành v.v…

Để thực hiện các quá trình trên với hiệu quả cao các tác nhân xúc tác này phải được duy trì ở nồng độ cao và giải phóng ra với tốc độ được điều tiết [91] Đòi hỏi này có thể được giải quyết bằng cách cố định enzym lên một vật mang có khả năng giải phóng các

tế bào enzym vào môi trường khảo sát Các tế bào enzym trong dung dịch huyền phù thường cho hoạt tính tốt chỉ trong vòng 1-2 ngày, nhưng khi được cố định trên vật mang hoạt tính có thể được kéo dài đến 30 ngày Các hạt được làm từ alginat canxi chính là vật liệu mang đầu tiên được sử dụng đề cấy cố định enzym Các tế bào enzym được huyền phù hóa trong dung dịch alginat natri và được nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 để tạo ra các hạt canxi alginat chứa enzym Chẳng hạn cho một dung dịch đường chạy qua cột alginat canxi chứa enzym, tại đầu ra ta sẽ nhận được dung dịch cồn Alginat canxi được xem là một chất trung gian để từ đó chế tạo ra các sản phẩm alginat được thế bởi các ion kim loại khác nhau với các tính chất khác nhau Chính vì lẽ đó, trong công nghệ sản xuất polysacarit từ rong nâu ngày nay người ta đặc biệt quan tâm đến công nghệ thu nhận alginat canxi thay vì axit alginic hoặc alginat natri như trước đây

Theo IUPAC, fucan sulfat hóa là một polysacarit có nền chính là L-fucose sulfat hóa với các đường đơn khác nhỏ hơn 10% Fucan sulfat hóa của rong nâu thường được gọi là fucoidan [26] Cấu trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [74] với những thay đổi trong cơ cấu liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfat và các loại đường đơn khác nhau trong polysacarit và phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [41], vì vậy việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan y,

ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất Từ loài rong Fucus

distichus L, năm 2004, các nhà khoa học L.B Nga đã phân lập được các phân tử

fucoidan với đơn nguyên gồm 2 vòng fucopyranose sulfat hóa ở vị trí 2 và 2,4 lặp đi lặp lại [75] như sau:

thường đã được axit hóa hoặc các dung môi khác

Năm 1950 Percival và Ross đã điều chế fucoidan từ Fucus vesiculosus và

F.spiralis, bằng cách chiết với nước sôi trong 24 giờ, loại bỏ alginate và protein bằng

Pb-acetate và kết tủa fucoidan như một phức hydroxide bằng cách thêm Ba(OH)2 Thủy phân phức thu được với H2SO4 loãng và fucoidan được phân lập sau bước thẩm tách kéo dài và một vài xử lý với Filter cell [105]

Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung dịch chiết với rong lên hiệu suất thu hồi fucoidan Kết quả cho thấy điều kiện tối

ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH 2,0÷2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 700C trong 1 giờ Bằng cách xử lý này chỉ một lần chiết có thể rút ra được cỡ 50% fucoidan, trong khi 3 lần chiết có thể rút ra được hơn 80% fucoidan Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần rong khô với 10 phần H2O tại

1000C trong 3÷7,5 giờ và lấy ra được 55-60% fucoidan Theo tác giả chiết nước là không thích hợp do khó tách bã rong khỏi dung dịch nước Fucoidan thô được tách khỏi dung dịch chiết axit được trung hòa và cô đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa phân đoạn với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v) Có thể điều chế fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý với formaldehyde và tách hợp chất không tan tạo thành [31]

Những nổ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp hệ thống để chiết fucoidan

đã được thực hiện bởi Mian và Percival [81] Họ đã phát triển phương pháp chiết tuần

tự, bắt đầu bằng xử lý với formaldehyde, tiếp theo bằng chiết với cồn ở nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, muối và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau đó rong được khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt độ phòng và tại 700C) để chiết laminaran và fucoidan (alginat được cố định ở dạng muối Ca không tan) Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl (pH 2) Đến đây bã được chiết tiếp với Na2CO3 để thu nhận lại alginat hòa tan Hai lượng dung môi bổ xung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các phân đoạn fucoidan Quy trình chiết tuần tự này hầu như không được sử dụng về sau, nhưng đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Zvyagintseva và Duarte [137,45] đã sử dụng các phương pháp chiết đơn giản, nhưng lại áp dụng các bước làm sạch phức tạp, tốn nhiều công sức

Nora M.A Ponce và cộng sự [90] đã xử lý rong nâu với cồn 80%, bã sau đó được chiết với 3 dung môi khác nhau thường hay sử dụng để thu nhận fucoidan đó là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch HCl loãng (pH 2) Trong cả 3 trường hợp việc chiết được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sau đó ở 700C Hiệu suất chiết và đặc tính của sản phẩm là tương tự nhau trong cả 3 trường hợp với chỉ một số ít khác biệt Các dung dịch chiết ở nhiệt độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfat được đặt tên là “galactofucan”, thể hiện hoạt tính ức chế herpes simplex virus 1 và 2 nhưng không gây độc tế bào Sản phẩm khác là thành phần chính của dịch chiết thu được ở 700C, bao gồm chủ yếu là fucose đi kèm với các monosacarit khác, một lượng đáng kể axit uronic và lượng nhỏ sulfat ester, được gọi chung là “uronofucoidan”, không thể hiện hoạt tính kháng virus, nhưng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

Mới gần đây các nhà khoa học L.B Nga [102] đã đưa ra một quy trình công nghệ chiết tách fucoidan có độ sạch > 90%, sử dụng màng siêu lọc Quy trình bao gồm xử lý bột rong với dung dịch axit thực phẩm nồng độ 0,5÷1,0% trong 4-5h và dịch chiết axit

được lọc thẩm tách bằng màng siêu lọc trên màng 100-300 kDa, tiếp theo sấy phun để thu nhận sản phẩm cuối cùng dưới dạng bột

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Nước ta có tổng chiều dài bờ biển hơn 3.600 km làm ranh giới phía tây của biển Đông Biển Đông có diện tích trên 3,5 triệu km2, đứng hàng thứ 4 trong 61 biển quan trọng của thế giới

Theo các kết quả điều tra cho thấy, biển Đông có nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả tài nguyên sinh vật và tài nguyên không sinh vật, tài nguyên trong khối nước, trên đáy và trong lòng đất dưới đáy biển

Tài nguyên sinh vật (Living resources) bao gồm 11.000 loài sinh vật thủy sinh, 1.300 loài sinh vật trên đảo, trong các vùng biển-đảo Việt Nam (động vật đáy, cá, động vật thân mềm, rong biển) cùng vô số các chủng vi sinh vật biển vẫn chưa được biết đến Kết quả điều tra đến nay đã thống kê được khoảng 1.000 loài rong biển trong đó có 683 loài đã được phân loại trong vùng biển Việt Nam [89] Các nghiên cứu điều tra hầu hết mới chỉ tập trung vào việc phân loại, đánh giá trữ lượng, điều kiện sinh thái và thành phần hóa học sơ bộ Trong khi đó các nghiên cứu sâu về thành phần hoá học, cấu trúc và các đặc tính sinh lý của các polysacarit và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong rong biển còn rất ít và hạn chế

Kết quả điều tra đã chỉ ra một số nguồn lợi rong biển đáng kể ở Việt Nam trong

đó bao gồm rong Mơ (Sargassum), rong Câu (Gracilaria) và Carrageenophytes, những

nguyên liệu chính cho sản xuất các polysacarit rong biển

Các nghiên cứu về rong Mơ và công nghệ sản xuất alginat và fucoidan

- Đây là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất của nước ta, cho đến nay đã phát hiện được hơn 60 loài phân bố phổ biến và rộng khắp ven biển và các đảo với sản lượng khai thác ước tính đạt khoảng 10.000 tấn khô/năm [13]

Tại Việt Nam rong Mơ là nguồn nguyên liệu chính cho sản xuất alginat và fucoidan (chúng chứa khoảng 1,1-2,7% fucoidan và 20-35% alginat) Alginat được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học, y học, công nghiệp giấy, công nghiệp dệt và tơ nhân tạo Fucoidan được sử dụng làm dược liệu và thực phẩm chức năng giúp điều trị và hỗ trợ điều trị một số bệnh nan y như ung thư, viêm loét dạ dày, rối loạn đường huyết, viêm nhiễm v.v…

Năm 1999 Trần Thị Luyến và Ngô Đăng Nghĩa [8,18] Trường Đại học Thủy sản Nha Trang và Lâm Ngọc Trâm [7] Viện Hải dương học có một số báo cáo về nghiên cứu công nghệ sản xuất alginat natri để phục vụ cho công nghiệp dệt và thực phẩm Đây

là những nghiên cứu áp dụng công nghệ của Nhật Bản từ đầu thập niên 80 và trước đó vào đối tượng rong Mơ Việt Nam ở một trình độ chưa cao, hiệu quả kinh tế thấp nên không triển khai được vào sản xuất Cho đến nay vẫn chưa có một patent nào về công nghệ sản xuất alginat của các tác giả Việt Nam được công bố và hiện không có một cơ

sở nào sản xuất alginat tại Việt Nam

Năm 2004-2006 Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã chủ trì thực hiện và được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại xuất sắc đề tài Độc lập cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu Công nghệ và Thiết bị sản xuất

fucoidan quy mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam” [1,34,33,10]

Các nghiên cứu về carrageenophyte và công nghệ sản xuất carrageenan

Đã xác định được 25 loài rong đỏ chứa carrageenan mọc chủ yếu ở ven biển miền Trung, tuy nhiên nguồn lợi tự nhiên này rất hạn chế về sản lượng Mặc dù trong số đó cũng có những loài có khả năng trồng chủ động để tạo nguồn nguyên liệu cho chế biến

các loại carrageenan như loài rong Hồng Vân (Euchema gelatinae) có chứa

β-carrageenan tuy nhiên tốc độ tăng trưởng rất chậm Các tính chất hóa lý của

carrageenan chiết từ loài rong đỏ này đã được tác giả Trần Đình Toại - Viện Hóa Học nghiên cứu [16,17]

Năm 1993 Phân Viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu

và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã di trồng thành công rong Sụn (Kappaphycus

alvarezii) từ Philipine vào vùng biển Việt Nam và trong hơn 17 năm qua đã nghiên cứu

các đặc tính sinh học, phương pháp nhân giống cũng như các giải pháp kỹ thuật và mô hình trồng rong Sụn tại các vùng thủy vực khác nhau Đến nay việc trồng rong Sụn đã phát triển mạnh, năm 2005 đã xuất khẩu được 3.000 tấn rong khô/năm Rong Sụn là nguyên liệu chính để sản xuất κ-carrageenan [5,6]

Năm 2005 Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang tiếp tục di nhập

thêm 2 loài rong mới Eucheuma denticulatum và Kappaphycus striatum từ Philipine vào

Việt Nam Kết quả khảo nghiệm sơ bộ cho thấy chúng phát triển rất tốt Các nghiên cứu

về thành phần hóa học và cấu trúc của carrageenan từ Kappaphycus alvarezii,

Kappaphycus striatum và Eucheuma denticulatum lần đầu tiên tại Việt Nam đã được các

tác giả của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang thực hiện [92,14,4,19]

Carrageenan được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm (chiếm 70%), dược phẩm, mỹ phẩm, dệt, giấy, sơn và công nghệ sinh học Các nghiên cứu về công nghệ sản xuất carrageenan ở nước ta còn rất ít Năm 2003-2004 Trần Đình Toại, Viện Hóa học đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách và tinh chất carrageenan

từ rong đỏ vùng biển Việt Nam” [15] Tác giả đã nghiên cứu thiết kế một dây chuyền công nghệ sản xuất carrageenan công suất 6 tấn sản phẩm mỗi năm, nhưng lại sử dụng

rong Hồng Vân, một loài rong chứa chủ yếu β-carrageenan và không có nhiều ở nước ta

để làm nguyên liệu Năm 2006-2007 Trường Đại học Nha Trang chủ trì với sự tham gia của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang thực hiện đề tài “Nghiên cứu

ứng dụng công nghệ chế biến các sản phẩm từ rong Sụn Kappaphycus alvarezii (Doty)

Doty” tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có một công bố nào về kết quả nghiên cứu của đề

tài Hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa có một cơ sở nào sản xuất carrageenan ở quy mô công nghiệp

Nghiên cứu rong biển kinh tế trong đó bao gồm cả rong nâu và rong đỏ là một thế mạnh và nằm trong định hướng chiến lược của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Vì vậy, kể từ khi thành lập (1993) đến nay Viện đã chủ trì thực hiện nhiều đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ về rong biển một cách đồng bộ: điều tra

cơ bản, di giống, trồng và phát triển nguồn nguyên liệu và công nghệ tạo một số sản phẩm mới có giá trị gia tăng từ tài nguyên rong biển Việt Nam, cụ thể là:

1 Năm 1996 đã di trồng và phát triển thành công loài rong Sụn (Kappaphycus

alvarezii) vào vùng biển Việt Nam

2 Năm 1996-1997 đã thực hiện đề tài điều tra cơ bản “Điều tra các yếu tố ảnh hưởng đối với hiệu quả trồng, khai thác và giá trị kinh tế của rong biển phía Nam Việt Nam” cấp Trung tâm KHTN & CNQG

3 Năm 2001-2003 thực hiện đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất agar chất lượng cao từ một số loài rong câu nguyên liệu chính của Việt Nam” cấp Trung tâm KHTN & CNQG

4 Năm 2005-2007 chủ trì thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ “Điều tra quy hoạch và đề xuất giải pháp trồng rong sụn bền vững” cấp Bộ Thủy Sản

5 Năm 2004-2006 chủ trì và nghiệm thu đạt loại xuất sắc đề tài trọng điểm cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất fucoidan quy mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam”

6 Năm 2007-2010 chủ trì đề tài “Nghiên cứu ứng dụng tạo một số chế phẩm từ hoạt chất chiết xuất từ rong biển để phòng bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus)

ở tôm sú” đề tài độc lập cấp Bộ NN và PTNT

7 Năm 2007-2008 chủ trì đề tài “Nghiên cứu toàn diện các hợp chất từ rong nâu Việt Nam Nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinh học của các polysacarit và các sản phẩm chuyển hóa chúng bằng enzym” thuộc Chương trình hợp tác nghiên cứu cơ bản giữa Viện KH&CNVN với Quỹ Nghiên cứu Cơ bản Nga

8 Năm 2007-2009 chủ trì đề tài “Nghiên cứu điều chế oligosacarit fucan sunphat hóa sử dụng enzym phân lập từ một số loài sinh vật biển Việt Nam” đề tài độc lập cấp Viện KH & CN Việt Nam

9 Năm 2007-2009 chủ nhiệm đề tài “Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu giải

pháp bảo vệ nguồn lợi rong mơ Sargassum Khánh Hòa” cấp Sở Khoa học và Công nghệ

Khánh Hòa

10 Là tác giả của 2 quyển sách chuyên đề “Rong biển Việt Nam- (phần phía Bắc)” NXB KH-TN, (1993) và “The Common Marine Seaweed- Association”, Japan Seaweed Assosidation (2005)

Trên cơ sở những thành quả nghiên cứu KH-CN về lĩnh vực rong biển đã thu được trong thời gian qua và xuất phát từ những đòi hỏi của nhu cầu phát triển kinh tế-xã hội của khu vực Nam Trung Bộ, Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang được giao chủ trì thực hiện Nhiệm vụ hợp tác Quốc tế về khoa học và công nghệ theo Nghị định thư Việt Nam-L.B.Nga: “Nghiên cứu rong biển Việt Nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit (carrageenan, fucoidan, alginat canxi)”

Mục tiêu của Nhiệm vụ là thiết lập các công nghệ phức hợp hiệu quả cao chế biến các loài rong nâu và rong đỏ Việt Nam và xây dựng các tổ hợp sinh- dược học sản xuất các carrageenan, fucoidan và alginat

Chúng tôi đã triển khai thực hiện Nhiệm vụ trên cơ sở hợp tác với Viện nghiên cứu Thủy sản và Hải dương học L.B.Nga (VRINO) ở thành phố Matxcơva Viện VNIRO được thành lập năm 1993 Viện có nhiệm vụ nghiên cứu tìm ra các nguồn tài nguyên có giá trị công nghiệp của vùng biển nước Nga, nghiên cứu các vấn đề khoa học

và công nghệ phục vụ khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật biển và bảo

vệ môi trường vùng biển thuộc L.B.Nga và Đại dương

- Viện VNIRO có biên chế 494 người, trong đó có 36 tiến sĩ khoa học, 8 giáo sư

và 113 tiến sĩ Trong Viện có 33 phòng thí nghiệm và 9 ban khoa học khác nhau để phục

vụ 5 hướng nghiên cứu khoa học chính:

1 Nghiên cứu phức hợp (complex) tài nguyên sinh vật của đại dương và vùng biển nước Nga

2 Hợp tác quốc tế về đánh bắt cá

3 Thông tin thống kê về kinh tế thủy sản nước Nga và thế giới

4 Nuôi trồng thủy sản và bảo tồn sinh vật biển

5 Chế biến thủy sản (cá, động vật biển, rong biển,…)

- Trong lĩnh vực rong biển Viện đã tiến hành nghiên cứu một cách đồng bộ, từ điều tra, nghiên cứu sinh hóa-hóa lý, công nghệ chế biến đến triển khai sản xuất

- Viện đã tiến hành nghiên cứu một cách hệ thống trữ lượng nguồn lợi rong biển tại các vùng biển Baren, biển Trắng và biển Đen, và đã đưa ra được dự báo chung về xu hướng phát triển công nghiệp rong biển và thực vật biển tại các vùng biển Trắng, biển Đen, biển Baren, Viễn Đông và phía bắc nước Nga Viện đã tiến hành nghiên cứu đầy

đủ đặc tính sinh hóa của rong đỏ, rong nâu, các tính chất hóa học, tính chất gel của các polysaccharide như agar, agarose, alginat, fucoidan, laminaran, carrageenan và các tính chất dược học của chúng cũng như tác động của chúng lên cơ thể con người với mục đích y học

- Viện đã nghiên cứu đưa ra các quy trình công nghệ và thiết bị chế biến rong biển hiện đại nhằm tạo ra nhiều sản phẩm mới phục vụ cuộc sống đó là: 1) Các sản phẩm để làm thực phẩm, thực phẩm chức năng phòng ngừa bệnh, dược liệu từ các chất

có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ rong biển và thực vật biển; 2) Các sản phẩm để làm gel sinh học từ alginat, agar và carrageenan; 3) Các sản phẩm sử dụng làm phụ gia cho công nghiệp thực phẩm (các chất tạo keo, tạo nhũ, hòa tan lipit trong thịt và cá hộp)

- Các patent công nghệ sản xuất các sản phẩm keo rong biển: agar, agarose, carrageenan, alginat và các chất bổ xung có hoạt tính sinh học chiết từ rong Đỏ và rong Nâu của Viện VNIRO đã được áp dụng triển khai vào sản xuất tại một số nhà máy ở vùng Alkhangelck, Korxakov và Sakhalin thuộc L.B Nga

- Viện VNIRO đã tham gia vào 15 tổ chức quốc tế nghiên cứu thủy sản và hợp tác song phương với 30 tổ chức nghiên cứu thủy sản trong nước và quốc tế Các kết quả nghiên cứu của Viện đã đóng góp một phần vào thành quả nghiên cứu khoa học công nghệ của nước Nga Viện đã đào tạo được hơn 1.100 nghiên cứu sinh

1.3 Kết luận

- Nước ta có nguồn tài nguyên rong biển rất đa dạng và phong phú, phân bố tại các thủy vực khác nhau dọc theo hơn 3.600 km bờ biển và có thể tự tái tạo lại bằng các phương pháp trồng và phát triển tự nhiên

- Nhu cầu tiêu thụ của các sản phẩm dịch keo và các chế phẩm hoạt tính sinh học (HTSH) tại các thị trường trong nước và tại các nước lân cận thuộc khu vực Châu Á Thái Bình Dương là gần như vô tận

- Cho đến nay tại Việt Nam chưa có các công nghệ tương xứng để sản xuất carrageenan, fucoidan và alginat canxi

- Thực tiễn chỉ ra rằng đặc thù phát triển khoa học và cơ sở kinh tế của Việt Nam hiện chưa cho phép chỉ dựa vào nội lực của đất nước mà có thể chuyển sang giai đoạn phát triển hiện đại Chính vì vậy việc hợp tác với các nhà khoa học Nga để giải quyết các Nội dung của nhiệm vụ là hết sức cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

PHẦN II CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu cơ bản quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cây rong

2.1.1 Phương pháp xác định sự tăng trọng của rong đỏ

Việc xác định tốc độ tăng trọng của các dòng rong Sụn được tiến hành định kỳ 15 ngày/lần, theo công thức của Penniman et al (1986) [104]

Wt : Trọng lượng rong tươi (g) sau thời gian t

W0 : Trọng lượng rong tươi (g) ban đầu t: Thời gian trồng (ngày)

Xử lý và phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê theo chương trình

Microsoft Excel trong công cụ Data Analysis

2.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng polysacarit

- Xác định hàm lượng carrageenan trong 02 loài rong carrageenophytes

+ Xác định hàm lượng κ-carrageenan của rong không qua xử lý kiềm (tự nhiên) Cân 10g mẫu khô, rửa sạch cát, muối Chiết với tỷ lệ rong:nước = 1:50, đun ở nhiệt độ 800C cho đến khi rong nát, lọc Sau đó, thêm KCl 0,2% vào thể tích vừa lọc Tiếp theo, đổ ra khay dày khoảng 1cm, để nguội ở nhiệt độ phòng Kế tiếp, cắt sợi, đông lạnh trong 24giờ Cuối cùng, rả đông, phơi khô

+ Xác định hàm lượng κ-carrageenan của rong đã qua xử lý kiềm

Cân 10g mẫu khô, rửa sạch cát, muối Sau đó, xử lý kiềm KOH 4% theo tỷ lệ rong:nước = 1:40 ở nhiệt độ 800C trong 3giờ Tiếp theo, trung hoà bằng dung dịch

H2SO4 5% trong 30 phút Cuối cùng, rửa dưới vòi nước máy cho đến môi trường trung tính Rong xử lý ở trên được chiết với tỷ lệ rong:nước = 1:50, đun ở nhiệt độ 800C cho đến khi rong nát, lọc Sau đó, thêm KCl 0,2% vào thể tích vừa lọc Tiếp theo, đổ ra khay dày khoảng 1cm, để nguội ở nhiệt độ phòng Kế tiếp, cắt sợi, đông lạnh trong 24 giờ Cuối cùng, xả đông, phơi khô thu được sản phẩm carrageennan

- Xác định hàm lượng alginat của các loài rong alginophytes

Mẫu rong được khuấy với dung dịch Na2CO3 nồng độ 3% (25ml) trong vòng 1 giờ ở 700C, dịch chiết được tách bằng ly tâm, và cặn được xử lý lần hai dưới điều kiện tương tự Dịch chiết soda gộp lại được xử lý ở nhiệt độ phòng với 5 giọt (110mg; 0,035ml) bromide (Br-); khuấy một vài phút cho đến khi bromide tan hoàn toàn và giữ

qua đêm Dung dịch đã loại màu được thẫm tách 3 ngày với nước cất chuyển vào trong bình thể tích 500ml, đưa về vạch bằng nước cất và lọc (nếu cần thiết) qua giấy lọc, hàm lượng alginic acid được xác định trong 0,5ml dung dịch mẫu bằng phản ứng so màu với 3,5-dimethylphenol và sulfuric acid Dung dịch sodium alginate (100 mg/l, BDH, UK) được sử dụng để vẽ đường chuẩn trong vùng 0-50 µg trên mẫu

- Xác định độ ẩm

Cân mẫu vào trong đĩa đáy bằng, để qua đêm trong tủ sấy ở nhiệt độ 100-1100C

và cân Sự mất khối lượng sau khi sấy được đánh giá như một đơn vị đo hàm lượng độ

ẩm

2.1.3 Xác định sinh tổng hợp của rong nâu

Biến động mùa vụ của một số loài rong mơ ưu thế được theo dõi bằng phương pháp lấy mẫu trong khung sinh lượng Mỗi tháng, tại vị trí khảo sát mẫu được thu một lần trong suốt thời gian một năm từ tháng Giêng đến tháng 12, nhưng riêng vào thời kỳ rong phát triển nhanh từ tháng 3 đến tháng 6 thì được thu 2 tuần một lần Rong được thu hết trong khung sinh lượng kích thước 0,5mx0,5m đặt ngẫu nhiên dọc theo 3 tuyến thẳng góc với bờ từ nơi rong phát triển gần bờ nhất cho đến nơi rong phát triển thấp nhất Khoảng 5 khung mẫu đặt ngẫu nhiên cách nhau 30m dọc theo các tuyến dài 120-130m Những khung mẫu không có rong cũng được ghi nhận để tính sinh lượng trung bình và sự phân bố không gian của các loài rong Mơ

Rong Mơ được lấy mẫu bằng lặn vo và với thiết bị lặn SCUBA sử dụng khung sinh lượng kích thước 0,5mx0,5m Ở mỗi địa điểm thu khoảng 20-30 khung mẫu để lấy giá trị trung bình Tất cả các cá thể rong trong mỗi khung mẫu được thu hết và cho vào một túi lưới nilông riêng có ghi nhãn rong được giữ trong thùng xốp và mang về phòng thí nghiệm, tiến hành đo đạt chiều dài, trọng lượng, số cây, ghi nhận có hiện diện thỏi sinh sản hay không

Rong được rửa sạch bằng nước ngọt, để lấy hết đất cát, các sinh vật phụ sinh trước khi cân Trước hết đếm tất cả số cá thể chung và riêng cho từng loài để tính mật

độ Trọng lượng tươi cũng được cân chung và riêng cho từng loài Trọng lượng đạt được trong mỗi khung được nhân với 4 để tính sinh lượng trong 1m2 (g.rongtươi.m−2) Trọng lượng khô của mẫu được sấy trong lò ở 600C trong 48 giờ và giá trị này được chuyển thành trọng lượng khô trong mỗi m2 (g.rongkhô.m−2)

Vị trí nghiên cứu

Vị trí nghiên cứu được lựa chọn dựa trên cơ sở các đợt khảo sát trước đây, các

đặc điểm sinh thái môi trường Các bãi rong Mơ dọc ven biển Khánh Hòa sắp xếp thành

11 vùng trọng điểm vào 3 nhóm có nền đáy khác nhau, cạn (<3m), vừa (5-6m), sâu 15m) Chọn 4 điểm đại diện cho các đặc điểm sinh thái của các bãi rong Mơ ở Khánh Hòa và thuận tiện cho việc theo dõi hàng tháng, bao gồm Hòn Chồng (109012'47"E, 12016' 05"N) và Sông Lô (109012'18"E, 120 09' 57"N) đại diện cho vùng cạn (<3m), Bãi Nam (109014'59"E,120 13' 57"N) đại diện cho vùng sâu vừa (5-6m), rạn ngầm Bãi Cạn Lớn-Grand bank (109012’25”E, 120 13' 57"N) đại diện cho vùng đá ngầm sâu (10-15m) dưới mặt nước

(10-Đối tượng nghiên cứu

Dựa trên các kết quả khảo sát trước đây, chúng tôi chọn 5 loài phổ biến có tần suất xuất hiện cao và chiếm 95% tổng sản lượng rong Mơ của cả tỉnh Khánh Hòa, đại

diện cho các loài rong Mơ ở Khánh Hòa, bao gồm rong Mơ mịn (Sargassum serratum), rong Mơ mũi mác (S mcclurei), rong Mơ nhiều phao (S polycystum), rong Mơ thân dẹp (S binderi), rong Mơ nhại (S aemulum) Tất cả các loài rong kể trên đều có 1 đai phân

bố S serratum phân bố ở vùng triều trên, S polycystum tìm thấy ở vùng triều thấp đến phền trên dưới triều, S mcclurei phân bố ở phần trên dưới triều và S binderi cho thấy phân bố nơi sâu hơn S mcclurei và cho đến độ sâu 6 m dưới mức triều thấp nhất

Việc theo dõi sinh học rong Mơ được thực hiện hàng tháng từ tháng 8/2009

1/2008-2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng cho việc xây dựng quy trình xử lý và bảo quản rong nguyên liệu

2.2.1 Nguyên liệu

- Mẫu rong K alvarezii được thu tại Ninh Thuận vào tháng 3/2009

- Mẫu rong nâu Sarrgassum seratum được thu tại Hòn Đỏ-Nha Trang vào tháng

4/2009

- Lấy 10 kg rong tươi rửa nước ngọt phơi khô và 10 kg rong tươi rửa nước biển phơi khô

- Bảo quản rong trong hai vật liệu là bao bố và bao nilon:

1 Rong K.alvarezii rửa nước ngọt bảo quản trong bao bố

2 Rong K.alvarezii rửa nước ngọt bảo quản trong bao nilon

3 Rong K.alvarezii rửa nước biển bảo quản trong bao bố

4 Rong K.alvarezii rửa nước biển bảo quản trong bao nilon

5 Rong S.seratum rửa nước ngọt bảo quản trong bao nilon

6 Rong S.seratum rửa nước ngọt bảo quản trong bao bố

7 Rong S.seratum rửa nước biển bảo quản trong bao nilon

8 Rong S.seratum rửa nước biển bảo quản trong bao bố

8 mẫu này được bảo quản ở nơi khô ráo, hàng tháng xác định thành phần hóa học gồm:

độ ẩm, protein, carbohydrate, carrageenan (1,2,3,4) và alginat (5,6,7,8) và thành phần vi

sinh gồm: Tổng vi sinh vật hiếu khí, tổng nấm men nấm mốc, Coliform, E.coli

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp xác định carrageenan

Mẫu rong đỏ được rửa sạch, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm 50g mẫu vào trong 1.500 ml phosphate buffer (5.10-3M, pH = 7) Sau khi được khuấy và đun ở 115-1200C trong 1 giờ, dung dịch được lọc dưới áp suất cao qua màng lọc GF/D Nước lọc được cô đặc rồi kết tủa bằng cồn 800 cho phép thu được carrageenan thô Đem ly giải với nước cất bằng túi cellophan có kích thước lỗ lọc 12.000 dalton, thời gian ly giải là 3 ngày, sau

đó dung dịch được làm đông khô Cân sản phẩm và tính thành phần phần trăm

2.2.2.2 Phương pháp xác định alginat

Cân khoảng 10g rong khô, ngâm rong trong 500 ml dung dịch formaldehit 1%, khuấy nhẹ trong 12 giờ Sau đó rửa sạch rong bằng nước cất Tiếp tục ngâm rong trong dung dịch H2SO4 0,2N trong 4 giờ rồi lại rửa sạch bằng nước cất Alginate được chiết bằng Na2CO3 1% trong 12 giờ, có khuấy nhẹ Lọc thu phần dịch lọc Kết tủa alginat bằng cồn 950 theo tỉ lệ dịch chiết:cồn là 1:2, lọc thu tủa, rửa tủa bằng acetone, sấy khô ở

- Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng pha loãng chứa 8,5g NaCl và 1g pepton trong 100ml nước Dung dịch này được chứa trong các bình chứa 0,5-1,0 lít, hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào trong các ống nghiệm vô trùng

™ Quy trình phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí

Chuẩn bị mẫu: Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất mẫu như sau: dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khử trùng cân chính xác 5g mẫu vào trong bao PE Tất cả thao tác tiếp theo cần phải tiến hành trong điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu này 45ml dung dịch pha loãng SPW Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5phút Trong trường hợp không có máy dập mẫu thực hiện thao tác đồng nhất mẫu như sau: xát nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng Sau khi được làm đồng nhất bằng một trong các phương pháp như trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10 lần so với ban đầu Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với đầu típ vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hay dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5-10 lần Dung dịch mẫu này có độ pha loãng là 10-2 Sau đó sử dụng cùng pipet hoặc pipetman có đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ 2 chứa dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3 Tiếp tục thực hiện tương tự cho đến độ pha loãng cần thiết Lưu ý nếu pipet hoặc đầu tip pipetman có nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt

ngoài bình chứa ), cần phải thay ngay bằng pipet hoặc đầu tip vô trùng khác

Cấy mẫu: Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinh vật trong 1ml để cấy lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng hoặc pipetman với đầu típ vô

trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2-3 đĩa (tức là thực hiện 2-3 lần lặp lại) Sau khi cấy đưa vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 450C Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đưa môi trường vào Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30÷10oC trong

72 giờ Nhiệt độ và thời gian ủ có thể thay đổi theo quy định của tiêu chuẩn

Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (TCVN 6262-1:1997)

™ Nguyên tắc

Mẫu đã đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37±10C trong 24-48 giờ Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa

muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như neutra red, crystal violet

Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính lớn

hơn 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để định lượng

Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 440C Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ

khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa

™ Môi trường và hoá chất

- Môi trường Trypton Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thuỷ tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4-80C Trước khi sử dụng môi trường được đun chảy và làm nguội ở 450C trong bể điều nhiệt

- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị trong các chai thuỷ tinh, được đun chảy và làm nguội ở 450C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng Có thể sử dụng môi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB

- Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp ngược Hấp khử trùng Sau khi hấp, kiểm tra các ống để đảm bảo không có bọt khí trong ống Durham

- Môi trường canh EC Broth được chuẩn bị tương tự như trường hợp môi trường BGBL

- Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm hấp khử trùng

- Thuốc thử Kovac’s hay Indol

™ Quy trình phân tích Coliforms

Mẫu được đồng nhất hoá và pha loãng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450C Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường Để ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên

môi trường TSA Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370±10C trong 24-48 giờ Thực hiện trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với nồng độ pha loãng

Thử nghiệm khẳng định Coliforms Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn

carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn

carbon trong mẫu lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực

hiện thêm bước khẳng định như sau: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp khẳng định

Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC (trường hợp khẳng định Coliforms phân) Ủ các

ống BGBL ở 37±10C và các ống EC ở 440C trong 24-48 giờ Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Tính tỷ lệ khẳng định là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử

nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được

thực hiện thử nghiệm indol ở 440C Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được

xem là (+) trên thử nghiệm Indol

Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (TCVN 6846-2007)

™ Môi trường hoá chất

- Môi trường canh Trypton Soya Agar (VRB) được chuẩn bị tương tự phần định

lượng Coliforms

- Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong

mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không

có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham Các ống EC này được bảo quản ở 2-80C cho đến khi sử dụng

- Môi trường canh Lactose Trypton Lauryl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự như môi trường canh EC

- Môi trường canh Trypton Broth được chuẩn bị tương tự phần định lượng Coliforms

- Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng, để nguội và bảo quản ở 4-80C cho đến khi sử dụng

- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục

- Thuốc thử Kovac’s

™ Quy trình phân tích E.coli

Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliform phân

với bước khẳng định được tiến hành như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường canh EC, ủ ở 44±0,50C trong 24 giờ Chọn các ống

cho kết quả (+) (sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyển sang các môi trường sau: canh trypton, canh MR-VP, thạch simmon Citrate Ủ các môi trường trên ở 44±0,50C trong 24 giờ Thực hiện thử nghiệm Indol, Mrthyl Red, Voges Proskauer, Citrate Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) (IMViC là + + - -)

Xác định tổng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7954:1987)

™ Môi trường và hoá chất

- Dung dịch pha loãng (nước pepton 1%)

- Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DBRC Agar)

- Môi trường thạch Malt Extract Agar (MEA)

- Môi trường thạch Potato Dextrose Agar (PDA)

- Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

- Môi trường canh Sabouraud Dextrose Agar (SDB)

Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng.Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng

™ Quy trình phân tích định lượng nấm men và nấm mốc

Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhất mẫu Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môi trường DBRC Agar hoặc DG18 Nếu mật độ trong nấm men và nấm mốc thấp, có thể cấy 1ml mẫu Dùng que gạt thuỷ tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khô Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 250C trong 5-7 ngày Đĩa đã được đặt ngửa để tạo độ ẩm cho sự phát triển của nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch Thực hiện 3 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng Đếm số lượng khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy Khi cần thiết phải quan sát bằng kính hiển

vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm mốc Kết quả được ghi bằng đơn vị CPU/g Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loại nghi ngờ sinh độc

tố, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm

Cần lưu ý rằng trong thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiểm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác Đối với mỹ phẩm, việc định lượng được thực hiện trên các đĩa môi trường Môi trường thạch MEA hay thạch PDA Các đĩa được ủ ở 300C trong 7 ngày trước khi tiến hành đếm riêng lẻ số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc xuất hiện trên đĩa

2.3 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học rong carrageenophytes và alginophytes

2.3.1 Phân tích protein thô theo AOAC (1996)

Protein thô được xác định bằng phương pháp micro Kjeldahl Cân lấy 2g, đưa