Nghiên cứu nhân nhanh giống keo lai tự nhiên, keo lai nhân tạo, bạch đàn uro, bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và lát hoa bằng công nghệ tế bào

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN ĐẾN

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN

NÔNG THÔN ĐẾN 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG KEO LAI TỰ NHIÊN, KEO LAI NHÂN TẠO, BẠCH ĐÀN URO, BẠCH ĐÀN LAI NHÂN TẠO (MỚI CHỌN TẠO) VÀ LÁT HOA

BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO”

Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Cơ quan thực hiện đề tài: Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng Chủ nhiệm đề tài : ThS Đoàn Thị Mai (2006 - 5/2010)

ThS Lê Sơn (6 - 12/2010)

8809

HÀ NỘI – 2011

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN

NÔNG THÔN ĐẾN 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG KEO LAI TỰ NHIÊN, KEO LAI NHÂN TẠO, BẠCH ĐÀN URO, BẠCH ĐÀN LAI NHÂN TẠO (MỚI CHỌN TẠO) VÀ LÁT HOA

PHẦN 1 BÁO CÁO THỐNG KÊ

i

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

VIỆN KH LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Hà Nội, Ngày tháng năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, bạch đàn uro, bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào

Thuộc: Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020

2 Chủ nhiệm đề tài:

2.1 Họ và tên: Đoàn Thị Mai (từ 10/2006 đến tháng 5 năm 2010)

Ngày, tháng, năm sinh: 07.05.1955 Nữ

Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính

Điện thoại: Tổ chức: 04.38389813

Nhà riêng: 04.37520836, Mobile:0912646044

Fax: 04.38262800 E - mail: doan.thi.mai@fsiv.org.vn

Tên tổ chức đang công tác:Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 7, Ngõ 4, Đường Nông Lâm, Đông Ngạc - Từ Liêm -

Hà Nội

2.2 Họ và tên: Lê Sơn (từ 6/2010 đến tháng 12 năm 2010)

Ngày, tháng , năm sinh: 07.03.1977 Nam

Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Điện thoại: Tổ chức: 04.38389813

Nhà riêng: 04.37577686 Mobile: 01232018828

Fax: 04.38262800 E - mail: doan.thi.mai@fsiv.org.vn

ii

Tên tổ chức đang công tác:Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Xóm 3 - Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Điện thoại: Fax:

Website: www.fsiv.org.vn

Địa chỉ: Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Hoàng Nghĩa

Số tài khoản: Ngân hàng:

Tên cơ quan chủ quản đề tài : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài:

- Theo hợp đồng đã ký kết: từ ngày 01 tháng 10 năm 2006 đến ngày 1 tháng 12 năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 10 năm 2006 đến tháng 10 năm 2010

iii

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Theo kế hoạch (triệu

- Lý do thay đổi: bổ sung vốn năm 2008 thực hiện nhiệm vụ HTQT:

150.000.000 đồng (Bằng chữ: Một trăm năm mươi triệu đồng chẵn) và thay

đổi trong việc ghép nhóm mục chi theo quy định mới

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài

Stt Số, thời gian ban hành văn

iv

6 Số 1484/QĐ-BNN-KHCN,

Ngày 25 tháng 12 năm 2007

Thành lập tổ thẩm định đề tài thuộc chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn

8 Số: 400/HĐ-BNN-KHCN,

ngày 11 tháng 12 năm 2007

Hợp đồng trách nhiệm

9 Ngày 21 tháng 12 năm 2007 Biên bản nghiệm thu khối lượng thưc

hiện kế hoạch năm 2006 của đề tài

10 Ngày 21 tháng 11 năm 2007 Biên bản nghiệm thu khối lượng thưc

hiện kế hoạch năm 2007 của đề tài

11 Ngày 12 tháng 12 năm 2008 Biên bản nghiệm thu khối lượng thưc

hiện kế hoạch năm 2008 của đề tài

12 Ngày 17 tháng 12 năm 2009 Biên bản nghiệm thu khối lượng thưc

hiện kế hoạch năm 2009 của đề tài

13 Ngày 22 tháng 11 năm 2010 Thay đổi chủ trì đề tài

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài

Stt Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết

minh

Tên tổ chức đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1 Viện nghiên cứu

cây nguyên liệu

giấy

Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

Nghiên cứu nhân giống cho bạch đàn uro

Nhân giống cho bạch đàn uro PN3d ở quy mô bán sản xuất

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1 Đoàn Thị Mai Đoàn Thị Mai Chủ nhiệm đề tài

(từ 2006 đến

- Xây dựng đề cương, kế hoạch

v

5/2010) tổng thể

- Triển khai tổ chức, thực hiện

- Triển khai tổ chức, thực hiện

đề tài

4 Hà Huy Thịnh Hà Huy

Thịnh Triển khai tổ chức, thực hiện đề tài

5 Cấn Thị Lan Cấn Thị Lan Triển khai tổ chức,

thực hiện đề tài

6 Huỳnh Đức

Nhân

Phạm Thị Kim Thanh

Nhân giống cho bạch đàn PN3d

Nhân giống cho bạch đàn PN3d

ở quy mô 20.000 cây/năm

7 Ngô Thi Minh

Duyên

Vũ Thị Ngọc Nhân giống các

dòng keo lai tự nhiên BV71, BV73

và BV75

6 Tình hình hợp tác quốc tế

Stt Theo kế hoạch Thực tế đạt được Ghi chú

1 Cử 01 cán bộ đi đào Cử 01 cán bộ (Nguyễn Thị Mỹ

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị

Stt Theo kế hoạch Thực tế đạt được Ghi chú

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu

Thời gian Stt Các nội dung, công việc chủ yếu

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Người, cơ quan thực hiện

2 Nghiên cứu xác định

môi trường nhân chồi

cho các đối trượng

nghiên cứu

Nghiên cứu Giống cây rừng

3 Tiếp tục nghiên cứu

4 Nghiên cứu cải tiến

môi trường nhân chồi

cho các đối tượng

nghiên cứu

Nghiên cứu Giống cây rừng

trường nhân chồi cho

các đối tượng nghiên

cứu

12/2008

01/2008-12/2008

Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

vii

6 Nghiên cứu xác định

môi trường ra rễ cho

các đối tượng nghiên

cứu

01/2008- 12/2008

12/2008

01/2008-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

7 Bước đầu tạo chồi và

cấy ra rễ cho các đối

tượng nghiên cứu

01/2008- 12/2008

12/2008

01/2008-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

trường ra rễ cho từng

các đối tượng nghiên

cứu

01/2009- 12/2009

12/2009

01/2009-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

9 Tiếp tục tạo chồi, cấy

ra rễ cho các đối

tượng nghiên cứu và

tạo cây giống ở vườn

ươm

01/2009- 12/2009

01/2009- 12/2009

Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

12/2009

01/2009-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

11 Xây dựng quy trình

nhân giống bằng công

nghệ nuôi cấy mô tế

bào

01/2010- 10/2010

10/2010

01/2010-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

12 Tiếp tục tạo cây giống

ở vườn ươm

01/2010- 10/2010

10/2010

01/2010-Trung tâm

NC Giống cây rừng

10/2010

01/2010-Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

Thực tế đạt được

(đảm bảo yêu cầu cây

giống lâm nghiệp

trồng trong bầu)

cây 8.000-10.000 8.000-10.000

30.000 cây/đối tượng

20.000-2

Cây giống bạch đàn

lai nhân tạo (UE35),

dòng keo lai nhân tạo

(MA02) và lát hoa ở

vườn ươm, (đảm bảo

yêu cầu cây giống lâm

nghiệp trồng trong

vườn ươm)

cây 3.000-5.000 3.000-5.000

5.000 cây/đối tượng

3

Mô hình nhân giống

keo lai, bạch đàn lai

và lát hoa (Qui mô

sản xuất 20.000 cây

giống/năm)

Mô

Ghi chú

1

Quy trình nhân giống keo lai tự

nhiên, bạch đàn Uro, keo lai,

bạch đàn lai nhân tạo, lát hoa

(Được áp dụng trong sản xuất

giống cây lâm nghiệp mới chọn

d, Kết quả đào tạo

Số lượng Stt

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

x

e, Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Stt Tên kết quả đã được

ứng dụng

Thời gian

Địa điểm Kết quả sơ bộ

1 Quy trình nhân giống

cho các giống Keo lai

3 Công ty cổ phần giống lâm nghiệp vùng Nam Bộ

Các đơn vị này đã sản xuất được cây giống với số lượng từ 20.000 cây/năm đến quy mô sản xuất công nghiệp

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ

Đề tài đã xây dựng được 05 quy trình nhân nhanh bằng công nghệ nuôi cấy mô cho các đối tượng nghiên cứu Các quy trình này đã được áp dụng vào sản xuất thực tiễn tại các đơn vị sản xuất lâm nghiệp thông qua hoạt động chuyển giao giống gốc và kỹ thuật nhân giống (xây dựng mô hình nhân giống) Từ đó, không những phát triển các kết quả nghiên cứu (giống mới chọn tạo, kỹ thuật nhân giống) vào sản xuất

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội

Cây con được sản xuất theo quy trình có giá thành giảm từ 15% so với trước đây, như vậy các đơn vị và cá nhân trồng rừng kinh tế có thể giảm bớt chi phisb đầu vào mà vẫn sử dụng được nguồn cây giống có chất lượng Do

đó, hiệu quả kinh tế của trồng rừng được nâng lên,giúp cho người lao động giảm bớt các khó khăn do đặc thù ngành nghề lâm nghiệp

xi

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài

Stt Nội dung Thời gian thực hiện Ghi chú

1 Báo cáo định kỳ Tháng 6 và tháng 12 hàng năm 02 báo cáo/năm

2 Báo cáo sơ kết Tháng 12 năm 2008

3

Kiểm tra tiến độ &

nghiệm thu khối

lượng thực hiện đề

tài hàng năm

Cơ quan thực hiện đề tài TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU GIỐNG CÂY RỪNG

PHẦN 2 BÁO CÁO KHOA HỌC

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 13

1.1 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 13

1.2 Các giai đoạn chính trong quá trình nuôi cấy in vitro 14

1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị 14

1.2.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động 15

1.2.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi 15

1.2.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh 15

1.2.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm 16

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy mô - tế bào 16

1.3.1 Môi trường nuôi cấy 16

1.3.1.1 Môi trường hoá học 16

1.3.2 Vật liệu nuôi cấy 23

1.4 Những vấn đề trong nhân giống in vitro 24

1.5 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài 26

1.5.1 Ngoài nước 26 1.5.2 Trong nước 29 1.6 Phân tích, đánh giá những vấn đề KH&CN còn tồn tại, hạn chế phải

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 36

2.2 Cách tiếp cận 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 37

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 37

2.4.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm 37

2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 40

2.4.5 Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 41

2.4.6 Kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm 43

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả nghiên cứu nhân giống cho Keo lai tự nhiên dòng BV71,

3.1.1.1 Xác định loại hoá chất khử trùng thích hợp 47

3.1.1.2 Xác định thời điểm lấy mẫu khử trùng trong năm 49

3.1.1.3 Đánh giá khả năng tái sinh chồi của từng dòng Keo lai nghiên

cứu 49 3.1.2 Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho Keo lai 51

3.1.2.1 Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai tự

3.1.2.2 Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho Keo lai nhân tạo

(MA02) 54 3.1.3 Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi 55

3.1.3.1 Ảnh hưởng của BAP và Kn đến khả năng nhân nhanh chồi

3.1.3.2 Ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi

3.1.4 Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi 61

3.1.4.1 Xác định môi trường tiền ra rễ cho Keo lai tự nhiên dòng

3.1.4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp giữa BAP và NAA đến quá trình nhân

3.1.5.1 Xác định môi trường ra rễ cho Keo lai tự nhiên dòng BV71,

3.1.5.2 Ảnh hưởng của IBA và NAA đến quá trình ra rễ của Keo lai

3.1.6 Xác định phương pháp chăm sóc và huấn luyện cây con Keo lai 73

3.1.6.1 Xác định thời gian huấn luyện cây thích hợp 73

3.1.6.2 Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô 74

3.1.7 Tối ưu hóa phương pháp nuôi cấy cho Keo lai 76

3.1.7.1 Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho các dòng Keo

lai nghiên cứu 77

3.1.7.2 Xác định phương pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo

lai nghiên cứu 79

3.2 Kết quả nghiên cứu nhân giống Bạch đàn lai nhân tạo dòng UE35 và

3.2.1 Khử trùng mẫu cấy 80

3.2.1.1 Xác định phương pháp khử trùng thích hợp cho Bạch đàn

UE35 81 3.2.1.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng bật chồi của

3.2.1.3 Ảnh hưởng của mùa vụ tới khả năng tái sinh chồi 84

3.2.2 Xác định loại môi trường nuôi cấy cơ bản cho Bạch đàn 85

3.2.3 Nhân tạo chồi 86

3.2.3.1 Xác định môi trường nhân chồi cho Bạch đàn UE35 87

3.2.3.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi của Bạch đàn

3.2.3.3 Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP và Kn đến khả năng nhân

3.2.4 Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi (Môi trường tiền ra

rễ) cho Bạch đàn 92

3.2.4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến HSNC và

3.2.5 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng và phương thức cấy tới khả

năng sinh trưởng của Bạch đàn trong giai đoạn nhân chồi 96

3.2.5.1 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng tới kết quả nhân chồi Bạch

đàn 96 3.2.5.2 Ảnh hưởng của phương thức cấy tới kết quả nhân chồi Bạch

đàn 98 3.2.6 Kết quả thí nghiệm ra rễ Bạch đàn 99

3.2.6.1 Xác định môi trường ra rễ cho Bạch đàn lai UE35 100

3.2.6.2 Xác định môi trường ra rễ thích hợp cho Bạch đàn uro PN3d

103 3.2.6.3 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều

cao của cây con ở vườn ươm 105

3.3.1 Tạo mẫu sạch 107

3.3.2 Khả năng tái sinh chồi của hai đối tượng Lát hoa nghiên cứu 108

3.3.3 Xác định môi trường thích hợp cho các đối tượng nghiên cứu 109

3.3.3.1 Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản 109

3.3.4 Xác định môi trường tạo rễ 113

3.4 Xác định phương pháp tạo rễ chồi non bằng chấm thuốc bột TTG trên

môi trường cát sông hoặc bầu đất 114

3.4.1 Tạo rễ từ chồi in vitro các dòng Keo lai tự nhiên nghiên cứu 114

3.4.1.1 Xác định loại hóa chất và nồng độ chất kích thích tạo rễ thích

hợp 114 3.4.1.2 Xác định mùa vụ ra rễ thích hợp bằng phương pháp chấm

3.4.2 Tạo rễ chồi in vitro Lát hoa bằng chấm thuốc bột TTG 119

3.4.2.1.Xác đinh loại hóa chất và nồng độ chất kích thích tạo rễ thích

3.4.2.2 Xác định mùa vụ cho ra rễ chồi non thích hợp 121

Chương 4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VÀ CHUYỂN

GIAO GIỐNG GỐC CHO CÁC ĐƠN VỊ NGHIÊN CỨU VÀ SẢN

XUẤT LÂM NGHIỆP 123

4.1 Quy trình nhân giống cho các dòng Keo lai tự nhiên BV71, BV73 và

BV75 124

4.1.1 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 124

4.1.2.1 Tạo chồi lần đầu 125

4.1.3 Nhân chồi 126

4.1.3.1 Giai đoạn nhân nhanh số lượng chồi 126

4.1.3.2 Giai đoạn nâng cao chất lượng chồi 127

4.1.4 Ra rễ 127

4.1.5.1 Huấn luyện cây con trong ống nghiệm 128

4.1.5.2 Chuẩn bị bầu đất 128

4.1.5.3 Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất 128

4.1.6 Phòng trừ sâu bệnh ở vườn ươm 130

4.1.7 Tiêu chuẩn cây con xuất vườn 131

4.2 Quy trình nhân giống Keo lai nhân tạo dòng MA02 bằng nuôi cấy mô

131

4.2.1 Nguồn giống 131

4.2.2 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 131

4.2.3.1 Tạo chồi lần đầu 132

4.2.4 Nhân chồi 133 4.2.4.1 Giai đoạn nhân nhanh số lượng chồi 133

4.2.4.2 Giai đoạn nâng cao chất lượng chồi 133

4.2.5 Ra rễ 134

4.2.6.1 Huấn luyện cây con trong ống nghiệm 134

4.2.6.2 Chuẩn bị bầu đất 134

4.2.6.3 Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất 135

4.2.6.5 Phòng trừ sâu bệnh ở vườn ươm 136

4.2.7 Tiêu chuẩn cây con xuất vườn 137

4.3 Quy trình nhân giống Bạch đàn lai nhân tạo dòng UE35 bằng nuôi cấy

mô 138

4.3.1 Nguồn giống 138

4.3.2 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 138

4.3.3.1 Tạo chồi lần đầu 138

4.3.4 Nhân chồi 140 4.3.4.1 Giai đoạn nhân nhanh số lượng chồi 140

4.3.4.2 Giai đoạn nâng cao chất lượng chồi 140

4.3.5 Ra rễ 140

4.3.6.1 Huấn luyện cây con trong ống nghiệm 141

4.3.6.2 Chuẩn bị bầu đất 141

4.3.6.5 Phòng trừ sâu bệnh ở vườn ươm 143

4.3.7 Tiêu chuẩn cây con xuất vườn 143

4.4 Quy trình nhân giống cho bạch đàn uro dòng PN3d bằng nuôi cấy mô

143

4.4.1 Nguồn giống 143

4.4.2 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 143

4.4.3.1 Tạo chồi lần đầu 144

4.4.4 Nhân chồi 145 4.4.4.1 Giai đoạn nhân nhanh số lượng chồi 145

4.4.4.2 Giai đoạn nâng cao chất lượng chồi 146

4.4.5 Ra rễ 146

4.4.6.1 Huấn luyện cây con trong ống nghiệm 146

4.4.6.2 Chuẩn bị bầu đất 146

4.4.6.5 Phòng trừ nấm bệnh ở vườn ươm 149

4.4.7 Tiêu chuẩn cây con xuất vườn 149

4.5 Quy trình nhân giống cho Lát hoa bằng nuôi cấy mô 149

4.5.1 Nguồn giống 149

4.5.2 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 149

4.5.3.1 Tạo chồi lần đầu 150

4.5.4 Nhân chồi 151 4.5.4.1 Giai đoạn nhân nhanh số lượng chồi 151

4.5.4.2 Giai đoạn nâng cao chất lượng chồi 151

4.5.5 Ra rễ 152

4.5.6.1 Huấn luyện cây con trong ống nghiệm 152

4.5.6.2 Chuẩn bị bầu đất 153

4.5.6.3 Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất 153

4.5.6.4 Phòng trừ sâu bệnh ở vườn ươm 154

4.5.7 Tiêu chuẩn cây con xuất vườn 154

Chương 5 KẾT LUẬN 155

5.2 Với Keo lai nhân tạo 155

5.3 Với Bạch đàn lai nhân tạo 156

5.5 Đối với Lát hoa 157 5.6 Đã xác định được phương pháp ra rễ chồi in vitro bằng thuốc bột TTG

5.7 Xây dựng quy trình nhân giống và chuyển giao vào sản xuất 157

TÀI LIỆU THAM KHẢO 159 PHỤ LỤC 162

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho Keo

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BAP và Kn ở nồng độ khác nhau đến khả năng

nhân chồi Keo lai tự nhiên dòng BV71, BV73 và BV75 sau 25 ngày nuôi

cấy 57 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP và Kn ở nồng độ khác nhau tới số lượng và

chiều dài chồi của Keo lai nhân tạo dòng MA02 (sau 25 ngày nuôi cấy)

59 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi

Bảng 3.9 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA tới quá trình nhân chồi Keo

Bảng 3.10 Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai tự nhiên

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho Keo lai nhân tạo (dòng

MA02 sau 25 ngày cấy) 71

Bảng 3.12 Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai 74

Bảng 3.13 Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai 75

Bảng 3.14 Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho nuôi

cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển 78

Bảng 3.16 Kết quả khử trùng mẫu Bạch đàn PN3d bằng các hoá chất khử

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Bạch đàn (sau

Bảng 3.18 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả

năng tạo chồi (sau 20-22 ngày nuôi cấy) 85

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa BAP + Kinetin đến HSNC và

TLCHH Bạch đàn UE35 sau 25 ngày nuôi cấy 89

Bảng 3.21 Kết quả thí nghiệm nhân chồi Bạch đàn uro dòng PN3d 90

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kn đến khả năng nhân chồi Bạch

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa BAP +Kn + IBA đến HSNC và

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kn + NAA đến HSNC và

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng tới khả năng nhân chồi của

Bạch đàn sau 20 ngày nuôi cấy 97

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của phương thức cấy tới khả năng nhân chồi của Bạch

đàn 99 Bảng 3.27 Ảnh hưởng của các nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của Bạch đàn

UE35 (sau 15 ngày nuôi cấy) 101

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ

trung bình và chiều dài rễ Bạch đàn UE35 (sau 20 ngày cấy ra rễ) 103

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của các IBA và NAA riêng rẽ và phối hợp đến khả

năng ra rễ Bạch đàn uro dòng PN3d (20 ngày cấy) 104

Bảng 3.30 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con

sau 1 tháng cấy vào giá thể tại vườn ươm 105

Bảng 3.32 Khả năng tái sinh chồi của hai dòng Lát hoa 109

Bảng 3.33 Kết quả xác định môi trường cơ bản cho Lát hoa sau30-35 ngày

nuôi cấy 110 Bảng 3.34 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân chồi Lát hoa

sau 30 ngày nuôi cấy 111

Bảng 3.35 Kết quả thí nghiệm kích thích ra rễ cho Lát hoa 113

Bảng 3.36 Kết quả ra rễ chồi in vitro Keo lai tự nhiên dòng BV71, BV73 và

Bảng 3.37 Ảnh hưởng của mùa vụ tới khả năng ra rễ Keo lai tự nhiên dòng

BV71, BV73 và BV75 (sau 30 ngày cấy ra rễ) 117

Bảng 3.38 Kết quả thí nghiệm ra rễ trực tiếp chồi non in vitro (sau 30-35

ngày chấm thuốc) 120

Bảng 3.39 Kết quả thí nghiệm ra rễ chồi in vitro Lát hoa theo mùa vụ (sau

35-40 ngày cấy ra rễ) 122

Ảnh 3.4 Ảnh hưởng của các môi trường đến khả năng nhân chồi của Keo lai

nhân tạo MA02 (sau 25 ngày cấy chuyển) 55

Ảnh 3.5 Sự ảnh hưởng của BAP và Kn đến khả năng tạo cụm chồi của Keo

lai nhân tạo (dòng MA02 sau 25 ngày nuôi cấy) 60

Ảnh 3.6 Bình chồi Keo lai tự nhiên dòng BV71 sau 25 ngày nuôi cấy 63

Ảnh 3.7 Cụm chồi Keo lai nhân tạo (dòng MA02) từ các môi trường khác

nhau sau 25 ngày nuôi cấy 66

Ảnh 3.8a & 3.8b Các chồi Keo lai tự nhiên ra rễ 69

Ảnh 3.9 Các bình chồi Keo lai tự nhiên ra rễ 69

Ảnh 3.10 Chồi Keo lai nhân tạo dòng MA02 sau 25-27 ngày cấy ra rễ 72

Ảnh 3.11 Luống Keo lai đã ra rễ ở vườn ươm sau 30 ngày cấy 76

Ảnh 3.12 Các bình Keo lai nuôi cấy theo các phương pháp khác nhau sau 25

ngày 78 Ảnh 3.13 Chồi bất định Bạch đàn lai UE35 sau khử trùng 20 ngày 82

Ảnh 3.14 Chồi bất định Bạch đàn PN3d hình thành sau khi khử trùng 25

ngày 83 Ảnh 3.15 Cụm chồi Bạch đàn UE35 ở các loại môi trường nuôi cấy khác

nhau 86 Ảnh 3.16 Ảnh hưởng của BAP và Kn tới khả năng nhân chồi Bạch đàn uro

PN3d sau 20 ngày nuôi cấy 90

Ảnh 3.17 Cụm chồi Bạch đàn lai dòng UE35 được nuôi cấy trong các loại

môi trường khác nhau sau 20 ngày cấy 95

Ảnh 3.18 Bình nhân chồi Bạch đàn theo chế độ 3 (bên trái) và theo chế độ

thông thường (bên phải) sau 20 ngày cấy 97

Ảnh 3.19 Cụm chồi Bạch đàn từ các phương thức cấy khác nhau 99

Ảnh 3.20 Các chồi Bạch đàn lai dòng UE35 ra rễ trong môi trường có bổ

Ảnh 3.21 Luống cây con Bạch đàn sau 20 ngày cấy vào bầu đất tại vườn ươm

106 Ảnh 3.22 Chồi bất định Lát hoa hình thành sau khi khử trùng 25 ngày 108

Ảnh 3.23 Ảnh hưởng của BAP và Kn đến khả năng tạo cụm chồi Lát hoa sau

30 ngày nuôi cấy 111

Ảnh 3.24 Các cụm chồi Lát hoa sau 30 ngày nuôi cấy 112

Ảnh 3.25 Các bình nhân chồi Lát hoa sau 30 ngày cấy 112

Ảnh 3.26 Các chồi Keo lai tự nhiên ra rễ bằng chấm thuốc bột TTG 116

Ảnh 3.27 Ra rễ chồi in vitro Keo lai tự nhiên bằngchấm thuốc bột TTG 117

Ảnh 3.28 Cấy các chồi in vitro Keo lai tự nhiên ra rễ được cấy vào bầu đất

118 Ảnh 3.29 Luống Keo lai tự nhiên ra rễ tại vườn ươm 118

Ảnh 3.30 Các chồi Lát hoa ra rễ bằng chấm thuốc bột TTG có gốc là IBA

(trái) và NAA (phải) sau 25 ngày cấy 121

Ảnh 3.31 Các chồi Lát hoa ra rễ bằng chấm thuốc bột TTG có gốc là IBA ở

các nồng độ khác nhau sau 30 ngày cấy ra rễ 121

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào 14

Sơ đồ 2.1 Các giai đoạn trong quá trình nhân giống cho một số giống cây lâm

nghiệp mới được chọn lọc 40 Biểu đồ 3.1 Kết quả khử trùng các dòng Keo lai BV71, BV73 và BV75 50

Biểu đồ 3.2a Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của loại môi trường đến khả

năng nhân chồi dòng BV71sau 25 ngày nuôi cấy 53

Biểu đồ 3.2b Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của loại môi trường đến khả

năng nhân chồi dòng BV73 sau 25 ngày nuôi cấy 54

Biểu đồ 3.2c Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của loại môi trường đến khả

năng nhân chồi dòng BV75 sau 25 ngày nuôi cấy 54

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của loại môi trường đến khả năng tái sinh chồi Keo

Biểu đồ 3.4a Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân

chồi của Keo lai dòng BV71 sau 25 ngày nuôi cấy 58

Biểu đồ 3.4b Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân

Biểu đồ 3.4c Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và Kn tới khả năng nhân nhanh và

kéo dài chồi Keo lai nhân tạo (dòng MA02 sau 25 ngày nuôi cấy) 60

Biểu đồ 3.6a Kết quả thí nghiệm phối hợp của BAP và NAA tới khả năng tạo

Biểu đồ 3.6b Kết quả thí nghiệm phối hợp của BAP và NAA tới khả năng

Biểu đồ 3.6c Kết quả thí nghiẹm phối hợp của BAP và NAA tới khả năng tạo

Biểu đồ 3.7 Kết quả thí nghiệm phối hợp của BAP và NAA tới khả năng tạo

Biểu đồ 3.8a Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các chất kích thích đến tỷ lệ

Biểu đồ 3.8b Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các chất kích thích đến chiều

Biểu đồ 3.8c Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các chất kích thích đến số rễ

Biểu đồ 3.9a Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của chất kích thích đến tỷ lệ ra rễ

Biểu đồ 3.9b Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các chất kích thích đến 73

Biểu đồ 3.9c Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các chất kích thích đến số

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, trong khi năng suất rừng trồng quảng canh chỉ đạt 7m3/ha/năm, thì năng suất trồng rừng bằng dòng vô tính bằng các giống đã được cải thiện đã đạt trên 15m3/ha/năm đối với Bạch đàn, riêng với Keo lai có thể đạt 20-30m3/ha/năm tùy từng lập địa Trong chương trình trồng mới 5 triệu héc ta rừng ở nước ta, có đến 3 triệu ha là rừng trồng sản xuất bao gồm 1 triệu ha cây công nghiệp dài ngày và 2 triệu ha là cây lâm nghiệp, trong số đó

5-có đến 70% là các loài cây mọc nhanh bao gồm các loài Keo, Bạch đàn, nên nhu cầu về giống, đặc biệt là giống có năng suất và chất lượng cao cho các đối tượng này là rất lớn

Keo và Bạch đàn là những loài cây lá rộng, mọc nhanh, có biên độ sinh thái rộng, rất phù hợp cho trồng rừng trên quy mô lớn ở nước ta Ngoài việc cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất giấy, ván nhân tạo, gỗ của các loài cây này còn được sử dụng cho các mục đích khác như xây dựng, đồ gỗ và trang trí nội thất, gỗ củi, Cây Keo lai (giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm) là cây lâm nghiệp quan trọng, có khả năng cố định nitơ, tuy có khả năng ra hoa kết hạt tốt nhưng không thể dùng hạt để làm giống do hiện tượng phân tính ở thế hệ sau Do vậy bên cạnh biện pháp nhân giống bằng hom thì việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô có những đóng góp nhất định trong việc đảm bảo tính chất di truyền của cá thể được chọn lọc, đặc biệt đối với các giống lai

Lát hoa (Chukrasia tabularis) là loài cây có giá trị kinh tế rất cao do có

vân gỗ sáng màu, dễ chế biến nên được sử dụng rộng rãi trong chế biến đồ gỗ cao cấp Mặt khác, đây cũng là loài cây đang bị khai thác cạn kiệt nên Lát hoa trong tự nhiên còn rất ít, do đó đây là đối tượng cần thiết nghiên cứu phát triển

Từ các kết quả nghiên cứu trong giai đoạn 2000-2005, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng đã chọn tạo được một số giống Keo lai tự nhiên,

Keo lai nhân tạo, Bạch đàn và một số dòng Lát hoa có năng suất cao Để phát triển các giống mới chọn tạo này vào sản xuất, việc xây dựng quy trình nhân nhanh bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào là hướng đi thích hợp nhất Đến nay, thông qua các chương trình chọn giống và phát triển các giống đã được cải thiện vào sản xuất một phần diện tích rừng trồng kinh tế đã được trồng từ cây con vô tính Việc sản xuất và cung cấp giống có chất lượng cho trồng rừng hiện nay chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp giâm hom vì giá thành của cây con từ nuôi cấy mô là tương đối cao Qua thực tế trồng rừng sản xuất cho thấy cây mô với các ưu điểm nổi trội có khả năng sinh trưởng và chống chịu tốt hơn so với cây hom Mặt khác, cây nuôi cấy mô có độ trẻ hóa cao, thâm mềm, có phần gốc thân tròn và bộ rễ phát triển gần như cây hạt, cây

có chất lượng đồng đều, sạch bệnh và sức sống cao nên trồng rừng kinh tế bằng cây mô là giải pháp công nghệ thích hợp

Mặc dù có những ưu điểm vượt trội nhưng do giá thành sản phẩm cao (thường gấp từ 4-8 lần so với cây hom và 10-15 lần so với cây hạt) nên cây con từ nuôi cấy mô chưa có vị trí thích hợp trên thị trường và tỷ lệ của cây mô trong trồng trồng rừng là chưa đáng kể Từ trước đến nay, trong sản xuất lâm nghiệp các kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô và giâm hom thường độc lập Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng kết hợp giữa kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ

thuật giâm hom chồi non in vitro bằng chấm thuốc kích thích tạo rễ dạng bột (ký hiệu TTG) thành công nghệ giâm hom chồi non in vitro sẽ giảm được

đáng kể giá thành cây con (có thể tới 40% tùy thuộc từng loài), sẽ góp phần làm tăng dần diện tích trồng rừng bằng cây vô tính do giảm giá thành đầu tư ban đầu cho trồng rừng Do vậy, sẽ tăng tính an toàn sinh học trong trồng rừng vô tính vì số lượng dòng vô tính được sử dụng trong trồng rừng tăng lên

Quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho các dòng Keo lai và Bạch đàn trước đây mặc dù đã được áp dụng trong sản xuất, nhưng do đặc điểm về

mặt di truyền không đồng nhất, các cá thể (dòng) khác nhau có những phản ứng với điều kiện môi trường nuôi cấy rất khác nhau nên quy trình nhân giống của đối tượng này không sử dụng được cho các đối tượng khác một cách tuyệt đối cho dù trong cùng một loài Việc lựa chọn các loại mô thích hợp dùng trong nhân giống đối với từng dòng cũng khác nhau Vì vậy, việc xác định và tối ưu hoá phương pháp nhân chồi, ra rễ và điều kiện nuôi cấy, cho các giống mới được chọn tạo là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất lâm nghiệp Vì vậy, đề tài đã tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho những đối tượng nghiên cứu riêng biệt nhằm đưa nhanh các kết quả nghiên cứu vào sản xuất

Trong khuôn khổ nghiên cứu, ngoài việc hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô thông thường, đề tài còn xác định phương thức kết hợp giữa nuôi cấy mô tế bào và kỹ thuật giâm hom trực tiếp các chồi

in vitro bằng chấm thuốc kích thích tạo rễ dạng bột (được gọi là TTG) cho

một số loài cây lâm nghiệp bằng cách cắt rời mầm nuôi cấy in vitro, chấm vào

bột kích thích ra rễ, cấy trên giá thể (cát sông hoặc bầu đất) và chăm sóc ở vườn ươm để tạo thành cây con hoàn chỉnh là hướng đi mới Công nghệ này

đã được nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng cho một số dòng Keo lai được công nhận là giống quốc gia (BV10, BV16) bởi GS.TS Lê Đình Khả, PGS.TS Nguyễn Ngọc Tân và ThS Đoàn Thị Mai nhưng mới chỉ

ở quy mô thí nghiệm Việc nghiên cứu và triển khai thành công công nghệ này cho các giống Keo lai và Lát hoa mới được chọn lọc trên quy mô bán sản xuất sẽ rút ngắn thời gian nhân giống, tiết kiệm các chi phí đầu vào và làm giảm giá thành cây con (khoảng 20-30%), sẽ đáp ứng được yêu cầu của trồng rừng kinh tế

Về đối tượng, đề tài tập trung vào nghiên cứu nhân nhanh một số giống cây rừng đã được cải thiện về mặt di truyền và được công nhận là giống tiến

bộ kỹ thuật Các giống này thích hợp với điều kiện đất đai, khí hậu ở Việt Nam và có diện tích gây trồng tương đối lớn trong các chương trình trồng rừng cụ thể là:

1 Các giống Keo lai bao gồm: các giống Keo lai tự nhiên (BV71, BV73, BV75), giống Keo lai nhân tạo MA02 (MA02)

2 Các giống Bạch đàn bao gồm: Bạch đàn uro PN3d, bạch đàn lai nhân tạo UE35

3 Lát hoa: các dòng cây trội TL3 (Thái Lan) và NA3 (Việt Nam) được chọn lọc thông qua các khảo nghiệm xuất xứ

Để chuyển giao các kết quả nghiên cứu cho sản xuất lâm nghiệp, đề tài cũng tiến hành xây dựng một số mô hình nhân giống với quy mô bán sản xuất (khoảng 20.000 cây/năm) tại một số đơn vị nghiên cứu và sản xuất trong nước Việc xây dựng mô hình được triển khai theo phương thức chuyển giao giống gốc và kỹ thuật nhân giống

Trong quá trình thực hiện, đề tài cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ của các cấp có thẩm quyền, của lãnh đạo Viện KHLN Việt Nam, Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường (Bộ NN&PTNT), các phòng chức năng thuộc Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam và đặc biệt là sự đóng góp của tập thể các cán bộ làm công tác quản lý, cán bộ nghiên cứu và phục vụ nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng

Nhân dịp này, chúng tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó, đồng thời cũng xin được ghi nhận sự đóng góp vô tư và tích cực của các cộng tác viên khác cũng như của các đối tác trong và ngoài nước

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào

Nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào là phương pháp nhân giống được thực hiện bằng nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và được kiểm soát Vì vật liệu nuôi cấy thường rất nhỏ và thực hiện trong môi trường nhân tạo nên phương pháp nhân giống này còn được gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân

giống in vitro

Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào được coi là nền tảng của việc nuôi cấy mô Điều này được nhà thực vật học ngưòi Đức Haberlandt đề xuất lần đầu tiên vào năm 1902 Tác giả cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ về cá thể

đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Giả thuyết đó đến nay đã được thực nghiệm chứng minh trên nhiều loài thực vật bậc cao

Sự phân hoá và phản phân hoá cũng là cơ sở quan trọng trong nuôi cấy

mô - tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng, tất cả các loại tế bào đó đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh và được tạo nên bởi quá trình phân hóa Đó là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các mô chức năng chúng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình Nếu tách một tế bào hoặc một nhóm tế bào ra khỏi cơ thể và nuôi cấy chúng trong những điều kịên môi trường thích hợp, chúng lại quay trở lại dạng tế bào phôi sinh ban đầu và

lại có khả năng phân chia mạnh mẽ và phân hóa để tái sinh cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là phản phân hoá (sơ đồ 1)

Về bản chất, sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (trước đó bị ức chế) giúp cơ thể biểu hiện tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động

Sơ đồ 1.1 Quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào

1.2 Các giai đoạn chính trong quá trình nuôi cấy in vitro

1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị

Giai đoạn này được xem như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên hoặc ra khỏi các khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh

và tạo điều kiện chủ động về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài rất khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên

Tế bào phôi sinh

Phân hóa tế bào

Tế bào chuyên hóa

Tế bào giãn Phản phân hóa

1.2.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động

Mục tiêu của giai đoạn này là tạo được mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Bộ phận của cây được chọn làm mẫu cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loài cây và đặc biệt đúng giai đoạn phát triển Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng cho thí nghiệm nuôi cấy mô ở hầu hết các loại cây trồng Ngoài ra, chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng Mẫu trước khi cấy vào môi trường

cơ bản được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ thích hợp để làm sạch nguồn bệnh Tuỳ thuộc vào từng vật liệu mà chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp Trong quá trình khử trùng mẫu cấy phải hết sức thận trọng để không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy

1.2.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nhân giống Trong giai đoạn này, vai trò của chất điều hoà sinh trưởng là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng chồi tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy

1.2.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh

Tạo rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây con hoàn chỉnh Khi tạo rễ cần loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số Auxin kích thích tạo rễ Tuỳ theo loài cây mà sử dụng loại và nồng độ Auxin cho phù hợp Thông thường các chất IBA, NAA, IAA với hàm lượng từ 1- 5 mg/l thích hợp trong quá trình kích thích tạo rễ cho nhiều loài cây thân gỗ Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo được quá nhỏ và ngắn, có thể sử dụng 1-5mg/l

GA3 và một số hợp chất hữu cơ như nước dừa non,… bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con trước khi chuyển sang khu huấn luyện

1.2.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm

Cây con đạt được những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được chuyển dần từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới,

sau đó chuyển ra vườn ươm Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn

định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải thoáng mát, cường

độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao,…Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm Trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7- 10 ngày kể từ ngày cấy)

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy mô - tế bào

Một số lượng lớn các yếu tố phức tạp ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái mô - tế bào, tuy nhiên những yếu tố này phụ thuộc mạnh mẽ vào loài

1.3.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm cả môi trường hóa học và điều kiện bên ngoài được xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy

1.3.1.1 Môi trường hoá học

Môi trường hóa học được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy

in vitro Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh: Thành phần, hàm lượng

các chất trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát sinh hình thái của các bộ phận nuôi cấy Khả năng tái sinh chồi, lá, rễ của cây hoàn chỉnh cũng như sự sinh trưởng và phát triển của toàn cây Tuỳ từng loài, giống,