Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm

BỘ NÔNG NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA

BỘ NÔNG NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC

(THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN)

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG CHẤT DIỆT KHUẨN SINH HỌC (NISIN VÀ ENTEROCIN) DÙNG TRONG BẢO

QUẢN NÔNG SẢN THỰC PHẨM

Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài/dự án: TS Đỗ Thị Huyền

7987

Hà Nội - 2010

BỘ NÔNG NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC

(THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN)

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG CHẤT DIỆT KHUẨN SINH HỌC (NISIN VÀ ENTEROCIN) DÙNG TRONG BẢO QUẢN

NÔNG SẢN THỰC PHẨM

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài:

(ký tên và đóng dấu)

TS Đỗ Thị Huyền PGS.TS Trương Nam Hải

Văn phòng Bộ NN & PTNN Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội - 2010

VIỆN CÔNG NGHIỆ SINH HỌC

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội., ngày 31 tháng 12 năm 2009.

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn

sinh học (nisin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm

Mã số đề tài, dự án: Không

Thuộc:

- Chương trình: Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Thủy sản

2 Chủ nhiệm đề tài: Họ và tên: Đỗ Thị Huyền

Ngày, tháng, năm sinh: 10/11/1975 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên.Chức vụ

Điện thoại: Tổ chức: 084 4 37560339 Nhà riêng: 084 4 37556062

Mobile: 01683048056 Fax: 084 4 37560339 E-mail: dohuyen1011@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ sinh học ………

Địa chỉ tổ chức:18-Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội…

Địa chỉ nhà riêng: P34, A10 Ngõ 120 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học …

Điện thoại: 084 4 37562790 Fax: 084 4 37562790

E-mail: tnhai@ibt.ac.vn/tnhai@hn.vnn.vn

Website: http//www.ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18-Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Trương Nam Hải

Số tài khoản: 21510000106037

Ngân hàng: Đầu tư và phát triển Việt Nam (BIDV)

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN 1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án: - Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 1 tháng 01 năm 2007 đến 31 tháng 12 năm 2009 Thực tế thực hiện: từ 1 tháng 01 năm 2007 đến 31 tháng 12 năm 2009 - Được gia hạn (nếu có): không 2 Kinh phí và sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: ……2649……tr.đ, trong đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: ………2500 ….tr.đ + Kính phí hỗ trợ bổ sung đào tạo: …149……tr.đ + Kinh phí từ các nguồn khác: …… 0… tr.đ + Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): …………

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Số

TT Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí

(Tr.đ)

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí

(Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

400,9 390,9 10,0

400,9 390,9 10,0

400,9 390,9 10,0

- Lý do thay đổi (nếu có):

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

1 15, 25/06/2007 Hợp đồng trách nhiệm

2 10, 03/07/2008 Hợp đồng trách nhiệm Bổ sung nội dung và

kinh phí thực hiện đề tài

3 01/04/2008 Biên bản xét duyệt quyết

toán ngân sách năm 2007

4 10/01/2009 Biên bản xét duyệt quyết

toán ngân sách năm 2008

5 1839, 18/06/2008 Quyết định bổ sung nội

dung, kinh phí của Bộ

trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

6 14/01/2009 Biên bản đánh giá cơ sở

8 14/01/2010 Biên bản đánh giá cơ sở

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp, lên men để sản xuất chất diệt khuẩn sinh học enterocin

Chủng nấm men sinh enterocin Chế phẩm enterocin Qui trình lên men sả xuất

enterocin

2 Viện Cơ điện

nông nghiệp

và Công nghệ

sau thu hoạch

Viện Cơ điện nông nghiệp

và Công nghệ sau thu hoạch

Nghiên cứu công nghệ lên men, công nghệ thu hồi

và tạo chế phẩm nisin, từ các chủng

tự nhiên và tái tổ hợp quy mô pilot

Xây dựng quy trình ứng dụng chế phẩm nisin, enterocin trong bảo quản nông sản

và đánh giá tác dụng của chế phẩm

- Chủng L

lactic sinh nisin

- Chế phẩm nisin

- Qui trình lên men sản xuất nisn

- Một số qui trình bảo quản thịt quả, nước quả

Cam kết tiếp nhận công nghệ sản xuất khi công nghệ được hoàn thiện

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Chỉ đạo thực hiện nội dung nghiên cứu

và báo cáo định kỳ, thống kê hàng năm

2 TS Đỗ Thị

Huyền

TS Đỗ Thị Huyền

Tối ưu biểu hiện gen trong các chủng biểu hiện cao

- Chế phẩm EntP, 800 AU/ml

- Qui trình lên men sản xuất EntP trong nồi 80 lít

Ngọc Tân

Nghiên cứu biểu hiện

gen as48 trong E coli

- Đã biểu hiện AS48 dưới dạng dung hợp với Intein

- AS48 được tạo ra dưới 2 dạng, dạng thẳng và dạng vòng

- EntP được tinh sạch bằng qui trình đơn giản

- EntP có hoạt tính kháng

lại S

aureus, L monocytoge nes

5 TS Lê Văn

Trường

TS Lê Văn Trường

6 TS Nguyễn

Thị Trung

TS Nguyễn Thị Trung

- Biểu hiện gen entP trong các

hệ biểu hiện khác nhau

- Chủng nấm men sinh EntP với hoạt tính 20 AU/ml dịch lên men

Châu Châu nội dung

nghiên cứu

về mảng sản xuất và thử nghiệm nisin

8 Th.S Nguyễn

Thị Hương

Trà

Th.S Nguyễn Thị Hương Trà

9 Th.S Vũ Kim

Thoa

Th.S Vũ Kim Thoa

10 CN Đỗ Tất

Thủy

CN Đỗ Tất Thủy

- Phân lập chủng sinh nisin từ các nguồn khác nhau

- Tối ưu lên men để thu lượng lớn nisin

- Sản xuất nisin ở qui

mô 1000 lít

- Thử nghiệm sử dụng nisin trong bảo quản nông sản thực phẩm

- Chủng vi sinh sinh tổng hợp nisin, hoạt tính 38.104 AU/ml dịch lên men

- Chế phẩm nisin, hoạt tính 4.104 AU/ml

- 11 qui trình bảo quản các loại thịt quả nhuyễn, nước quả, sữa đậu nành, bánh phở, tôm, cá

- Lý do thay đổi ( nếu có): Không

1 Nghiên cứu công nghệ lên

men để sản xuất EntPIntein ở

E coli tái tổ hợp

Thời gian: 04-11/2008

Đã tối ưu lên men để làm tăng sinh khối tế bào lên khoảng 5 lần và lượng EntPIntein thu được lớn

Thời gian: 04-11/2008

Kinh phí: 149 triệu đồng

Địa điểm: Học Viện Hoàng

Gia, Stockholm, Thụy Điển

Số cán bộ: 1

Kinh phí: 149 triệu đồng Địa điểm: Học Viện Hoàng

Gia, Stockholm, Thụy Điển

Số cán bộ: 1

2

- Lý do thay đổi (nếu có): Không

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1 Hội thảo chuyên đề: “Các

phương pháp bảo quản thực

sử dụng ”

Tại phòng 306, A10, Viện Công nghệ sinh học, hội thảo chuyên đề khoa học được tổ chức vào hồi 14 giờ thứ sáu ngày 14 tháng 08 năm 2009

Kinh phí: 5,0 triệu đồng

“Các phương pháp bảo quản thực phẩm đang được

sử dụng ”

Tại phòng 306, A10, Viện Công nghệ sinh học, hội thảo chuyên đề khoa học được tổ chức vào hồi 16 giờ, ngày 16 tháng 11 năm 2009

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

hoạch

Thực tế đạt được

Người,

cơ quan thực hiện

1 Tiếp tục phân lập tuyển chọn

2 Đánh giá khả năng ức chế các

vi khuẩn gây thối hỏng trên

nông sản thực phẩm của nisin

3 Nghiên cứu tối ưu hoá môi

trường cho sinh tổng hợp

nisin cao

7- 12/ 2007 7- 12/

2007

Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

4 Nghiên cứu ảnh hưởng của

các yếu tố của môi trường

như thời gian lên men, pH,

độ oxy hoà tan cho sinh tổng

hợp nisin cao

7-12/2007 7-12/2007 Viện Cơ

điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

5 Nghiên cứu nâng cao sản

lượng nisin bằng công nghệ

nuôi cấy hốn hợp chủng L

lactis và K marxianus

1- 6/ 2008 1- 6/ 2008 Viện Cơ

điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu

hoặch

6 Nghiên cứu nâng cao sản

lượng nisin từ L lactis bằng

công nghệ lên men gián đoạn

hai pha

7- 12/ 2008 7- 12/

2008

Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

7 Nghiên cứu nâng cao sản

lượng nisin bằng nuôi cấy cố

định tế bào trên canxi alginat

trong quá trình lên men gián

đoạn và lên men gián đoạn có

bổ sung dinh dưỡng

1- 12/ 2008 1- 12/

2008

Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

8 Nghiên cứu công nghệ thu

hồi và tạo chế phẩm nisin 6- 12/ 2008 6- 12/ 2008 Viện Cơ điện nông

nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

9 Nghiên cứu công nghệ sản

xuất nisin ở quy mô pilot

1000l/ mẻ tương đương 1 kg

nisin bột/mẻ

1- 6/ 2009 1- 6/ 2009 Viện Cơ

điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoặc

10 Tổng hợp gen as48, entP mã

hoá enterocin nhân tạo từ các

đoạn oligo

3-7/2007 3-7/2007 Viện Công

nghệ sinh học

11 Thiết kế vector biểu hiện gen

as48 trong tế bào E coli

8-11/2007 8-11/2007 Viện Công

nghệ sinh học

12 Thiết kế vector biểu hiện

pPICGel (pPIC9 hoặc

pPICZ-anpha mang gen trx,

trình tự mã hoá cho vị trí cắt

của axit formic) Vector được

3/2008

3/2008

12/2007-Viện Công nghệ sinh học

dùng để biểu hiện gen

enterocin trong nấm men

13 Đưa gen as48*, entP vào

vector biểu hiện pPICGel để

biểu hiện gen trong nấm men,

vector pKTH290 để biểu hiện

gen trong Bacillus

5-7/2008 5-7/2008 Viện Công

nghệ sinh học

14 Tích hợp gen as48*, entP

vào hệ gen của nấm men P

Pastoris, đồng thời biến nạp

gen vào Bacillus và nghiên

cứu sự biểu hiện của gen,

hoạt tính kháng khuẩn của

peptide tái tổ hợp được tạo

ra Chọn ra chủng có khả

năng biểu hiện enterocin tốt

nhất

2/2009

2/2009

8/2008-Viện Công nghệ sinh học

15 Nghiên cứu tối ưu việc biểu

hiện gen trong chủng có khả

năng biểu hiện cao

3-5/2009 3-5/2009 Viện Công

nghệ sinh học

16 Nghiên cứu qui trình tinh

sạch, phân cắt bằng protease

để thu Ent nguyên vẹn có thể

được sử dụng trong bảo quản

thực phẩm

5-7/2009 5-7/2009 Viện Công

nghệ sinh học

17 Nghiên cứu qui trình lên men

ở qui mô phòng thí nghiệm

và qui mô lớn hơn để thu

được lượng enterocin tối đa

7-9/2009 7-9/2009 Viện công

nghệ sinh học

18 Xây dựng qui trình ứng dụng

nisin và enterocin trong bảo

quản một số nông sản dạng

sơ chế và chế biến bao gồm:

a) Mô hình bảo quản các sản

phẩm từ các loại quả:

- Bảo quản các loại thịt quả

7/ 2009 - 12/ 2009

7/ 2009 - 12/ 2009

Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

nhuyễn của na, ổi, dứa, cà

chua

- Bảo quản các loại nước quả

như: nước dứa, nước ổi, sữa

đậu nành…

b) Mô hình bảo quản các sản

phẩm chế biến từ gạo như:

bún, bánh phở

c) Mô hình bảo quản các loại

rau tươi bán ở siêu thị

d) Mô hình bảo quản tôm

trong chế biến

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

Mức hoạt tính: 35x104 AU/ml

Kháng lại B

coagulans, B cereus, C

Perfringens

Kéo dài thừoi gian bảo quản thực phẩm từ 40% đến 100% so với đối chứng

monocytogenes, Bacillus

Kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm

Có phổ kháng khuẩn rộng

không kháng B

subtilis

Kéo dài thời gian bảo quản bánh phở 100% thời gian so với đối chứng

coli, L

monocytogenes

- Hoạt tính 10AU/ml dịch lên men

L

monocytogenes

- Hoạt tính 35x104 AU/ml dịch lên men

Một chủng nấm men sinh

enterocin P Hoạt tính tối đa khi lên men trong bình tam giác là 320 AU/ml dịch lên men, trong nồi lên men 80 lít đạt 25 AU/ml dịch lên men

- Lý do thay đổi (nếu có):

Thích nghi được với điều kiện Việt Nam Hiệu suất lên men đạt 35x104AU/ml dịch lên men

Thích nghi được với điều kiện Việt Nam Hiệu suất lên men đạt 25 AU/ml dịch lên men

nhuyễn, nước quả, các loại rau tươi bán

ở siêu thị và các sản phẩm thủy sản dùng trong xuất khẩu ở qui mô 100 kg/mẻ

11 qui trình: bảo quản thịt quả nhuyễn của na,

ổi, dứa, cà chua, nước ổi, nước dứa, sữa đậu nành, tôm, cá bằng chế phẩm nisin, bánh phở bằng nisin và enterocin Hiệu quả bảo quản kéo dài được từ

40 đến 100%

thời gian so với đối chứng

Qui mô 100 kg/mẻ

- Lý do thay đổi (nếu có):

Số lượng, nơi công bố

(Tạp chí, nhà

xuất bản)

1 Bài báo 6-12 bài 6 bài Tạp chí công

nghệ sinh học: 4 Hội nghị GMO: 1 Tạp chí Khoa học và Công nghệ: 1

2 Đào tạo sau đại học Tham gia đào

tạo ít nhất 1 tiến sỹ, 4 thạc

sĩ

1 tiến sĩ sẽ bảo vệ cuối năm 2010

- 2 thạc sĩ đã bảo vệ thành công

1 học viên cao học sẽ bảo vệ vào cuối năm

2010

1 tiến sĩ, 2 ThS, và 1 học viên cao học

sẽ tốt nghiệp tại trường

ĐH Khoa học

tự nhiên, Hà Nội

- Lý do thay đổi (nếu có): Một học viên cao học dự định bảo vệ một nội dung

nghiên cứu của Đề tài nhưng do trong thời gian làm luận văn, học viên được đi

đào tạo ngắn hạn ở nước ngoài và thực hiện mảng đề tài khác nên đã đổi đề

cương nghiên cứu

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

- Đã đào tạo được đội ngũ cán bộ chuyên sâu về lĩnh vực sinh học phân tử, làm chủ được kỹ thuật biểu hiện peptide ngắn trong nấm men Đây là một lĩnh vực khó vì các peptide ngắn ngoại lai dễ dàng bị cơ thể chủ phân cắt

- Đã nắm vững các nguyên tắc cơ bản trong việc thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của peptide theo nhiều cách khác nhau

- Đã đào tạo được cán bộ nắm vững về công nghệ lên men chủng tái tổ hợp để

sản xuất protein tái tổ hợp trong nấm men và trong E coli

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

- Nisin lần đầu tiên được sản xuất và thử nghiệm để bảo quản nhiều loại thực phẩm khác nhau như các loại thịt nhuyễn của quả, nước quả, bánh phở, tôm, cá ở Việt Nam Kết quả đã cho thấy nisin đã diệt hết các vi khuẩn hiếu khí trong nước quả và đã kéo dài thời giam bảo quản thực phẩm thêm 40 đến 100 % thời gian bảo quản so với đối chứng Tính giá 1 lít nisin đến tay người tiêu dùng là 975

ngàn đồng Giỏ của 1 kg nisin đến tay người tiờu dựng là 1200 ngàn đồng, rẻ hơn

so với nisin nhập từ Trung Quốc (1500 ngàn đồng)

3 Tỡnh hỡnh thực hiện chế độ bỏo cỏo, kiểm tra của đề tài, dự ỏn:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Đó tổng hợp được gen as48 và entP nhõn tạo

Đó đưa được gen as48 vào vector để biểu hiện trong E coli

2 Kỳ 2 12/2007 NC1: Sản xuất nisin từ chủng phõn lập

được

- Đó tuyển chọn 12 chủng vi khuẩn lactic cú

khả năng sinh nisin cao, trong đú cú 3-4

chủng Lactococcus lactic cú hoạt tớnh ức chế mạnh vi khuẩn Bacillus coagulans,

S.aureus, Salmonella, E.coli là những vi

khuẩn thường gây ngộ độc thực phẩm và gây thối hỏng nông sản thực phẩm

NC2 Nghiờn cứu sản xuất enterocin bằng chủng tỏi tổ hợp

- Protein dung hợp InteinAS48 được biểu

hiện tốt trong E coli nhưng việc cắt bỏ gen

dung hợp, đúng vũng AS48 gặp nhiều khú khăn nờn sản lượng AS48 thu được là rất

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

thấp.Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu biểu hiện AS48 ở dạng thẳng, không dung hợp nhưng vẫn giữ được cấu trúc bậc

3 của peptide và hy vọng cấu trúc mới sẽ

được biểu hiện tốt hơn trong vi khuẩn

3 Kỳ 3 6/2008 NC1: Sản xuất nisin từ chủng phân lập

được

- Đã phân lập được 2 chủng Kluyveromyces

marxianus từ 50 mẫu sữa chua hỏng

- Đã khảo sát được một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy hỗn hợp chủng

Lactococcus lactis C52 và chủng

Kluyveromyces marxianus Kết quả cho

thấy sản lượng nisin khi nuôi cấy hỗn hợp

chủng L.lactis và K.marxianus tăng gấp

khoảng 1,5 lần so với khi nuôi cấy chủng

Lactococus lactis C52 đơn độc Bằng công

nghệ lên men gián đoạn hai pha, mật độ tế bào tăng 25%, sản lượng nisin tăng 19% so

với nuôi cấy gián đoạn một pha

NC2 Nghiên cứu sản xuất enterocin bằng chủng tái tổ hợp

- Đã thiết kế thành công các vector biểu hiện

mang gen entP, cụ thể là vector

pPICamy1-entP, pPICamy2-pPICamy1-entP, pPICpPICamy1-entP, his, pPICZentP, pPICZentPhis dùng để biểu

pPICentP-hiện gen trong nấm men P pastoris

- Đã đưa gen entP vào pAC7 để tạo thành vector pAC7-baamyF1-entP và pAC7- baamyF2-entP dùng để biểu hiện gen trong Bacillus

- Đã đưa gen entP dung hợp với intein 1

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

(protein dung hợp được cắt bỏ bằng pH) và intein 2 (protein dung hợp được cắt bỏ bằng

DTT) để biểu hiện gen trong E coli

- Đã biểu hiện gen trong nấm men và

tăng 1,7 lần so với nuôi cấy bằng tế bào L

lactis C52 tự do với pH tự do ở thời gian

đầu và bằng 6,8 ở các giờ tiếp theo Trong quá trình lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng sản lượng nisin tăng 2,5 lần so

với nuôi cấy bằng tế bào L.lactis C52 tự do

- Chúng tôi đã tiến hành lên men có bổ sung lactose thì thấy rằng hoạt tính nisin thu được ngoài môi trường tăng lên nhiều lần, đạt 38.104 AU/ml

- Đã tiến hành nghiên cứu thu hồi nisin bằng một số hóa chất như muối sodium cloride, ethanol và methanol Kết quả cho thấy nisin được thu hồi khoảng 80% từ môi trường nuôi cấy bằng 1% NaCl Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất vì giảm được chi phí nhất và cũng thu được lượng lớn nisin từ môi trường Sau khi thu hồi nisin được bổ sung

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

với 76% NaCl, 21,5% sữa gầy thì hoạt độ nisin duy trì được 95% sau khi bảo quản khô là 5 tháng

NC2 Nghiên cứu sản xuất enterocin bằng chủng tái tổ hợp

- EntP đã được biểu hiện trong E coli,

Bacillus và nấm men Đã chọn ra được 2

chủng có khả năng biểu hiện EntP cao đó là

chủng nấm men sinh HisEntP và chủng E

coli sinh EnPIntein2 Bằng công nghệ lên

men, chúng tôi đã tối ưu được một số điều kiện để làm tăng sinh khối cũng như tăng sản lượng EntPIntein2 tái tổ hợp để có được lượng lớn dùng trong tinh chế, nghiên cứu

khả năng kháng khuẩn của EntP tạo ra

5 Kỳ 5 6/2009 NC1: Sản xuất nisin từ chủng phân lập

được

- Chúng tôi đã tiến hành lên men trong nồi

1000 lít để sản xuất nisin và đưa ra qui trình sản xuất nisin

- Đã nghiên cứu được một số qui trình bảo quản bánh phở và nước quả

NC2 Nghiên cứu sản xuất enterocin bằng chủng tái tổ hợp

- Đã tối ưu được các điều kiện lên men chủng nấm men cho sinh tổng hợp enterocin Bằng công nghệ lên men trong nồi lên men 10 lít, chúng tôi đã tìm được qui trình sơ bộ để đưa lên nồi lên men 80 lít

6 Kỳ 6 12/2009 NC1: Sản xuất nisin từ chủng phân lập

được

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

- Chúng tôi đã nghiên cứu được 9 qui trình sử dụng nisin hoặc enterocin để dùng trong bảo quản thịt quả nhuyễn của na, dứa, ổi, cà chua, nước ổi, nước dứa, tôm, cá, bánh phở Nisin với lượng khoảng 600-650 ml có hoạt tính 5,2x104 AU/ml làm ổn định cảm quan của sản phẩm và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm từ 30-100% thời gian so với đối chứng Đã nghiên cứu sử dụng nisin trong bảo quản bánh phở, tôm, cá với qui mô 1 tấn/mẻ

NC2 Nghiên cứu sản xuất enterocin bằng chủng tái tổ hợp

- Đã tinh chế được EnP từ chủng E coli tái tổ

hợp

- Thu hồi EntP từ nấm men để sử dụng trong nghiên cứu bảo quản

- EntP ức chế tốt vi khuẩn L monocytogenes

và S aureus nhưng không kháng được B

subtilis

- Trong nồi lên men 80 lít, chúng tôi cũng tiến hành 3 lần để đưa ra qui trình sản xuất enterocin tái tổ hợp từ chủng nấm men

II Báo cáo thống kê

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

- 2 qui trình lên men sản xuất nisin, enterocin

- 9 qui trình sử dụng nisin hoặc enterocin vào bảo quản trong nông sản thực phẩm

III Kiểm tra định kỳ

1 Lần 1 13/11/2007 - Đoàn của Bộ gồm 9 người từ Vụ khoa học

Công nghệ, đại điện Vụ tài chính, đại diện văn phòng Bộ, đại diện Vụ kế hoạch Bộ NN

và PTNN, đại diện Bộ Khoa học Công nghệ

- Kết luận chính: Đề tài đã thực hiện các nội dung nghiên cứu theo thuyết minh đã phê duyệt

IV Báo cáo kết quả tình hình thực hiện Đề tài

1 Báo cáo tiến

độ thực hiện

Đề tài năm

2007

12/2007 Gửi Văn phòng Bộ Nông nghiệp

2 Báo cáo tiến

3/2009 Gửi Văn phòng Bộ Nông nghiệp để phục vụ

cho Hội nghị đánh giá kết quả thực hiện Đề

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

12/2009 Gửi Văn phòng Bộ Nông nghiệp

Phục vụ cho buổi họp quyết toán kinh phí năm 2009

V Nghiệm thu cơ sở

- Đề tài đã hoàn thành 4 nội dung nghiên cứu theo đăng ký

- Phương pháp sử dụng là các phương pháp

cơ bản của sinh học phân tử, lên men

- Kết quả đạt được là đáng tin cậy

- Đề tài đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đăng ký năm 2009

- Phương pháp sử dụng có độ tin cậy cao

- Kết quả đạt được là đáng tin cậy, thuyết phục

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

- Các phương pháp nghiên cứu hiện đại

và thường qui có độ tin cậy, độ chính xác đạt yêu cầu của Đề tài

MỞ ĐẦU

Bacteriocin được xem là chất bảo quản thực phẩm chống thối hỏng có tiềm năng vì chúng có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn có hại gây thối hỏng rau củ quả và gây bệnh ở người Mặc dù có khả năng diệt khuẩn tốt nhưng bacteriocin lại không gây độc cho người và dễ dàng được tiêu hóa do bản chất của bacteriocin là các peptide ngắn Trong số các bacteriocin kháng khuẩn, nisin và enterocin được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm

Nisin là peptide được sinh ra từ vi khuẩn Lactococcus lactis đã được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi Do chủng L lactis là chủng an toàn nên nisin trên thị trường được sản xuất trực tiếp từ chủng gốc Ngược lại, enterocin lại thường được sinh ra từ các vi khuẩn

Enterococcus Vi khuẩn này không an toàn như L lactis vì chúng dễ thu nhận các gen từ vi

khuẩn gây bệnh khác kể cả gen mã hóa tính trạng kháng kháng sinh Vì vậy, xu hướng chung, các nhà khoa học trên thế giới đều muốn sản xuất được enterocin dạng tái tổ hợp để dùng trong bảo quản thực phẩm Vì vậy, trong Đề tài này, chúng tôi cũng Đề xuất hai hướng nghiên cứu và đã được Bộ Nông nghiệp cấp kinh phí để thực hiện đó là:

(1) Nghiên cứu sản xuất nisin từ chủng vi khuẩn phân lập được Hướng nghiên cứu này được thực hiện tại viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch (2) Nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm Hướng nghiên cứu này được thực hiện tại viện Công nghệ sinh học

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất enterocin tái tổ hợp

- Xây dựng quy trình ứng dụng nisin và enterocin trong bảo quản một số thực phẩm dạng sơ chế và chế biến

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Đề tài:

Thực phẩm tươi sống được bảo quản bằng nhiều cách nhưng phổ biến nhất vẫn là bằng hóa chất và phương pháp vật lý Nhiều loại hoá chất ảnh hưởng sâu sắc đến sức khoẻ

cộng đồng, gây dị ứng, rối loạn tiêu hóa Nisin và enterocin là các chất có tiềm năng sử dụng trong bảo quản nông sản thực phẩm đã được chứng minh là an toàn đối với sức khỏe con người Nisin đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ ở các nước trên thế giới Vì vậy, với mục tiêu nghiên cứu sản xuất nisin, enterocin dùng trong bảo quản thực phẩm, Đề tài đã góp phần giải quyết yêu cầu cấp bách về công nghệ bảo quản lương thực thực phẩm bằng chế phẩm sinh học an toàn ở nước ta

Các chủng giống tạo ra của đề tài là các chủng đã được công nhận là an toàn, có thể dùng trong thực phẩm và y dược

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về tình hình ngộ độc thực phẩm và vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm

Mặc dù con người đã sử dụng những công nghệ bảo quản thực phẩm mới và an toàn nhưng các ca ngộ độc thực phẩm vẫn không ngừng gia tăng Trong số các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, vi khuẩn là tác nhân phổ biến nhất, chiếm hơn hơn 90% Vi khuẩn

gây ngộ độc chủ yếu là Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, C

perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 [7] Do đó, an toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là bảo quản thực phẩm phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh [7] Từ tháng 1 đến tháng 7 năm 2008, Việt Nam có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 người mắc và 43 người tử vong Bởi vậy, việc tìm ra chất bảo quản thực phẩm an toàn là vô cùng quan trọng [1, 10] Trong những

năm gần đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm có liên quan đến L monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nước trên thế giới Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi khuẩn Listeria đã được Tổ chức y tế thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao Listeria phân

tán rộng rãi trong môi trường đất, nước, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm sang thực phẩm Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm như sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu [2]

Do đó, việc nghiên cứu để đưa vào sản xuất và ứng dụng các bacteriocin có khả năng ức

chế hoặc tiêu diệt Listeria là một yêu cầu cấp thiết

1.2 Một số phương pháp mới dùng trong bảo quản thực phẩm

Ngày nay một số phương pháp mới đã được sử dụng để bảo quản nông sản thực phẩm đó là phương pháp khử trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không,

sử dụng áp suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - các bacteriocin [7] Việc sử dụng bacteriocin một mình hoặc kết hợp với xử lý hoá lý và chất bảo quản hoá học là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn gây thối hỏng thực phẩm và gây bệnh cho người [5]

1.3 Tổng quan chung về bacteriocin

1.3.1 Bacteriocin

Bacteriocin là các protein được vi khuẩn tiết ra để tiêu diệt các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng gần [37, 44] Đây là điểm khác biệt quan trọng để phân biệt chúng với chất kháng sinh Vì là peptide nên bacteriocin bị phân cắt nhanh chóng trong dịch tiêu hóa

và không ảnh hưởng tới sức khỏe con người [6, 26] Gen mã hóa cho bacteriocin có thể

nằm trong hệ gen (như plantaricin A, sakacina 674), trên plasmid hoặc trên transposon (như nisin) [49] Tên của bacteriocin thường được đặt theo tên chi của vi khuẩn sinh ra bacteriocin và có tiếp tố “cin” để chỉ hoạt tính kháng khuẩn Ví dụ colicin được sinh ra từ

E coli, monocins từ L monocytogenes, subtilin được tạo ra bởi B subtilis, staphylocin từ

S aureus Các chữ cái ghi cùng tên của bacteriocin là chỉ số bacteriocin được tìm ra trong

cùng một loài vi khuẩn Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài

Lactobacilli [26]

Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp [49] Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn [10] Hiện nay, có hàng trăm loại bacteriocin đã được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau trong đó có cả bacteriocin được tìm thấy ở vi khuẩn

cổ (archaeocin) [44]

1.3.2 Phân loại bacteriocin

Bacteriocin có thể được phân loại theo đặc điểm cấu trúc hoặc khối lượng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất [41, 46] Riley et al (2007) đã chia bacteriocin thành hai nhóm: nhóm sinh ra từ vi khuẩn gram âm và nhóm sinh ra từ vi khuẩn gram dương Bacteriocin của vi khuẩn gram dương phong phú và đa dạng hơn ở vi khuẩn gram âm

Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein kích thước lớn được phân thành 3 nhóm: nhóm 1 - cholicin kích thước lớn (25-80 kDa), nhóm 2 - Các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 - bacteriocin gồm các tiểu đơn vị hợp thành [40]

Hiện nay có hơn 30 loại bacteriocin từ E coli đã được xác định [44]

Nisin là đại diện được nghiên cứu sớm nhất trong các bacteriocin sinh ra từ vi khuẩn gram dương [46] Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn gram dương là các peptit nhỏ, mang điện dương, kỵ nước hay lưỡng tính và thường không có thụ thể nhận biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trường hợp ngoại lệ) Quá trình tổng hợp và tiết bacteriocin ra ngoài tế bào khác nhau ở các bacteriocin khác nhau [41, 44] Theo Klaenhammer et al

1993 và Kemperman et al (2003a), bacteriocin từ vi khuẩn gram dương được chia thành

bốn lớp:

Lớp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các peptit bền nhiệt, tác

động lên cấu trúc màng ( có kích thước <5 kDa), chứa các axit amin hiếm, bị biến đổi sau dịch mã như lanthionin (Lan), α-methyllanthion, β-methyl lanthionin (MeLan),

dehydroalanin và dehydrobutyrin Lớp I còn được phân nhỏ hơn thành các lantibiotic loại

A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn [26, 40]

Lớp II - Bacteriocin <10 kDa gồm các bacteriocin peptit đa dạng về khối lượng

phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông thường (non-lantibiotic) Đây là lớp được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhất [44] Những peptit này được chia thành ba phân lớp đó là lớp IIa (cấu trúc tương tự như pediocin- có một trình tự liên ứng đầu N của

bacteriocin hoàn chỉnh - Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys, có hoạt tính diệt mầm bệnh L

monocytogenes hiệu quả) [26]; lớp IIb (bacteriocin có nhiều tiểu đơn vị); lớp IIc (các bacteriocin còn lại)

Lớp III - Bacteriocin kích thước lớn >10 kDa là các protein không bền nhiệt, trừ

propionicin SM1 từ Propinonibacterium jensenii Do đó, lớp này ít được ứng dụng trong

thực phẩm [44]

Lớp IV - Các bacteriocin vòng là lớp đặc biệt gồm các bacteriocin có cấu trúc

vòng (Bảng 1.2) Đây là các peptit được biến đổi sau dịch mã bằng liên kết cộng hoá trị nội phân tử tạo cấu trúc vòng cho peptit trưởng thành Đến nay, khoảng 8 peptit trong lớp này được nghiên cứu nhiều trong đó có enterocin AS-48 [44, 47]

1.3.3 Ứng dụng của bacteriocin

1.3.3.1 Bảo quản nông sản thực phẩm

Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm là làm tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do thực phẩm hư hỏng, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như xử lý nhiệt Bacteriocin giúp duy trì giá trị dinh dưỡng và vitamin của sản phẩm, cung cấp những thực phẩm mới (ít axit, hàm lượng muối thấp và hàm lượng nước cao) thỏa mãn nhu cầu của công nghiệp và người tiêu dùng [37] Xu hướng trong công nghiệp chế biến thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia, chất hóa học nhân tạo, hạn chế quá trình chế biến nhưng phải đảm bảo

an toàn, giữ nguyên chất lượng Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin [19, 26]

Bacteriocin có các đặc điểm lý tưởng trong bảo quản thực phẩm Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng Các bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như những protein khác trong thức ăn [41] Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ảnh hưởng không đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn rộng hoặc hẹp tùy theo bacteriocin, chúng tác động lên nhiều mầm bệnh và vi khuẩn gây hỏng thực phẩm [19] Một số bacteriocin phát huy được hiệu quả tốt hơn hẳn khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng

khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn khác Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngừa sự phát triển của những chủng kháng Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như áp suất cao hay xung điện giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với những vi khuẩn có khả năng sống sót cao như bào tử Hiệu quả bảo quản thực phẩm của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như hệ vi khuẩn có trong thực phẩm Thực phẩm phải được xem như là hệ sinh thái ở đó tồn tại cả vi khuẩn có lợi và vi khuẩn gây thối hỏng Sự tương tác giữa các vi khuẩn này có thể ảnh hưởng đến sự cân bằng vi sinh Do đó, cần xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi loại thực phẩm [26]

Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới ba dạng chính [10]:

- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic - LAB: Lactic acid bacteria) để

tạo bacteriocin in situ Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin

trong sản phẩm sẽ quyết định khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm;

- Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm;

- Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin trong quá trình chế biến thực phẩm

Hiện nay, các nhà khoa học còn hướng tới việc tạo màng polythen hoạt tính có gắn bacteriocin để đóng gói thực phẩm [10]

1.3.3.2 Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

Do nisin có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn gram dương nên chúng được sử

dụng trong ngăn ngừa chứng viêm vú ở gia súc Hiện nay, mutacin sinh ra từ S mutans

biến đổi di truyền được sử dụng trong sản phẩm chăm sóc sức khỏe răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng để ức chế sâu răng và cao răng Bacteriocin có trong xà phòng,

mỹ phẩm giúp loại trừ mụn [26, 40]

Các bacteriocin gần đây cũng được ứng dụng trong lĩnh vực y tế Do vi sinh vật đang tăng dần tính kháng kháng sinh nên các liệu pháp trong điều trị chống lại bệnh nhiễm trùng sẽ trở nên vô hiệu Bacteriocin có thể là một giải pháp giúp điều trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc [41] Ưu điểm của bacteriocin trong lĩnh vực y tế

đó là enterocin là sản phẩm tự nhiên, sinh ra từ “vi khuẩn có lợi, an toàn” và không ảnh hưởng tới sức khỏe Các chủng probiotic và các chủng tạo bacteriocin có khả năng bảo vệ đường tiêu hóa chống lại vi khuẩn gây bệnh [10, 26]

1.3.3.3 Các dấu chuẩn trong vector

Với mục đích khoa học, các gen kháng kháng sinh đang được sử dụng như là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc những thể biến nạp [49, 53] Tuy nhiên, các dấu chuẩn này không được chấp nhận khi tạo chủng sử dụng cho thực phẩm, y tế Do đó, các gen mã hóa bacteriocin có thể được sử dụng như là dấu chuẩn chọn lọc thay thế, tạo vector tách dòng

an toàn để có thể ứng dụng trong thực phẩm và y tế [26]

1.3.4 Tiêu chuẩn để thương mại hóa bacteriocin

Tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải là chủng GRAS (Generally regarded as safe - được đánh giá là những vi sinh vật an toàn) [49]

Tính kháng khuẩn: Bacteriocin phải ức chế được sự sinh trưởng của các mầm bệnh

và vi khuẩn gây hỏng như L monocytogenes và C botulinum hay có hoạt tính chống lại

một mầm bệnh đặc hiệu nhưng không ức chế sinh trưởng của các giống khởi động khác [10, 37] Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính cao để bảo quản thực phẩm Hiện nay

mới có hai bacteriocin được thương mại hóa đó là nisin từ L lactis và pediocin PA-1/AcH

từ P acidilactici Các bacteriocin phổ hẹp có thể được dùng để ức chế đặc hiệu cao với vi khuẩn gây hại nguy hiểm như L monocytogenes [26]

1.4 Các bacteriocin được nghiên cứu trong đề tài

1.4.1 Nisin

1.4.1.1 Nisin và một số tính chất của nisin

Nisin là một peptide kỵ nước gồm 34 axit amin trong đó có một số axit amin đã cải biến, có khối lượng phân tử là 3488 Da Các axit amin được cải biến đó là dehydroalanin

và dehydrobutyrin được tạo ra bằng cách khử hydro trong phân tử axit amin Các axit amin này liên kết với các axit amin khác thông qua cầu lưu huỳnh, tạo thành 5 vòng đặc trưng (Hình 1.1) Phân tử nisin không chứa axit amin thơm nên hấp thụ ở bước sóng 280 nm [11] Các axit amin được cải biến đóng vai trò như nhóm ái nhân giúp cho bacteriocin xâm nhập vào màng tế bào đích Có ít nhất 6 loại nisin đã được nghiên cứu sâu về tính chất ( ký hiệu bằng các ký tự từ A đến E và Z), trong đó dạng A là dạng hoạt động mạnh nhất [28]

Khả năng tan: nisin là một peptit mang điện tích dương nên mức độ hoà tan của nisin

phụ thuộc rất nhiều vào pH pH càng thấp thì khả năng tan càng tốt Nisin hoà tan tốt nhất

ở pH2 (5,7 mg/ml) và giảm nhanh ở pH6 (1,5 mg/ml), pH8 ( 0,25 mg/ml) Hầu như nisin không tan trong môi trường trung tính hoặc kiềm Ngoài ra, mức độ hòa tan của nisin còn phụ thuộc vào dung dịch đệm

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Nisin A ( theo Gross et.al 1971 )

Tính bền nhiệt: nisin là một bacteriocin bền nhiệt Ở nhiệt độ thấp từ 4-10oC hoạt tính nisin hầu như không thay đổi trong một thời gian dài Khi xử lý ở 30-60oC trong 30 phút, hoạt tính nisin vẫn duy trì 80-90% hoạt tính ban đầu Tuy nhiên, khi xử lý ở nhiệt độ cao hơn (từ 80oC trở lên), hoạt tính bắt đầu giảm mạnh Ở 100oC, hoạt tính nisin còn 50% khi xử lý 60 phút

1.4.1.2 Khả năng diệt khuẩn của nisin

Khả năng diệt vi khuẩn Gram dương

Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram dương gồm

những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B cereus,

Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L monocytogens, L innocua, L grayi, L ivanovii, L murrayi, L seeligeri, L welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium Giá trị quan trọng của nisin đối với việc bảo quản thực phẩm được thể

hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử như là Clostridium và Bacillus là tác

nhân chính gây thối thực phẩm Theo Campeel, chỉ cần một lượng 0,03 ppm nisin trong

sản phẩm là đủ ức chế sự phát triển bào tử chịu nhiệt B subtilis

Khả năng diệt vi khuẩn Gram âm

Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ

EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella [50] Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella, Klebsiella, E

coli [35] Nisin sinh ra từ chủng L lactis ST 34BR phân lập từ bia đại mạch có hoạt tính

kháng vi khuẩn gram âm như E coli, P aeruginosa và vi khuẩn Gram dương như L

plantarum, L casei, S aureus [51]

Khả năng diệt nấm mốc

Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi sinh

vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus [39]

Tác dụng của nisin lên nấm men

Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ 50 IU/g đã kéo dài thời gian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày Các vi sinh vật chiếm ưu thế trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể [34]

1.4.1.3 Cơ chế hoạt động của nisin

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng nisin tác động lên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm qua hai bước chính: bám trên thành tế bào vi khuẩn thông qua ái lực sau đó xâm nhập qua thành tế bào vào màng nguyên sinh chất nhờ khuếch tán và tạo thành lỗ nhỏ trên màng nguyên sinh chất Bằng cách này, nisin gây thoát các phân tử, ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển proton PMF, ảnh hưởng tới sinh tổng hợp ATP, dẫn tới

sự chết tế bào

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nisin

Hoạt tính của nisin trong thực phẩm phụ thuộc vào một số yếu tố như khả năng tích điện, độ hòa tan và một số yếu tố trong thực phẩm

Tính đồng nhất của thực phẩm có thể ảnh hưởng đến khả năng khuyếch tán của nisin

và khả năng bảo quản thực phẩm đó Nisin hoạt động tốt trong môi trường lỏng hơn là môi trường rắn Nisin ức chế vi khuẩn ở trong dịch nuôi cấy tốt hơn là trong thực phẩm

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự khuyếch tán của nisin bao gồm pH, nồng độ muối, nitrat, nitrit, pha huyền phù, thành phần chất béo, protease, nồng độ đường, thành phần chất sinh trưởng Chất phụ gia thực phẩm có thể làm tăng khả năng hoạt động của nisin, bảo vệ phân tử trong quá trình xử lý nhiệt

Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính nisin đó là nhiệt độ, áp suất thẩm thấu Sự thay đổi áp suất, nhiệt độ của thực phẩm cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của nisin

1.4.1.5 Sử dụng nisin trong bảo quản nông sản thực phẩm

Nisin được thương mại đầu tiên ở Anh năm 1953 Ngày nay, nisin là một sản phẩm được FDA phê chuẩn, được WHO công nhận an toàn [49] và bán dưới dạng bột sấy khô -

từ sữa tách bơ qua quá trình lên men Nisaplin là sản phẩm nisin thương mại, được sử dụng trên hơn 50 nước như là một chất phụ gia thực phẩm, chủ yếu trong chế biến phomat,

và sản phẩm sữa FAO/WHO đồng ý cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969

Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại dùng cho thực phẩm là nisin từ L

lactis và pediocin PA-1/AcH từ P acidilactici với tên thương mại tương ứng là

NisaplinTM, ALTATM [10]

Nisin được sản xuất từ chủng L lactis tự nhiên Mức độ an toàn của nisin đã được

thử nghiệm trên hai loài động vật là chuột và lợn với liều dùng là 7 g/kg trọng lượng của

cơ thể Kết quả khẳng định nisin không gây độc mà chỉ ảnh hưởng rất ít trên động vật này [3, 11]

Hiện nay nisin được sử dụng vào bảo quản thực phẩm theo các hướng: bổ sung vi khuẩn sinh nisin; bổ sung nisin tinh khiết hoặc bán tinh khiết; bổ sung sản phẩm được lên men bởi vi khuẩn sinh nisin vào thực phẩm hoặc trong quá trình chế biến thực phẩm Nisin được dùng bảo quản các loại thực phẩm như thịt và các sản phẩm từ thịt, sữa, các sản phẩm

đồ hộp và các sản phẩm lên men

1.4.1.6 Tình hình nghiên cứu nisin trong nước

Ở Việt nam, việc nghiên cứu tìm kiếm chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học- bacteriocin đã bắt đầu từ vài năm nay do nhóm tác giả Lê Thanh Bình -Viện Công nghệ sinh học, Nguyễn Thuỳ Châu -Viện cơ điện Nông nghiệp và công nghệ Sau thu hoạch, Viện Di truyền và Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Viện Công nghệ thực phẩm…thực hiện Hầu hết các hướng nghiên cứu đều tập trung đi sang lọc, tuyển chọn, xác định đặc tính chủng giống và bacteriocin của chúng Phạm Ngọc Lan và cộng sự- Viện

cộng nghệ sinh học đã phân lập được chủng Tn 143 có tác dụng ức chế sự phát triển của B

subtilis, B cereus, Samonella Phan Khánh Hoa-Viện Công nghiệp thực phẩm đã nghiên

cứu khả năng sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn L lactis Ngoài ra một số nhóm còn nghiên

cứu phổ tác động của nisin với các vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc Ngoài ra, một số hướng nghiên cứu cao hơn đã được tiến hành như sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm Bên cạnh đó, có những nhóm nghiên cứu đã nhập khẩu nisin để bảo quản một số thực phẩm như sữa, nước mắm, cá, dung dịch trứng

1.4.2 Enterocin

Enterocin là bacteriocin được sinh ra từ chủng Enterococci Đây là chủng có khả

năng thu nhận gen cao đặc biệt là các gen kháng kháng sinh từ vi sinh vật khác và có khả năng truyền gen này sang các chủng gây bệnh ở ngoài môi trường Vì vậy, nó được xem là chủng không an toàn cho thực phẩm Bacteriocin sinh ra từ các chủng này được gọi là các enterocin hay enterococcin và hầu hết thuộc về lớp II Các enterocin được tinh chế và xác

định di truyền nhiều năm nay đều từ E faecalis và E faecium [40] Điều thú vị là enterocin

có khả năng chống lại các Enterococci khác, LAB, L monocytogenes, S aureus và

Clostridium spp (gồm C botulinum, C perfringens và C tyrobutyricum) [42] Hoạt tính

kháng Listeria có thể được giải thích bởi thực tế rằng Enterococci và Listeria có quan hệ

gần về mặt phát sinh Enterocin có tính bền với nhiệt độ cao và khoảng pH hoạt động rộng

[15] Đặc biệt, enterocin CRL35 có hoạt tính ức chế thậm chí cả virus Herpes simplex [17]

1.4.2.1 Đặc điểm phân tử, khả năng diệt khuẩn của enterocin AS-48

Đặc điểm phân tử, di truyền

Enterocin AS-48 đã được nghiên cứu hơn 20 năm qua Đây là peptide dạng vòng điểm

hình, được tinh sạch đầu tiên từ E faecalis [17, 40, 42, 48] Enterocin AS-48 được mã hóa bởi

plasmid đáp ứng pheromon pMB2 kích thước 68 kb [47] Locus tổng hợp AS-48 là một cụm (14,8

kb) gồm 10 gen as-48ABCC 1 DD 1 EFGH tham gia trong quá trình sản xuất enterocin AS-48 và tạo

tính miễn dịch Gen cấu trúc as-48A, mã hoá một pre-peptit 105 axit amin chứa một đoạn peptit

dẫn đầu gồm 35 axit amin [14] Peptide này được loại bỏ trong quá trình tiết để tạo AS-48 trưởng thành [47] Trong tự nhiên, AS-48 được biểu hiện kèm theo một peptit miễn dịch Peptit này có tác dụng bảo vệ tế bào chủ khỏi ảnh hưởng của AS-48 [44].

Hình 1.2 Cấu trúc bậc hai của enterocin AS-48

Enterocin AS-48 trưởng thành có cấu trúc phân tử gồm 70 axit amin (khối lượng phân tử là 7,1 kDa) trong đó tỷ lệ các axit amin dạng kỵ nước chiếm 49% Các axit amin đều không chứa gốc lanthionin, β-methyllanthionin và dehydrat nên khác biệt hẳn so với nhóm lantibiotic [20, 47]

Cấu trúc đơn phân của AS-48 gồm năm chuỗi xoắn kép α liên kết với nhau bởi các vùng nối ngắn, vòng xung quanh một cấu trúc rất vững chắc - lõi kị nước tạo thành một cuộn hình cầu [47] H1, H2 và H3 tạo nên bề mặt kỵ nước bao bên ngoài phân tử AS-48 [47] AS-48 tạo cấu trúc bậc ba bằng cách nối axit amin tận cùng đầu N với axit amin tận cùng đầu C (giữa Met1 và Trp70) trong vùng xoắn H5 để tạo thành phân tử dạng vòng Chính dạng cấu trúc này đã làm phân tử ổn định cấu trúc không gian và rất bền nhiệt (nhiệt

độ biến tính là 102oC) [20, 38, 44] AS-48 có 14 gốc mang điện (8 Lys, 2 Arg và 4 Glu) giúp phân tử mang điện dương mạnh (pI 10,5) Các gốc này chủ yếu nằm trong H4 và trong vùng nối giữa H4 và H5 Các gốc này ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng khuẩn của AS-48 bằng cách thúc đẩy quá trình hình thành lỗ trên màng tế bào [20] Tổng điện thế dương

tăng cao (từ +6 lên +10) tại pH 3 giúp cho sự ổn định dạng monomer trong dung dịch [47, 46]

Hoạt tính của AS-48 phụ thuộc pH và trạng thái oligomer hóa của protein Mức độ liên kết của enterocin AS-48 trong dung dịch khác nhau tùy theo môi trường hóa lý [46]

Hình 1.3 Cơ chế xuyên màng của AS-48

a) DF-II và phân tử photpho lipit; b) DF-I, DF-II và xuyên màng

Khả năng diệt khuẩn của AS-48

Đích tấn công của AS-48 là màng tế bào chất của vi khuẩn Chúng dung hợp với màng tế bào để hình thành các lỗ hay kênh có đường kính khoảng 7Ao, phá vỡ điện thế màng và tiêu hao lực proton PMF (do kênh vận chuyển tích cực ngừng hoạt động và AS-48 mang điện tích dương với màng mang điện âm) [38, 47] Điều này làm tăng quá trình thẩm thấu không phụ thuộc điện thế màng, tăng tính thấm màng cho các ion và các phân tử nhỏ, dẫn đến giải phóng các bào quan trong tế bào chất ra ngoài, phân giải tế bào đích [6, 7] AS-48 tồn tại ở hai dạng cấu trúc liên kết DF-I và D-II (Dimeric form) (Hình 1.3) Dạng này tích điện cao hơn so với dạng đơn phân (monomer), do đó khả năng hòa tan trong dung dịch lớn hơn Quá trình tác động gồm sự chuyển dịch từ dạng DF-I hòa tan trong nước thành dạng gắn màng DF-II [47] Dạng DF-I trong dung dịch có 85% vùng bị che lấp tương tác với các gốc kỵ nước Dạng gắn màng DF-II cô lập phần kỵ nước của AS-48 - chôn vùi vào trong màng, phần ưa nước tiếp xúc với dung môi (H4, H5 ưa nước tương tác với nhau còn H1, H2 và H3 kỵ nước) Sự sắp xếp lại trong cấu trúc không gian giữa các chuỗi xoắn kép chuyển AS-48 từ dạng hòa tan trong nước DF-I sang dạng gắn màng DF-II

Sự chuyển dịch này dẫn đến sự quay 90o của mỗi đơn phân protomer trong DF-I, làm các chuỗi xoắn kép kỵ nước bị che khuất một phần H1, H2 (thời điểm lưỡng cực mạnh mẽ của DF-I giúp AS-48 tiếp cận với màng) để dung môi có thể tới được Trạng thái này cho phép

Enterocin AS-48 có hoạt tính kháng khuẩn rộng gồm vi khuẩn gram dương

và gram âm [37, 44] Trong đó, các vi khuẩn gram âm như E coli, Myxococcus

spp., Agrobacterium spp., Salmonella cholerasuis và Shigella sonnei bị ức chế ở

nồng độ bacteriocin cao hơn so với các vi khuẩn gram dương gây bệnh Đến nay,

chưa có bacteriocin nào khác từ LAB được biết có phổ ức chế rộng như thế

1.4.2.2 Đặc điểm cấu trúc sinh học, khả năng kháng khuẩn và những nghiên cứu biểu hiện Enterocin P

Đặc tính sinh học của enterocin P

Enterocin P là peptide ngoại bào, được vi khuẩn E faecium P13 tổng hợp ở

ribosome Với phổ hoạt động rộng, enterocin P có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn

gram (+) gây bệnh như S aureus, C perfringens, C botulinum đặc biệt là các chủng L

monocytogenes Enterocin P khá bền nhiệt Chúng có thể duy trì hoạt tính ở 100oC trong

60 phút hay ở 121oC trong 15 phút Ngoài ra EntP có khoảng pH hoạt động khá rộng, từ 2 đến 11 và có hoạt tính ổn định trong thời gian dài khi bảo quản ở 4oC hoặc -20oC [8]

Cấu trúc gen

Các gen chịu trách nhiệm cho quá trình tổng hợp tạo ra enterocin P được tổ chức thành một operon Operon này gồm hai khung đọc mở liên tiếp (Hình 1.4) Khung đầu tiên

là gen cấu trúc entP (structural gene) mã hoá cho chuỗi peptide gồm 71 axit amin 27 axit

amin đầu tiên là peptit tín hiệu đầu N đặc thù kị nước, 44 axit amin tiếp theo là enterocin P trưởng thành Bacteriocin này được tổng hợp dưới dạng tiền peptide Peptide tín hiệu bị cắt

bỏ tại vị trí sau nhóm axit amin Val-Asp-Ala để tạo ra EntP trưởng thành có hoạt tính sinh học gồm 44 axit amin với khối lượng phân tử tính theo lý thuyết là 4,493 kDa Khung đọc

mở 2 mã hóa cho peptit miễn dịch

Hình 1.4 Trình tự gen và axit amin tương ứng của entP và gen miễn dịch

Khung đọc mở thứ nhất (gen entP) mã hoá cho chuỗi tiền EntP gồm 71 axit amin Khung

đọc thứ hai (orf2) mã hóa cho 88 axit amin của peptide miễn dịch Ngay sau nhóm axit amin V-D-A là vị trí cắt đặc hiệu của enzym cắt chuỗi tín hiệu signal peptidase (mũi tên)

để tạo ra enterocin P trưởng thành Tương ứng với mỗi khung đọc mở có một vị trí nhận biết của ribosome (RBS) cho quá trình dịch mã

Cấu trúc không gian

EntP thuộc bacteriocin lớp IIa Cấu trúc không gian của bacteriocin lớp này đã được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [17, 24] Trong môi trường gần giống màng tế bào (membrane-mimicking environment) với sự có mặt của micelle và liposome chúng mới có cấu trúc rõ ràng: vùng đầu N và vùng đầu C [12]

Vùng đầu N tích điện (+) chứa nhóm YGNGV bảo thủ cao Vùng này chứa hai gốc cystein tham gia vào việc hình thành nên cầu nối disunfit Vùng N có cấu trúc phiến gấp nếp β Đầu C hình thành một hoặc hai cấu trúc xoắn α, theo sau là đuôi C với chiều dài có thể thay đổi [12] Ở hầu hết các bacteriocin, đuôi C này sẽ gập vào vùng C trước nó, do đó hình thành nên cấu trúc kẹp tóc [29] Vùng C có vai trò quan trọng quyết định tính đặc hiệu với tế bào đích [12, 15]