Nghiên cứu đề xuất giải pháp khả thi phòng, chống hiện tượng bùng phát vi tảo trong đầm nuôi tôm sú thâm canh

BỘ NÔNG NGHỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM CHƯƠNG TRÌNH PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC THỦY SẢN ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP

BỘ NÔNG NGHỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

CHƯƠNG TRÌNH PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRONG LĨNH VỰC THỦY SẢN ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

ĐÁNH GIÁ NHANH SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI TẢO LAM ĐỘC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ NGHIÊN CỨU ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP KHẢ THI PHÒNG,

CHỐNG HIỆN TƯỢNG BÙNG PHÁT VI TẢO TRONG ĐẦM NUÔI TÔM SÚ THÂM CANH

Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện Công nghệ môi trường - Viện KH & CN VN

Chủ nhiệm đề tài/dự án:

ThS Nguyễn Sỹ Nguyên

9148

DON Dissolved Organic Nitrogen

DOP Dissolved Organic Phosphorus DIN Dissolved Inorganic Nitrogen

DIP Dissolved Inorganic Phosphorus

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long

FCR Food Conversion Ratio

HPLC High-Performance Liquid Chromatography MCs Microcystin

TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam

TOC Total Organic Carbon

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Ảnh hưởng một số loài tảo trong nuôi trồng thuỷ sản … 11

Bảng 1.2 Độc tố VKL và các sinh vật tạo ra nó ……… 14

Bảng 2.1 Mồi, thành phần và điều kiện phản ứng PCR ………… 41

Bảng 3.1.5.1 Thành phần TVPD trong các ao nuôi tôm tại Bạc Liêu … 98 Bảng 3.1.5.2 Thành phần TVPD trong các ao nuôi tôm tại Sóc Trăng 103

Bảng 3.2.1 So sánh thời gian thực hiện của 2 qui trình đánh giá sự xuất hiện của VKL độc tiềm tàng trong điều kiện phòng thí nghiệm ……… 127

Bảng 3.3.1 Mối tương quan Pearson giữa các yếu tố môi trường năm 2008 ……… 150

Bảng 3.3.2 Mối tương quan Pearson giữa các yếu tố môi trường năm 2009 ……… 153

Bảng 3.4.2.1 Điều kiện tự nhiên ao nuôi thâm canh tôm sú 177

Bảng 3.4.2.2 Một số hiện tượng bệnh thường gặp của tôm nuôi, nguyên nhân và cách xử lý 181

Bảng 3.4.2.3 Mức độ cảnh báo và hành động đáp ứng 183

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc gen mã hoá độc tố microcystin ……… 15

Hình 1.2 Ba phương thức sinh trưởng khác nhau của phytoplankton và tỷ lệ N:P tế bào ……… 29

Hình 2.1 Các ao nuôi tôm tại Bạc Liêu và Sóc Trăng ……… 34

Hình 2.2 Quy trình phân lập vi tảo trong phòng thí nghiệm ………… 39

Hình 3.1.2.1 Biến động nhiệt độ tại các ao nuôi tôm năm 2008 ………… 50

Hình 3.1.2.2 Biến động nhiệt độ tại các ao nuôi tôm năm 2009 ………… 51

Hình 3.1.2.3 Biến động pH tại các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 52

Hình 3.1.2.4 Biến động pH tại các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 53

Hình 3.1.2.5 Biến động độ mặn trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 54

Hình 3.1.2.6 Biến động độ mặn trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 55

Hình 3.1.2.7 Biến động CĐAS trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 56

Hình 3.1.2.8 Biến động CĐAS trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 56

Hình 3.1.2.9 Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 57

Hình 3.1.2.10 Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 58

Hình 3.1.2.11 Biến động độ kiềm trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 59

Hình 3.1.2.12 Biến động độ kiềm trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 60

Hình 3.1.2.13 Biến động hàm lượng Chlorophyll a trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 61

Hình 3.1.2.14 Biến động hàm lượng Chlorophyll a trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 62

Hình 3.1.2.15 Biến động hàm lượng Fe tổng trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 64

Hình 3.1.2.16 Biến động hàm lượng Fe tổng trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 64

Hình 3.1.2.17 Biến động hàm lượng Silicat trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 65

Hình 3.1.2.18 Biến động hàm lượng Silicat trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 66

Hình 3.1.2.19 Biến động hàm lượng COD trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 67

Hình 3.1.2.22 Biến động hàm lượng BOD trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 69

Hình 3.1.2.23 Biến động hàm lượng DIN trong các ao nuôi tôm năm 2008 70 Hình 3.1.2.24 Biến động hàm lượng DIN trong các ao nuôi tôm năm 2009 70 Hình 3.1.2.25 Biến động hàm lượng DON trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 72

Hình 3.1.2.26 Biến động hàm lượng DON trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 73

Hình 3.1.2.27 Biến động hàm lượng PON trong các ao nuôi tôm năm 2008 74 Hình 3.1.2.28 Biến động hàm lượng PON trong các ao nuôi tôm năm 2009 75 Hình 3.1.2.29 Biến động hàm lượng DIP trong các ao nuôi tôm năm 2008 76 Hình 3.1.2.30 Biến động hàm lượng DIP trong các ao nuôi tôm năm 2009 76 Hình 3.1.2.31 Biến động hàm lượng DOP trong các ao nuôi tôm năm 2008 77 Hình 3.1.2.32 Biến động hàm lượng DOP trong các ao nuôi tôm năm 2009 78 Hình 3.1.2.33 Biến động hàm lượng PP trong các ao nuôi tôm năm 2008 79

Hình 3.1.2.34 Biến động hàm lượng PP trong các ao nuôi tôm năm 2009 79

Hình 3.1.2.35 Biến động độ đục trong các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 80

Hình 3.1.2.36 Biến động độ đục trong các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 81

Hình 3.1.3.1 Biến động độ ẩm trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2008 82 Hình 3.1.3.2 Biến động độ ẩm trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2009 83 Hình 3.1.3.3 Biến động hàm lượng T-N trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 83

Hình 3.1.3.4 Biến động hàm lượng T-P trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 84

Hình 3.1.3.5 Biến động hàm lượng T-N trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 85

Hình 3.1.3.6 Biến động hàm lượng T-P trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 86

Hình 3.1.3.7 Biến động hàm lượng TOC trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 87

Hình 3.1.3.8 Biến động hàm lượng TOC trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 87

Hình 3.1.3.9 Biến động hàm lượng sắt tổng trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2008 ……… 88

Hình 3.1.3.10 Biến động hàm lượng sắt tổng trong trầm tích các ao nuôi tôm năm 2009 ……… 88 Hình 3.1.3.11 Biến động hàm lượng silicat trong trầm tích các ao nuôi tôm

năm 2009 ……… 90 Hình 3.1.3.13 Biến động hàm lượng H2 S trong trầm tích các ao nuôi tôm

năm 2008 ……… 91 Hình 3.1.3.14 Biến động hàm lượng H2 S trong trầm tích các ao nuôi tôm

năm 2009 ……… 92 Hình 3.1.4.1 Biến động tổng số VK hiếu khí trong nước ao nuôi tôm năm 2008 và 2009 ……… ……… 93 Hình 3.1.4.2 Biến động Vibrio tổng số trong nước ao nuôi tôm năm 2008 và 2009 ……… ……… 93 Hình 3.1.4.3 Biến động tổng số VK kỵ khí sinh Htôm năm 2008 và 2009………… ……… 94 2S trong nước ao nuôi Hình 3.1.4.4 Biến động tổng số VK hiếu khí trong trầm tích ao nuôi tôm năm 2008 và 2009 ……… ……… 96 Hình 3.1.4.5 Biến động Vibrio tổng số trong trầm tích ao nuôi tôm năm 2008 và 2009 ……… 96 Hình 3.1.4.6 Biến động tổng số VK kỵ khí sinh H2 S trong trầm tích ao

nuôi tôm năm 2008 và 2009 ……… 97 Hình 3.1.5.1 Biến động thành phần loài hiện diện tại các ao nuôi tôm ở Sóc Trăng trong vụ tôm năm 2008 và 2009 ……… 107Hình 3.1.5.2 Biến động thành phần loài hiện diện tại các ao nuôi tôm ở Bạc Liêu trong vụ tôm năm 2008 và 2009 ………. 107Hình 3.1.5.3 Số loài TVPD quan trắc được trong các ao nuôi tôm tại Sóc

Trăng và Bạc Liêu ……… 108

Hình 3.1.5.4 Tỉ lệ thành phần TVPD trong các ao nuôi tôm tại ST và BL 108

Hình 3.1.5.5 Mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại BL năm 2008 …… 110 Hình 3.1.5.6 Mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại BL năm 2009 …… 110

Hình 3.1.5.7 Mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại ST năm 2008 …… 111

Hình 3.1.5.8 Mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại ST năm 2009 …… 112 Hình 3.1.5.9 Mật độ TVPD trung bình trong các ao tôm tại ST và BL 2008 – 2009 ……… 113Hình 3.1.5.10 Tỉ lệ mật độ tế bào đối với các ngành TVPD 2008 -2009 … 113

Hình 3.2.1 Một số chủng vi tảo phân lập được từ các đầm ao nuôi tôm tại ST và BL ……… 119Hình 3.2.2 So sánh trình tự của các mẫu nghiên cứu với các trình tự trong ngân hàng gen 125

Hệ số tương quan của gen mcyA trong các mẫu nghiên cứu

trong các môi trường khác nhau ……… 129

Hình 3.3.2 Đường cong sinh trưởng của chủng O.cf.limosa trong các môi trường khác nhau ……… 129

Hình 3.3.3 Nghiên cứu thử nghiệm các môi trường sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm ……… 130

Hình 3.3.4 Đồ thị mối liên hệ giữa mật độ tế bào và mật độ quang của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii và O cf.limosa 131 Hình 3.3.5 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên hàm lượng Chl a của VKL G cf lemmermanii ……… 132

Hình 3.3.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên hàm lượng Chl.a của VKL Oscillatoria sp1 ……… 133

Hình 3.3.7 Ảnh hưởng của pH lên hàm lượng Chl a của VKL G cf lemmermanii ……… 134

Hình 3.3.8 Ảnh hưởng của pH lên hàm lượng Chl.a của VKL Oscillatoria sp1 ……… 135

Hình 3.3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng Chl a của VKL G cf lemmermanii ……… 136

Hình 3.3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng Chl.a của VKL Oscillatoria sp1 ……… 137

Hình 3.3.11 Ảnh hưởng của nồng độ P lên sinh trưởng của VKL G cf lemmermanii ……… 138

Hình 3.3.12 Ảnh hưởng của nồng độ P lên sinh trưởng của VKL O.cf.limosa ……… 139

Hình 3.3.13 Ảnh hưởng của tỉ lệ N/P lên sinh trưởng của chủng VKL G.cf lemmermanii ……… 141

Hình 3.3.14 Ảnh hưởng của tỉ lệ N/P lên sinh trưởng của chủng VKL O.cf limosa ……… 142

Hình 3.3.15 Ảnh hưởng của nồng độ Fe lên sự sinh trưởng của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii ……… 143

Hình 3.3.16 Ảnh hưởng của tỉ lệ P/Fe lên sự sinh trưởng của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii ……… 144

Hình 3.3.17 Ảnh hưởng của tỉ lệ N/Fe lên sự sinh trưởng của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii ……… 145

Hình 3.3.18 Phân tích hợp phần chính dựa trên các thông số thủy lý, thủy hóa trong ao nuôi tôm năm 2008 ……… 148

Hình 3.3.19 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường trong ao nuôi năm 2008 ……… 151

Hình 3.3.20 Phân tích hợp phần chính dựa trên các thông số thủy lý, thủy hóa trong ao nuôi tôm năm 2009 ……… 152

Hình 3.3.22 Hàm lượng POtại Sóc Trăng và Bạc Liêu ……… 43- trong trầm tích các ao nuôi tôm thâm canh 155Hình 3.3.23 Mối liên hệ giữa hàm lượng Chl.a và tỷ lệ DIN/DIP trong các ao nuôi năm 2008 ……… 156Hình 3.3.24 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường trong ao nuôi (giới hạn lại một số yếu tố có tương quan với Chl.a) ……… 157Hình 3.3.25 Mối liên hệ giữa hàm lượng Chl.a và tỷ lệ DIN/DIP trong các ao nuôi năm 2009 ……… 158Hình 3.4.1 Khống chế bùng phát vi tảo Geitlerinema cf lemmermannii thông qua điều chỉnh các yếu tố pH, ánh sáng và độ mặn … 161Hình 3.4.2 Khống chế bùng phát VKL Geitlerinema cf lemmermanii

bằng hóa chất diệt tảo Alga-stop ở mô phòng thí nghiệm … 162 Hình 3.4.3 Khống chế bùng phát VKL Geitlerinema cf lemmermanii

bằng polymer sinh học ở qui mô phòng thí nghiệm ……… 163 Hình 3.4.4 Khống chế bùng phát vi tảo Geitlerinema cf lemmermanii

thông qua điều chỉnh yếu tố ánh sáng ở qui mô pilốt ……… 164 Hình 3.4.5

Dao động giá trị pH của thí nghiệm khống chế bùng phát vi

tảo Geitlerinema cf lemmermanii thông qua điều chỉnh yếu

tố ánh sáng ở qui mô pilốt ……… 165 Hình 3.4.6

Dao động giá trị nhiệt độ của thí nghiệm khống chế bùng

phát vi tảo Geitlerinema cf lemmermanii thông qua điều

chỉnh yếu tố ánh sáng ở qui mô pilốt ……… 165 Hình 3.4.7 Khống chế bùng phát VKL Geitlerinema cf lemmermanii bằng chất diệt tảo Alga-Stop ở qui mô pilot ……… 166Hình 3.4.8 Khống chế bùng phát VKL Geitlerinema cf lemmermanii

bằng polymer sinh học ở qui mô pilot ……… 167 Hình 3.4.9

Ảnh hưởng của tỉ lệ dinh dưỡng P/Fe, N/Fe, N/P lên tăng

trưởng của VKL Geitlerinema cf lemmermanii ở qui mô

pilot ……… 168

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIẸU ……… 5

1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trường nuôi tôm thâm canh …… 5

1.2 Sinh trưởng của các loài tảo độc, hại và ảnh hưởng của chúng tới năng suất, chất lượng thuỷ sản ……… 9

1.3 Áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu giám sát và đánh giá nhanh hiện diện của vi tảo độc ……… 12

1.3.1 Vi khuẩn lam độc và độc tố ……… 13

1.3.2 Vai trò của gen mã hoá độc tố microctystin trong việc phát hiện vi khuẩn lam gây độc thuộc chi Microcystis bằng kỹ thuật sinh học phân tử ……… 17

1.4 Mối quan hệ giữa sinh trưởng của vi tảo và các tác nhân môi trường ……… 22

1.4.1 Các yếu tố lý – hóa ……… 22

1.4.1.1 Ánh sáng ……… 22

1.4.1.2 Nhiệt độ ……… 23

1.4.1.3 Thông số pH ……… 24

1.4.1.4 Độ kiềm ……… 25

1.4.1.5 Độ muối ……… 25

1.4.2 Các yếu tố dinh dưỡng ……… 26

1.4.2.1 Các yếu tố dinh dưỡng đa lượng ……… 26

1.4.2.2 Các nguyên tố vi lượng ……… 30

1.4.2.3 Những yếu tố khác 30

1.5 Các phương pháp phòng chống hiện tượng sinh trưởng bùng phát của vi tảo ……… 31

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 34

2.1 Địa điểm và thời gian khảo sát ……… 34

2.1.1 Địa điểm khảo sát và thu mẫu ……… 34

2.1.2 Thời gian khảo sát và thu mẫu ……… 35

2.2 Các phương pháp thu mẫu ……… 35

2.2.1 Mẫu nước ……… 35

2.2.2 Mẫu bùn ……… 35

2.2.3 Mẫu thực vật phù du ……… 35

2.3 Các phương pháp phân tích ……… 36

2.3.1 Chất lượng nước và bùn ……… 36

2.3.2 Phương pháp định tính và định lượng TVPD ……… 38

2.3.3 Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi tảo ……… 38

2.3.3.1 Phương pháp phân lập ……… 38

2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy 40

2.3.4 Phương pháp sinh học phân tử ……… 40

2.3.4.1 Tách chiết và làm sạch ADN ……… 40

2.3.4.2 Phương pháp nhân gen bằng phản ứng PCR ……… 41

2.3.4.3 Phương pháp điện di trên gel agarose ……… 42

2.3.4.4 Phương pháp cloning và giải trình tự ……… 42

2.3.4.5 Phân tích trình tự 42

2.3.5 Đánh giá độc tính và độc tố ……… 42

2.3.5.1 Phương pháp chiết độc tố ……… 43

2.3.5.2 Phương pháp thử độc tính sinh học trên Artemia salina…… 43

2.3.5.3 Phương pháp PPI 43

2.3.6.1 Thử nghiệm môi trường nuôi, ánh sáng, pH và nhiệt độ … 44

2.3.6.2 Các phương pháp thử nghiệm dinh dưỡng ……… 45

2.3.7 Các phương pháp thử nghiệm hạn chế sinh trưởng của vi tảo ở qui mô PTN và qui mô pilot ……… 46

2.3.7.1 Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm ……… 46

2.3.7.2 Thử nghiệm qui mô pilot ……… 47

2.4 Phương pháp điều tra hiện trạng KTXH nông hộ và kỹ thuật nuôi tôm thâm canh ……… 47

2.5 Phương pháp xử lý số liệu ……… 48

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ………… 49

3.1 Hiện trạng môi trường ao nuôi tôm sú tại các địa điểm nghiên cứu ……… 49

3.1.1 Hiện trạng KTXH nông hộ và kỹ thuật nuôi tôm thâm canh 49 3.1.2 Môi trường nước ao nuôi tôm ……… 50

3.1.2.1 Nhiệt độ ……… 50

3.1.2.2 Giá trị pH ……… 51

3.1.2.3 Độ mặn ……… 53

3.1.2.4 Cường độ ánh sáng ……… 55

3.1.2.5 Hàm lượng oxy hòa tan ……… 57

3.1.2.6 Độ kiềm ……… 59

3.1.2.7 Hàm lượng chlorophyll-a ……… 61

3.1.2.8 Hàm lượng Fe tổng ……… 63

3.1.2.9 Hàm lượng silicat ……… 65

3.1.2.10 Hàm lượng COD ……… 66

3.1.2.11 Hàm lượng BOD ……… 68

3.1.2.12 Hàm lượng DIN ……… 70

3.1.2.13 Hàm lượng DON ……… 71

3.1.2.14 Hàm lượng PON ……… 73

3.1.2.15 Hàm lượng DIP ……… 75

3.1.2.16 Hàm lượng DOP ……… 76

3.1.2.17 Hàm lượng PP ……… 78

3.1.2.18 Độ đục ……… 80

3.1.3 Môi trường trầm tích ao nuôi tôm ……… 81

3.1.3.1 Độ ẩm ……… 81

3.1.3.2 Tổng N và P ……… 83

3.1.3.3 Hàm lượng TOC ……… 86

3.1.3.4 Hàm lượng sắt tổng ……… 88

3.1.3.5 Hàm lượng Silicat ……… 89

3.1.3.6 Hàm lượng H 2 S ……… 91

3.1.4 Vi khuẩn trong ao nuôi tôm 92

3.1.4.1 Vi khuẩn trong nước nuôi 92

3.1.4.2 Vi khuẩn trong trầm tích 95

3.1.5 Thành phần và mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại Bạc Liêu và Sóc Trăng 98

3.1.5.1 Thành phần TVPD trong các ao nuôi tôm tại Bạc Liêu và Sóc Trăng 98

3.1.5.2 Mật độ TVPD trong các ao nuôi tôm tại Bạc Liêu và Sóc Trăng 109

3.2 Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học phân tử đánh giá nhanh sự hiện diện các loài vi tảo lam độc gây hại trong đầm nuôi tôm thâm canh 117

3.2.1 Phân lập và nuôi cấy một số chủng VKL trong đầm nuôi tôm 117

3.2.2 Phát hiện gen mã hóa độc tố trong các mẫu VKL phân lập 120

3.2.3.1 Nghiên cứu độc tính và độc tố của một số mẫu VKL 122 3.2.3.2 Nghiên cứu phân đoạn gen mcyA mã hóa độc tố MCs ở một

số chủng VKL 124 3.3 Nghiên cứu mối quan hệ Môi trường - Sinh trưởng của vi

tảo, xác định các yếu tố môi trường then chốt kiểm soát vi

tảo 128 3.3.1 Nghiên cứu sự sinh trưởng tảo lam trên các môi trường nuôi

cấy 128 3.3.2 Nghiên cứu mối tương quan giữa mật độ tế bào và mật độ

quang trong sinh trưởng của tảo lam 130 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh

trưởng của tảo lam 132 3.3.3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của

VKL 136 3.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng VKL

Geitlerinema cf lemmermanii 136

3.3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng VKL

Oscillatoria sp1 137 3.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ P lên sinh trưởng của

VKL 137 3.3.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ P lên sinh trưởng của chủng VKL

Geitlerinema cf lemmermanii 137

3.3.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ P lên sinh trưởng của chủng VKL

Oscillatoria limosa 139

3.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ N/P lên sự sinh trưởng của

VKL 140 3.3.7.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ N/P lên sinh trưởng của VKL

Geitlerinema cf lemmermanii 140

3.3.7.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ N/P lên sinh trưởng của VKL

Oscillatoria cf limosa 141

3.3.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Fe lên sự sinh

trưởng của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii 142

3.3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ P/Fe lên sự sinh trưởng và

phát triển của chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii 144 3.3.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ N/Fe lên sự sinh trưởng của

chủng VKL Geitlerinema cf lemmermanii 145 3.3.11 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường và sinh trưởng của

vi tảo trong các ao nuôi tôm nghiên cứu 146 3.3.11.1 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường và sinh trưởng của

vi tảo trong năm 2008 147 3.3.11.2 Mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường và sinh trưởng của

vi tảo trong năm 2009 151 3.4 Nghiên cứu đề xuất giải pháp khả thi phòng, chống hiện

tượng bùng phát vi tảo trong đầm nuôi tôm thâm canh 160 3.4.1 Nghiên cứu thực nghiệm khống chế bùng phát VKL

Geitlerinema cf lemmermanii trong phòng thí nghiệm và

qui mô pilot 160

phát vi tảo trong đầm nuôi tôm thâm canh 169 3.4.2.1 Các giải pháp tổng hợp 170 3.4.2.2 Các giải pháp cụ thể 176 3.4.2.3 Một số giải pháp trong khuôn khổ nghiên cứu của Đề tài 184 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 190 TÀI LIỆU THAM KHẢO 193

MỞ ðẦU

Hoạt ñộng nuôi trồng thuỷ sản của nước ta thực sự khởi sắc từ những năm 1990 Năng suất nuôi liên tục tăng từ 347.000 tấn năm 1991 ñến 1150.000 tấn năm 2003 Năm 2008 xuất khẩu thủy sản ñạt trên 4,5 tỷ USD Trong ñó, tôm sú và cá tra là hai mặt hàng xuất khẩu chủ lực, riêng xuất khẩu tôm ñạt giá trị kim ngạch 1,5 tỷ USD Năm 2009, theo Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản (VASEP), xuất khẩu tôm ñạt trên 1,67 tỉ USD, tăng 9,4 %

về khối lượng và 3% về giá trị với năm 2008 Theo tổng thư ký VASEP, năm

2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực, kim ngạch xuất khẩu tôm dự kiến ñạt 1,4 tỉ USD [8]

Ở nước ta hình thức nuôi tôm sú thâm canh quy mô lớn ở các vùng ven biển ñang phát triển mạnh Năm 2006 diện tích nuôi tôm sú ở Việt Nam khoảng 670,8 nghìn ha chiếm 68,8% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản Trong nuôi tôm sú thâm canh, ô nhiễm môi trường kèm theo dịch bệnh là trở ngại lớn nhất , gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế, làm giảm diện tích nuôi tôm và sản lượng tôm xuất khẩu Năm 2008 diện tích tôm nuôi bị bệnh hoặc chết lên tới 64 000 ha, chiếm 15% diện tích thả giống Năm 2009, diện tích nuôi tôm

sú cả nước khoảng 548 000 ha, giảm 66 000 ha so với cùng kỳ năm ngoài [6] Với sự gia tăng về diện tích nuôi tôm trong những năm gần ñây, ô nhiễm môi trường có thể có những tác ñộng tới quần xã TVPD vốn rất nhạy cảm với các ñiều kiện môi trường Trong quá trình nuôi trồng thuỷ sản, các chất dinh dưỡng vô cơ và hữu cơ xuất hiện trong vùng nước nuôi do các loại thức ăn dư thừa, quá trình bón phân, cải tạo, xử lý ao ñầm, là nguồn dinh dưỡng bổ sung ñáng kể cho thuỷ vực nuôi trồng thuỷ sản dẫn ñên hiện tượng phú dưỡng [4] và là nguyên nhân làm bùng phát nở hoa của vi tảo Chính vì vậy, tại các

vùng nuơi trồng thuỷ sản, khả năng bùng phát vi tảo, đặc biệt là VKL độc trong các ao đầm cĩ thể gây hại tới các đối tượng nuơi là rất lớn

Sự phát triển bùng phát của thực vật phù du hay cịn gọi “nở hoa của nước” là một hiện tượng tự nhiên Trong thủy vực, nở hoa của nước với mật

độ tế bào thực vật phù du lên tới hàng triệu tế bào/lít Khoảng 25% trong số các lồi gây hiện tượng nở hoa cĩ khả năng sản sinh độ tố và sự nở hoa của những lồi tảo gây hại đang là mối đe doạ gây ảnh hưởng lớn đến ngành nuơi trồng thuỷ sản [48] Sự nở hoa của nhiều lồi thực vật phù du thuộc các ngành/nhĩm khác nhau cĩ thể làm cho cá, tơm chết hàng loạt dẫn đến những thiệt hại lớn về kinh tế [3] Phần lớn các VKL gây nở hoa nước cĩ khả năng

sản ra độc tố là đại diện của các chi Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nostoc Thường gặp nhất là chi Microcystis Nhiều chủng

của chi này sản ra các độc tố heptapeptit mạch vịng, thường gọi là microcystin [22], [80] Hiện nay, ở Việt Nam chưa cĩ nghiên cứu nào về việc phát hiện VKL độc trong đầm ao nuơi tơm thâm canh, cũng như các giải pháp

về phịng ngừa và chống sự bùng phát của vi tảo độc

Việc thiếu kinh nghiệm để phân biệt sự nở hoa cĩ Microcystis độc và

khơng độc mà khơng cần phải phân lập và kiểm tra độc tố đã gây rất nhiều khĩ khăn trong cơng tác quản lý nguồn nước Một vài nghiên cứu về hình thái

và phân tử đã cố gắng giải quyết mối quan hệ khơng rõ ràng giữa độc tính của

Microcystis với cấu trúc quần thể của nĩ ðể phát hiện những chủng VKL sản

ra MCs một cách tốt hơn, một số nhà khoa học Australia [57] và các nhà khoa học Nhật Bản [58] đã phát triển các mẫu dị di truyền phát hiện trực tiếp gen

mcyA và vùng adenyl hố trong cụm gen MC synthetase từ đĩ cĩ thể nhận dạng Microcystis gây độc Các mẫu dị phân tử này đều được kiểm tra trên các

mẫu ngồi tự nhiên và mẫu phân lập trong phịng thí nghiệm trước khi ứng dụng [83] Phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi và được coi như một phương pháp chẩn đốn để cảnh báo sớm sự nở hoa của nước cĩ VKL độc, và

rất nhạy vì sự khuyếch ựại bằng phương pháp PCR Cùng với sự gia tăng số lượng các gen liên quan tới các con ựường sinh tổng hợp ựộc tố VKL khác, phương pháp phân tử sẽ vẫn ựược phát triển ựể phát hiện những gen này

Ngoài ra xác ựịnh các yếu tố môi trường có liên quan ựến sự phát triển bùng phát của vi tảo trong thuỷ vực có ý nghĩa rất quan trọng về mặt khoa học

và thực tiễn nhất là trong nuôi trồng thuỷ sản Nguyên nhân dẫn ựến sự nở hoa của nước bao gồm: nồng ựộ các chất dinh dưỡng trong thuỷ vực cao, ựặc biệt là các muối ựa lượng Nitơ và Phốt pho như nồng ựộ amonium nitrogen cao [19] ; nhiệt ựộ nước ấm; cường ựộ chiếu sáng, pH cao, hàm lượng CO2 thấp [90] Nồng ựộ dinh dưỡng trong môi trường và tế bào ảnh hưởng ựến sự sinh trưởng của vi khuẩn lam nhiều hơn là tỷ lệ N/P Nở hoa của vi khuẩn lam thắch hợp ở ựiều kiện tỉ số N/P thấp <1 [42], [53], [54], [64] để hạn chế và giảm thiểu sự phát triển bùng phát của vi tảo trong các ựầm ao nuôi thuỷ sản,

ựã có nhiều nghiên cứu liên quan ựến vấn ựề này Một trong những phương pháp hoá học là dùng các chất diệt tảo (chất hóa học hoặc chất có nguồn gốc thiên nhiên [12] Ngoài ra, người ta cũng dùng các phương pháp cơ học như hớt các lớp váng bọt trên bề mặt nước hoặc sử dụng các chất keo tụ ựể tăng cường thu thập lớp váng Hiện nay các nhà khoa học ựang nỗ lực kiểm soát sinh khối tảo bằng phương pháp sinh học thông qua kắch thắch sự phát triển của thực vật bậc cao như sử dụng rong biển ựể loại bỏ thừa dinh dưỡng trong các ựầm, ao nuôi, tiến hành phương pháp nuôi ựa ựối tượng [84], [85]

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài Ộđánh giá nhanh sự hiện diện của vi tảo lam ựộc bằng kỹ thuật sinh học phân tử và nghiên cứu ựề xuất giải pháp khả thi phòng, chống hiện tượng bùng phát vi tảo trong ựầm nuôi tôm sú thâm canhỢ ựược thực hiện nhằm góp phần giải quyết các vấn ựề lý luận khoa học

và thực tiễn sản xuất nêu trên

- Có ựược phương pháp sinh học phân tử ựánh giá nhanh các loài vi tảo ựộc gây hại trong ựầm nuôi tôm thâm canh

- Xác ựịnh ựược vai trò của các nhân tố môi trường ựối với việc sinh trưởng bùng phát và khả năng sinh ựộc tố của vi tảo

- đề xuất ựược các giải pháp khả thi kiểm soát sinh trưởng bùng phát của vi tảo, góp phần vào việc nuôi trồng thủy sản bền vững

Các nội dung chắnh đề tài ựã tiến hành gồm :

Nội dung 1: đánh giá hiện trạng môi trường tại vùng nuôi thủy sản Bạc Liêu

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trường nuôi tôm thâm canh

Nuôi trồng thủy sản là một khái niệm dùng ựể chỉ tất cả các hình thức nuôi trồng ựộng, thực vật thủy sinh ở các môi trường nước ngọt, lợ và mặn

Theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, nuôi trồng thuỷ sản trong 7 tháng ựầu năm 2010, các doanh nghiệp thuỷ sản xuất khẩu ựạt kim ngạch khoảng 2,45 tỉ USD tăng hơn 11,63% so cùng kì năm 2009 Tuy hàng thuỷ sản Việt Nam xuất khẩu ựã có mặt ở nhiều nước trên thế giới nhưng cơ cấu thị trường nhìn chung ựã có thay ựổi qua các năm Tắnh ựến hết tháng 6/2010, EU, Nhật Bản và Hoa Kì vẫn là 3 thị trường nhập khẩu thuỷ sản lớn nhất, 3 thị trường này chiếm 59,35% giá trị xuất khẩu của cả ngành, tỷ lệ này năm 2005 là 69,7% Tôm là mặt hàng rất quan trọng ựóng góp cho sự tăng trưởng của thuỷ sản trong thời gian qua Năm 2009, khối lượng xuất khẩu ựạt gần 210 nghìn tấn với kim ngạch trên 1,67 tỉ USD, tăng 9,4% về khối lượng

và 3% về giá trị so với năm 2008 Ờ ựây là mặt hàng thuỷ sản xuất khẩu duy nhất trong năm 2009 Năm 2009, Việt Nam xuất khẩu tôm vào 82 thị trường, trong ựó Tôm sú vẫn là mặt hàng chủ lực, chiếm trên 75% giá trị xuất khẩu

đa số các vùng nuôi tôm tập trung ở miền Nam như Bến Tre, Kiên Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc LiêuẦ [8]

Nhìn chung, ô nhiễm môi trường ựầm nuôi tôm thâm canh ở các quốc gia Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, đài Loan, Thái Lan và Indonesia, Ầ ựều hình thành trong quá trình nuôi như các chất thải từ thức ăn và các hoá chất tắch tụ ở ựáy ựầm nuôi tạo thành một lớp bùn ô nhiễm Thành phần lớp bùn chủ yếu là các chất hữu cơ như prôtêin, lipid, axit béo với công thức chung CH3(CH2)nCOOH, photpholipid, Sterol- vitamin D3, các hoocmon,

trong tình trạng ngập nước, yếm khí, các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh, phân huỷ các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm là hydrosulphua (H2S), Amonia (NH3), khí metan (CH4), rất có hại cho thuỷ sinh vật, ví dụ nồng ñộ 1,3 ppm của H2S có thể gây sốc, tê liệt và thậm chí gây chết tôm Khí amonia (NH3) cũng ñược sinh ra từ quá trình phân huỷ yếm khí thức ăn tồn dư gây ñộc trực tiếp cho tôm, làm ảnh hưởng ñến ñộ pH của nước và kìm hãm sự phát triển của thực vật phù du

Ô nhiễm môi trường bên ngoài ñầm nuôi ñược sản sinh từ nguồn thức

ăn, phân bón, thuốc thú y thủy sản, trong quá trình chăn nuôi thải ra bên ngoài ñầm nuôi bao gồm: Các bon hữu cơ (gồm thức ăn, phân bón v.v), Ni tơ ñược phân huỷ từ các prôtêin, Phốt pho phân huỷ từ các prôtêin Nồng ñộ các chất

ô nhiễm trên ñược biểu thị bởi một số chỉ tiêu chung như chỉ tiêu nhu cầu ôxy hoá sinh - BOD, tổng Nitơ và tổng Phôtpho Ngoài ra, việc sử dụng các chất kháng khuẩn, chất khử trùng, thuốc gây mê và các chất kích thích… trong các ñầm nuôi tôm cũng ngày càng gia tăng thêm sự ô nhiễm Các hoá chất sát trùng này ñã tiêu diệt phần lớn các vi sinh vật có lợi trong ñầm ao làm cản trở các quá trình phân huỷ sinh học các loại thức ăn thừa ñồng thời làm gia tăng các loại vi sinh vật yếm khí ñáy ao gây ô nhiễm nền ñáy và tích luỹ ñộc hại lâu dài trong nuôi trồng thuỷ sản

Theo báo cáo của Feng, 1996 vùng nuôi tôm sú thâm canh lớn ở biển Bohai - Trung Quốc với hàm lượng COD cao hơn gấp 200 lần và photpho cao hơn 900 lần so với môi trường xung quanh Các nghiên cứu về COD, photpho

và NH4+-N trong cùng một vùng ở vụ sau lần lượt cao hơn 3,7; 7,8 và 2,4 lần

so với thời gian nuôi tôm vụ trước [32], các chỉ số này chỉ thị một cân bằng cần thiết trong chu kì vật chất ở môi trường tiếp theo Nếu hiệu quả tiêu thụ thức ăn mỗi vụ là 15 ñến 20% và tỉ lệ biến chuyển thức ăn là 2 thì ở Trung Quốc ñã tạo ra ñược 200 nghìn tấn tôm và thải bỏ từ 320 nghìn tới 340 nghìn tấn dòng chất thải nuôi trồng ra biển

Ở Thái Lan, các hoạt ñộng nuôi tôm thâm canh ở vùng cửa sông Chao Phraya ñã tạo ra dòng thải giàu dinh dưỡng, gây ô nhiễm cao tới môi trường nước bề mặt nếu không ñược xử lý Các chất thải từ việc nuôi tôm bao gồm các chất thải rắn (tích tụ trong bùn ao), các hợp chất hữu cơ (thức ăn dư thừa, phân bón, xác tôm và thực vật phù du bị chết) và các chất chuyển hoá hoà tan

như amôni, ure và carbon dioxit [79]

Các loại thức ăn dư thừa, cặn lắng và ñất ao bị xói mòn dẫn ñến tích luỹ tại giữa ao bởi hoạt ñộng của quạt gió kĩ thuật Bùn ñược làm giàu nitơ, photpho và carbon cùng với cặn lắng xung quanh và sự tích luỹ này ñược kết hợp với sự phân huỷ kị khí và thải ra amôni, sunfua hữu cơ và hidro sulfit Thức ăn tôm và bùn ao bị rửa trôi là nguồn chính của các chất thải hữu cơ (khoảng 22 tấn/ha.vụ nuôi) Khoảng 78 – 79% của tổng nitơ và 92-95% tổng photpho cho vào ao bị thải ra môi trường Các nghiên cứu này cũng ước tính tải trọng tổng nitơ khoảng 57,3 ñến 118,1kg và tổng photpho khoảng 13 ñến 24,4kg/tấn tôm thu hoạch ñối với tỉ lệ biến chuyển thức ăn lần lượt là 1,2:1 và 2,1:1 Tính toán này cho thấy rằng, khoảng 63-78% nitơ tổng và 76-86% photpho tổng ñược bổ sung vào ao ñã bị mất ñi vào hệ sinh thái ao hoặc thải

bỏ vào môi trường

Nhìn chung, mô hình nuôi tôm thâm canh ở Việt Nam ñã ñi vào thực tiễn nuôi trồng của bà con nông dân vùng nuôi trồng thuỷ sản Tuy nhiên, một thực tế là việc nuôi thâm canh chỉ tiến hành liên tục ñược 2 – 3 vụ, sau ñó môi trường các ao nuôi bị ô nhiễm rất nặng, gây thiệt hại lớn cho người nông dân Nhiều trang trại dẫn ñến phá sản bởi tôm chết, tôm mắc bệnh, ô nhiễm môi trường gia tăng, phú dưỡng ao nuôi kéo dài và xuất hiện nhiều loài tảo ñộc hại

Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thọ, 2007 về ô nhiễm ao nuôi tôm

trường vùng nuôi thuộc loại ô nhiễm rất nặng Chất hữu cơ chủ yếu từ các nguồn thức ăn, xác ñộng thực vật…Trong môi trường nước, nghiên cứu cũng phát hiện hàm lượng nitơ hữu cơ hoà tan trong vùng nuôi tôm thâm canh từ 0,867 tời 1,956 mg/l, cao nhất ở vùng Sóc Trăng Nguồn nitơ hữu cơ chủ yếu

từ các chất dinh dưỡng chưa phân huỷ hoàn toàn [6]

Ô nhiễm trong nuôi tôm thâm canh ñang là một vấn ñề lớn trong nuôi trồng thuỷ sản Khi hàm lượng chất thải dinh dưỡng quá nhiều gây ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, thực vật phù du phát triển mạnh kèm theo nhiều loài sản sinh ñộc tố trong môi trường Hiện tượng này thường thấy ở các ñầm nuôi tôm thâm canh khi không có sự kiểm soát ô nhiễm từ dinh dưỡng phát sinh Nghiên cứu trong các ñầm ao nuôi trồng thuỷ sản, Chu Văn Thuộc, 2006

ñã phát hiện loài vi khuẩn lam Oscillatoria lemmermanii ñạt mật ñộ cao tại

các ao nuôi tôm và kênh dẫn nước vào mùa mưa Mật ñộ tế bào vi khuẩn lam

Aphanizomenon flos-aquae rất cao, khoảng 2-6 triệu tb/L trong các ao nuôi

và Gymnodinium spp (dinoflagellates) Sự xuất hiện hiện tượng nở hoa của

tảo hai roi và các loài thuộc tảo lam, tảo silíc , tảo lục dẫn ñến thiệt hại về kinh tế trong ngành công nghiệp thuỷ sản, gây nhiễm ñộc tôm bởi các ñộc tố

Ở Trung Quốc, thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm thâm canh bởi loài tảo

Alexandrium tamarense (Gonyaulax tamarensis) và Gymnodinium; ở Malaysia, là loài Hornellia (Chattonella) và Pyrodinium bahamense var compressum; ở Việt nam là loài Nitzchia navis-varingica; ở Ecuador là loài Gyrodinium instriatum; và ở New Mexico là loài VKL S diplococcus, Schizothrix calcicola, và tảo hai roi P minimum, Gymnodinium catenatum từ

nguồn nước cung cấp cho ao nuôi Tất cả các thiệt hại trong ñầm ao tôm khi

có sự nở rộ của thực vật phù du là rất to lớn, ảnh hưởng ñến chất lượng và ñời sống của tôm nuôi [9]

1.2 Sinh trưởng của các loài tảo ñộc, hại và ảnh hưởng của chúng tới năng suất, chất lượng thuỷ sản

Thực vật phù du là những sinh vật sử dụng chất vô cơ trong ao nuôi làm nguồn thức ăn (autotrophs) Ban ngày dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, thực vật phù du (tảo) cần CO2 ñể dùng làm nguyên liệu trong quá trình quang hợp, quá trình này sản xuất ra oxy Nhưng khi không có ánh nắng, trời mưa hoặc vào ban ñêm, tảo vẫn phải dùng oxy ñể hô hấp

Vi tảo trong các hệ sinh thái thuỷ vực, ngoài chức năng là những sinh vật sản xuất tạo ra năng suất sơ cấp, chúng còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài ñộng vật phù du, ấu trùng giáp xác, ñộng vật thân mềm, cá, tôm…Phần lớn các loài vi tảo là có lợi, tuy nhiên một số loài vi tảo có hại cho môi trường do bản thân chúng có khả năng sản sinh ra ñộc tố nhưng khi phát triển với mật ñộ cao hoặc giai ñoạn tàn lụi lại gây hiện tượng thiếu oxy hoà tan hoặc làm tăng hàm lượng amoniac trong nước…và từ ñó gây hại cho các thủy sinh vật khác

Hầu hết các loài vi tảo biển nở hoa thường ñưa ñến hậu quả làm cho môi trường xấu ñi, hàm lượng oxy hòa tan suy giảm nhanh chóng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến ñời sống thủy sinh vật Tảo chết và chìm xuống ñáy thủy vực và bị phân hủy bởi các vi sinh vật khác ñặc biệt là vi khuẩn Kết quả gây nên hiện tượng thiếu ôxy trong các tầng nước làm chết các loài thủy sản Quá trình này làm thay ñổi thành phần hóa học trong nước, gây tăng các khí ñộc ðến nay, các nhà khoa học ñã xác nhận có khoảng trên 300 loài vi tảo ñã

dọa ñến khu hệ ñộng vật và thực vật tự nhiên ở nước, ảnh hưởng ñến nuôi trồng thủy sản và sức khỏe của con người [30] Nguyên nhân chính là do ñộc

tố tảo có thể ñược tích lũy trong vài loài ñộng vật thân mềm sò, ốc hay cá…

và không bị phá hủy trong quá trình ñun nấu, không ảnh hưởng ñến mùi vị của thực phẩm Do vậy, cả ngư dân cũng như người tiêu dùng khó có thể xác ñịnh ñược các thực phẩm biển bị nhiễm ñộc do tảo gây ra

Loài tảo sợi có hại cho tôm và ảnh hưởng ñến năng suất nuôi trồng thuỷ

sản chủ yếu là nhóm Oscillatoria sp và Anabaena sp ðặc biệt hơn, loài tảo gây váng nổi trên mặt nước như các loài thuộc chi Microcytis sẽ làm cho tôm

có mùi tanh bùn và mùi hôi, ñồng thời chi tảo này còn là nhóm thải ra chất nhờn ở màng bọc của tế bào, có thể gây ra sự tắc nghẽn ở mang tôm Khi chúng bùng phát sẽ làm cho nước có ñộ pH cao và làm cho hàm lượng oxy giảm thấp vào sáng sớm Trong nuôi trồng thuỷ sản nói chung và các ao nuôi tôm thâm canh nói riêng, ô nhiễm ñáng kể và lâu dài nhất phải kể ñến nhóm

Dinoflagellate mang ñộc tố như Alaxandium sp., Gonyaulax sp…Những loại

này mang ñộc tố PSP và DSP khi phát triển cực ñại trong ao nuôi, ñộc tố sẽ gây cho tôm chết Ngoài ra, một số tảo là nguồn thức ăn trong nuôi trồng thuỷ

sản như Chaetoceros sp., Skeletonema sp., thường làm màu nước dễ thay

ñổi bởi vòng ñời của chúng tương ñối ngắn, nên việc quản lý màu nước rất khó [26]

Sự nở hoa của nhiều loài thực vật phù du thuộc các nhóm khác nhau có thể làm cho cá, tôm chết hàng loạt dẫn ñến thiệt hại lớn về kinh tế [39] Tại một số ao nuôi tôm bán thâm canh, ảnh hưởng của nở hoa của vi tảo sau khi tăng cường phân bón ñến sự phát triển của tôm ñược Cortes – Altamirano & Licea – Duran ghi nhận năm 1999 Ngoài ra, nở hoa của VKL xuất hiện các ñốm nâu ở tôm gây ảnh hưởng không nhỏ ñến sản lượng nuôi trồng, ñây là trường hợp quan sát ở Ecuador [75] Sự phát triển bùng phát của thực vật phù

du trong các ñầm ao nuôi tôm, cá ñược ghi nhận khá thường xuyên ở nhiều

nơi trên thế giới Nở hoa của tảo gây hại và những ảnh hưởng của chúng trong nuôi trồng thuỷ sản ñược trình bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1 Ảnh hưởng một số loài tảo trong nuôi trồng thuỷ sản

nhân

Ảnh hưởng ñến tôm, cá

Tài liệu tham khảo

Bohai Sea,

Trung Quốc

Euglena spp

Noctiluca scintillans

Làm thiếu hụt oxy, sản sinh amoni

Gây chết

Mingyan & Jiansheng (1993) Taiwan

Trung Quốc

Alexandrium tamarense

Sinh ñộc tố

Huei-Meei và

cs, 1993 Malaysia Chatonella spp Làm thiếu

hụt oxy Gây chết

Maclean (1989)

Texas,

Hoa Kì

M aeruginosa Anabaena spp

Sản sinh ñộc tố gan

Prorocentrum minimum/

Gymnodinium catenatum

Gây ñộc

Tăng trưỏng giảm, gây chết

Altamirano (1994) Garate-Lizarraga và

Cortes-cs (2003) Ecuador Gyrodinium

instriatum

Làm thiếu hụt oxy Gây chết

Jimenez (1993) Bắc Mỹ Oscillatoria,

Sản sinh ñộc tố ASP Gây chết

Kotaki và cs,

2000

Trung Quốc

Prymnesium parvum

Sản sinh ñộc tố, làm tắc nghẽn mang cá

Gây chết Guo và cs

1996

1.3 Áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu giám sát và

Hiện tượng phú dưỡng tại các thuỷ vực - hậu quả của sự phát triển công nghiệp, nông nghiệp, thuỷ sản và quá trình ñô thị hoá là mối quan tâm bức thiết trong công tác quản lý môi trường nước của nhiều nước trên thế giới, ñặc biệt là các nước ñang phát triển Sự ô nhiễm ngày càng nghiêm trọng tại các thuỷ vực luôn ñi kèm với hiện tượng nở hoa nước mà bản chất là sự phát triển

ồ ạt của thực vật nổi, chủ yếu là các vi khuẩn lam (VKL)

Phần lớn các VKL gây nở hoa nước có khả năng sản ra ñộc tố là ñại

diện của các chi Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nostoc Thường gặp nhất là chi Microcystis Nhiều chủng của chi này sản ra

các ñộc tố heptapeptit mạch vòng, thường gọi là microcystin Dạng ñộc cấp tính của microcystin sẽ dẫn ñến sự phá huỷ gan trầm trọng do phá vỡ cấu trúc

tế bào gan (phá huỷ cytokeleton), mất cấu trúc thể xoang, tăng trọng lượng gan do xuất huyết và gây sốc sự vận chuyển máu, rối loạn nhịp tim ñến chết Những cơ quan khác bị ảnh hưởng là thận, phổi và ruột Hậu quả tác ñộng trường diễn của MCs sẽ gây kích thích tạo khối u, gây ung thư da và gan ở người Hàm lượng MCs trong nước uống theo quy ñịnh của WHO là 1 µg/l [26]

Việc thiếu kinh nghiệm ñể phân biệt sự nở hoa có Microcystis ñộc và

không ñộc mà không cần phải phân lập và kiểm tra ñộc tố ñã gây rất nhiều khó khăn trong công tác quản lý nguồn nước Một vài nghiên cứu về hình thái

và phân tử ñã cố gắng giải quyết mối quan hệ không rõ ràng giữa ñộc tính của

Microcystis với cấu trúc quần thể của nó Các phương pháp phân tử ñể thực

hiện thường dựa trên sự ña hình allozyme, các gen 16S rRNA, vùng ñệm giữa các gen phycocyanin (PC- IGS), lai ADN- ADN, sự sắp xếp các base, ña hình

ADN ñược khuyếch ñại ngẫu nhiên, gen rbcL Cùng với việc ñưa ra nguồn gốc của Microcystis, các kết quả này chứng minh sự không ñồng nhất giữa

các chủng gây ñộc và không ñộc Sự nhận dạng locus di truyền ñảm nhiệm

tổng hợp MCs của M aeruginosa gần ñây cho phép xác ñịnh lại vấn ñề gây

ñộc ðể tăng hiệu quả phát hiện những chủng VKL sản sinh ñộc tố MCs một cách tốt hơn, một số nhà khoa học Australia [57] và các nhà khoa học Nhật

Bản [58] ñã phát triển các mẫu dò di truyền phát hiện trực tiếp gen mcyB và

vùng adenyl hoá trong cụm gen MC synthetase từ ñó có thể nhận dạng

Microcystis gây ñộc Các mẫu dò phân tử này ñều ñược kiểm tra trên các mẫu

ngoài tự nhiên và mẫu phân lập trong phòng thí nghiệm trước khi ứng dụng

1.3.1 Vi khuẩn lam ñộc và ñộc tố

Sự phân biệt bằng hình thái giữa VKL ñộc và không ñộc rất khó vì một vài chi chứa cả loài ñộc và không ñộc Một vài loài VKL ñược biết là ñộc, song cũng có loài về mặt di truyền có thể sản sinh ñộc tố, nhưng không phải trong tất cả các ñiều kiện và một vài loài không bao giờ sản sinh ñộc tố Hiện nay có nhiều phương pháp xác ñịnh ñộc tố VKL như sử dụng hoạt tính sinh học ñộc tố (ñộc tố gan, ñộc tố thần kinh, ñộc tố tế bào, hoạt tính enzyme và các tương tác miễn dịch) hoặc sử dụng trực tiếp các gen mã hoá ñộc tố [25] , [34], [62] Ngoài các phương pháp này, trên thế giới, trong nhiều thập kỷ nay, một số nước ñã ứng dụng các phương pháp SHPT ñể phát hiện ñộc tố của các sinh vật, ñặc biệt là tảo mà không cần qua nuôi cấy, hơn nữa lại có tính chính xác và ñộ nhạy cao Các kỹ thuật này dựa trên cơ sở phản ứng PCR mà phân

tử ñích là DNA ñang ngày càng phổ biến [25], [83], [87] Sự phân bố toàn cầu của VKL ñộc chứng tỏ sự diễn thế sinh thái rộng khắp của chúng mà ñôi khi gây ra các vấn ñề liên quan ñến con người Cộng ñồng thường sử dụng nước

bề mặt và hồ chứa cho sinh hoạt Khi những nguồn nước có sự bùng phát tảo thì các thành phần mùi và vị không ñộc do VKL tạo ra làm ảnh hưởng ñến

thế nào nhưng nếu VKL ñộc ở trong các nguồn nước một thời gian dài có thể gây hại

Bởi vậy, việc phát hiện VKL ñộc và ñộc tố của chúng là nền tảng cho việc quản lý những vùng nước sạch Thông thường phương pháp nhận dạng VKL bằng kính hiển vi ñược sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với phân tích ñộc

tố trực tiếp Phân biệt hình thái VKL ñộc và không ñộc có thể rất khó vì một vài chi chứa cả chủng ñộc và không ñộc Một vài loài VKL ñược biết là ñộc song cũng có loài không phải bất cứ lúc nào cũng sản sinh ñộc tố (gây ñộc),

và cũng có một vài loài không bao giờ tạo ñộc tố Các phương pháp phát hiện VKL ñộc dựa trên DNA ñã trở thành phổ biến vì tính ñặc hiệu (những gen ñích liên quan ñến sinh tổng hợp ñộc tố), nhậy và nhanh tiềm năng của chúng

Aplysiatoxins Lyngbya, Schizothrix, Planktothrix

Cấu trúc của cyanotoxins ñã biết gồm có nhiều dạng alkaloid và peptid mạch vòng Nhiều chủng VKL tạo ra một hoặc nhiều cyanotoxins ñược trình bày trên Bảng 1.2 Hai dạng phổ biến nhất của cyanotoxins là microcystins và nodularins với nhiều cấu trúc khác nhau Peptid mạch vòng gây ñộc khi ức

chế các protein phosphatase nhất ñịnh Những peptid mạch vòng này và một vài alkaloids ñược sản sinh thông qua phức hệ enzym lớn không qua ribosom Những peptid không ñược tạo ra từ ribosom khác của vi khuẩn và nấm ñược biết ñến bao gồm enterobactin, cyclosporin-a, và erythromycin

Hệ gen mã hoá cho ñộc tố microcystin là hệ gen mã hoá cho phức hệ enzyme tổng hợp microcystin, gồm 7 axit amin

Ngoài một số chi sản sinh ra ñộc tố microcystin ñã biết (Anabaena, Planktothrix, Nostoc, ) thì M aeruginosa ñược coi là chi sản sinh chủ yếu

ñộc tố microcystin Có khoảng 80 dạng khác nhau của microcystin ñã ñược phát hiện

Hình 1.1 Cấu trúc gen mã hoá ñộc tố microcystin

Theo Neilan thì phức hệ enzyme tổng hợp microcystin ñược tổng hợp nhờ cơ chế khung lưu huỳnh (thio-template), trong ñó các gen mã hoá quá trình tổng hợp microcystin gồm những modul tạo ra các vùng chức năng (domain) có vai trò liên quan ñến hoạt ñộng của các axit amin Phần lớn các modul chứa vùng adenyl hoá, vùng thiolation và vùng trùng ngưng

(condensation), trong ñó vùng adenyl hoá chịu trách nhiệm nhận dạng các axit amin ñặc hiệu (Hình 1.1)[57], [83]

Sau khi axit amin ñược hoạt hoá thành acyladenylate thì aminoacyladenylate chuyển thành chất mang 4’phosphapantetheine trong vùng thiolation Vùng trùng ngưng (condensation) sắp xếp 2 axit amin ñã ñược hoạt hoá ñể hình thành liên kết peptid [24], [47], [60]

Những nghiên cứu của Dittmann, 1996 ñã chỉ ra rằng cụm gen tổng

hợp microcystin (mcy) có 10 gen (mcy A-J), bao gồm các gen tổng hợp peptid (mcyABC), tổng hợp polyketid (PKSs, mcyD), các gen tổng hợp peptid và polyketid (mcyEG), gen vận chuyển(mcyH) và gen sửa chữa giả ñịnh (mcyJ) Cụm gen mcyA-C và mcyD-J tạo thành 2 hệ thống gen Trong ñó, các gen mcyA, mcyB, mcyC liên quan ñến sự hoạt hoá và liên kết Mdha, DAla, L-X

của microcystin trong quá trình tổng hợp [25], [28], [83]

Cụm gen mã hoá cho phức hệ enzyme tổng hợp microcystin cũng ñã ñược nghiên cứu và giải trình tự Cụm gen 55-kb này bao gồm 6 cấu trúc ñọc

mở (vùng dịch mã) với phức hệ tổng hợp polyketid hoặc polypeptide không

qua ribosome (từ mcyA tới mcyE và mcyG) và bốn cấu trúc ñọc mở nhỏ hơn với chức năng tiền giả ñịnh và sửa chữa giả ñịnh (mcyF và mcyH cho tới mcyJ) Vùng xúc tác từ mcyA cho tới mcyE và mcyG có liên quan ñến sự kết

hợp những tiền chất như phenylacetate, malonyl coenzyme A, methionine, glutamate, serine, alanine, leucine, D-methyl-isoaspartate và arginine Cấu trúc dọc mở nhỏ hơn mã hoá cho các protein ñơn chức năng

S-adenosy-L-ñược giả ñịnh là liên quan ñến sự O-methyl hoá (mcyJ), epime hoá (mcyF), ñề hydrat hoá (mcyI) và sự ñịnh vị tế bào (mcyH)

Kaebernick cho rằng có mười cấu trúc ñọc mở (hay vùng dịch mã)

ñược phiên mã theo 2 ñịnh hướng từ locus 1737-bp trung tâm giữa mcyA và

mcyD và ñược sắp xếp như vậy trước khi ñược phân thành hai operon giả ñịnh

là mcyABC và mcyDEFGHIJ [44], [45]

1.3.2 Vai trò của gen mã hoá ñộc tố microcystin trong việc phát hiện vi khuẩn lam gây ñộc thuộc chi Microcystis bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, công nghệ sinh học

và ñặc biệt là sinh học phân tử ñã ñạt ñược rất nhiều thành tựu Trong những năm gần ñây, những tiến bộ của sinh học phân tử ñã nâng cao những hiểu biết

về sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và sự ñiều khiển sao mã trên cơ sở

di truyền Những gen qui ñịnh sự sinh tổng hợp ñộc tố cũng vừa mới ñược phát hiện Hiện nay việc quản lý nguồn nước diễn ra hết sức phức tạp và khó khăn, ñặc biệt trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản do còn nhiều hạn chế trong

quá trình phân biệt giữa những bloom Microcystis ñộc và không ñộc, hơn nữa

không có quá trình phân lập và kiểm tra sự tạo thành của ñộc tố

Trên thế giới, các phương pháp phổ biến thường ñược sử dụng ñể phát hiện sự có mặt của ñộc tố VKL như phương pháp HPLC, phương pháp ELISA, phương pháp MALDI-TOF, hay các phương pháp sinh học như thử hoạt tính trên chuột, trên ñộng vật không xương sống và các phương pháp sinh học phân tử hiện ñại… Trong ñó việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân

tử có thể sớm phát hiện những vi sinh vật tạo ra ñộc tố mà không cần qua nuôi cấy, hơn nữa có tính chính xác và ñộ nhạy cao Các kỹ thuật phát hiện dựa trên cơ sở phản ứng PCR mà phân tử ñích là các ADN ngày càng phổ biến,

trong ñó các gen mcy liên quan ñến quá trình mã hoá ñộc tố microcystin có

vai trò rất quan trọng

Triển vọng mới trong việc phát hiện những cá thể tạo ra ñộc tố microcystin ñã rõ nét hơn kể từ khi các gen mã hoá cho phức hệ enzyme tổng hợp microcystin ñược phát hiện Các gen này ñược sắp xếp tạo thành cụm gen

Planktothrix Vì vậy các đoạn mồi được thiết kế nhằm khuếch đại những phần trong cụm gen mcy Nhờ kỹ thuật PCR và một số kỹ thuật khác người ta cĩ

thể phát hiện các chủng VKL cĩ khả năng tạo ra độc tố microcystin [25], [87]

Tanabe đã chứng minh rằng độc tố được chia thành 2 nhĩm, nhĩm A và nhĩm B dựa trên các phương pháp phát hiện các locus của 7 gene Phát hiện này đặt ra hai câu hỏi: 1) Các gen mcy này cĩ cấu trúc tương tự các gen chỉ thị khơng? hoặc chúng phát triển cĩ liên quan trực tiếp đến các gen khác trong

bộ gen của M aeruginosa 2) Các tác nhân nào liên quan đến di truyền gene mcy? ðể giải quyết những vấn đề này, Tanabe đã phân tích các gen mcy từ những chủng độc và khơng độc hại - 118 chủng M aeruginosa độc và khơng

độc [81]

ðể biết được cĩ bao nhiêu kiểu gen mã hố cho sự tạo thành

microcystin của các chủng Microcystis sp ở các quần thể ngồi tự nhiên,

Kurmayer đã sử dụng những mẫu phân lập từ những tập đồn VKL được lấy tại hồ Wanssee (Berlin, ðức), tiến hành mơ tả đặc điểm hình thái, sau đĩ sử

dụng phương pháp PCR để nhân vùng gen mcyB Theo tác giả, gen mcyB mã

hố cho sự hoạt hố của một axit amin mà axit amin này cĩ vai trị quan trọng trong suốt quá trình sinh tổng hợp microcystin Kết quả là hầu hết số khuẩn

lạc (73%) thuộc lồi M aeruginosa cĩ chứa gen này, trong đĩ chỉ 16% khuẩn lạc thuộc M.ichthyoblae và khơng cĩ khuẩn lạc nào thuộc M wesenbergii cho

sản phẩm PCR [47]

Những nghiên cứu gần đây về vị trí locus các gen liên quan đến sự tổng

hợp microcystin ở M aeruginosa mở ra hướng mới cho việc tìm hiểu về độc

tố của chúng ðể phát hiện chính xác những chủng VKL tạo độc tố microcystin, Neilan, 1999 và Nishizawa, 1999 đã phát triển những mẫu dị di

truyền định hướng, lần lượt từ gen mcyB tới vùng adenyl hĩa bên trong cụm

gen tổng hợp microcystin, dựa trên trình tự của các peptid synthetase và các enzyme adenylate của sinh vật prokaryote và eukaryote [57], [58]

Những cặp mồi ñể khuếch ñại vùng N – methyltrasferase (NMT) của

gen mcyA ñã ñược Tillett, 2001 phát triển Kết quả cho thấy ñoạn gen mcyA

sau khi ñược khuếch ñại bằng phản ứng PCR có chiều dài khoảng 250 bp

Trong tổng số 37 chủng Microcystis sp nghiên cứu, vùng NMT có mặt ở 18

chủng (những chủng này ñều có kết quả dương tính với phép phân tích PPI)

và không có mặt ở các chủng còn lại Tác giả ñã dùng những mồi này (MAF

và MAR) ñể tiến hành với các mẫu bloom ngoài tự nhiên và phát hiện thấy 6 trong số 8 mẫu có vùng gen này, phù hợp với kết quả phân tích ñộc tố [83]

Cặp mồi MAF và MAR ñược coi như những mẫu dò di truyền chính xác, chúng có thể kết hợp và phát triển cùng với những cặp mồi mà Neilan,

1999 hoặc Nishzawa, 1999 ñã dùng ñể phát hiện nhanh những chủng gây ñộc

tiềm tàng thuộc chi Microcystis Cặp mồi này cũng dùng ñể phân biệt những

mẫu bloom ngoài thực ñịa chứa nhóm VKL ñộc hay không ñộc [57], [58]

Bên cạnh việc sử dụng phương pháp hiện ñại và chính xác nhất hiện nay (MALDI – TOF) ñể ñịnh tính và ñịnh lượng ñộc tố microcystin, Ordorika, 2004 ñã sử dụng phương pháp PCR ñể khuếch ñại vùng bên trong

gen mcyA và mcyB, ñược xem là chỉ thị ñối với quá trình sinh tổng hợp ñộc tố

này Ngoài việc sử dụng các mồi như Neilan, 1999 ñã phát triển, tác giả ñã

kết hợp với cặp mồi khác ñể khuếch ñại vùng ñệm giữa gen cpcBA và vùng

ñệm của phycocyanin (PC IGS) Cặp mồi này cho phép khuếch ñại một phần

vùng trùng ngưng của gen mcyA (kích thước khoảng 250 bp) và vùng adenyl hóa ñầu tiên (Al) của mcyBl (kích thước 1312 bp) Cả hai gen này ñều có vai

trò trong cụm gen sinh tổng hợp microcystin Khoảng 95% số khuẩn lạc (305 khuẩn lạc) nghiên cứu có vùng PC – IGS ðể tìm hiểu mối quan hệ giữa sự có

khoảng 70% khuẩn lạc không chỉ cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR mà còn cả phương pháp MALDI – TOF [60]

Hầu hết các tác giả ñều cho rằng những mẫu dò sử dụng cho vùng gen tổng hợp microcystin tỏ ra hiệu quả hơn so với việc tiến hành với các vùng

tương tự ở gen khác, ñặc biệt là những vùng gen mcyABC

Ở Việt Nam, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong thăm dò và xác ñịnh sự hiện diện của một số loài VKL ñộc hại mới chỉ bắt ñầu từ năm 2008 Theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Liên (ðại học Huế), trong số 24 chủng thuộc 7 loài có tiềm năng sinh ñộc tố microcystin thì có tới 19 chủng có kết quả phân tích gen phù hợp với kết quả phân tích bằng ELISA [5] Một số kết quả phân tích gen mã hóa ñộc tố microcystins của nhóm tác giả Viện Công nghệ môi trường trong năm 2006 – 2007 cũng cho thấy, gen mcyA có thể làm chỉ thị phân tử trong việc phát hiện nhanh VKL ñộc trong một số thủy vực nước ngọt (số liệu chưa công bố)

Những ví dụ trên chứng minh rằng phương pháp dựa trên phản ứng PCR là một công cụ ñầy triển vọng nhằm hiểu rõ hơn về sự phân bố của sinh vật tạo ra ñộc tố microcystin trong quần thể VKL Tuy nhiên, ñối với các mẫu ngoài tự nhiên, việc phát hiện VKL có tiềm năng tạo ñộc tố microcystin hay không ñôi khi nhầm lẫn do 2 lý do: Hiện tượng ña hình DNA tồn tại trong các

gen mcy, chẳng hạn như gen mcyB ở Microcystis sp hoặc sự xuất hiện của các gen mcy ở các cá thể không tạo ra ñộc tố microcystin, chẳng hạn như ñược tìm thấy ở M aeruginosa và P rubescens có thể do ñột biến Vấn ñề

này ñã ñược một số tác giả nghiên cứu khá kĩ Chẳng hạn, những ñột biến xen

ñoạn do sự tái tổ hợp tương ñồng ở gen mcyA, xảy ra với chủng M

aeruginosa K – 139 làm mất khả năng tạo ñộc tố microcystin Hay những biến ñổi xảy ra ở gen mcyB liên quan ñến việc tạo ra nhiều dạng microcystin khác nhau, ñiển hình là sự biến ñổi gen ở Planktothrix ñã tạo ra trên 25 dạng

microcystin khác nhau [25], [55], [58], [60], [87]

Những nghiên cứu của Tillett, 2001 cũng cho thấy gen mã hố cho các peptid synthetase được tập hợp thành các Operon lớn đối với những domain

cĩ trình tự bảo thủ lặp lại Sử dụng trình tự này cĩ thể xác định những gen

peptid synthetase của M aeruginosa Việc gây đột biến vào những gen này đã

tạo ra những chủng khơng độc ðiều này rất hữu ích khi tiến hành thiết kế các mồi để phát hiện những gen gây độc [83]

Trong một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Mỹ, các gen sinh

tổng hợp độc tố microcystin từ các chủng thuộc lồi M aeruginosa và 1 lồi thuộc chi Planktothrix đã được giải trình tự đầy đủ Những trình tự đã biết

này cho phép thiết kế các mẫu dị oligonucleotid để phát hiện một cách đặc

hiệu các gen này Trong khi một vài lồi thuộc chi Microcystis khơng rõ cĩ sản sinh độc tố hay khơng thì tất cả các chủng thuộc lồi M aeruginosa chứa

gen mã hố cho microcystin sẽ được xem xét như sinh vật sản sinh microcystin (gây độc) [34], [61]

Số lượng các cơng trình sử dụng phương pháp phân tử để phát hiện VKL độc tăng một cách nhanh chĩng Trước khi trình tự của cụm gen sinh tổng hợp microcystin được cơng bố, phương pháp dựa trên DNA để phát hiện

và phân tích phát sinh chủng loại VKL độc đã được khảo sát Gần đây, các trình tự của gen sinh tổng hợp microcystin đã trở thành phương tiện phát hiện phân tử rất đặc hiệu Những trình tự này được dùng mọi nơi trên thế giới để thiết kế và xây dựng bộ dị phát hiện gen độc dựa trên phương pháp PCR Phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi và được coi như một phương pháp chuẩn đốn để cảnh báo sớm sự nở hoa của nước cĩ VKL độc và rất nhạy vì sự khuếch đại sử dụng trực tiếp hệ gen của VKL Cùng với sự gia tăng số lượng các gen liên quan tới các con đường sinh tổng hợp độc tố VKL khác, phương pháp phân tử sẽ vẫn được phát triển để phát hiện những gen

1.4 Mối quan hệ giữa sinh trưởng của vi tảo và các tác nhân môi trường

Việc xác ñịnh các yếu tố môi trường liên quan ñến sự phát triển bùng phát của vi tảo trong thuỷ vực có ý nghĩa rất quan trọng về mặt khoa học và thực tiễn nhất là trong nuôi trồng thuỷ sản Trong môi trường ao nuôi thủy sản, tảo là nguồn thức ăn cho tôm, cá, nhuyễn thể Tuy nhiên mật ñộ tảo quá cao không những hạn chế sự tăng năng suất nuôi trồng thủy sản mà còn gây hại cho môi trường nước nuôi [2] Nguyên nhân dẫn ñến sự phát triển quá mức của vi tảo bao gồm: nồng ñộ các chất dinh dưỡng trong môi trường cao, các muối ña lượng chứa nitơ và photpho như nồng ñộ NH4 cao [19]; nhiệt ñộ nước ấm; cường ñộ chiếu sáng, pH cao, hàm lượng CO2 thấp [90] Trong ñó,

sự gia tăng nguồn dinh dưỡng chứa N và P trong môi trường nuôi vẫn ñược xem là yếu tố quan trọng nhất ñối với sự phát triển và bùng phát của vi tảo Theo Rapala, 1998; Willame, 2005, việc bổ sung thêm P và N là nhân tố quan trọng thúc ñẩy sự sinh trưởng của tảo lam [65], [88] Nồng ñộ dinh dưỡng trong môi trường và tế bào tảo cũng ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng của tảo lam nhiều hơn là tỷ lệ N:P [46], [74]

Sự nở hoa của nước chịu ảnh hưởng mạnh mẽ và ñồng thời không chỉ của các ñiều kiện ngoại cảnh như các các yếu tố dinh dưỡng, tính chất thuỷ lý, thuỷ hoá của cột nước, ñiều kiện thời tiết, mà còn cơ chế bên trong tế bào của các loài gây nở hoa ñảm bảo cho khả năng phát triển chiếm ưu thế trong những ñiều kiện stress [3] Dưới ñây là tổng quan về tác ñộng của các yếu tố môi trường lên sự phát sinh và phát triển của vi tảo trong ñầm ao nuôi tôm

1.4.1 Các yếu tố lý - hóa

1.4.1.1 Ánh sáng

Ánh sáng có vai trò quan trọng cho tảo phát triển Năng lượng ánh sáng cần cho tảo là loại ánh sáng nhìn thấy có bước sóng nằm trong vùng từ 400-

700nm Sắc tố màu hấp thụ ánh sáng của tảo chủ yếu là chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng ñỏ và lục Vì vậy những loài tảo ở sâu trong nước là những loài có sắc tố quang hợp phù hợp với khả năng hấp thụ ánh sáng có khả năng truyền sâu, tức là loại ánh sáng ít bị nước hấp thụ

ðối với VKL là những cơ thể ưa bóng, nghĩa là chúng duy trì sinh trưởng quang tự dưỡng ở cường ñộ ánh sáng tương ñối thấp do nhu cầu năng lượng ñể duy trì cấu trúc và chức năng của tế bào rất thấp so với những TVPD cạnh tranh khác Bên cạnh ñó VKL còn là những cơ thể dị dưỡng hoặc quang

dị dưỡng, bởi vậy chúng có thể sống trong những ñiều kiện ánh sáng rất thấp như ở ñáy hồ hoặc trong lớp cặn ñáy, hoặc nơi hoàn toàn không có ánh sáng như trong ruột ñộng vật [26] Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên cho thấy nhu cầu ánh sáng của VKL thay ñổi rất lớn phụ thuộc

loài Chẳng hạn Planktothrix (Oscillatoria) agardhii thích nghi với ñiều kiện ánh sáng thấp trong khi Microcystis lại có quang hợp tối ưu và khả năng

chống quang ức chế ở cường ñộ ánh sáng rất cao Một số loài khác lại có thể

thích nghi với cả ánh sáng cao lẫn thấp như Synechococcus trong nước ngọt

và Prochlorococcus trong nước biển [86] Ánh sáng là yếu tố môi trường cần

thiết cho sinh trưởng của VKL, tuy nhiên ánh sáng quá cao khi ñược các sắc

tố hấp thu có thể dẫn ñến việc sản ra những gốc ôxy làm tảo chết [26], [65]

ðể có thể thích nghi với những thay ñổi ánh sáng trong môi trường VKL sử dụng cơ chế thay ñổi ñộ nổi và thay ñổi bộ máy quang hợp

1.4.1.2 Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới nuôi trồng thủy sản Trước hết nhiệt ñộ ảnh hưởng ñến năng suất tự nhiên của hệ sinh thái ao hồ, ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp ñến hầu hết các thông số khác ñặc trưng cho

Hiện tượng nở rộ VKL tại các thủy vực nước ngọt là kết quả của những tác ñộng của nhiều yếu tố môi trường khác nhau Tuy nhiên, nhiệt ñộ cao và hàm lượng các chất dinh dưỡng cao ñược coi là những yếu tố môi trường quan trọng nhất quyết ñịnh sự phát triển lấn át của VKL trong thủy vực Nhiệt ñộ tối ưu cho sinh trưởng của VKL theo nhiều tác giả là khoảng 20-32oC [26], [40], [65], [68]

Nhìn chung, VKL có tốc ñộ sinh trưởng, hoạt ñộng quang hợp và hô hấp ở nhiệt ñộ tối ưu cao hơn so với những TVPD khác, do vậy VKL thường gây nở hoa nước vào mùa hè, khi nhiệt ñộ trong thuỷ vực khá cao và VKL phát triển lấn át các TVPD khác trong môi trường Nhiều tác giả cho rằng nhiệt ñộ cao trong thuỷ vực có thể là yếu tố chủ yếu quyết ñịnh sự phát triển của quần xã VKL dẫn ñến khả năng tạo sự nở hoa nước của VKL nước ngọt Tuy nhiên, nhiều tác giả khác lại cho rằng chỉ riêng yếu tố nhiệt ñộ có vẻ không ñủ ñể quyết ñịnh sự phát sinh và phát triển của loài VKL nào ñó [26]

Tác ñộng kết hợp của nhiệt ñộ và ánh sáng ñược xác nhận là ñóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và sự sản ra microcystins và anatoxin-a của

Anabaena spp mặc dù những nghiên cứu về tác ñộng này còn rất ít [66]

1.4.1.3 Thông số pH

Nước ao hồ có giá trị pH từ 6 - 7 sẽ chứa ít VKL hơn là trong các nguồn nước có pH cao hơn ðộ kiềm của nước cũng ảnh hưởng ñến thành phần của các nhóm tảo: nước có ñộ kiềm cao thường chứa ít tảo lam và nhiều tảo lục Những kết quả nghiên cứu về tác ñộng của pH (và nồng ñộ CO2) lên sinh trưởng của tảo còn khá ít, rời rạc và mâu thuẫn Chẳng hạn, King (1970) cho rằng nồng ñộ CO2 thấp và pH cao là ñiều kiện tiên quyết ñể VKL phát triển lấn át Shapiro (1972) cũng cho rằng VKL có sử dụng CO2 tốt hơn tảo lục ở nồng ñộ CO2 thấp do ñó làm giảm nồng ñộ CO2 tới mức chỉ có VKL mới có thể quang hợp và phát triển lấn át các TVPD khác Tuy nhiên ông ñã bác bỏ

giả thiết này khi nghiên cứu sự phát sinh và phát triển của Aphanizomenon flos-aquae và Anabaena flos-aquae trong hồ Squaw ở Wisconsin (Mỹ)

Shapiro ñã nhận thấy mặc dù có sự khác biệt rất lớn về giá trị pH và nồng ñộ CO2 giữa hai hồ, sự nở hoa nước gây ra bởi Aphanizomenon flos-aquae và

Anabaena flos-aquae xảy ra và ñạt ñỉnh ñiểm cùng lúc [63]

1.4.1.4 ðộ kiềm

Trong các ao hồ nuôi quảng canh, người ta cũng nhận thấy mối tương quan thuận chiều giữa ñộ kiềm, năng suất của tảo và năng suất nuôi thủy sản Tuy nhiên, sự kiện nêu trên chưa hẳn ñã là bằng chứng rằng nước có ñộ kiềm cao là thúc ñẩy năng suất tảo và của vật nuôi Nước có ñộ kiềm cao thường chứa nhiều các loại ion khác hơn là nước có ñộ kiềm thấp và nó ảnh hưởng tới

tỷ lệ của ñạm và lân trong nguồn nước

Nhìn chung, với ñộ kiềm thấp trong ao có bón phân thì ñộ kiềm tăng có tác dụng thúc ñẩy tảo phát triển nhanh hơn là trong ao không bón phân và có

ñộ kiềm cao Với ñộ kiềm cao hơn người ta chưa có ñược những bằng chứng sát thực Riêng trong các ao hồ nuôi cá rô phi có bón phân, người ta nhận thấy năng suất nuôi tăng lên khi tăng ñộ kiềm của nước tới 60 – 70mg/l [2]

1.4.1.5 ðộ muối

Giống như nhiều yếu tố ngoại cảnh khác như nhiệt ñộ quá cao hoặc lạnh, khô hạn , ñộ muối trong môi trường cũng có những tác ñộng lên sinh trưởng và phát triển của quần xã VKL trong thuỷ vực ðối với những loài VKL cố ñịnh N2, nồng ñộ muối trong môi trường tác ñộng trước hết ñến quá trình cố ñịnh N2, sau ñó ñến quang hợp và hô hấp Cường ñộ quang hợp và

hàm lượng chl.a của Microcystis firma và Synechocystis sp 6803 giảm mạnh

khi nuôi cấy ở nồng ñộ muối ức chế [16]