Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclono antibody) để chuẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi

Đề tài Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclono antibody) để chuẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi thuộc công trình nghiên cứu khoa học cấp bộ .Nôi dung gồm

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (MONOCLONO - ANTIBODY) ĐỂ CHUẨN ĐOÁN

NHANH BỆNH VIRUS TRÊN TÔM NUÔI

CNĐT: ĐINH THƯƠNG VÂN

8284

HÀ NỘI - 2010

NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà nội, ngày 5 tháng 10 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

(Monoclono-Antibody) để chẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi

Họ và tên: Đinh Thương Vân

Ngày, tháng, năm sinh: 31/07/1957 Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính

Điện thoại: Cơ quan: 04-37563386 Nhà riêng: 04-37673411

Mobile: 0904154789 Fax: 047914815

E-mail: thuongvan57@yahoo.co.uk

Tên cơ quan đang công tác: Viện Công nghệ sinh học

Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: 68/53/9 Đường Cầu Giấy , Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài:

Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam

Điện thoại: : 04-8362599 Fax: 04-8363144 E-mail: tnhai@ibt.ac.vn

Website: http://www.ibt.ac.vn/

Địa chỉ: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng cơ quan: Trương Nam Hải

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài : Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 28 tháng 4/ năm 2008 đến tháng 9/ năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 4/năm 2008 đến tháng 9/năm 2010

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

chuyển

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực

Mã số: KC.06/06-10

3 QĐ

2831/QĐ-BKHCN ngày

26/10/2007

QĐ về việc phê duyệt các tổ chức, cá nhân trúng tuyển chủ trì

06 đề tài cấp nhà nước năm 2008 thuộc chương trình Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực

thủy sản 1 miền Bắc CNSH tách chiết tinh

chế WSSV

- Thu thập các mẫu ấu trùng tôm (post larvae 10-15) nhiễm MBV

- Kiểm tra que thử tại các cơ sở nuôi tôm của Viện

WSSV

- Cung cấp 5000 tôm post nhiễm MBV

- Kiểm tra 200 que thử tại các cơ sở nuôi tôm

2 Viện Kỹ thuật

Hóa sinh và tài

liệu nghiệp vụ

Viện Kỹ thuật Hóa sinh và tài liệu nghiệp vụ

- Chọn màng phù hợp

để gắn sinh phẩm

- Tìm nồng độ thích hợp của các sinh phẩm

để gắn màng một cách hiệu quả nhất

- Xác định độ nhạy và

độ đặc hiệu và độ bền của que thử đã chế tạo

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Số

TT

Tên cá nhân đăng ký

theo Thuyết minh

Tên cá nhân đã tham gia

thực hiện

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1 TS Đinh Thương Vân TS Đinh Thương Vân Chủ nhiệm

2 TS Lê Thị Tâm TS Lê Thị Tâm Tham gia

3 PGS TS Đinh Duy

Kháng

PGS TS Đinh Duy Kháng Tham gia

4 TS Đỗ Thị Thảo TS Đỗ Thị Thảo Tham gia

5 TS Đồng Văn Quyền TS Đồng Văn Quyền Tham gia

6 ThS Hà Thị Thu ThS Hà Thị Thu Thư kí

7 TS Phạm Anh Tuấn Th.S Nguyễn Thị Thu

Hiền

Tham gia

8 ThS Nguyễn Hữu Ninh KS.Nguyễn Thị Phương Tham gia

9 CN Võ Anh Tú KS.Nguyễn Viết Vương Tham gia

10 ThS Lê Trọng Văn ThS Lê Trọng Văn Tham gia

11 ThS Bạch Thị Như Quỳnh Tham gia

Tham gia

tác, thay đổi công tác, học tập ở nước ngoài

1 Trao đổi kinh nghiệm với

BIOTEC Thái Lan về sản xuất

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1 Hội thảo Tổ chức 3 hội thảo cấp Viện Công nghệ sinh

học với mục đích thảo luận các kết quả nghiên cứu, nghiệm thu các chuyên đề

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

hoạch

Thực tế đạt được

Người,

cơ quan thực hiện

1 Tạo ra được quy trình công nghệ

3 Tạo ra được quy trình công nghệ

sản xuất bộ thử phát hiện nhanh,

4 Sử dụng quy trình công nghệ đã

tạo ra để sản xuất được được 500

bộ thử cho mỗi loại bệnh đạt chất

lượng tương đương hàng ngoại

nhập

8/2010 8/2010 Viện kỹ thuật

hóa sinh và tài liệu nghiệp vụ- Tổng cục kỹ thuật- Bộ Công an

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

3 Que thử phát hiện nhanh

WSSV

500 500 Độ nhạy và độ

đặc hiệu của que thử sẽ được đánh giá dựa trên việc

so sánh với kit của nước ngoài và các kỹ thuật khác

4 Que thử phát hiện nhanh

MBV

500 200 Độ nhạy và độ

đặc hiệu của que thử sẽ được đánh giá dựa trên việc

so sánh với kit của nước ngoài và

Polyhedrin của MBV

Thực tế đạt được

1 Báo cáo định kì 6

3 Báo cáo trung gian

7 Đào tạo sau đại học:

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Phiếu đăng kí bản quyền giải pháp hữu ích về que thử phát

hiện nhanh WSSV

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

- Đề tài đã ứng dụng một cách thành công các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc sản xuất thành công kháng thể đa dòng cũng như kháng thể đơn dòng và các que thử nhanh sử dụng kháng thể đơn dòng để chẩn đoán bệnh ở tôm nói riêng và thủy sản nói chung mà ởViệt Nam, cho đến nay chưa có cơ sở nào nghiên cứu sản xuất thành công kháng thể đơn dòng vì vậy các sản phẩm dạng II & III của đề tài có tính thời sự và khoa học cao

- Đã tạo ra những quy trình kỹ thuật như: quy trình công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein Polyhedrin của MBV Quy trình công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 của virus đốm trắng Quy trình công nghệ sản xuất bộ thử phát hiện nhanh WSSV và quy trình công nghệ sản xuất bộ thử phát hiện nhanh MBV góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chẩn đoán virus tôm nói riêng và chẩn đoán bệnh tôm nói chung, tăng cường quản lý nhà nước về nhập khẩu que thử chẩn đoán bệnh tôm

- Đưa công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng thành công cụ đắc lực cho công tác chẩn đoán, điều trị bệnh cho gia súc, vật nuôi và con người đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong lĩnh vực kháng thể đơn dòng

- Góp phần đưa sinh học phân tử kết hợp phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của công tác chẩn đoán và điều trị bệnh

- Góp phần nâng cao năng lực của cán bộ nghiên cứu tham gia đề tài, trong lĩnh vực kháng thể đơn dòng và góp phần đào tạo nhân lực, góp phần đưa nền khoa học nước ta từng bước hội nhập khu vực và quốc tế trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại sản xuất kháng thể đơn dòng tạo kit chẩn đoán nói chung và tạo kit chẩn đoán trong lĩnh vực thủy sản nói riêng

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

không cần đầu tư máy móc thiết bị đắt tiền, có thể thử ngay ngoài hiện trường là nhu cầu cấp thiết đối với người nuôi tôm hiện nay Trong kế hoạch tổng thể về phát triển nuôi trồng thủy sản, ngành nuôi tôm càng ngày càng được chú trọng và phát triển vì kim ngạch xuất khẩu tôm đã có những đóng góp rất lớn cho kim ngạch xuất khẩu chung của cả nước Việc ngăn ngừa, giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh trong ngành nuôi tôm cần phải được quan tâm đúng mức, trong đó, các kit chẩn đoán nhanh bệnh ở tôm đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực này

- Giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm tôm tăng thu nhập cho người nuôi tôm

do giá thành que thử sản xuất rẻ hơn nhập khẩu

Đưa nước ta hội nhập bình đẳng với trào lưu phát triển thủy sản công nghệ cao của khu vực

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo định kỳ I Kết quả Kiểm tra định

bào lai sinh kháng thể đơn dòng

3.Số liệu về tinh chế WSSV từ mô

của Cambarus clarkii

4 Sè liÖu vÒ thu nhận ấu trùng

tôm nhiễm MBV

5.Số liệu về tạo dịch báng trong

chuột BALB/c Thu nhận, tinh chế

2- Đã thu số liệu về KTDD đặc hiệu và có ái lực cao với VP28

tự nhiên của WSSV, gây MD, dung hợp tế bào lai

3- Thu số liệu và tinh chế WSSV từ 250 mẫu tôm nghi bị nhiễm

- Đã thu số liệu từ 167 mẫu nhiễm virus Tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng là 66,8%

4- Đã thu số liệu từ 98 mẫu nhiễm MBV xác định bằng PCA và soi mô Tỷ lệ nhiễm

là 79,2%

5- Thu số liệu về tạo dịch báng trong chuột BALB/c Thu nhận, tinh chế kháng thể đơn dòn Gây báng cho 10 chuột BALB/c thí nghiệm Kết quả đạt 60%KTDD tinh chế đạt 21,02mg/ml

thuần chủng BALB/c

12 Sè liÖu kiểm tra đáp ứng miễn

dịch của chuột bằng ELISA

13.Số liệu về các tế bào lai sinh

kháng thể đơn dòng có tính đặc

hiệu cao với polihedrin của MBV

14.CĐ: Kháng thể đa dòng, kháng

thể đa dòng kháng IgG của chuột

15.Số liệu sản xuất kháng thể đa

dòng kháng WSSV MBV

16.Số liệu sản xuất kháng thể đa

dòng kháng IgG của chuột

8-Thu số liệu ttừ 250 mẫu tôm nghi bị nhiễm MBV

9-Đang thu số liệu 10-Thu số liệu từ 198 con tôm nhiễm MBV được xác đinh bằng PCR và soi mô

11- Thu thập số liệu về sử dung polyhedrin tinh chế gây

MD cho chuột thuần chủng:10 chuột chia lam 5 lô

12- Chuột đáp ứng MD tôt nhất với KN VP28 liều 50µl/con/lần

13- Tế bào Myeloma dòng: P3X-Ag18 đạt 83,5%

Sp2/0-Ag10 đạt 89,82%

14- 15-16- Đã nêu được lý thuyết về KT đa dòng, sản xuất

KT đa dòng kháng IgG của chuột

1 Số liệu về chọn lọc các dòng tế

bào lai sinh kháng thể đơn dòng

2 Tạo dịch báng trong chuột

9 Thu thập số liệu nghiên cứu

Thu các số liệu về điểm nhận

dạng, xác định phản ứng trên màng, nồng độ, độ nhạy và độ đặc hiệu

của que thử đã chế tạo với các

kháng nguyên đã sản xuất trong

11 Các số liệu nghiên cứu kiểm

tra que thử trên tôm nhiễm bệnh

đốm trắng (WSSV)

Thu số liệu đầy đủ rõ ràng về

độ nhạy, dộ đặc hiệu, phản ứng chéo

1 Bản hướng dẫn kỹ thuật sử

dụng tiếp cận thị trường với que

thử WSSV và MBV

2 Báo cáo kết quả kiểm tra que

thử trên tôm nhiễm bệnh đốm

trắng (WSSV)

3 Báo cáo kết quả kiểm tra que

thử trên tôm nhiễm bệnh MBV

4.Que thử phát hiện nhanh WSSV

5.Que thử phát hiện nhanh MBV

6.Báo cáo tổng kết đề tài

- Hoàn thành bản hướng dẫn

kỹ thuật sử dụng tiếp cận thị trường với que thử WSSV và MBV đạt chất lượng như quy định trong hợp đồng

- Thu các kết quả kiểm tra que thử trên tôm nhiễm bệnh đốm trắng (WSSV) Hoàn thành báo cáo

- Thu các kết quả kiểm tra que thử trên tôm nhiễm bệnh MBV Hoàn thành báo cáo

- Hoàn thành 500 que thử phát hiện nhanh WSSV, đạt độ nhạy và độ đặc hiệu

- Hoàn thành 500 que thử phát hiện nhanh MBV, đạt độ nhạy

và độ đặc hiệu

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

MỤC LỤC HÌNH ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam 4

1.2 Một số đặc điểm của virus WSSV và MBV 7

1.2.1 Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV) 7

1.2.2 Monodon Baculovirus (MBV) 10

1.3 Kháng thể 12

1.3.1 Kháng thể đa dòng 14

1.3.2 Kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong chẩn đoán WSSV và MBV 15

1.3.2.1 Kháng thể đơn dòng 15

1.3.2.2 Kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh ở tôm 18

1.3.2.2.1 Lý thuyết chung về chọn lọc các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng 18

1.3.2.2.2 Cộng hợp kháng thể đơn dòng với chất nhũ vàng (Gold colloid) 20

1.3.3 Tình hình nghiên cứu về kháng thể đơn dòng và chế tạo que thử 21

1.4 Nghiên cứu lựa chọn màng trong chế tạo kit thử nhanh 24

1.4.1 Sơ đồ cấu tạo và bố trí các loại màng trong que thử dạng sắc ký miễn dịch 24

1.4.2 Màng hút mẫu 26

1.4.3 Màng mang kháng thể gắn vàng 27

1.4.4 Màng gắn kháng thể 28

1.4.5 Màng hấp thụ 33

1.4.6 Các loại nguyên liệu khác 35

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Vật liệu nghiên cứu 36

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 36

2.2.1 Hóa chất 36

2.2.2 Thiết bị 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3.1 Gây miễn dịch trên động vật 37

2.3.1.1 Gây miễn dịch cho chuột 37

2.3.2 Phương pháp lấy tế bào nuôi dưỡng (feeder cell) 38

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào Myeloma 39

2.3.4 Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể 40

2.3.5 Tạo dòng tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể đơn dòng 41

2.3.6 Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng 42

2.3.7 Phương pháp tinh sạch kháng thể 42

2.3.8 Phương pháp ELISA sàng lọc các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng có ái lực và tính đặc hiệu cao 44

2.3.10 Phương pháp western blot 45

2.3.11 Phương pháp tinh chế polyhedrin 46

2.3.12 Phương pháp nghiên cứu chế tạo que thử 49

2.3.12.1 Xử lý màng 51

2.3.12.2 Qui trình định lượng kháng thể lên vạch test và control line 52

2.3.12.3 Qui trình đưa kháng thể cộng hợp vàng lên màng 54

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein VP28 của vỏ virus đốm trắng 56

3.1.1 Thiết kế vector biểu hiện pET21 – VP28 trong tế bào E.coli 56

3.1.2 Biểu hiện gen vp28 trong tế bào E.coli BL21 DE3 57

3.1.3 Tinh sạch protein VP28 tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+ 57

3.1.4 Thu nhận kháng thể kháng VP28 58

3.2 Qui trình công nghệ tạo kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 61

3.2.1 Gây miễn dịch cho chuột bằng protein VP28 tái tổ hợp gây bệnh đốm trắng (WSSV) 61

3.2.2 Dung hợp tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên VP28 với tế bào myeloma để tạo tế bào lai hybridoma sinh kháng thể đơn dòng .62

3.2.3 Tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 66

3.2.4 Kiểm tra tính đặc hiệu của dòng tế bào bằng Elisa 68

3.2.5 Nhân nuôi lượng lớn tế bào hybrid kháng VP28 tự nhiên dòng WS-E4C2 .69

3.2.6 Thu nhận kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 kháng VP28 70

3.2.7 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus WSSV gây bệnh đốm trắng trên tôm .71

3.2.8 Tinh sạch kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 kháng VP28 72

3.2.9 Xác định một số đặc tính của kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 .72

3.3 Gắn chất nhũ vàng với kháng thể đơn dòng kháng VP28 74

3.4 Tinh chế protein polyhedrin và virion của MBV 75

3.4.1 Xét nghiệm mẫu tôm bị nhiễm MBV 75

3.4.2 Tinh chế protein polyhedrin và virion của MBV 77

3.5 Qui trình công nghệ tạo kháng thể đơn dòng kháng polyhedrin của MBV 80

3.5.1 Gây miễn dịch cho chuột bằng protein polyhedrin tự nhiên tinh sạch từ tôm bệnh còi (MBV) 80

3.5.2 Kết quả dung hợp tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên polyhedrin với tế bào myeloma để tạo tế bào lai hybridoma sinh kháng thể đơn dòng 82

3.5.3 Tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 86

3.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu của dòng tế bào thu được 88

3.5.5 Thu nhận kháng thể đơn dòng kháng polyhedrin 89

3.5.6 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein polyhedrin của MBV 90

3.5.7 Tinh sạch kháng thể đơn dòng kháng MBV 91

3.6 Nuôi cấy, duy trì và bảo quản dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng WSSV, MBV 92

3.6.1 Tỉ lệ sống sau các đợt cấy chuyển 92

3.6.2 Kết quả đánh thức tế bào 93

3.7 Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh chẩn đoán virus WSSV và MBV 95

3.7.1 Chọn màng và nồng độ phù hợp để gắn sinh phẩm 95

3.7.1.1 Lựa chọn màng hút mẫu 95

3.7.1.2 Lựa chọn và tối ưu hoá hệ đệm 97

3.7.1.3 Xử lý màng hút mẫu 97

3.7.2 Lựa chọn và phương pháp xử lý màng mang kháng thể gắn vàng 98

3.7.2.1 Lựa chọn màng mang kháng thể gắn vàng 98

3.7.2.2 Xử lý màng chứa kháng thể cộng hợp 99

3.7.2.3 Lượng chứa của màng chứa kháng thể cộng hợp 100

3.7.2.4 Tối ưu hoá hệ đệm xử lý màng chứa kháng thể cộng hợp 100

3.7.2.5 Thử nghiệm khả năng giải phóng kháng thể khỏi màng 101

3.6.2.6 Thử nghiệm tốc độ dẫn mẫu 102

3.7.3 Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật của màng đến các chỉ tiêu của test 103

3.7.3.1 Khoá các gốc tự do trên màng trải kháng thể 105

3.7.4 Kết quả lựa chọn các thành phần khác của test 107

3.7.4.1 Tấm đế 107

3.7.4.2 Túi vỏ ngoài của test 107

3.7.4.3 Chất chống ẩm 107

3.7.5 Nghiên cứu lựa chọn nồng độ các sinh phẩm sử dụng trong que thử 108

3.7.5.1 Định dạng phản ứng nhận biết WSSV/MBV trên màng que thử 108

3.7.5.2 Tối ưu nồng độ kháng thể bắt giữ tại test line và control line cho test kiểm tra nhanh WSSV 110

3.7.5.3 Tối ưu nồng độ kháng thể bắt giữ tại T và C cho test kiểm tra nhanh MBV 111

3.7.5.4 Kết quả tối ưu nồng độ kháng thể cộng hợp vàng 112

3.8 Bản hướng dẫn kỹ thuật sử dụng và tiếp cận thị trường với que thử WSSV và MBV 112

3.8.1 Cấu tạo và tính năng của que thử 112

3.8.2 Hướng dẫn sử dụng 113

3.9 Xác định giới hạn phát hiện của test 114

3.9 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu 115

3.10 Thống kê các kết quả đề tài chính đã đạt được so với đăng kí trong hợp đồng KH&CN với Bộ Khoa học và Công nghệ 117

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119

4.1 KẾT LUẬN 119

4.2 KIẾN NGHỊ 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

PHỤ LỤC 140

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BM Tế bào lai (Hydridoma cell)

T Test

C Control

FAO Food and Agriculture Organization

MỤC LỤC BẢNG

Tên bảng TrangBảng 1.1 Thông số kỹ thuật của màng do hãng Milipore sản xuất 30

Bảng 1.2 Thông số kỹ thuật của màng do hãng Whatman sản xuất 31

Bảng 2.1 Các thông số và trình tự cặp mồi 47

Bảng 3.2 Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng

kháng VP28 trên 2 dòng tế bào myeloma

Bảng 3.6 Định lượng hàm lượng protein polyhedrin có trong mẫu tinh

chế

79

Bảng 3.7 Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng

kháng polyhedrin trên 2 dòng tế bào myeloma

84

Bảng 3.8 Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh

kháng thể đơn dòng kháng VP28 tự nhiên

87

Bảng 3.9 Kết quả thu dịch báng của chuột 89

Bảng 3.10 Tỷ lệ tế bào lai sống sau các lần cấy chuyển 92

Bảng 3.11 Khả năng sống sót của tế bào sau khi đánh thức 93

Bảng 3.12 Thông số kỹ thuật của màng hút mẫu có bản chất sợi thủy

tinh

96

Bảng 3.14 Thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp 101

Bảng 3.16 Kết quả xác định mức độ dương tính giả và âm tính giả 115

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.2 Protein polyhedrin sau tinh chế và chụp ảnh dưới kính hiển

vi điện tử (theo C.Boosangnongchokying 2006)

12

Hình 2.4 Màng sau khi trải kháng thể 54 Hình 3.1 Điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi VP28NdeI và

Hinh 3.5 Kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyênVP28 – kháng thể

kháng VP28

60

Hình 3.6 Hoạt độ kháng thể kháng VP28 của các kháng huyết thanh

thu từ các chuột được gây miễn dịch

62

Hình 3.7 Tế bào Myeloma dòng Sp2/0 (A) và P3X-Ag14 (B) sau 5

ngày nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS

63

Hình 3.8 Tế bào lai giữa tế bào lympho B tách từ lách chuột sau miễn

dịch và tế bào myeloma (A) dòng Sp2/0 (B) dòng P3X sau 7 ngày

nuôi trong môi trường chọn lọc HAT

64

30 giếng có giá trị OD cao nhất từ quá trình sàng lọc ban đầu

Hình 3.10 (A) Clone tế bào ở giếng D8C1; (B) Clone tế bào ở giếng

E4C2 sau quá trình tách dòng

68

Hình 3.11 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do

05 dòng tế bào tạo ra trên các kháng nguyên khác nhau

69

Hình 3.12 Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng ở các độ pha loãng

khác nhau của (A): dịch báng sau li tâm; (B): Dịch kháng thể tinh

sạch

73

Hình 3.13 Đánh giá phản ứng đặc hiệu của kháng thể đơn dòng

kháng VP28 tái tổ hợp với kháng nguyên tự nhiên ở tôm mắc bệnh

Hình 3.16 Mẫu tôm nhiễm MBV xuất hiện thể ẩn bằng kỹ thuật

nhuộm mẫu cắt mô tế bào

76

Hình 3.17 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra với cặp mồi MBV,

WSSV, YHV, IHHNV, TSV

77

Hình 3.20 Protein polyhedrin sau tinh chế được kiểm tra trên gel

acrylamid 12%

78

Hình 3.21 Hoạt độ kháng thể kháng polyhedrin của các kháng huyết

thanh thu từ các chuột được gây miễn dịch

81

Hình 3.22 Tế bào Myeloma dòng Sp2/0 (A) và P3X-Ag14 (B) sau 5

ngày nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS

82 Hình 3.23 Tế bào lai giữa tế bào lympho B tách từ lách chuột sau 84

miễn dịch và tế bào myeloma (A) dòng Sp2/0 (B) dòng P3X sau 7

ngày nuôi trong môi trường chọn lọc HAT

Hình 3.24 Kiểm tra giếng có tế bào lai cao nhất 85 Hình 3.25 (A) Clone tế bào ở giếng D8C1; (B) Clone tế bào ở giếng

E4C2 sau quá trình tách dòng

87

Hình 3.26 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do

05 dòng tế bào tạo ra trên các kháng nguyên khác nhau

88

BCA Protein Assay kit và dựng đường chuẩn cũng như phương trình

tính hàm lượng mẫu kiểm tra

91

Hình 3.28 Tế bào WSSV (A) Tế bào lai WSSV khi mới đánh thức;

(B) Tế bào lai WSSV sau 3 ngày nuôi cấy

94

Hình 3.29 Khả năng sinh kháng thể đơn dòng kháng VP28 và

polyhedrin của 2 dòng tế bào lai WSSV và MBV sau khi cất trong

nito lỏng 3 tháng và 6 tháng

95

Hình 3.33 Màng chứa kháng thể cộng hơp dạng cuộn trước và sau khi

rải kháng thể

98

Hình 3.34 Một số mẫu màng chứa kháng thể cộng hợp 98

Hình 3.39 Sơ đồ bố trí kháng thể trên que thử 109

Hình 3.41 Nồng độ kháng thể tại vùng T và vùng C của kit WSSV 111

Hình 3.43 Lựa chọn tỷ lệ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu cho que thử

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nuôi trồng thuỷ sản (trong đó có ngành nuôi tôm) là một trong những ngành kinh tế quan trọng, đóng góp một phần đáng kể trong kim ngạch thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu

Á Trong đó ngành nuôi tôm là một trong những ngành công nghiệp mũi nhọn mang lại doanh thu nhiều tỷ đô la Mỹ hàng năm Theo thông báo của Hội nghị genome tôm sú họp ở Bangkok Thái Lan (ngày 2-3 tháng 10 năm 2004), thu nhập do xuất khẩu tôm của các nước châu Á đã vượt quá 4 tỷ USD mỗi năm Sản lượng tôm nuôi của Thái Lan đạt 540.000 tấn trong năm 2009, tăng 9% so với năm 2008 (459.000 tấn) Giá trị dự kiến đạt 2,8 tỉ USD, tăng so với 2,5 tỉ USD năm 2008 Riêng về tôm sú, xuất khẩu tôm của Thái Lan trong 10 tháng đầu năm 2009 tăng 8% về khối lượng lên 230.855 tấn và 12,24% về giá trị lên 2,2 tỉ USD

Ở Việt Nam, thủy sản cũng là một ngành kinh tế mũi nhọn trong sự nghiệp kinh tế của đất nước, là một trong số 10 nước xuất khẩu thủy sản hàng đầu thế giới Hàng năm, xuất khẩu thủy sản đã mang lại cho đất nước một khoản ngoại tệ rất lớn, trong đó tôm là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh

tế cao Các thị trường xuất khẩu thủy sản quan trọng nhất của Việt Nam là

Mỹ, EU, Nhật và Hàn Quốc, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu

Theo thống kê, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của nước ta đạt khoảng 4,3

tỷ USD năm 2009, thấp hơn năm 2008 (4,5 tỷ USD) Dự đoán năm 2010 xuất khẩu thủy sản đạt 4,8 tỷ USD Trong năm 2009, sản lượng thu hoạch tôm của các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long: tôm sú 280.000 tấn và tôm thẻ chân trắng đạt 11.000 tấn Sản lượng thuỷ sản năm 2009 ước tính đạt 4847,6 nghìn tấn, tăng 5,3% so với năm 2008, trong đó tôm 537,7 nghìn tấn, tăng 7,2% Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm sú năm 2009 ước tính khoảng 549,1 nghìn ha, giảm 10,7% so với năm trước Ngành công nghiệp này đang bị tổn thất nghiêm

virus gây bệnh cho tôm, hai tác nhân quan trọng được quan tâm đặc biệt, là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh còi (MBV)

Khi không có thuốc trị bệnh do virus gây ra cho tôm thì việc phát hiện sớm bệnh, đặc biệt bệnh virus ở tôm giống sẽ hạn chế được nhiều rủi ro vì các yếu tố môi trường và thức ăn dễ kiểm soát hơn

Việc nghiên cứu xác định bệnh tôm do các loại virus trên gây ra đã được một số cơ sở nghiên cứu bằng các phương pháp khác nhau như hóa tế bào, PCR Tuy nhiên, các phương pháp này khá tốn kém, đòi hỏi phòng thí nghiệm

với trang thiết bị khá đắt tiền Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu

ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclono-Antibody)

để chẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi” với mục tiêu phát triển công

nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng để tạo bộ thử phát hiện nhanh, chính xác bệnh virus trên tôm nuôi

- Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bộ kit thử phát hiện nhanh, chính xác WSSV và MBV trên tôm nuôi với chất lượng tương đương hàng ngoại nhập nhưng với giá thành thấp hơn

Ý nghĩa khoa học và thực tế của đề tài

Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng là công nghệ nền cho việc sản xuất nhiều sinh phẩm chẩn đoán và điều trị bệnh ở người và vật nuôi Hoàn chỉnh được công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam sẽ có đóng góp có ý nghĩa cho khoa học và công nghệ của nước nhà

Viện Công nghệ Sinh học coi kháng thể đơn dòng là chiếc chìa khóa mở

ra công nghệ chế tạo các sinh phẩm chẩn đoán của Viện Vì vậy, từ lâu Ban lãnh đạo Viện đã quan tâm đầu tư để có được công nghệ tạo ra sản phẩm này Đối với các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu như Viện Kỹ thuật hóa sinh

và tài liệu nghiệp vụ, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, kết quả của đề tài sẽ là cầu nối để cho ra đời các sản phẩm chẩn đoán nhanh bằng que thử và đưa vào ứng dụng thực tiễn, trước mắt là cho chẩn đoán các bệnh virus ở tôm sau đó là các bệnh khác dựa trên nguyên lý chế tạo với sinh phẩm chủ lực là kháng thể đơn dòng

Việc phát hiện nhanh các bệnh virus ở tôm nuôi bằng que thử nhanh,

dễ sử dụng, không cần đầu tư máy móc thiết bị đắt tiền, có thể thử ngay ngoài hiện trường là nhu cầu cấp thiết đối với người nuôi tôm hiện nay Trong kế hoạch tổng thể về phát triển nuôi trồng thủy sản, ngành nuôi tôm càng ngày càng được chú trọng và phát triển vì kim ngạch xuất khẩu tôm đã có những đóng góp rất lớn cho kim ngạch xuất khẩu chung của cả nước Việc ngăn ngừa, giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh trong ngành nuôi tôm cần phải được quan tâm đúng mức, trong đó, các kit chẩn đoán nhanh bệnh ở tôm đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực này

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, sản lượng tôm trên toàn thế giới không ngừng tăng trưởng Theo công bố của Tổ chức nông- lương thế giới (FAO), lượng tôm trên toàn thế giới gần hai thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175% Theo báo cáo của hội nghị tôm toàn cầu (năm 2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới tăng bình quân khoảng 10,5%/ năm; năm 1999 là 1.084.000 tấn, năm 2000 là 1.143.000 tấn và đến 2003 đạt 1.860.000 tấn (Bùi Quang Tề, 2003) Giá trị xuất khẩu đã có xu thế tăng liên tục Sản lượng đạt cao nhất vào năm 2005 với hơn 184 ngàn tấn, năm 2006 giảm xuống còn hơn 131 ngàn tấn

Nuôi tôm đóng góp khoảng 40% tổng xuất khẩu thủy sản chuyển giao giá trị (Phi et al., 2009/PhD) Ngành nuôi trồng thủy sản đã bắt đầu sản xuất

thương mại xuất khẩu đầu những năm 1980 với tôm sú (P.monodon) ban đầu

Năm 2007, sản lượng tôm quốc gia được khoảng 350.000 tấn, trong đó

khoảng 270.000 tấn P monodon và 80.000 tấn tôm thẻ chân trắng Từ đó, nuôi trồng P.monodon đã là một trong những ngành phát triển nhất đạt mức

sản xuất toàn quốc là 350.000-400.000 tấn/năm Như vậy, Việt Nam cũng đã đóng góp đáng kể vào sự phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản Trong năm

2009, ước tính rằng tổng số xuất khẩu chuyển giao giá trị của P.monodon đạt

2 tỷ USD

Cũng theo thống kê mới nhất của FAO về xuất khẩu tôm sú trên thế giới,

số liệu năm 2006, Việt Nam tiếp tục 4 năm liền đứng thứ 1 về giá trị xuất khẩu, đạt 1,25 tỷ USD Về sản lượng, Việt Nam đứng thứ 4, với 131.615 tấn, sau Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia Năm 2008, xuất khẩu tôm sú đạt 1,62 tỷ USD

Song song với việc gia tăng diện tích nuôi trồng và sản lượng là việc bùng phát dịch bệnh Ở Thái Lan, dịch bệnh đã làm giảm sản lượng nuôi tôm

từ 225.000 tấn năm 1995 xuống còn 160.000 tấn năm 1996 Ở Đài Loan, năm 1987 có 88.000 tấn nhưng do dịch bệnh nên năm 1993 chỉ đạt 12.000 tấn Hai nước Indonesia và Philippin trong khoảng thời gian 1993 – 1995, sản lượng tôm giảm khoảng 48,55%

Ở Việt Nam, hiện nay tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi đã xảy ra trầm trọng Trong giai đoạn tết Canh Dần, nhiều người nuôi tôm ở Long An điêu đứng vì tôm nuôi bị nhiễm bệnh và chết ngay từ đầu vụ Cho đến thời điểm hiện tại, diện tích thiệt hại trên toàn tỉnh đã trên 255,95 ha, tập trung chủ yếu

ở xã Tân Chánh, huyện Cần Đước

Vụ tôm năm 2009, Thái Bình nuôi thả 275 triệu con tôm giống trên diện tích 3.560 ha, tăng hơn năm ngoái 60 ha Tuy nhiên, dịch bệnh đốm trắng đã

và đang phát sinh trên đàn tôm nuôi tại địa bàn 2 huyện Thái Thụy và Tiền Hải, gây thiệt hại lớn cho các hộ nuôi tôm

Chỉ tính riêng 10 tỉnh Nam Bộ thiệt hại do bệnh tôm gây ra vào cuối năm 1994, đã lên đến 50 triệu USD Tại Đồng bằng sông Cửu Long, năm

2001, diện tích nuôi tôm là 404.911 ha với sản lượng 143.822 tấn đạt 80% sản lượng tôm của cả nước Tuy nhiên, đến năm 2002 có tới 30 - 60% tổng diện tích thả nuôi bị nhiễm bệnh, sản lượng tôm giảm mạnh, gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm

Theo báo cáo của bộ thuỷ sản về tình hình dịch bệnh tôm năm 2002, trong quý I và hầu hết thời gian nuôi hiện tượng tôm bị bệnh chết xảy ra liên tục Ở các tỉnh phía nam như Phú Yên, Minh Hải, Kiên Giang, Sóc Trăng, Nha Trang, Khánh Hoà, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 268.500 ha/437.295 ha chiếm 61,4% diện tích nuôi Ở các tỉnh phía Bắc và Miền Trung như Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An diện tích bị bệnh là 8.500 ha chiếm 24,28% diện tích nuôi tôm

Theo số liệu thống kê của Phòng bệnh học thuộc Trung tâm nghiên cứu

MBV và bệnh do vi khuẩn Trong đó cả những vùng mới chuyển đổi cũng xuất hiện bệnh và lây lan rộng (Báo cáo bộ Thuỷ sản, 2002; Thu Hằng, Việt Oanh, 2006; Số liệu thống kê nông - lâm - thuỷ sản Việt Nam 1975 – 2000) Năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích nuôi tôm bị bệnh và chết là 30083ha Các tỉnh, thành ven biển từ

Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước Quảng Ninh và Hải Phòng có tỷ lệ tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV là 37,5 – 57,7% Thanh hoá có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh Nghệ An có 9,1 – 47,8% diện tích bị bệnh WSSV, 25.6 – 30.4% bị bệnh MBV, 25 – 54,5% bị bệnh YHV Hà Tĩnh có

150 ha nuôi tôm bị bệnh, trong đó có 67 ha bị bệnh WSSV với 27 ha có tôm nuôi bị chết (Hà Anh, 2004; Như Phong, 2003; Bùi Quang Tề, 2003)

Trong những tháng đầu năm 2006, một số tỉnh đã xảy ra tôm chết do bị bệnh Theo số liệu của sở Thuỷ Sản Cà mau, diện tích tôm nuôi bị chết trong những tháng đầu năm 2006 lên đến 200.000 ha (Trần Vũ, Trần Phương, 2006) Tại Tiền Giang, bệnh tôm đã gây thiệt hại 2593 ha với 5265 triệu con giống (Thu Hằng, Việt Oanh, 2006) Tỉnh Quảng Bình có tới 55 ha nuôi tôm

sú bị bệnh (Tuyết Minh, 2006)

Các dịch bệnh này chủ yếu do virus gây nên Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra gần 20 loài hay nhóm virus khác nhau gây bệnh cho tôm, nhưng chỉ có 4 loài virus được xác định là gây thiệt hại nhiều nhất và có tác động nghiêm trọng nhất đến nền công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới trong thời gian qua, đó là: virus gây hội chứng đốm trắng (white syndrome virus – WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (yellow heard virus – YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mô (infectous hypodermal and hemato poietic necrosis virus – IHHNV) và virus gây hội chứng Taura (Taura syndrome virus – TSV)

1.2 Một số đặc điểm của virus WSSV và MBV

1.2.1 Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome

virus-WSSV)

WSSV là tác nhân gây bệnh được quan tâm đặc biệt vì những tác hại nghiêm trọng của chúng đến nền công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới (Takahashi et al 1994, Chou et al 1995, Wongteerasupaya et al 1995, Lo et

al 1996, Flegel 1997, Karunasagar et al 1997, Hsu et al 1999) WSSV được

phát hiện đầu tiên vào năm 1982 ở tôm P japonicus nuôi tại vùng Đông Bắc

Đài Loan (Chou et al 1995), tiếp đến là Nhật Bản, năm 1993 từ tôm nhập khẩu của Trung Quốc và nhiều nơi khác như: Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam Tháng 1 năm 1999, virus gây bệnh đốm trắng cũng đã được phát hiện thấy ở các nước Châu Mỹ: Nicaragua, Honduras, Guatemala

và Panama Theo các nhà nghiên cứu thì tôm ở bán cầu Tây có có độ nhạy cảm cao với WSSV và YHV Hai virus này là nguyên nhân gây ra vụ các dịch bệnh rất nghiêm trọng và làm cho nền công nghiệp nuôi tôm lâm vào tình trạng khó khăn (D.V Lighter, 2000) Sau thời gian này, WSSV đã gây chết tôm hàng loạt và gây tổn thất nặng nề cho ngành công nghiệp nuôi tôm, đặc biệt là tôm sú (Inouye et al 1994, Chou et al 1995, Wongteerasupaya et

al 1995, Lo et al 1996, Karunasagar et al 1997,Hossain et al 2001)

Các dấu hiệu lâm sàng đặc trưng của bệnh này là bên trong vỏ giáp xuất hiện các đốm trắng trơn ở mang, chân có đường kính khoảng 0,5 đến 2 mm (Takahashi et al 1994, Chou et al 1995, Wang, et al 1995, Lo et al 1996) Các triệu chứng tiếp theo bao gồm bỏ ăn, lờ đờ, mất lớp vỏ cutin, chuyển màu từ phớt hồng sang màu hồng, gan tụy thường có màu trắng hoặc hơi vàng (Nakano et al 1994, Durand et al 1997, Karunasagar et al 1997, Otta et al 1999) Khi bị bệnh đốm trắng, khả năng miễn dịch của tôm yếu đi dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân có hại: vi khuẩn, nấm… Tỷ lệ tôm

nhất ở giai đoạn 30 - 45 ngày tuổi Khi tôm đạt cỡ 12 g/con trở lên thì thời gian ủ bệnh có thể kéo dài hơn nên tôm có thể phát triển đạt cỡ thương phẩm trước khi phát bệnh cũng như chết hàng loạt

WSSV là virus có vỏ lớn, dạng hình que WSSV chứa ADN sợi kép (Wongteerasupaya et al 1995, Durand et al.1996) với kích thước khá lớn khoảng 300kb (Van Hulten et al 2001) và kích thước virion là khoảng 70 - 150nm x 180 - 250nm Các kết quả phân tích di truyền cho thấy WSSV là đại diện của nhóm virus mới Whispovirus Toàn bộ hệ gen của WSSV phân lập ở Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan đã được xác định trình tự Virion của virus được tách từ tôm nhiễm bệnh chứa 5 loại protein cấu trúc chính là vp28, vp26, vp24, vp19 và vp15 trong đó vp28 và vp26 là 2 protein thuộc vỏ virus

Các kết quả phân tích về gen cho thấy có sự tương đồng về trình tự nucleotid và trình tự axit amin giữa VP26 và VP28 (41%) Điều này cho giả thuyết rằng, các gen protein cấu trúc này có thể được hình thành bằng cách nhân đôi gen và sau đó phân hoá thành các protein có chức năng khác nhau trong virus Sự hiểu biết về cấu trúc gen này của virus gây bệnh đốm trắng cũng như những protein chính của virus là tiền đề cho các nghiên cứu về quá trình sao chép và cơ chế gây nhiễm bệnh của virus, giúp cho việc nghiên cứu tìm ra biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả (Đinh Thương Vân et al, 2005) Việc phát hiện sớm bệnh là đặc biệt quan trọng, góp phần ngăn ngừa lan tràn dịch bệnh, giảm thiệt hại cho người dân Có nhiều phương pháp chẩn đoán WSSV: các phương pháp thông thường như phương pháp kính hiển vi, phương pháp giải phẫu bệnh Tuy nhiên, những phương pháp này mức độ chính xác không cao, dễ bị nhầm lẫn các bệnh với nhau, hoặc khi tôm đã bị bệnh nặng dẫn đến sai lầm trong điều trị

Hiện nay, trên thế giới trong đó có Việt Nam đã áp dụng các phương pháp hiện đại trong chẩn đoán bệnh tôm như:

(a) Nhiễm trùng WSSV có thể ở dạng thể cấp với các dấu hiệu lâm sàng

và có sự thay đổi về mô bệnh học, nhưng cũng có thể ở dạng thể mãn và chỉ

có thể phát hiện được bằng một số kỹ thuật nhạy như PCR (Lo et al.1996,

1997, Hossain et al.2001) Phương pháp PCR (Nunan LM, Lightner DV, 1997) sử dụng các mồi (primer) được thiết kế dựa vào trình tự ADN của 2

virus giống Baculo của tôm Penaeid đó là Baculovirus penaei (BP) và

Monodon baculovirus (MBV) trong đó Nested PCR sẽ làm tăng thêm độ

nhạy của phản ứng tới hơn 100 lần (Lo et al 1996);

(b) Kĩ thuật PCR và lai ADN in situ (Kanachanphum P et al, 1998);

(c) Dùng kháng thể đơn dòng kháng VP28 để phát hiện WSSV bằng phương pháp ELISA Đây là phương pháp nhanh, nhạy và đặc hiệu Phương pháp này được xem như có hiệu quả tương đương với phương pháp PCR một bước trong phát hiện WSSV (Liu W et al, 2002; Van Hulten et al, 2000); (d) Các phương pháp khác như: dot blot nitrocellulose enzyme immunoassay (Nadala and Loh, 2000), ELISA (Nadala et al 1997, Sahul Hameed et al 1998) và western blotting (Nadala et al 1997, Magbanua et al 2000)

Các kĩ thuật nói trên đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh

và cho kết quả nhanh, nhạy, chính xác và đặc biệt có thể phát hiện được mầm bệnh ở giai đoạn nhiễm bệnh sớm Tuy nhiên, các phương pháp này thường có chi phí cao, hoá chất, thiết bị phức tạp và đòi hỏi các kỹ thuật viên phải có trình độ cao

Vì thế, việc ứng dụng kháng thể đơn dòng vào sản xuất các que thử nhanh có độ chính xác cao hiện được xem là có tính khả thi và hợp lí hơn cả Đối với bệnh đốm trắng trên tôm, một số nước phát triển trong khu vực châu

Á như Nhật Bản, Thái Lan v.v đã sản xuất thành công các que thử nhanh có

sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện sớm virus WSSV

1.2.2 Monodon Baculovirus (MBV)

MBV là virus được tìm thấy đầu tiên ở tôm P monodon (Lightner and Redman 1981) thuộc giống Baculovirus Họ Baculoviridae là virus có vật liệu

(Rohrmann 1986), thuộc nhóm virus có hình thể ẩn trong nhân tế bào mà nó

cảm nhiễm MBV đã được xác định và gây nhiễm ở các loài tôm sau: P

monodon, P.merguiensis, P.semisulcatus, P.kerathurus, P.vannamei, P.esculentus, P.penicillatus, P indicus, Metapenaeus ensis (Johnson and

Lightner 1988, Lightner 1988, Chen et al 1989, Ramasamy et al 1995, Vijayan et al 1995, Karunasagar et al 1998) MBV là tác nhân gây bệnh rất thường xuyên ở tôm, nhưng virus này có độc lực không cao khi gây nhiễm ở

P monodon (Nash et al 1988) Tuy nhiên, đôi khi cũng gây ra tỷ lệ chết rất

cao ở giai đoạn post-larvae (tỷ lệ chết có thể lên tới trên 90%)

Bệnh MBV có thể cảm nhiễm ở nhiều giai đoạn phát triển của tôm Bệnh MBV không phải chỉ phụ thuộc vào mức độ cảm nhiễm cao hay thấp mà còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường ao nuôi Tôm bị nhiễm MBV thường giảm đáng kể tốc độ sinh trưởng, gan-tụy chuyển sang màu vàng nhạt đến màu nâu Nếu tôm giống thả nuôi có mức độ nhiễm MBV cao thì có thể gây chết hàng loạt trong hai tuần đầu, nếu không gây chết loại virus này cũng làm tôm mẫn cảm hơn với các tác nhân khác nên tôm nuôi thường hay bị còi cọc, chậm lớn và thường xuất hiện các dấu hiệu khác như: đen mang, cụt râu,

đỏ thân Một dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của những con tôm bị nhiễm MBV là

sự tồn tại các thể ẩn hình cầu trong nhân tế bào gan, nhờ vậy có thể phát hiện được dễ dàng bệnh này dưới kính hiển vi MBV thường đồng nhiễm với một

số tác nhân virus như IHHNV, HPV, WSSV và và vi khuẩn như Vibrio spp,

Pseudomonas spp

Các phương pháp chẩn đoán thông thường bao gồm nhuộm trực tiếp với malachite green hoặc mô bệnh học để phát hiện MBV Các kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, Nested PCR, sử dụng các mẫu dò phân tử

đã được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán MBV Ngoài ra, các kỹ thuật miễn dịch như ELISA, cũng được ứng dụng trong phát hiện MBV MBV thường lây truyền qua đường phân Phân từ tôm nhiễm bệnh lây qua trứng và

ấu trùng Phương pháp tốt nhất để loại trừ nhiễm trùng MBV là xác định chính xác tôm mẹ mang virus và loại trừ các mẻ ấu trùng nhiễm bệnh Cũng như các kĩ thuật dùng trong chẩn đoán WSSV, đây là các kĩ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác và đặc biệt có thể phát hiện được mầm bệnh ở giai đoạn nhiễm bệnh sớm, nhưng chi phí cao và đòi hỏi các kỹ thuật viên phải có trình độ cao Do đó, một số nước phát triển trong khu vực châu Á như Nhật Bản, Thái Lan v.v đã sản xuất thành công que thử nhanh sử dụng kháng thể đơn dòng kháng Polihedrin để phát hiện sớm virus MBV (Boonsanongchokying et al 2006)

Polyhedrin là một loại protein của MBV bao bọc xung quanh hạt virus và hình các vật thể (occlussion body) trong các tế bào biểu mô gan tụy của tôm

sú (Penaeus monodon) Các vật thể này tồn tại trong nhân của các tế bào biểu

mô gan tụy và ruột của tôm sú nhiễm MBV Nhiễm trùng MBV có thể phá vỡ

Hinh 1.1 Tôm nhiễm MBV (nhuộm xanh malachit)

Độ phóng đại 100 x

Polyhedrin là loại protein tinh thể đặc trưng của virus thuộc họ Baculoviridae

Polyhedrin có vai trò bao bọc xung quanh hạt virus, giữ cho hạt virus ổn định trong điều kiện biến đổi của môi trường Polyhedrin của MBV có khối lượng phân tử là 58 kDa

Hình 1.2 Protein polyhedrin sau tinh chế và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử (theo C.Boosangnongchokying 2006)

1.3 Kháng thể

Kháng thể (Antibody) hay còn gọi là các Globulin miễn dịch (Immunoglobulin), được sinh ra khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích Kháng thể có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh

ra nó Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc phân

tử kháng nguyên quyết định mà do các nhóm quyết định kháng nguyên (Epitope) của kháng nguyên quyết định Epitope là toàn bộ hay chỉ là một phần của phân tử kháng nguyên Epitope không những quyết định tính đặc hiệu của kháng thể tương ứng mà còn quyết định vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho mẫn cảm có thể gắn với kháng nguyên đó Nếu trên kháng nguyên có một loại “nhóm quyết định kháng nguyên” thì kích thích cơ thể sinh ra một loại kháng thể tương ứng và sự kết hợp đặc hiệu đó là duy nhất, nếu kháng nguyên có nhiều “nhóm quyết định kháng nguyên” thì sẽ sinh ra nhiều loại kháng thể tương ứng Tuy nhiên, chúng tuân theo nguyên tắc

nhóm quyết định kháng nguyên nào thì kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng của nhóm ấy và các nhóm này kết hợp đặc hiệu độc lập nhau

Khi các tế bào trình diện (TBTD) đưa trình epitope cho các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (TQMD) thông qua phần đệ trình của mình là MHC (Major Histocompatibility Complex) các tế bào có TQMD sẽ đón nhận epitope nhờ các recepter của chúng (ở tế bào T gọi là TCR) Khi một tế bào TQMD đón nhận một epitop (KN), chúng sẽ biến đổi ở mức hoạt động gen

di truyền và ghi nhận đặc điểm của epitope đó Sự ghi nhận này mang tính đặc hiệu rất cao, nghĩa là một tế bào T hay B khi đã nhận diện một quyết định kháng nguyên (epitope) nó sẽ tạo ra protein mang dấu ấn của epitope đó

để sinh ra chỉ một loại kháng thể đặc hiệu cho epitope đó

Một kháng nguyên được đưa vào cơ thể một con vật sẽ tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) sản sinh ra một họ kháng thể kháng lại kháng nguyên

đó Huyết thanh của con vật này có các kháng thể có tính đặc hiệu khác nhau, có lực liên kết KN - KT khác nhau, do các tế bào miễn dịch khác nhau tổng hợp ra, được gọi là kháng thể đa dòng (Polyclonal Antibody)

Nếu chọn ra một tế bào (B) có khả năng tổng hợp ra kháng thể kháng kháng nguyên có tính đặc hiệu và ái lực KN- KT cao, nhân nó lên thành tập hợp của nhiều tế bào có cùng một nguồn gốc là một tế bào ban đầu, tạo thành dòng tế bào (B), thì kháng thể do dòng tế bào này tạo ra cũng sẽ có tính đặc hiệu và ái lực KN - KT cao Kháng thể do dòng tế bào này tạo ra được gọi là kháng thể đơn dòng (KTĐD)

Điều khó khăn là tế bào lympho B mẫn cảm có khả năng sinh kháng thể

có đời sống ngắn (chỉ vài ngày) và khả năng nhân lên (sinh sản) cũng không

cao (cả in vivo và in vitro) Vào năm 1975, G Kohler và Cesar Milstein đã

giải quyết được vấn đề này bằng cách lai tế bào ung thư tủy (Myeloma (M)

là một loại tế bào tiền ung thư có khả năng sinh sản nhanh và gần như “bất

có khả năng sống liên tục, sinh sản nhanh, vừa giữ được khả năng tổng hợp kháng thể có chất lượng cao Từ tế bào lai BM này sẽ tạo được dòng tế bào lai mang hệ gen của cả tế bào Lympho B mẫn cảm, và của cả tế bào ung thư

Myeloma M Kĩ thuật lai tế bào để sản xuất KTĐD in vitro ngày nay được

hoàn thiện bởi nhiều tác giả

1.3.1 Kháng thể đa dòng

Sự hình thành kháng thể được thực hiện bởi lympho bào B theo học thuyết chọn dòng của Burnet (1957) Theo thuyết này, mỗi dòng tế bào lympho B trong cơ thể đã được đặt sẵn chương trình cho việc tổng hợp chỉ một loại kháng thể Trên bề mặt tế bào này đã có sẵn một thụ thể để nhận biết

và tương tác với một và chỉ một kháng nguyên hay nói đúng hơn là một quyết định kháng nguyên duy nhất Sau khi tiếp xúc với kháng nguyên, lympho bào

B sẽ được kích thích tăng sinh và biệt hóa thành các tương bào (các tế bào plasma) để tổng hợp ra các kháng thể Một số lympho bào B sau khi tiếp xúc kháng nguyên không biệt hóa thành các tế bào plasma mà trở thành các tế bào ghi nhớ miễn dịch có đời sống lâu dài, đáp ứng miễn dịch này gọi là đáp ứng ghi nhớ (anamnestic response)

Von Behring (1880) chứng minh rằng huyết thanh của một động vật gây miễn dịch chống lại độc tố của bệnh bạch hầu có chứa một chất trung hoà được độc tố đó Chất này được ông gọi là kháng thể, nghĩa là một loại protein

có đặc tính chống lại các thể vi khuẩn gây bệnh Ngày nay, tất cả các phân tử kháng thể được chứng minh là các globulin có chức năng miễn dịch và có bản chất glycoprotein Căn cứ vào cấu trúc và chức năng, kháng thể được chia làm 5 lớp là IgG, IgM, IgA, IgE, IgD Các phân tử kháng thể tham gia vào hệ thống miễn dịch nhờ hai chức năng:

+ Có khả năng liên kết với kháng nguyên ít nhất ở hai vị trí tiếp nhận đối với kháng nguyên Khả năng liên kết với kháng nguyên có được là do sự biến