Bài giảng phân tích thành phần thực phẩm phương pháp sắc ký khí

GC HPLC Carbonhydrat 1 • ðường không bay hơi, do ñó cần phải chuyển hóa thành chất bay hơi • Quá trình dẫn xuất hóa bằng phản ứng hóa học • Dạng dẫn xuất tạo ra acetates, ethyl ethers, and trimethylsi[.]

• ðường không bay hơi, do ñó cần phải chuyển hóa thành

chất bay hơi

• Quá trình dẫn xuất hóa bằng phản ứng hóa học

• Dạng dẫn xuất tạo ra: acetates, ethyl ethers, and

trimethylsilyl ethers

• Phương pháp dẫn xuất ñược lựa chọn phụ thuộc vào

ñiều kiện nhiệt ñộ của GC cần thiết cho bay hơi dẫn

xuất ñường

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Gas Chromatography (Analysis for individual CHO’s)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Reduction to Alditol (for reducing sugars)

BƯỚC:

• ðường bị khử ñến alditols bằng cách sử dụng sodium

borohydride, NaBH4(See Fig 10-7)

• Khử aldehydes và ketones ñến alcohols bậc 1

• Alditols (the alcohol form) sau ñó acetylated với acetic

anhydride ñể tạo ra alditol peracetates, có thể phân tích

GC (acetic acid derivatives are volatile)

Phương pháp dẫn xuất khác

Acetates

• Xử lý sugar với acetyl chloride hoặc acetic anhydride –

“Reflux” khoảng 4h với sự hiện diện của dung môi hữu cơ

Methyl ethers

• Xử lý sugar với either methyl iodide/silver oxide or dimethyl

sulfate/NaOH

TMS ethers

• Xử lý sugars với pyridine và a methylsilyl (silica based)

media

PHƯƠNG PHÁP HPLC

You’ve Got a Problem to Solve

I need a quantitative separation of carbohydrates in some

of our products

as soon as possible.

I’ll need a separation technique

I’ll get

on it!

KỸ THUẬT PHÂN TÁCH

I have two separation techniques in my lab,

High Performance Liquid Chromatography

and Gas Chromatography Which should I use?

So sánh HPLC và GC

Tính chất bay hơi Tính phân cực

HPLC

• Không yêu c ầ u bay h ơ i

• M ẫ u ph ả i hòa tan

trong pha ñộ ng

GC

• M ẫ u ph ả i bay h ơ i

HPLC

GC

• Phân tách c ả ch ấ

phân c ự c và ch ấ

không phân c ự c

• Phân tách c ả ch ấ

phân c ự c và ch ấ

không phân c ự c

So sánh HPLC và GC

Nhiệt ảnh hưởng ñến mẫu Kích thước phân tử mẫu

HPLC

• Phân tích ti ế n hành ở

nhi ệ ñộ b ng ho ặ c

th ấ p h ơ n nhi ệ ñộ

phòng

GC

• M ẫ u ph ả i ch ị u

ñượ c nhi ệ ñộ

cao

HPLC

GC

• Không có gi ớ i h ạ n trên

• Trong th ự c t ế ñộ hòa tan b ị gi ớ i h ạ

• Thông th ườ ng <

500 amu (Da)

So sánh HPLC và GC

HPLC

• M ẫ u ph ả i ñượ c l ọ c

tr ướ c

• M ẫ u nên ở trong dung

môi gi ố ng pha ñộ ng

GC

• Dung môi ph ả i bay

h ơ i, và thườ ng có

ñ i ể m sôi th ấ p h ơ n

ch ấ t phân tích

HPLC

GC

• Kích th ướ c m ẫ u ph ụ

thu ộ c vào kích th ướ c

c ộ t i.d.

• Th ườ ng 1 - 5 µ L

So sánh HPLC và GC

Cơ chế phân tách Detectors

HPLC

• C ả pha t ĩ nh và pha

ñộ ng ñề u có ả nh

h ưở ng lên kêt qu ả

phân tách

GC

•Pha t ĩ nh ch ỉ có

ch ứ c n ă ng v ậ n chuy ể

HPLC

GC

• Ph ổ bi ế n UV-Vis

• Ph ổ bi ế n là FID,

So sánh HPLC và GC

Phân tích các thành phần như thế nào?

Carbohydrates

1 fructose

2 Glucose

3 Saccharose

4 Palatinose

5 Trehalulose

6 isomaltose

Zorbax NH 2 (4.6 x 250 mm)

70/30 Acetonitrile/Water

1 mL/min Detect=Refractive Index

1

2 3 4

5

mAU

6

Phân tách

Separation in based upon differential migration between the stationary and

mobile phases Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g C18, Silica

Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column.

Injector

Detector Column

Solvents

Mixer

Pumps

High Performance Liquid Chromatograph

Waste

31

Injector

Detector Column

Solvents

Pumps

Mixer

Chromatogram

Start Injection mAU

time

The Chromatogram

Injection

to

tR mAU

time

tR

to - elution time of unretained peak

tR- retention time - determines sample identity

Area or height is proportional

to the quantity of analyte.

HPLC Analysis Parameters

Mobile Phases

Flow Rate Composition Injection Volume Column

Oven Temperature

Modes of High Performance Liquid

Chromatography

Phase

Mobile Phase

Neutrals

Weak Acids

Weak Bases

Reversed Phase

C18, C8, C4 cyano, amino

Water/Organic Modifiers

Ionics, Bases, Acids Ion

Pair

C-18, C-8 Water/Organic

Ion-Pair Reagent Compounds not

soluble in water

Normal Phase

Silica, Amino, Cyano, Diol

Organics

Ionics Inorganic Ions Ion

Exchange

Anion or Cation Exchange Resin

Aqueous/Buffer Counter Ion High Molecular Weight

Compounds

Polymers

Size Exclusion

Polystyrene Silica

Gel Filtration-Aqueous Gel Permeation-Organic

1/ SUPELCOSIL LC-NH2 Column

2/ SUPELCOGEL Columns