Nghiên cứu sản xuất thuốc lipidan điều trị rối loạn lipid máu

Đây là bài thuốc kinh nghiệm đã được sử dụng dưới dạng thuốc sắc, dùng để điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trong nhiều năm cho kết quả khả quan.. Một số nghiên cứu về việc sử dụng c

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC

LIPIDAN ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Phạm Vũ Khánh

Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Y - Dược học cổ truyền Việt Nam

8444

HÀ NỘI - 2011

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC LIPIDAN

ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

Học viện YDHCT Việt Nam

PGS TS Phạm Vũ Khánh

HÀ NỘI - 2011

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST alanin amino transferase

DĐVN III Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ 3

DĐVN IV Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ 4

MN/PCE tỷ lệ vi nhân/tế bào hồng cầu đa sắc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 3

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 Sự chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể 4

2 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh rối loạn lipid máu 5

3 Tình hình nghiên cứu bào chế thuốc điều trị hội chứng rối loạn lipid máu 6

3.1 Ngoài nước 6

3.2 Trong nước 8

4 Quan niệm của y học cổ truyền về hội chứng rối loạn lipid máu 10

4.1 Nguyên tắc điều trị chứng đàm ẩm 10

4.2 Phương pháp điều trị đàm 10

5 Về thuốc LIPIDAN 11

5.1 Trần bì 11

5.2 Bán hạ nam 12

5.3 Bạch linh 12

5.4 Mộc hương nam 12

5.5 Hậu phác nam 13

5.6 Ngũ gia bì chân chim 13

5.7 Sơn tra 13

5.8 Xa tiền tử 14

5.9 Sinh khương 14

CHƯƠNG 2 15

NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

1 Nguyên liệu nghiên cứu 15

1.1 Công thức bài thuốc LIPIDAN 15

1.2 Hỗn dịch và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 15

2 Đối tượng nghiên cứu 16

3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Nghiên cứu bào chế viên nang LIPIDAN 16

3.2 Đánh giá các chỉ số kỹ thuật của viên nang LIPIDAN 17

3.3 Theo dõi độ ổn định của thuốc 20

3.4 Xác định độ an toàn của thuốc 20

3.5 Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên động vật thí nghiệm 26

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

4.1 Địa điểm 28

4.2 Thời gian 28

5 Xử lý số liệu 28

6 Cách chọn mẫu, cỡ mẫu 28

6.1 Cách chọn mẫu 28

6.2 Cỡ mẫu 28

7 Các biện pháp khống chế sai số 29

8 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3 30

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

1 Quy trình sản xuất viên nang LIPIDAN 30

1.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 30

1.2 Sơ chế nguyên liệu 30

1.3 Phương pháp bào chế cao khô LIPIDAN 31

1.4 Quy trình bào chế viên nang LIPIDAN 34

1.5 Xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm 37

1.6 Theo dõi độ ổn định của thuốc 37

2 Độ an toàn của thuốc 38

2.1 Độc tính cấp 38

2.2 Độc tính bán cấp 39

2.3 Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản 46

3 Tác dụng của thuốc LIPIDAN trên thực nghiệm 49

3.1 Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của LIPIDAN theo cơ chế ngoại sinh 49

3.2 Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của LIPIDAN theo cơ chế nội sinh 52

CHƯƠNG 4 54

BÀN LUẬN 54

1 Nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN 54

1.1 Kiểm nghiệm thuốc nguyên liệu, bán thành phẩm 54

1.2 Nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN 54

2 Độc tính của thuốc LIPIDAN 55

2.1 Độc tính cấp và độc tính bán cấp 55

2.2 Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản 56

3 Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc LIPIDAN 57

CHƯƠNG 5 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng rối loạn chuyển hóa lipid máu là một trong những tình trạng thường gặp ở các nước phát triển, có xu hướng tăng ngày càng nhanh ở các nước đang phát triển Đây là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc hình thành bệnh vữa xơ động mạch Ở nước ta, bệnh vữa xơ động mạch - với các biến chứng như suy động mạch vành, đột tử, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não trước đây ít gặp - đang có xu hướng tăng nhanh theo nhịp độ phát triển của xã hội, dự báo sẽ trở thành một bệnh đáng lo ngại cho sức khỏe của người cao tuổi Ngoài bệnh vữa xơ động mạch, rối loạn lipid máu cũng được coi là yếu tố nguy

cơ quan trọng của một số bệnh tim mạch khác như: tăng huyết áp, đái tháo đường [1],[2],[9] Theo tài liệu của Tổ chức Y tế thế giới, ở các nước phát triển,

tử vong nhiều nhất là do bệnh tim (32%) mà chủ yếu là do vữa xơ động mạch, rồi đến tai biến mạch máu não (13%), nhiều hơn hẳn các loại bệnh khác [9] Giải quyết rối loạn chuyển hóa lipid máu đã trở thành một mục tiêu trong các biện pháp dự phòng tiên phát và thứ phát của các bệnh đó

Công thức thuốc LIPIDAN được thành lập dựa trên cơ sở lý luận của y học

cổ truyền Đây là bài thuốc kinh nghiệm đã được sử dụng dưới dạng thuốc sắc, dùng để điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trong nhiều năm cho kết quả khả quan

Để có thể sản xuất các chế phẩm thuốc cổ truyền trên dây chuyền công nghiệp đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định của Bộ Y tế; tạo điều kiện dễ dàng trong việc bảo quản và sử dụng thuốc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình sản xuất thuốc ở quy mô pilot

2 Xây dựng tiêu chuẩn của thuốc LIPIDAN.

3 Thử tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc trên súc vật thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu chủ yếu:

- Nghiên cứu quy trình sản xuất thuốc LIPIDAN quy mô pilot

- Xác định độ an toàn của thuốc (độc tính cấp, bán cấp, ảnh hưởng của

thuốc trên di truyền và sinh sản)

- Thử tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc trên súc vật thí

nghiệm

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm (nguyên liệu, bán thành phẩm, thành

phẩm).

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Sự chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể

Trong cơ thể, lipid được chuyển hóa theo hai chu trình: ngoại sinh và nội sinh

- Chu trình ngoại sinh: lipid sau khi được đưa vào cơ thể qua đường thức

ăn, một phần được tiêu hóa ngay từ tá tràng; tại đây, dưới tác dụng của men lipase, các acid béo được chuyển thành các dạng tự do, từ đó hấp thu vào cơ thể theo đường tĩnh mạch cửa để vào gan, tham gia vào chu trình nội sinh Còn lại, phần lớn lipid từ thức ăn kết hợp với muối mật thành dạng nhũ tương (gọi là chylomicron) rồi được hấp thu qua đường bạch mạch ruột để vào tuần hoàn chung

- Chu trình nội sinh: đây là chu trình tạo ra phần lớn lượng lipid trong cơ thể Tại gan, các sản phẩm chuyển hóa của cơ thể như: acetyl Co-enzym A, glycerol-3-phosphate sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp thành acid béo và glycerin, từ đó tạo thành lipid trong cơ thể

Lipid được hấp thu vào cơ thể qua đường thức ăn và lipid được hình thành từ con đường nội sinh tại gan đều được đưa vào tuần hoàn chung bằng cách gắn với các apoprotein để tạo thành lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL - Very low density lipoprotein) mà thành phần chủ yếu là triglycerid

VLDL theo đường tuần hoàn tới mô mỡ, sau khi trao phần lớn triglycerid cho

mô mỡ, tỷ trọng tăng lên và lần lượt biến thành lipoprotein tỷ trọng trung gian (IDL - Intermediate density lipoprotein) rồi lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL - Low density lipoprotein) gồm đa số là cholesterol và phospholipid

Sau khi trao cholesterol cho các tế bào theo nhu cầu, LDL chuyển thành lipoprotein tỷ trọng cao (HDL - High density lipoprotein) HDL có tác dụng vận chuyển cholesterol ra khỏi các mô ngoại vi về gan nếu mô thừa chất này [10] Tác dụng của lipid trong cơ thể:

- Triglycerid được sử dụng vào việc cung cấp năng lượng cho cơ thể

- Cholesterol, phospholipid và một số ít triglycerid tham gia cấu tạo nên màng tế bào, màng các bào quan ở bào tương, thực thi một số chức năng trong tế bào Cholesterol còn là nguyên liệu ban đầu để tạo vitamin D, hormon sinh dục, hormon thượng thận và muối mật

Một người được coi là có chỉ số lipid máu bình thường khi:

- Cholesterol: < 5,2mmol/l (200mg/dL)

- HDL-C: ≥ 0,9mmol/l (35mg/dL)

- LDL-C: < 3,4mmol/l (130mg/dL)

- Triglycerrid: 1,7mmol/l - 2,3mmol/l (150mg/dL - 200mg/dL) [2], [14], [15], [24]

2 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh rối loạn lipid máu

Khi quá trình chuyển hóa lipid theo hai chu trình ngoại sinh và nội sinh diễn

ra bình thường thì sẽ không xảy ra tình trạng rối loạn lipid máu Tình trạng này chỉ xảy ra khi các yếu tố tạo nên hai chu trình này bị tác động gây thừa hoặc thiếu [10] Các yếu tố đó bao gồm:

- Ăn quá nhiều chất béo bão hòa sẽ trực tiếp làm tăng lipid máu, đồng thời làm tăng acetyl Co-enzym A (là nguyên liệu để tổng hợp lipid tại gan) Chất béo bão hòa có trong thức ăn có mỡ, đặc biệt là sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt mỡ,

bơ động vật, dầu dừa, dầu cọ, các loại bánh như bích quy, ga tô

- Ăn quá nhiều chất béo không bão hòa và không sử dụng các thức ăn chứa chất béo bão hòa trong thời gian dài sẽ làm giảm nồng độ cholesterol trong máu

Cơ chế làm hạ lipid máu của các acid béo không bão hòa hiện nay chưa rõ, nhưng chất xơ sợi của thức ăn làm acid mật không thể tái hấp thu từ ruột vào máu; thiếu acid mật, gan sẽ dùng cholesterol tạo acid mật, do đó làm giảm cholesterol

- Ít vận động dẫn tới tình trạng béo phì: theo Tổ chức Y tế thế giới, béo phì

là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe Tình trạng này gây nên sự tăng lipid một cách bất thường trong máu

- Uống rượu, hút thuốc lá cũng là những nguyên nhân gây rối loạn lipid máu

- Rối loạn lipid máu thứ phát: đái tháo đường, rối loạn chức năng một số tuyến nội tiết (tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận )

+ Đái tháo đường có kèm theo rối loạn lipid máu thường gặp ở người mắc đái tháo đường typ 2: do lượng glucose được đưa vào cơ thể quá nhiều, lượng insulin do tụy bài tiết ra không đủ để đáp ứng cho việc vận chuyển glucose trong cơ thể, gây nên tình trạng đái tháo đường; đồng thời, glucose được vận chuyển vào cơ thể quá nhiều sẽ tới gan để tham gia vào quá trình tạo thành acid béo và triglycerid, từ đó gây rối loạn lipid máu

+ Rối loạn chức năng một số tuyến nội tiết: một số tuyến nội tiết như tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận bài tiết các hormon (GH, ACTH, tyrosin, corticoid, adrenalin, noradrenalin) có tác dụng tham gia vào quá trình

chuyển hóa lipid trong cơ thể Sự rối loạn chức năng của các tuyến nội tiết sẽ gây nên tình trạng rối loạn lipid máu

- Ngoài ra, tình trạng rối loạn lipd máu còn có tính chất gia đình hoặc liên quan đến gen di truyền [2], [4], [14], [15], [24]

3 Tình hình nghiên cứu bào chế thuốc điều trị hội chứng rối loạn lipid máu

đã chứng minh hiệu lực của thuốc

- Tác dụng: thuốc uống không bị hấp thụ qua niêm mạc ruột, không bị các men tiêu hoá tác động, có khả năng trao đổi ion Cl- với acid mật, làm cho acid mật ở dạng liên kết không bị hấp thu trở lại mà theo phân để thải ra ngoài; cắt chu trình ruột - gan của acid mật và làm giảm cholesterol, LDL-C, tăng nhẹ HDL-C Thuốc có thể làm tăng triglycerid và VLDL

- Tác dụng không mong muốn: dễ gây đầy bụng, buồn nôn, táo bón, cản trở hấp thu các vitamin tan trong lipid và một số thuốc khác (digitalis, thuốc chống đông máu, hormon tuyến giáp) khi qua ruột

3.1.2 Acid nicotinic (Dilexpal, Novacyl) [1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]

Các nghiên cứu chứng minh tác dụng của thuốc: Coronary Drug Protect (1975), CLAS (Cholesterol Lowering Atherosclerosis Study, 1987), FATS (Familial Atherosclerosis Treatment Study, 1990)

- Tác dụng: với liều cao 2 - 6g/ngày, acid nicotinic làm giảm VLDL; giảm triglycerid do ức chế quá trình tiêu lipid ở tổ chức mỡ; làm giảm lượng acid béo cần thiết cho gan tổng hợp VLDL; tăng chuyển hoá VLDL, qua đó giảm LDL Ngoài ra, thuốc còn làm giảm lipoprotein(a), tăng nhẹ HDL

- Tác dụng không mong muốn: dễ gây rối loạn tiêu hoá, cảm giác nóng rát

dạ dày, suy thận, tăng nhãn áp

- Do dùng liều cao và có nhiều tác dụng không mong muốn nên thuốc ít được dùng ở nước ta hiện nay

3.1.3 Các acid béo không no omega-3 (Maxepa) [1], [2], [10], [14], [15],

[17], [24]

Nghiên cứu DART (Diet and Reinfaction Trial, 1989) dùng chế độ ăn nhiều

cá hoặc Maxepa trong 2 năm thấy giảm 16% tái phát nhồi máu cơ tim, 29% tử vong so với placebo

- Tác dụng: các acid béo không no họ omega-3 được chiết xuất từ cá biển,

có tác dụng làm giảm triglycerid và VLDL máu là chính; giảm nhẹ cholesterol, LDL; tăng nhẹ HDL (hiệu lực chưa bằng Fibrat); làm giảm nguy cơ huyết khối

do tác động đến chuyển hoá của prostaglandin

- Thuốc ít có tác dụng không mong muốn

- Tác dụng: giảm dòng acid béo về gan, giảm tổng hợp VLDL, tăng độ thanh thải VLDL, giảm hình thành LDL nhỏ và đặc dễ gây vữa xơ động mạch, giảm oxy hoá LDL Kết quả là làm giảm cả triglycerid và cholesterol, giảm VLDL và LDL, tăng HDL; các fibrat còn làm giảm kết tập tiểu cầu, giảm fibrinogen, acid uric máu Các fenofibrat còn làm giảm lượng lipoprotein(a) gemfibrozil còn làm tăng tổng hợp apoproteinAI và AII

- Tác dụng không mong muốn: đầy bụng, buồn nôn, ỉa lỏng, mẩn ngứa, có thể tăng men gan, yếu cơ, sỏi mật

- Tác dụng: ức chế men HMGCoA reductase làm cản trở quá trình nội sinh cholesterol trong tế bào, tăng tổng hợp các cảm thụ cho LDL để tăng thoái giáng LDL theo con đường các cảm thụ Các statin làm giảm cholesterol là chính, làm

giảm nhẹ triglycerid và tăng nhẹ HDL

- Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hoá, đau đầu, nổi mẩn, đôi khi tăng các men gan, yếu cơ

Tuy nhiên, đa số các sản phẩm trên đều có những tác dụng không mong muốn, đặc biệt là khi người bệnh cần điều trị trong một thời gian dài [1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]

Để hạn chế tác dụng không mong muốn của thuốc, giúp cho người bệnh yên tâm khi sử dụng, các nhà khoa học đã hướng đến việc nghiên cứu các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, trong đó có nghiên cứu sản xuất và sử dụng quả hướng thiên (Sky fruit) của Larry Brookes (Mỹ) Một số nghiên cứu về việc sử dụng các sản phẩm của sky fruit kết hợp với tân dược cho thấy hiệu quả hạ lipid máu, giảm được các hiện tượng lâm sàng gây khó chịu cho người bệnh khi chỉ dùng tân dược điều trị [18]

Trong lĩnh vực y học cổ truyền, có một số công trình nghiên cứu của Trung Quốc sử dụng công nghệ bào chế hiện đại để bào chế thuốc cổ truyền điều trị hội chứng này như: nấu cao, chế thành viên “Giáng chỉ linh phương”; “Trà đa phân”

do tỉnh An Huy, Trung Quốc sản xuất [49], [50]

Đa số các trường hợp dùng thuốc y học cổ truyền điều trị hội chứng rối loạn lipid máu dưới dạng cao lỏng hoặc thang sắc, không tiện lợi cho người sử dụng

3.2 Trong nước

Nước ta có nguồn dược liệu tự nhiên phong phú, có nền y học cổ truyền lâu đời và nhiều kinh nghiệm Đồng thời, liệu trình điều trị hội chứng rối loạn lipid máu thường kéo dài, các thuốc điều trị có nguồn gốc tổng hợp thường gây nhiều tác dụng không mong muốn, tạo tâm lý không yên tâm cho người bệnh Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các vị thuốc, bài thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, có tác dụng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu, hạn chế các tác dụng không mong muốn của thuốc và phạm vi chỉ định rộng rãi là một việc hết sức cần thiết

Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của thuốc cổ truyền Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu mới dừng lại ở việc đánh giá tác dụng của các bài thuốc trên thực nghiệm và lâm sàng như:

3.2.1 Nghiên cứu độc vị

- Nghiên cứu tác dụng dược lý cây ngưu tất về tác dụng hạ cholesterol máu

và hạ huyết áp [22]

- Bước đầu đánh giá tác dụng hạ cholesterol máu của alliso (tỏi) [18]

- Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu trên chế phẩm Bidentin bào chế

từ rễ cây ngưu tất [2]

- Bước đầu đánh giá tác dụng điều trị cholesterol máu cao của ngưu tất [26]

- Nghiên cứu ứng dụng củ nghệ làm thuốc hạ cholesterol máu [20]

- Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống tăng lipid máu của cây câu

3.2.2 Nghiên cứu bài thuốc

- Nghiên cứu bài thuốc Giáng chỉ ẩm trong điều trị hội chứng rối loạn lipid máu [15]

- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc THB94 trong điều chỉnh rối loạn lipid máu thể đàm thấp [1]

- Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh hội chứng rối loạn lipid máu thể phong đàm của Bán hạ bạch truật thiên ma thang [30]

- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc HHKV lên một số chỉ số lipid máu ở thỏ và chuột [25]

- Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh hội chứng rối loạn lipid máu của bài thuốc Nhị trần thang gia giảm [14]

- Nghiên cứu tác dụng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu của viên BKC [24]

- Đánh giá tác dụng hạ lipid máu và tăng lực của viên Curpenin trên một số chỉ tiêu lâm sàng và cận lâm sàng [2]

- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc TTII trên bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipid máu [1]

- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của chế phẩm “RUVINTAT” trên bệnh nhân tăng huyết áp và bệnh nhân rối loạn lipid máu [32]

- Nghiên cứu tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của viên cholestin [2]

Về các công trình nghiên cứu sản xuất thuốc: hiện nay chỉ có một vài công

trình nghiên cứu sản xuất thuốc hạ lipid máu từ dược liệu như: viên BIDENTIN của Viện dược liệu, viên Cholestin của công ty Dược phẩm Trung ương V được cấp số đăng ký sản xuất lưu hành toàn quốc

4 Quan niệm của y học cổ truyền về hội chứng rối loạn lipid máu

Hội chứng rối loạn lipid máu không có trong y văn của y học cổ truyền Cho đến nay nhiều nhà chuyên môn vẫn quan niệm đàm ẩm như là một trong những yếu tố chính gây nên hội chứng này [1], [2], [14], [15]

Dựa trên nhiều nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng, người ta thấy giữa hội chứng rối loạn lipid máu và chứng đàm thấp nội trở có nhiều điểm tương đồng [2], [10]:

- Yếu tố thể chất do tiên thiên quyết định, thường là tiên thiên bất túc, yếu

tố này có thể hiểu tương tự như yếu tố di truyền của y học hiện đại

- Yếu tố ăn uống (ẩm thực): do ăn quá nhiều các chất cao lương, thức ăn ngọt béo làm tổn thương tỳ vị, khiến vận hoá thất điều, đàm thấp nội sinh mà dẫn đến bệnh tật Yếu tố này tương tự như việc ăn quá nhiều thức ăn giàu mỡ động vật chứa nhiều acid béo no theo y học hiện đại

- Yếu tố ít vận động thể lực: sách Tố vấn thiên "Tuyên minh ngũ khí luận", viết :"Cửu ngọa thương khí, cửu tọa thương nhục" (nằm nhiều hại khí, ngồi nhiều hại cơ nhục) Thương khí dẫn đến khí hư, thương nhục dẫn đến tỳ hư, tỳ khí hư suy mà gây ra bệnh Y học hiện đại đã chứng minh vận động luyện tập thể lực làm giảm LDL-C, tăng HDL-C

- Yếu tố tinh thần (thất tình): lo nghĩ quá hại tỳ, giận dữ quá hại can, can mộc vượng khắc tỳ thổ làm tỳ vị rối loạn, hư yếu, công năng vận hoá suy giảm, đàm trọc ứ trệ kinh mạch mà sinh bệnh Đây chính là yếu tố căng thẳng tinh thần (stress) của y học hiện đại

để nuôi sống nữa" (Hải Thượng Lãn ông) có nghĩa chỉ loại bỏ phần đàm dư thừa

- Đàm ở một chỗ không ra phải dùng phép điều đàm

Vì đàm ở hội chứng rối loạn lipid máu là đàm vô hình, lưu hành và ứ đọng ở huyết mạch nên khi điều trị, dùng phép hoá đàm để điều trị nguyên nhân sinh ra đàm, làm cho đàm tự hết chứ không dùng đến phép tiêu và điều đàm

Theo y học cổ truyền, hội chứng rối loạn lipid máu là một chứng do nội đàm gây ra nên có đặc điểm là "bản hư tiêu thực" Tuỳ theo thế bệnh cấp hay hoãn

mà lấy phù chính làm chủ, khứ tà là phụ; hoặc khứ tà làm chủ, phù chính là phụ; hoặc vừa phù chính vừa khứ tà, tiêu bản đồng trị Bản hư chủ yếu là tỳ thận

hư tổn, tiêu thực chủ yếu là đàm trọc, huyết ứ Trị bản phải chú ý bổ tỳ, ích thận, trị tiêu phải chú ý các phép khứ đàm trừ thấp, thanh lý thông hạ, hoạt huyết hóa ứ Dựa vào nguyên nhân người ta chia đàm ra làm năm loại: thấp đàm, táo đàm, nhiệt đàm, phong đàm, hàn đàm Từ đó tuỳ theo từng loại đàm

mà có pháp điều trị khác nhau [1], [2], [14], [15], [22], [24], [30, [32]

5 Về thuốc LIPIDAN

Công thức thuốc LIPIDAN được thành lập dựa trên cơ sở lý luận của y học

cổ truyền, đã sử dụng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trên lâm sàng trong nhiều năm cho kết quả khả quan

Với mục đích sản xuất thuốc cổ truyền trên dây chuyền công nghiệp đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định của Bộ Y tế; tạo điều kiện dễ dàng trong việc bảo quản và sử dụng thuốc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cải dạng thuốc, xây dựng quy trình sản xuất thuốc ở quy mô pilot đạt tiêu chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn của thuốc LIPIDAN

Bài thuốc LIPIDAN bao gồm các vị sau:

5.1 Trần bì [6], [7], [23]

- Tên khoa học: Pericarpium Citri reticulatae

- Bộ phận dùng: vỏ quả chín đã phơi hoặc sấy khô của cây quýt (Citrus reticulata Blanco), họ Cam (Rutaceae)

- Hoạt chất chính: tinh dầu, flavonoid, vitamin A,B

- Tính vị: vị cay, đắng, tính ôn

- Quy kinh: can, thận

- Tác dụng: kiện tỳ, lý khí, táo thấp, hoá đàm

- Ứng dụng lâm sàng:

+ Chữa chứng đau do khí trệ

+ Kích thích tiêu hóa

+ Chữa nôn mửa do lạnh

+ Chữa ỉa chảy do tỳ hư

+ Chữa ho, long đờm do hàn thấp gây ra

5.2 Bán hạ nam [7], [23], [31]

- Tên khoa học: Rhizoma Typhonii trilobati

- Bộ phận dùng: thân rễ già được chế biến thành phiến khô của cây chóc

chuột Typhonium trilobatum (L.)Schott, họ Ráy (Araceae)

- Hoạt chất chính: tinh bột, alcaloid

- Tính vị: sau khi bào chế còn ít cay, ít ngứa, tính ôn

- Tên khoa học: Poria

- Bộ phận dùng: thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm phục linh (Poria cocos (Schw.) Wolf, họ Nấm lỗ (Polyporaceae), mọc ký sinh trên rễ một số loài

Thông

- Hoạt chất chính: đường, chất khoáng, triterpenoid

- Tính vị: vị ngọt, nhạt, tính bình

- Quy kinh: tâm, phế, thận, tỳ, vị

- Tác dụng: lợi tiểu, nhuận táo, bổ tỳ, ích khí, sinh tân, chỉ khát

- Ứng dụng lâm sàng:

+ Lợi niệu thông lâm

+ Cầm ỉa chảy mạn tính do tỳ hư

+ Trừ đờm nhiều do đàm thấp

+ Chữa cơn đau dạ dày do tỳ vị hư hàn

+ Chữa nôn mửa do tỳ vị hư

5.5 Hậu phác nam [23]

- Bộ phận dùng: vỏ phơi khô của cây quế rừng Cinnamonum, họ Long não

(Lauraceae)

- Tính vị: vị cay, ngọt, tính ấm

- Quy kinh: tỳ, vị, đại trường

- Tác dụng:hạ khí tán mãn, ôn trung táo thấp

- Ứng dụng lâm sàng:

+ Chữa chứng khí trệ gây đầy bụng, trướng, tức ngực, khó thở

+ Trừ đờm nhiều do đàm thấp

+ Chữa cơn đau dạ dày do tỳ vị hư hàn

+ Chữa nôn mửa do tỳ vị hư

5.6 Ngũ gia bì chân chim [6], [7], [23]

- Tên khoa học: Cortex Scheflerae heptaphyllae

- Bộ phận dùng: vỏ thân và vỏ cành đã phơi hay sấy khô của cây Ngũ gia bì

chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin), họ Nhân sâm (Araliaceae)

- Hoạt chất chính: saponin, tanin, tinh dầu

- Tính vị: vị cay, đắng, thơm, tính ôn

- Quy kinh: can, thận

- Tác dụng: trừ phong thấp, tráng gân cốt

- Ứng dụng lâm sàng:

+ Lợi niệu

+ Chữa đau khớp, đau dây thần kinh, đau các cơ do lạnh

+ Chữa phù do thiếu vitamin B1

5.7 Sơn tra [6], [7], [23]

- Tên khoa học: Fructus Mali

- Bộ phận dùng: quả chín đã thái phiến được phơi hay sấy khô của cây sơn

tra (Malus doumeri Bois A Chev.) họ Hoa hồng (Rosaceae)

- Hoạt chất chính: đường, acid hữu cơ, vitamin, tanin

+ Cầm ỉa chảy do ứ đọng thức ăn, ảnh hưởng đến tỳ vị gây ỉa chảy, bụng trướng đầy

5.8 Xa tiền tử [6], [7], [23]

- Tên khoa học: Semen Plantaginis

- Bộ phận dùng: hạt đã phơi hay sấy khô của cây mã đề (Plantago major

L.), họ Mã đề (Plantaginaceae)

- Hoạt chất chính: chất nhầy, acid uronic, dầu béo

- Tính vị: vị ngọt, tính hàn

- Quy kinh: can, thận, tiểu trường

- Tác dụng: lợi niệu, thanh nhiệt, thanh can, hoạt thai

- Tên khoa học: Rhizoma Zingiberis

- Bộ phận dùng: thân rễ tươi của cây Gừng (Zingiber officinale Rose.), họ

+ Chữa cảm mạo, nôn mửa, ho do lạnh

+ Kích thích tiêu hóa, chống đầy, ợ hơi

+ Giải độc và hạn chế độc tính của các vị thuốc bán hạ, nam tinh, phụ tử

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Nguyên liệu nghiên cứu

1.1 Công thức bài thuốc LIPIDAN (dùng trong 2 ngày - theo kinh nghiệm

điều trị)

Trần bì 08g Bán hạ chế 08g

Bạch linh 16g Hậu phác nam 06g

Mộc hương nam 10g Sơn tra 08g

Ngũ gia bì 08g Sinh khương 02g

1.2 Hỗn dịch và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

1.2.1 Hỗn dịch thuốc từ công thức bài thuốc LIPIDAN

Từ công thức bài thuốc LIPIDAN đã nêu ở trên, tiến hành sắc theo phương pháp cổ truyền

- Trần bì, hậu phác tán bột

- Sinh khương: ép lấy nước

- Các vị thuốc còn lại: đổ 300ml nước, sắc còn 100ml Làm ba lần như vậy rồi tiến hành hoà chung nước sắc của ba lần với nhau, ta có 300ml nước sắc Như vậy, 1ml nước sắc chứa 0,19g dược liệu

- Hoà bột trần bì, hậu phác, nước sinh khương vào nước sắc ở trên, ta được hỗn dịch thuốc (tạm gọi là hỗn dịch Lipidan) Hỗn dịch này dùng để đối chiếu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu với viên nang LIPIDAN

Do lượng thuốc sử dụng điều trị trên lâm sàng (theo kinh nghiệm) là 150ml/ngày nên chúng tôi tiến hành tính toán và đề ra lượng thuốc sử dụng trên động vật thí nghiệm là 2,5ml/kg thể trọng

1.2.2 Dung dịch cholesterol 10%

Cân 10g cholesterol Đun nóng cách thuỷ 50ml dầu lạc Cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết cholesterol Để nguội, thêm dầu lạc vừa đủ 100ml Như vậy, 1ml dầu chứa 0,1g cholesterol

1.2.3 Dung dịch Tween80 nồng độ 20%

Cân 20g Tween80, cho vào cốc có mỏ Cho 50ml dung dịch NaCl 9‰ vào Đun cách thuỷ, khuấy đều cho tan hết Tween80, sau đó đổ vào cốc có chân

100ml Thêm NaCl 9‰ vào cho vừa đủ 100ml, lắc đều Như vậy ta được dung dịch Tween80 nồng độ 20%

2 Đối tượng nghiên cứu

Súc vật nghiên cứu:

- Thỏ: cả hai giống, khoẻ mạnh, nặng từ 1,8kg - 2,5kg/con

- Chuột cống trắng: chuột đực khoẻ mạnh, trọng lượng 180g - 240g/con

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss: cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 20g

± 2g/con

Chuột do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng y sinh dược, Học viện Quân y cung cấp

Súc vật được nuôi trong phòng thí nghiệm với cùng điều kiện nhiệt độ, độ

ẩm, thời gian sáng - tối 12/12h Thức ăn do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm Học viện Quân y sản xuất, đảm bảo theo đúng tiêu chuẩn dinh dưỡng Nước uống được cung cấp đầy đủ

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu bào chế viên nang LIPIDAN

3.1.1 Bào chế cao khô LIPIDAN [6], [7], [8]

- Giai đoạn 1: sắc với nước đã khử khoáng (tỷ lệ nước:dược liệu = 4:1) theo phương pháp truyền thống, thuốc được sắc 3 lần:

+ Lần 1, đun sôi (kể từ lúc sôi) 20 - 30 phút, lọc nóng qua rây 150

+ Lần 2, đun sôi 40 phút, lọc nóng qua rây 150

+ Lần 3, đun sôi 1 giờ, lọc nóng qua rây 150

3.1.2 Bào chế viên nang LIPIDAN [6], [7], [8], [9]

Bào chế viên nang LIPIDAN theo phương pháp xát hạt ướt:

- Cao khô LIPIDAN + bột dược liệu và tá dược độn, tá dược dính

- Xát hạt ướt, sửa hạt

- Hạt thuốc + tá dược trơn

- Đóng nang

- Ép vỉ

3.1.3 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN

- Motor vạn năng Kalweka VDM 4SP

- Máy đo độ rã Erweka DT

- Cân phân tích điện tử XB 220A Precisa

- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius TE 3102S

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100

3.2.4 Mất khối lượng do làm khô: trộn đều bột thuốc của 20 nang Cân chính

xác 1g bột thuốc, tiến hành thử theo phụ lục 9.6, DĐVN IV, phương pháp sấy trong tủ sấy ở 850C, áp suất thường trong 5 giờ

+ Ethyl acetat, ethanol (TT)

+ Dung môi triển khai sắc ký: Toluen - ethyl acetat - acid formic (5:4:1) + Đèn tử ngoại UV 366nm

- Cách thử:

+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 70ml nước nóng,

khuấy kỹ, để nguội, ly tâm Chuyển dịch ly tâm vào bình gạn, lắc kỹ với 30ml ethyl acetat Sau khi tách lớp, gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký

+ Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 2g trần bì đã cắt nhỏ, thêm 10ml nước,

đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc Chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ với 30ml ethyl acetat Gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn

trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu tại hai điểm A và B Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển được khoảng 12 - 13cm Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại, bước sóng 366nm

Kết quả: mẫu thử phải có các vết phát quang cùng màu, cùng Rf với các vết của mẫu đối chiếu

∗ Ngũ gia bì chân chim: phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4,

+ Dung dịch acid hydrocloric đặc (TT)

+ Dung môi triển khai sắc ký: Cloroform, methanol (9:1)

+ Hiện màu: dung dịch vanilin 1% trong hỗn hợp acid methanol (1:1)

phosphoric Cách thử:

+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 30ml hỗn hợp

methanol - nước (4:1), đun sôi hồi lưu trên cách thủy 30 phút, để nguội, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 25ml nước, thêm 25ml acid hydrocloric đặc, đun sôi hồi lưu trong 3 giờ, để nguội, lọc Rửa cắn bằng nước cho hết acid và sấy khô ở 600C Hòa cắn trong 20ml cloroform bằng cách đun nóng nhẹ trên cách thủy, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký

+ Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 2g ngũ gia bì chân chim đã cắt nhỏ, thêm

100ml nước cất, đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc Cô dịch lọc đến cạn, hòa cắn trong 30ml hỗn hợp methanol - nước (4:1), đun sôi hồi lưu trên cách thủy 30 phút, để nguội, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 25ml nước, thêm 25nm acid hydrocloric đặc, đun sôi hồi lưu trong 3 giờ, để nguội, lọc Rửa cắn bằng nước cho hết acid và sấy khô ở 600C Hòa cắn trong 20ml cloroform bằng cách đun nóng nhẹ trên cách thủy, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu tại hai điểm A và B Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển được khoảng 11 - 12cm Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch vanilin 1% trong hỗn hợp acid phosphoric-methanol (1:1), sấy ở 1200C cho đến khi hiện rõ vết

Kết quả: mẫu thử phải có các vết cùng màu, cùng Rf với các vết của mẫu đối chiếu

+ Ethanol 50% (TT)

+ Dung môi triển khai sắc ký: n-butanol - acid acetic - nước (4:1:5) + Hiện màu: dung dịch ninhydrin 3% ethanol

- Cách thử:

+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 50ml nước nóng,

khuấy kỹ, để nguội, ly tâm Gạn lấy dịch ly tâm cho chảy qua cột sắc ký trao đổi ion (đã được xử lý theo DĐVN I, tập 1 - Phương pháp định lượng bằng trao đổi ion, trang 692), tốc độ chảy 20 - 25 giọt/phút Bỏ phần dung dịch chảy qua cột Thêm nước cất để giữ cho cột không bị khô Tiếp tục rửa cột bằng nước cất cho tới khi nước chảy qua cột có phản ứng trung tính (thử bằng chỉ thị Heliantin) Cho dung dịch amoniac 10% chảy qua cột với tốc độ như trên Khi dung dịch chảy qua cột bắt đầu có phản ứng kiềm thì hứng và bỏ đi khoảng 10ml dịch chiết đầu tiên Hứng lấy 30 - 40ml dịch chiết tiếp theo, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 2ml ethanol 50% được dung dịch chấm sắc ký

+ Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 1g bán hạ nam đã cắt nhỏ, thêm 100ml

nước, đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc Lấy dịch lọc cho chảy qua cột sắc ký trao đổi ion (đã được xử lý theo DĐVN I, tập 1 - Phương pháp định lượng bằng trao đổi ion, trang 692) rồi tiến hành tiếp như với dung dịch mẫu thử, bắt đầu từ “tốc

độ chảy 20 - 25 giọt/phút Hòa cắn trong 2ml ethanol 50% được dung dịch chấm sắc ký.”

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu tại hai điểm A và B Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển được khoảng 12 - 13cm Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch ninhydrin 3% ethanol, sấy ở 1200C cho đến khi hiện rõ vết

Kết quả: mẫu thử phải có các vết cùng màu, cùng Rf với các vết của mẫu đối chiếu

3.2.6 Độ nhiễm khuẩn

Cân 5g bột thuốc vào bình nón nút mài 200ml đã được tiệt trùng và đã biết khối lượng Thêm một lượng vừa đủ dung dịch natri clorid 0,9% vô trùng để thu

được dung dịch có nồng độ 10-1, lắc đều Từ dung dịch trên, pha loãng thành các nồng độ 10-2, 10-3 và tiếp tục tiến hành thử theo phụ lục 13.6, DĐVN IV

3.3 Theo dõi độ ổn định của thuốc [6], [7], [11]

Theo dõi tuổi thọ của 3 lô sản phẩm lưu ở điều kiện tủ vi khí hậu

- Thời gian lưu: 4 tháng tính từ ngày sản xuất

- Điều kiện bảo quản:

+ Độ nhiễm khuẩn (theo phụ lục 13.6, DĐVN IV)

Cách xác định và dự đoán tuổi thọ của thuốc bằng phương pháp lão hóa cấp tốc: thực hiện theo nguyên lý Vant-Hoff với cách tính tuổi thọ thuốc như sau:

C = CNT x KTrong đó:

- C: tuổi thọ (tính bằng ngày) ở nhiệt độ bảo quản bình thường (tBT = 200C)

- CNT: tuổi thọ thực nghiệm ở nhiệt độ nâng cao (tTN = 400C)

Chuột được theo dõi tình trạng chung trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết trong 72 giờ của từng lô để xác định liều LD50

3.4.2 Thử độc tính bán cấp [5], [34]

LIPIDAN đã được dự kiến liều điều trị sử dụng trên người, nên chúng tôi đã ngoại suy từ liều trên người cho các thử nghiệm độc tính, có tham khảo liều chết 50% (LD50)

Thỏ được chia ngẫu nhiên thành 3 lô khác nhau, mỗi lô 12 con

- Lô chứng uống nước lọc

- Lô uống viên nang LIPIDAN liều I: 100mg/100g trọng lượng cơ thể/ngày (gấp 10 lần liều điều trị theo LD50)

- Lô uống viên nang LIPIDAN liều II: 150mg/100g trọng lượng cơ thể/ngày (gấp 15 lần liều điều trị theo LD50)

- Thuốc được nghiền mịn và hòa trong nước lọc Các thỏ uống cùng một thể tích là 0,5ml/100g TLCT thỏ, liên tục trong 42 ngày, tiến hành quan sát tất cả các thỏ, đánh giá các chỉ tiêu gồm :

- Sinh lý - dược lý: tình trạng chung, hoạt động, ăn uống, trọng lượng cơ

thể, ghi điện tim

- Huyết học: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu

- Sinh hóa: AST, ALT, ure, creatinin,

- Mô bệnh học: vào ngày thứ 42 thỏ được phẫu thuật, quan sát hình ảnh đại

thể gan, lách, thận Sau đó sinh thiết các tạng để nghiên cứu hình ảnh mô bệnh học của 5 thỏ thực nghiệm ở mỗi lô Các mẫu mô bệnh học được nhuộm H.E, đọc trên kính hiển vi ánh sáng thường với độ phóng đại HE 400

* Thời điểm xét nghiệm: lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học, ghi điện tim, tại 3 thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu

3.4.3 Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản [5], [34], [35],

[40], [41], [42], [48]

3.4.3.1 Ảnh hưởng của LIPIDAN đến quá trình sinh sản

Chuột nhắt trắng Mus musculus L 500 con, dòng Swiss, trọng lượng từ 20 -

25g, khoẻ mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm

Trong quá trình thí nghiệm, chuột được nuôi dưỡng, chăm sóc và theo dõi hàng ngày

Thế hệ chuột nhắt trắng bố mẹ gọi là thế hệ P

Các chuột nhắt trắng con sinh ra từ thế hệ P gọi là thế hệ F1

Chuột nhắt trắng con được sinh ra từ thế hệ F1 gọi là thế hệ F2

Dùng LIPIDAN nghiền mịn, hòa trong nước lọc, cho chuột nhắt trắng thí nghiệm uống qua kim cong tày đầu, mỗi con chuột nhắt trắng uống với thể tích giống nhau là 2ml/100g trọng lượng cơ thể

Căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp (LD50), chúng tôi đã sử dụng mức liều cho chuột nhắt trắng là 30mg/100g trọng lượng cơ thể/24h (gấp 3 lần liều điều trị theo LD50).

Quy trình cho uống LIPIDAN: chuột nhắt trắng 160 con (gồm 40 con đực và

120 con cái), tách riêng đực - cái, nuôi 2 tuần trước khi nghiên cứu Khi trọng lượng cơ thể chuột nhắt trắng đạt đến 30g ± 3,0g, các chuột nhắt trắng được chia một cách ngẫu nhiên vào các lô, đánh dấu, cân trọng lượng cơ thể và vẫn tách riêng đực - cái, cho uống LIPIDAN vào buổi sáng hàng ngày trong 14 ngày, thuốc được đưa vào dạ dày chuột qua kim cong tày đầu

+ Lô chứng: cả chuột nhắt trắng đực và cái đều uống nước lọc

+ Lô nghiên cứu I: chuột đực được uống LIPIDAN liều 30mg/100g trọng lượng cơ thể chuột/24h, chuột cái không uống thuốc

+ Lô nghiên cứu II: chuột đực không uống thuốc, chuột cái được uống LIPIDAN liều 30mg/100g trọng lượng cơ thể chuột/24h

+ Lô nghiên cứu III: cả chuột đực và chuột cái đều được uống LIPIDAN liều 30mg/100g trọng lượng cơ thể chuột/24h

Sau 14 ngày, ghép chuột ở các lô vào một chuồng theo tỷ lệ 1 chuột đực : 3 chuột cái, tiếp tục cho uống nước lọc hoặc uống thuốc LIPIDAN trong 16 ngày Theo dõi sự thụ thai của chuột Khi thụ thai thành công (chuột nhắt trắng cái có chửa), nuôi đến 2 tuần (14 ngày) và chia thành 2 nhóm:

- 1/3 số chuột nhắt trắng cái được phẫu thuật để đánh giá số thai phát triển bình thường, số thai chết sớm/chết muộn

- Còn 2/3 số chuột nhắt trắng cái được nuôi đến khi chuột đẻ, đánh giá số chuột nhắt trắng con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình trong mỗi lứa đẻ, đếm số chuột con có dị tật bẩm sinh

- Thế hệ F1 sinh ra được nuôi lớn đến 20g ± 2,0g/chuột nhắt trắng Tách riêng đực, cái Nuôi tiếp đến khi đạt trọng lượng cơ thể 30g ± 3,0g/chuột nhắt trắng, tiến hành ghép đôi như trên

- Thế hệ F2 sinh ra cũng được xử lý hoàn toàn tương tự

Các chỉ tiêu đánh giá tác dụng trên sinh sản - phát triển

- Tỷ lệ chuột nhắt trắng thụ thai so với tổng số (tính bằng %)

- Số thai của mỗi chuột mẹ có chửa đã được phẫu tích (autopsy)

- Số thai chết (sớm/muộn), số thai dị tật (nếu có)

- Số chuột nhắt trắng con trung bình trong một lứa đẻ

- Trọng lượng trung bình một con (tính bằng gam)

- Số ngày trung bình cần thiết nuôi để đạt trọng lượng cơ thể là 20g ± 2,0g, đối với các thế hệ P, F1, F2

- Các loại dị tật bẩm sinh quan sát được

Mô hình thiết kế thử nghiệm đánh giá tác dụng trên sinh sản - phát triển

160 chuột nhắt trắng gồm 40 con đực

và 120 con cái, tách riêng đực - cái

Nuôi tới khi đạt trọng lượng cơ thể

30,0 ± 3,0g

Đánh dấu, phân ngẫu nhiên vào các

lô, tách riêng đực - cái

Lô NC II: chuột cái uống LIPIDAN 30mg/100g TLCT/24h x 14 ngày

Lô NC III: cả chuột đực và cái uống LIPIDAN 30mg/100g TLCT/24h x 14 ngày

Thụ thai thành công, nuôi đến 14 ngày

1/3 số chuột nhắt trắng cái

được phẫu thuật được nuôi cho đến khi chuột đẻ 2/3 số chuột nhắt trắng cái

Đếm số thai phát triển bình thường,

số thai chết sớm/chết muộn

Đếm số chuột nhắt trắng con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình,

số chuột con có dị tật bẩm sinh

Chuột nhắt trắng con nuôi tới khi đạt trọng lượng cơ thể 20 - 25g

Thế hệ F1

Ghép đôi theo tỷ lệ 1 đực : 3 cái

ở mỗi nhóm Tiếp tục cho nước lọc hoặc uống thuốc

trong 16 ngày

Lô nghiên cứu I:

1 đực : 3 cái Lô nghiên cứu II: 1 đực : 3 cái Lô nghiên cứu III:1 đực : 3 cái

Thụ thai thành công, nuôi đến 14 ngày

1/3 số chuột nhắt trắng cái

được phẫu thuật được nuôi cho đến khi chuột đẻ 2/3 số chuột nhắt trắng cái

Đếm số thai phát triển bình thường,

số thai chết sớm/chết muộn

Đếm số chuột nhắt trắng con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình,

số chuột con có dị tật bẩm sinh

Chuột nhắt trắng con nuôi tới khi đạt trọng lượng cơ thể 20 - 25g

Thế hệ F2

Nuôi tới khi đạt trọng lượng cơ thể

20g ± 2,0gTách riêng đực, cái

3.4.3.2 Ảnh hưởng của LIPIDAN đến đột biến nhiễm sắc thể

Cơ sở của phương pháp là tăng tạo thể nhiễm sắc chất nhỏ (micronuclei) ở tế bào hồng cầu đa sắc trong tuỷ xương của động vật khi dùng thuốc thử nghiệm so với động vật ở nhóm chứng Vi nhân là những nhân nhỏ trong tế bào hồng cầu

Lô nghiên cứu I:

1 đực : 3 cái Lô nghiên cứu II: 1 đực : 3 cái Lô nghiên cứu III:1 đực : 3 cái

Thụ thai thành công, nuôi đến 14 ngày

1/3 số chuột nhắt trắng cái

được phẫu thuật được nuôi cho đến khi chuột đẻ 2/3 số chuột nhắt trắng cái

Đếm số thai phát triển bình thường,

số thai chết sớm/chết muộn

Đếm số chuột nhắt trắng con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình,

số chuột con có dị tật bẩm sinh

Nuôi tới khi đạt trọng lượng cơ thể

20g ± 2,0gTách riêng đực, cái

đang phân chia, nằm chìm trong bào tương, bắt màu đậm hơn màu bào tương tế bào

Trước thí nghiệm: 11 chuột thí nghiệm được cho uống LIPIDAN với mức liều 30mg/100g trọng lượng cơ thể chuột/24h trong thời gian 30 ngày, thuốc được hòa trong nước lọc với mức 2ml/100g trọng lượng cơ thể

Nhóm chứng gồm 11 con, cho ăn chế độ bình thường, cho uống nước lọc

24 giờ sau khi cho uống mỗi loại thuốc lần cuối, xương đùi của chuột từ mỗi nhóm chứng và nhóm uống thuốc được bóc tách Tế bào tuỷ xương được bơm rửa từ xương đùi, rửa bằng BSA, ly tâm 100g/phút/10 phút, hút dịch nổi dàn lên lam kính sạch, nhuộm May - Grul Wald - Giemsa trong 5-10 phút, đọc và phân tích kết quả

Các chỉ tiêu đánh giá về chất liệu di truyền

1 Tỷ lệ hồng cầu đa sắc/hồng cầu đơn sắc (PCE:NCE)/1000 tế bào/ chuột

2 Tỷ số (tính bằng %) vi nhân trên tế bào hồng cầu đa sắc (MN/PCE)

3.5 Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên động vật thí nghiệm [36], [37], [39], [44], [45]

3.5.1 Tác dụng của LIPIDAN trên mô hình gây rối loạn lipid máu theo cơ chế ngoại sinh

Áp dụng phương pháp của Trovato A và cộng sự (1996)

Chuột cống trắng (CCT) được uống dung dịch cholesterol 10% với liều lượng 5ml/1kg thể trọng chuột, mỗi ngày vào buổi sáng, trong 6 tuần (42 ngày) để gây tăng cholesterol máu

Chuột cống trắng được chia thành 6 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (lô trắng, chuột bình thường): chuột chỉ uống nước lọc với thể tích 0,5ml/100g thể trọng chuột

- Lô 2 (lô chứng): gây tăng cholesterol máu bằng cách cho chuột uống dung dịch cholesterol 10%, sau đó 2 giờ cho uống nước lọc 0,5ml/100g thể trọng

- Lô 3 (lô uống hỗn dịch Lipidan trong 6 tuần): chuột uống dung dịch cholesterol 10%; sau đó 2 giờ cho uống hỗn dịch Lipidan 0,25ml/100g thể trọng

- Lô 4 (lô uống hỗn dịch Lipidan trong 3 tuần):

+ Từ tuần thứ nhất đến tuần thứ 3 của đợt thí nghiệm: uống dung dịch cholesterol 10%; sau đó 2 giờ được uống nước lọc 0,5ml/100g thể trọng

+ Từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6: uống dung dịch cholesterol 10%, sau đó 2 giờ được uống hỗn dịch Lipidan 0,25ml/100g thể trọng

- Lô 5 (lô điều trị LIPIDAN trong 6 tuần): uống dung dịch cholesterol 10%, sau đó 2 giờ được uống LIPIDAN liều 10mg/100g thể trọng (thuốc được hoà trong 0,5ml nước lọc/100g thể trọng)

- Lô 6 (lô điều trị LIPIDAN trong 3 tuần):

+ Từ tuần thứ nhất đến tuần thứ 3 của đợt thí nghiệm: uống dung dịch cholesterol 10%; sau đó 2 giờ được uống nước lọc 0,5ml/100g thể trọng

+ Từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6: uống dung dịch cholesterol 10%, sau đó 2 giờ được uống LIPIDAN liều 10mg/100g thể trọng (thuốc được hoà trong 0,5ml nước lọc/100g thể trọng)

Cân kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô trước, trong và sau thí nghiệm

2 tuần/lần

Vào cuối đợt thí nghiệm (ngày thứ 42), chuột ở mỗi lô cho nhịn ăn qua đêm Đến ngày thứ 43, tất cả chuột đều bị giết Lấy máu từ động mạch cảnh CCT vào ống nghiệm Tiến hành định lượng cholesterol toàn phần(CT), HDL-C, LDL-C

và triglycerid (TG) trong huyết thanh trên máy phân tích SCOUT của Italy

Mô hình nghiên cứu điều trị rối loạn lipid máu theo cơ chế ngoại sinh

Uống

nước

lọc

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống nước lọc

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống hỗn dịch Lipidan

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống nước lọc

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống thuốc LIPIDAN

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống nước lọc

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống hỗn dịch Lipidan

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống thuốc LIPIDAN

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống thuốc LIPIDAN

Uống dung dịch cholesterol, sau 2h uống nước lọc

3.5.2 Tác dụng của LIPIDAN trên mô hình gây rối loạn lipid máu theo cơ chế nội sinh

Áp dụng phương pháp của Kell, Correll và Ladd (1988) Gây tăng cholesterol máu ở thỏ bằng cách tiêm Tween 80 dung dịch 20%

Thỏ đực 18 con tiêm tĩnh mạch vành tai Tween 80 dung dịch 20% × 0,25ml/100g thể trọng thỏ trong dung dịch natriclorid 0,9% Tiếp đó tiêm cùng một thể tích dung dịch Natriclorid 0,9% Thỏ được chia thành 3 lô:

- Lô 1 (lô chứng - 6 con): chỉ tiêm Tween 80

- Lô 2 (lô điều trị I, uống hỗn dịch Lipidan - 6 con): cho thỏ uống hỗn dịch Lipidan liều 0,25ml/100g thể trọng thỏ vào thời gian trước khi tiêm Tween 80 là

24 giờ và ngay trước khi tiêm

- Lô 3 (lô điều trị II - 6 con): thỏ được uống thuốc LIPIDAN liều điều trị 10mg/100g thể trọng (thuốc được hòa trong 0,5ml nước lọc/100g thể trọng thỏ) vào thời gian trước khi tiêm Tween 80 là 24 giờ và ngay trước khi tiêm

* Lấy máu tĩnh mạch vành tai thỏ trước thực nghiệm và sau khi tiêm Tween

80 4 giờ 30 phút Định lượng cholesterol toàn phần(CT), HDL-C, LDL-C và triglycerid (TG) huyết thanh

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

4.1 Địa điểm

4.1.1 Bộ môn Dược liệu, Học viện Y - Dược học cổ truyền Việt Nam

4.1.2 Bộ môn Bào chế, Đại học Dược Hà Nội

4.1.3 Bộ môn Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội

4.1.4 Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y

4.1.5 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

3 lô sản phẩm sản xuất trên dây chuyền pilot

6.2.2 Các nghiên cứu thực nghiệm

Cỡ mẫu cho mỗi nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở các mô hình nghiên cứu thực nghiệm của Việt Nam và thế giới

7 Các biện pháp khống chế sai số

- Động vật thực nghiệm đảm bảo tiêu chuẩn do cơ sở chuyên trách cung

cấp

- Kỹ thuật đảm bảo đúng quy cách

- Mẫu được lựa chọn đảm bảo tính ngẫu nhiên

8 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

Các số liệu được thu thập, xử lý và đánh giá một cách trung thực, khách quan

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Quy trình sản xuất viên nang LIPIDAN

Trần bì Citrus reticulata Rutaceae Dược điển Việt Nam IV Bạch linh Poria cocos Polyporaceae Dược điển Việt Nam IV Ngũ gia bì Schefflera heptaphylla Araliaceae Dược điển Việt Nam IV Sơn tra Malus doumeri Rosaceae Dược điển Việt Nam IV

Xa tiền tử Plantago major Plantaginaceae Dược điển Việt Nam IV Sinh khương Zingiber officinale Zingiberaceae Dược điển Việt Nam IV Bán hạ nam Typhonium triobatum Schott Dược điển Việt Nam IV Mộc hương nam Ilex Aquifoliaceae Tiêu chuẩn cơ sở

Hậu phác nam Cinnamonum Lauraceae Tiêu chuẩn cơ sở

Talc Talcum Dược điển Việt Nam IV Tricalciphosphat Tricalcii phosphas USP32

PVP K30 Polyvinyl pyrrollidon K30 USP32

Cồn 96% Ethanolum 96% Dược điển Việt Nam IV

Rửa sạch, thái lát 0,5cm, phơi khô Sao vàng cháy cạnh

1.2.4 Ngũ gia bì chân chim [6], [7], [16], [23], [28], [31]

Rửa sạch tạp chất, ủ nềm, thái nhỏ, phơi âm can đến khô

1.2.5 Xa tiền tử [6], [7], [16], [23], [28], [31]

Sẩy bỏ hạt lép và tạp chất, phơi âm can cho khô