Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao

ảnh hưởng của nồng độ thuốc tới đáp ứng 2 tháng đầu Phụ lục 2: Các sản phẩm về đào tạo liên quan đến đề tài Phụ lục 3: Phương pháp định lượng RMP và PZA trong huyết tương Phương pháp địn

Phụ lục 1

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao định lượng nồng độ thuốc chống lao

trong huyết tương bệnh nhân lao

Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến

TS DS Nguyễn Thị Liên Hương

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

8418

Phụ lục 1

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao định lượng nồng độ thuốc chống lao

trong huyết tương bệnh nhân lao

Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến

TS DS Nguyễn Thị Liên Hương

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

Cấp quản lý: Bộ Y Tế

Thời gian thực hiện : từ tháng 12/2007 đến tháng 12/2010

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 460 triệu đồng

mục lục

Trang

Báo cáo thống kê kết quả thực hiện đề tài KHCN cấp Bộ viBản tự đánh giá tình hình thực hiện đề tài và những đóng góp mới

của đề tài KHCN cấp Bộ

2.1 Đối tượng nghiên cứu 192.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu 19

2.2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 20

bệnh nhân lao

25

2.3.2.1 Thiết kế nghiên cứu 252.3.2.2 Phương pháp tiến hành 262.3.3 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 28

Phần 3: Kết quả nghiên cứu

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 293.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng 29

3.1.1.1 Phương pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tương

29

3.1.1.2 Chương trình sắc ký 30 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng 32

3.1.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính 353.1.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36

nồng độ điều trị

46

3.2.2.6 Số lượng bệnh nhân có nồng độ thuốc thấp hơn phạm vi điều trị

47

3.2.3 Phân tích một số yếu tố liên quan đến nồng độ RMP,

INH, PZA huyết tương

48

3.2.3.1 Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương

4.2 Nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương bệnh nhân ở thời

điểm 2h sau uống thuốc

63

4.2.1 Nồng độ trung bình RMP, INH, PZA ở thời điểm 2h sau

uống thuốc

63

4.2.2 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân theo phạm vi nồng độ điều trị 654.2.3 Các yếu tố liên quan đến nồng độ RMP, INH, PZA

huyết tương

694.2.4 ảnh hưởng của nồng độ thuốc tới đáp ứng 2 tháng đầu

Phụ lục 2: Các sản phẩm về đào tạo liên quan đến đề tài

Phụ lục 3: Phương pháp định lượng RMP và PZA trong huyết tương Phương pháp định lượng INH trong huyết tương

Phụ lục 4: Hồ sơ về đạo đức trong nghiên cứu

Phụ lục 5: Phiếu theo dõi bệnh nhân nghiên cứu

Danh mục Những chữ viết tắt

AFB - Trực khuẩn bền với acid (kháng acid) (Acid Fast Bacilli)

ALT - Alanin aminotransferase

AST - Aspartat transaminase

AUC - Diện tích dưới đường cong nồng độ huyết tương - thời gian

(Area Under the Curve of Plasma Concentration - Time)

CDC - Trung tâm Kiểm soát và dự phòng bệnh tật Mỹ

(Center for Diseases Control and Prevention)

Cmax - Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tương

CTCLQG - Chương trình chống lao quốc gia

t1/2 - Thời gian bán thải của thuốc

Tmax - Thời gian thuốc đạt nồng độ cao nhất trong huyết tương kể từ khi

uống WHO - Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP BỘ

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

định lượng nồng độ thuốc chống lao RHZ trong huyết tương bệnh nhân lao

2 Chủ nhiệm đề tài:

1 Họ và tên: Lê Thị Luyến

Ngày, tháng, năm sinh: 22/2/1967 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ Y học

Chức vụ: chuyên viên chính

Điện thoại: Tổ chức: 62732249 Nhà riêng: 37846918 Mobile:

0913597423

Fax: 6 2732243 E-mail: luyenle22@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế

Địa chỉ cơ quan: 138A Giảng Võ, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 21 Lô 4A Trung yên 10, Q Cầu Giấy, Hà Nội

2 Họ và tên: Nguyễn Thị Liên Hương

Ngày, tháng, năm sinh: 06/7/1974 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm/học vị: Tiến sỹ Dược học

Chức vụ : Trưởng bộ môn Dược lâm sàng ĐH Dược Hà Nội

Điện thoại: (CQ)/ 04.9330771 (NR)/ 04.8586359 Mobile: 0904308406 Fax: E-mail: lienhuong6774@yahoo.com

Địa chỉ cơ quan: Trường Đại học Dược Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 8 Ngõ 72 Chính Kinh, Nhân Chính, Thanh Xuân, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tr−êng §¹i häc D−îc Hµ Néi

§iÖn tho¹i: 04 8255437 Fax: 04 9332332

E-mail: dhduocdn@netnam.org.vn

§Þa chØ: 13 Lª Th¸nh T«ng – Hµ Néi

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài:

- Theo quyết định phê duyệt: từ tháng 12/2007 đến tháng 7/2010

3 Cỏc văn bản hành chớnh trong quỏ trỡnh thực hiện đề tài/dự ỏn:

(Liệt kờ cỏc quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ cụng đoạn xỏc định nhiệm vụ, xột chọn, phờ duyệt kinh phớ, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phớ thực hiện nếu cú); văn bản của tổ chức chủ trỡ đề tài, dự ỏn (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu cú)

Số

TT

Số, thời gian ban

hành văn bản Tờn văn bản Ghi chỳ

1 5316/QĐ-BYT

ngày 25/12/2007 Quyết định phờ duyệt

2 8833/BYT-K2ĐT

ngày 22/02/2010 Cụng văn gia hạn thời gian thực hiện đề tài Gia hạn thực hiện đến thỏng 1/2011

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự ỏn:

Nội dung tham gia chủ yếu Ghi chỳ*

1 Đại học

Dược Hà

Nội

Đại học Dược Hà Nội

- Xây dựng phương pháp định lượng các thuốc trong huyết tương

- Triển khai định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương

- Nhập và phõn tớch dữ liệu

- Viết bỏo cỏo tổng kết

2 BV Lao và

bệnh phổi

TƯ

BV Lao và bệnh phổi TƯ

- Lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu

- Lấy mẫu máu định lượng

- Thu thập các dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng

- Theo dõi bệnh nhân nghiên cứu

- Xét nghiệm vi khuẩn lao

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1 TS Lê Thị Luyến

2 TS Nguyễn Thị Liên Hương

3 TS Nguyễn Thị Kiều Anh

Bảo quản mẫu Định lượng nồng độ thuốc

Phân tích và xử lý dữ liệu

Viết báo cáo tổng kết

- Phưong pháp định lượng PZA và RMP đồng thời

- Phương pháp định lượng INH

- Định lượng nồng

độ thuốc dựa trên phương pháp xây dựng được

- Mẫu bảo quản đúng điều kiện quy định

Lấy mẫu và vận chuyển huyết tương

Theo dõi diễn biến điều trị

Thu thập dữ liệu trên lâm sàng

**Thực hiện luận văn cao học

***Thực hiện luận văn chuyên khoa 2

- Thu thập đủ số bệnh nhân nghiên cứu

- Lấy đủ số mẫu và vận chuyển theo đúng điều kiện quy định

- Thu thập các dưc liệu của bệnh nhân trên lâm sàng theo quy định

- Lý do thay đổi (nếu có): * nghỉ hưu trong quá trình đề tài đang triển khai

6 Tình hình hợp tác quốc tế: Không

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Không

8 Túm tắt cỏc nội dung, cụng việc chủ yếu:

(Nờu tại mục 15 của thuyết minh, khụng bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sỏt trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 Xây dựng đề cương nghiên cứu

Thiết kế biểu mẫu Khảo sát

nồng độ thuốc và theo dõi bệnh

nhân

7/2007 – 12/2007

7/2007 – 12/2007

Lê Thị Luyến Nguyễn Liên Hương

Tập huấn cho các nghiên cứu

12/2007 – 5/2009

Nguyễn Liên Hương Nguyễn T Kiều Anh

Vũ Đình Hoà Nguyễn Tứ Sơn Trịnh Trung Hiếu

3 Lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu

Thu thập mẫu máu, Xử lý mẫu

5/2008 – 5/2009

5/2008 – 5/2009

4 - Theo dõi bệnh nhân, ghi chép

dữ liệu bệnh nhân nghiên cứu

- Chỉ định xét nghiệm đờm

- Xột nghiệm vi khuẩn lao

05/2008 – 07/2009

05/2008 – 07/2009

Chu Thị Minh Bành Đức Lâm Phạm T Phương Nam

Hoàng Thị Phượng Nguyễn Văn Hưng

5 - Bảo quản mẫu huyết tương

- Định lượng INH, PZA, RMP

huyết tương

05/2008 – 07/2009

05/2008 – 05/2010

Vũ Đình Hoà Nguyễn Tứ Sơn

Lờ T Luyến Phan Quỳnh Lan Nguyễn Thỳy Võn Trịnh Trung Hiếu

7 Viết Bỏo cỏo tổng kết 8/2009 –

10/2009

10/2010 – 12/2010

Lê Thị Luyến Nguyễn Liên Hương

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đó tạo ra:

a) Sản phẩm Dạng I: Không đăng ký

Thực tế đạt được

về tiêu chuẩn theo quy định của

FDA

Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, khả thi tại Việt Nam Được thẩm định đầy đủ

về tiêu chuẩn theo quy định của

FDA

Định lượng

đồng thời PZA

và RMP trong huyết tương

Số lượng, nơi cụng bố

trong huyết tương

Số liệu chính xác, khoa học, mô tả

được thực trạng nồng độ RMP, INH

và PZA trong huyết

tương

2 Báo cáo phân

tích

Phân tích về mối liên quan của nồng độ thuốc với các yếu tố

và liều điều trị

Phân tích về mối liên quan của nồng độ thuốc với các yếu tố

và liều điều trị

01Bỏo cỏo tổng hợp

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

1 Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại được các nhà khoa học trên thế giới khuyến cáo sử dụng trong định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương tại hầu hết các phòng nghiên cứu về dược động học và sinh khả dụng của thuốc Phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng được trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố và nghiên cứu áp dụng có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam

2 Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời RMP và PZA trong huyết tương bằng phương pháp HPLC: phương pháp chiết đơn giản, phương pháp phân tích hiệu quả, dễ áp dụng, định lượng được đồng thời RMP và PZA trong cùng một pha động Phương pháp định lượng đã được thẩm định đầy đủ

về các tiêu chuẩn theo yêu cầu của FDA về phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học

3 Xây dựng được và thẩm định phương pháp định lượng INH trong dịch sinh học Thẩm định đầy đủ các tiêu chuẩn theo quy định của FDA về phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học Phương pháp định lượng đơn giản, dễ thực hiện tại Việt Nam

4 Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC đã xây dựng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285 bệnh nhân lao đang điều trị tại Việt Nam

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Phương pháp định lượng nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương có giá trị ứng dụng trong các phòng nghiên cứu về dược động ứng dụng trong điều trị, sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc Đặc biệt có thể ứng dụng phương pháp này trong đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các thuốc chống lao khi lựa chọn đấu thầu thuốc của Chương trình chống lao quốc gia Việt Nam, nhằm lựa chọn được thuốc chống lao có chất lượng điều trị bệnh nhân

Các kết quả của nghiên cứu về nồng độ thuốc trong huyết tương giúp ích cho các chuyên gia về bệnh lao thấy được nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương thấp hơn phạm vi điều trị, góp phần đưa ra bằng chứng về nguyên nhân gia tăng bệnh lao và tình trạng kháng thuốc lao Ngoài ra, phân tích về ảnh hưởng của những yếu tố cá thể đến nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân, từ đó ứng dụng việc tối ưu hoá điều trị dựa trên nồng độ thuốc, cũng như đưa ra những vấn đề cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra các giải pháp điều trị, kiểm soát bệnh lao thành công

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,

người chủ trì…)

I Báo cáo định kỳ

Lần 1 2008 Thực hiện đúng theo tiến độ

II Kiểm tra định kỳ Thực hiện đúng theo tiến độ

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ

Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KHCN cấp Bộ

1 Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao

2 Chủ nhiệm đề tài:

TS BS Lê Thị Luyến – TS DS Nguyễn Thị Liên Hương

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

4 Thời gian thực hiện: 12/2007 – 12/2010

5 Tổng kinh phí thực hiện Đề tài: 460 triệu đồng

Trong đó, kinh phí từ NSNN: 460 triệu đồng

6 Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:

6.1 Mức độ hoàn thành khối lượng công việc:

Hoàn thành đầy đủ số lượng, chủng loại sản phẩm theo như đề cương đã đăng ký Thực hiện được đầy đủ các mục tiêu của đề tài:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng RMP, INH, PZA trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

- Khảo sát nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương bệnh nhân lao Các nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được phù hợp với mục tiêu nghiên cứu đã được phê duyệt

Vượt mức sản phẩm về đào tạo và công bố kết quả nghiên cứu so với đề cương đã được phê duyệt

6.2 Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN

1 Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời RMP và PZA trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: phương pháp chiết đơn giản, phương pháp phân tích hiệu quả, dễ áp dụng, định lượng được đồng thời PZA và RMP trong cùng một pha động Phương pháp định lượng đã được thẩm định đầy đủ về các tiêu chuẩn theo yêu cầu của FDA về phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học

2 Xây dựng được và thẩm định phương pháp định lượng INH trong dịch sinh học Thẩm định đầy đủ các tiêu chuẩn theo quy định của FDA về phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học Phương pháp định lượng đơn giản, dễ thực hiện tại Việt Nam

3 Các số liệu về nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương bệnh nhân lao phổi và màng phổi tại Việt Nam: mô tả được thực trạng nồng độ thuốc trong huyết tương so với nồng độ phạm vi điều trị cần đạt Nồng

độ INH và RMP thấp hơn phạm vi điều trị chiếm tỷ lệ cao (RMP 76,3%, INH 49,4%, PZA 18,1%) Ngoài ra có một số bệnh nhân có nồng độ thuốc trong huyết tương cao hơn phạm vi điều trị (INH 10,8%, PZA 13,8%)

4 Phân tích về mối liên quan giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với một số yếu tố liên quan về tình trạng bệnh tật và liều điều trị:

Bằng phương pháp phân tích tương quan đơn biến và phân tích tương quan đa biến đa cho thấy nồng độ các thuốc chống lao có tương quan thuận với liều điều trị Ngoài ra, yếu tố tuổi tương quan thuận với nồng độ RMP, thể lao có tương quan thuận với nồng độ INH, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân lao màng phổi có nồng độ INH cao hơn so với nhóm bệnh nhân lao phổi Bệnh nhân nữ có nồng độ PZA cao hơn so với nhóm bệnh nhân nam

6.3 Công bố các kết qủa nghiên cứu trên các tạp chí khoa học y dược và Hội nghị quốc tế:

- Đăng tải 05 bài báo trên Tạp chí Y học thực hành, Y học Việt Nam, Báo cáo toàn văn đăng tải trên Proceeding của Hội nghị Dược Đông Dương lần thứ 6 (2009)

- Báo cáo và đăng tải tóm tắt kết quả nghiên cứu tại các Hội nghị quốc tế:

- Hội thảo quốc tế về tối ưu hóa trị liệu bệnh lao tại Ấn Độ tháng 11 năm 2009 (International Symposium on optimization of inhaled tuberculosis therapies and implications for Host - Pathogen Interaction, New Dehli, India 3 - 5 November 2009)

- Hội nghị toàn cầu về bệnh lao và bệnh phổi lần thứ 41 tại Berlin (Đức) tháng 11 năm 2010 (41st World Conference on Lung Health

of the Union Againts Tuberculosis and Lung Diseases, Berlin, Germany 11- 15 November 2010)

- Hội nghị Dược Đông dương lần thứ 6 (The sixth Indochina

conference on pharmaceutical science, Hue 2009)

6.4 Đóng góp về đào tạo:

- Đào tạo 2 thạc sĩ Y học (đã bảo vệ vệ thành công năm 2008)

- Đào tạo 2 thạc sĩ Dược học học (đã bảo vệ vệ thành công năm 2008, 2009)

- Đào tạo 01 dược sĩ chuyên khoa cấp 2 (đã bảo vệ thành công năm 2010)

- Góp phần đào tạo về định lượng thuốc trong dịch sinh học, ứng dụng trong nghiên cứu dược động học/ dược lâm sàng cho các giảng viên của

Bộ môn Dược lâm sàng

6.5 Về tiến độ thực hiện:

Đã được gia hạn thời gian thực hiện đề tài 06 tháng (đến hết 1/2011) Hoàn thành đề tài đúng thời hạn đã được gia hạn

7 Về những đóng góp mới của đề tài:

Đề tài có những điểm mới sau đây:

7.1 Về giải pháp khoa học - công nghệ: Phương pháp HPLC là phương pháp

hiện đại được khuyến cáo sử dụng trong định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương trong hầu hết các phòng nghiên cứu về dược động học và sinh khả dụng của thuốc Phương pháp xây dựng được có áp dụng trên cơ sở của các nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố và có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt nam Phương pháp phân tích đơn giản, khả thi Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC đã xây dựng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285 bệnh nhân lao đang điều trị tại Việt Nam

7.2 Về phương pháp nghiên cứu: Ngoài những nghiên cứu về nồng độ RMP

huyết tương chúng tôi thực hiện năm 2005, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về nồng độ cả 3 thuốc chống lao thiết yếu RMP, INH, PZA trong huyết tương bệnh nhân lao

7.3 Những đóng góp mới khác:

Đóng góp trong đào tạo: các bác sĩ chuyên ngành lao, dược sĩ chuyên ngành dược lâm sàng có hiểu biết sâu hơn về ứng dụng dược động học trong điều trị

Các kết quả của nghiên cứu này cũng giúp ích cho các chuyên gia về bệnh lao thấy được nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương thấp hơn phạm

vi điều trị, góp phần đưa ra bằng chứng về nguyên nhân gia tăng bệnh lao và tình trạng kháng thuốc lao Ngoài ra, phân tích về ảnh hưởng của những yếu

tố cá thể đến nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân, từ đó ứng dụng việc tối ưu hoá điều trị dựa trên nồng độ thuốc, cũng như đưa ra những vấn đề

cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra các giải pháp điều trị, kiểm soát bệnh lao thành công

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2010

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS Lê Thị Luyến TS Nguyễn Thị Liên Hương

Đặt vấn đề

Hóa trị liệu là phương pháp quan trọng nhất để đảm bảo bệnh nhân lao

được điều trị khỏi bệnh và cắt nguồn lây trong cộng đồng Điểm đặc biệt của hoá trị liệu bệnh lao là thời gian điều trị kéo dài và đa trị liệu, vì vậy việc tuân thủ đúng liệu trình điều trị gặp nhiều khó khăn Số loại thuốc chống lao không nhiều, trong khi đó các thuốc chống lao mới ra đời vẫn còn rất ít và còn đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, khó tiếp cận trong điều kiện Việt Nam Các thuốc điều trị bệnh lao hiện đã và đang sử dụng tuy không mới nhưng vẫn là vũ khí quan trọng nhất để điều trị bệnh lao

Thực tế điều trị bệnh lao cho thấy đa số bệnh nhân lao đáp ứng tốt với phác đồ điều trị chuẩn và thực hiện điều trị có giám sát trực tiếp, nhưng có một số bệnh nhân đáp ứng kém mặc dù phác đồ đúng và tuân thủ điều trị Một

số nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác biệt giữa các cá thể về nồng độ thuốc lao đạt được trong huyết tương mặc dù được uống cùng liều như nhau Isoniazid (INH), Rifampicin (RMP), Pyrazinamid (PZA) là những thuốc chống lao thiết yếu được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam Các thuốc này có tác dụng diệt khuẩn và tiệt khuẩn trong tổn thương lao, được sử dụng kết hợp trong giai đoạn tấn công của các phác đồ điều trị Để điều trị có hiệu quả, nồng độ thuốc trong máu/huyết tương phải đạt nồng độ trong phạm vi điều trị Nồng độ các thuốc chống lao trong máu thấp có thể là một trong các nguyên nhân gây ra nguy cơ đáp ứng điều trị kém, kháng thuốc và tăng khả năng tái phát bệnh lao

Nghiên cứu năm 2005 tại Việt Nam về nồng độ RMP trong huyết tương

đã đưa ra phương pháp định lượng RMP huyết tương, các thông tin về đánh giá chất lượng RMP trong viên hỗn hợp có định liều và thực trạng nồng độ RMP trong huyết tương bệnh nhân[5],[6] Trong khi đó điều trị bệnh lao thường phối hợp nhiều thuốc, nhất là các thuốc uống như RMP, PZA, INH là

các thuốc chống lao thiết yếu, có mặt trong các phác đồ điều trị bệnh lao Do

đó nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân cần

có dữ liệu nồng độ cả RMP, PZA, INH

Định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương đòi hỏi các phương tiện kỹ thuật và phương pháp phân tích phù hợp Có nhiều phương pháp định lượng thuốc chống lao trong huyết tương, nhưng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến hơn cả do có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận được Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, máy HPLC tương đối phổ biến, trong khi đó việc định lượng nồng độ các thuốc chống lao RMP đã được chúng tôi xây dựng trong các nghiên cứu trước đây Cùng với RMP, INH và PZA là các thuốc chống lao thiết yếu dùng đồng thời trong phác đồ điều trị bệnh lao, cho đến thời điểm chúng tôi tiến hành nghiên cứu này, chưa có phương pháp định lượng nồng độ INH, PZA trong huyết tương phù hợp với điều kiện hiện nay tại Việt Nam

Những vấn đề được đề cập trên đây chính là lý do chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rifampicin, isoniazid,

pyrazinamid trong huyết tương bằng HPLC

2 Khảo sát nồng độ rifampicin, isoniazid, pyrazinamid trong huyết tương

bệnh nhân lao

• Giám sát nồng độ điều trị (Therapeutic Drug Monitoring) những thuốc

có phạm vi điều trị hẹp, bệnh nhân nghi ngờ khả năng hấp thu kém, có rối loạn chức năng gan thận, hoặc để theo dõi sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân

• Nghiên cứu dược động học của thuốc

• Đánh giá sinh khả dụng (bioavailability) và tương đương sinh học (bioequivalence) của thuốc

Để định lượng được nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương trong đánh giá sinh khả dụng của thuốc cũng như giám sát nồng độ điều trị, cần xây dựng

được phương pháp định lượng RMP, INH, PZA trong huyết tương Trước đây nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương được định lượng bằng phương

pháp đo quang hoặc phương pháp vi khuẩn học (sử dụng Staphylococcus aureus, Sarcina lutea hoặc Bacillus subtilis) Gần đây, một số phương pháp

khác như: phương pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay), miễn dịch huỳnh quang phân cực (fluorescence polarization immunoassay), sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) được sử dụng để

định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương cho độ chính xác cao

hơn

Định lượng thuốc chống lao trong huyết tương bằng HPLC được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế (IUATLD) khuyến cáo sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng của RMP, INH, PZA, EMB trong chế phẩm thuốc chống lao hỗn hợp chứa RMP [75] Ngoài ra, một số tác giả trên thế giới [37],[40],[77] đã xây dựng phương pháp định lượng thuốc chống lao trong huyết tương và dịch sinh học khác nhằm nghiên cứu dược

động học, sinh khả dụng và theo dõi điều trị. Nhìn chung các phương pháp

định lượng RMP, INH, PZA trong dịch sinh học được áp dụng gần đây hầu hết là sử dụng phương pháp HPLC vì đây là loại máy tương đối phổ biến ở các phòng nghiên cứu, phương pháp có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận được

1.1.1 Phương pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tương

Để chiết hoạt chất từ huyết tương phục vụ cho định lượng thuốc trong huyết tương bằng HPCL thường sử dụng các phương pháp sau:

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi Một số hỗn hợp dung môi đã được nghiên cứu để chiết RMP, INH, PZA bao gồm dichloromethan - diethylether, tỉ lệ 2:3 (v/v) [77], diethylether: diclomethane, tỉ lệ 2:1(v/v), acid tricloacetic 5% [72]

- Phương pháp chiết lỏng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt chất Mẫu được bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó được rửa giải bằng

hệ dung môi thích hợp để tách hoạt chất P.J Smith, J van Dyk, A Fredericks [64] dùng cột C18 Bondelut, được hoạt hóa lần lượt bằng methanol, nước, đệm phosphat pH 4,5 trước khi bơm mẫu 0,5 ml huyết tương được bơm vào cột, giữ trong 5 phút và cho chảy từ từ qua cột Sau thời gian này, các thành phần không liên kết được loại bỏ Cột chiết xuất

được rửa giải với 0,5 ml acetonitril, 0,5 ml methanol Tuy nhiên phương pháp này đắt tiền hơn vì phải chi phí cho sử dụng cột chiết xuất pha rắn

- Tủa protein huyết tương: là phương pháp đơn giản hơn cả Một số dung

[27], (tỉ lệ huyết tương: acetonitril = 1:1,5 hoặc 1:1); methanol [45], acid tricloacetic 5% [72]

1.1.2 Chương trình sắc ký

Qui trình chiết và phương pháp định lượng hoạt chất trong chế phẩm bào chế thường đơn giản hơn định lượng trong huyết tương do tạp (các tá dược) ít hơn và hàm lượng trong thuốc thường đã được dự đoán trước Đối với việc định lượng các hoạt chất trong huyết tương thường phức tạp hơn do hàm lượng thuốc trong huyết tương thấp, trong huyết tương có rất nhiều thành phần

và có thêm chất chuyển hóa của các hoạt chất Tại Việt Nam, năm 2005 chúng tôi đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương [5],[9]

Trên thế giới, có nhiều chương trình sắc ký được sử dụng để định lượng rifampicin trong huyết tương như trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số chương trình HPLC định lượng RMP, INH, PZA trong

Chất định lượng

[64] àBondapak C 18

(30 cm x 3,9 mm,

10 àm)

Methanol – 0,05 M ammonium formate (65:35)

UV (254nm)

RMP: 17 RMP và

dẫn chất, Rifapentin (cú mặt PZA) [17,

24]

nước, ACN

LC MS/MS

RMP:

2-3 phỳt

RMP và cỏc chất

Chất định lượng

chuyển húa;

Clarithromycin [24,

UV (idiod array) 280nm và 245nm

INH, PZA,RMP: 3.1;

45]

ODS Đệm phosphat pH6,

MeOH(4%), tetrapentyl ammoni bromide

UV 268

nm

PZA:

12.55 phỳt

PZA và cỏc chất chuyển húa [52] C8 Gradient: Đệm

9.3

PZA và RMP

chloroform–ACN (55:40:4:1)

UV 337nm

INH;

PZA;

RMP

1.1.3 Độ ổn định của RMP, INH, PZA trong huyết tương

Rifampicin dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ thường Le Guellec và cộng sự

[21] tại phòng thí nghiệm dược lý và độc tính lâm sàng, CHU Bretonneau

(Tours, Pháp) tiến hành nghiên cứu độ ổn định của RMP trong mẫu huyết

tương kết quả cho thấy RMP bị phân huỷ nhanh chóng ở nhiệt độ thường

(25OC) tới 54% trong vòng 8 giờ, thêm acid ascorbic có thể kéo dài độ ổn định

của RMP tới 12 giờ RMP ở nồng độ thấp bị phân huỷ nhanh hơn Tuy nhiên,

ở nhiệt độ -20OC, RMP ổn định hơn RMP trong huyết tương bệnh nhân uống

RMP thể hiện độ ổn định cao hơn, có thể do ở điều kiện in vivo, các phân tử RMP ổn định hơn

Một số nghiên cứu về độ ổn định của RMP huyết tương được tóm tắt ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Các nghiên cứu độ ổn định của rifampicin

- 80OC 12 tháng

Trong nghiên cứu trước đây năm 2005, chúng tôi đã nghiên cứu độ ổn

định của RMP huyết tương ở điều kiện bảo quản -400C đã cho thấy RMP trong mẫu huyết tương ổn định 3 tháng trong điều kiện bảo quản -400C

Độ ổn định của INH, PZA: các nghiên cứu về độ ổn định của INH và PZA trong huyết tương đều cho thấy độ ổn định của INH và PZA phụ thuộc nhiều vào điều kiện bảo quản, với điều kiện bảo quản -700C nồng độ các thuốc này ổn định trong khoảng 1 tháng trở lên

Bảng 1.3 Các nghiên cứu độ ổn định của INH, PZA trong huyết tương

Tài liệu tham

khảo Mẫu bảo quản

Điều kiện bảo quản

Nhiệt độ bảo quản

Trong điều kiện các phòng thí nghiệm tại Việt Nam hiện nay, các tủ

lạnh sâu -40oC tương đối phổ biến nhưng chưa có tài liệu nào công bố về độ

ổn định của INH và PZA trong các mẫu huyết tương ở điều kiện bảo quản

-40oC

1.1.4 Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp định lượng

Thẩm định phương pháp phân tích là xác nhận độ tin cậy của phép đo

hoạt chất trong môi trường đã cho bằng thực nghiệm

Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác,

hàm đáp ứng, giới hạn định lượng và độ ổn định của mẫu Thẩm định phương

pháp theo hướng dẫn của FDA về xây dựng các phương pháp phân tích sinh

học [68]

1.2 Dược động học của RMP, INH, PZA

Nghiên cứu về nồng độ thuốc trong huyết tương cần am hiểu về dược

động học của thuốc Dược động học của RMP, INH, PZA như sau:

1.2.1 Dược động học của RMP

Rifampicin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá, khi uống lúc dạ

dày rỗng, nó được hấp thu gần như hoàn toàn Nồng độ thuốc trong huyết

tương có sự giao động rất lớn giữa các cá thể [54],[50],[78] và khác nhau giữa

các tài liệu đã công bố, khi uống liều 600 mg sau 2 - 4h đạt Cmax huyết tương

4 - 32àg/ml [54], 7 - 10àg/ml [22, 65]

Dược động học của rifampicin bị ảnh hưởng bởi bữa ăn, nhưng phụ thuộc nhiều hơn vào thành phần thức ăn Nếu thức ăn có thành phần chủ yếu

là cacbonhydrat và protein thì ít bị ảnh hưởng hơn, nếu uống thuốc cùng bữa

ăn có nhiều mỡ thì nồng độ Cmax rifampicin huyết tương bị giảm và Tmax (thời gian đạt được Cmax) chậm lại [49]

Rifampicin liên kết với protein huyết tương 81 - 94% [54] Thuốc phân

bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, khuếch tán vào dịch não tuỷ khi màng não bị viêm Thuốc vào được cả nhau thai và sữa mẹ Nồng độ thuốc trong thành hang lao, nhu mô phổi và thận cao hơn so với trong huyết tương, nồng

độ thuốc trong màng phổi, xương thấp hơn trong huyết tương Khả năng thấm vào dịch não tuỷ và chất bã đậu rất kém chỉ đạt 20% so với trong huyết tương [57]

Nồng độ rifampicin trong huyết tương phụ thuộc nhiều vào quá trình sản xuất chế phẩm Nếu thay đổi kích thước tiểu phân hay tá dược, mặc dù cùng hàm lượng như nhau nhưng nồng độ thuốc hấp thu vào máu khác nhau

Sự giảm sinh khả dụng hay xảy ra với dạng chế phẩm hỗn hợp cố định liều

[13, 54],[38],[62]

Rifampicin chuyển hoá ở gan, thuốc bị khử acetyl nhanh thành chất chuyển hoá vẫn có hoạt tính 25-O-desacetyl-rifampicin Các chất chuyển hoá khác không còn hoạt tính là rifampin quinon, desacetyl rifampin quinon và 3-formyl-rifampin

Rifampicin thải trừ qua mật và nước tiểu dưới dạng thuốc không chuyển hoá và chất chuyển hoá, trải qua chu trình ruột - gan 60 - 65% liều dùng thải trừ qua mật và được bài tiết ra ngoài phân, 10% thuốc thải trừ ở dạng không biến đổi trong nước tiểu, 15% là chất chuyển hoá còn hoạt tính 25-O-desacetyl-rifampicin và 7% dẫn chất 3-formyl-rifampin không còn hoạt tính Thời gian bán thải của rifampicin là 3 - 5 giờ sau khi uống liều đầu, khi uống lặp lại là 2 - 3 giờ Thời gian bán thải kéo dài ở người suy gan [2],[54],[19]

1.2.2 Dược động học của INH

Isoniazid hấp thu nhanh và hoàn toàn theo đường tiêu hoá và tiêm bắp Sau khi uống liều 300mg (5 mg/ kg) được 1-2 h đạt nồng độ tối đa trong huyết thanh 3 - 8 àg/ml Nồng độ này có thể khác nhau giữa các cá thể mang loại hình acetyl hoá chậm hay nhanh, ở người chuyển hoá nhanh nồng độ Cmax huyết tương thường thấp hơn người chuyển hoá chậm [54],[57] Thức ăn làm giảm hấp thu và giảm sinh khả dụng isoniazid [2]

Isoniazid phân bố vào tất cả các cơ quan, các mô và dịch cơ thể Nồng

độ thuốc trong dịch não tuỷ bằng nồng độ thuốc trong huyết tương [54],[23] Nồng độ thuốc đạt được trong màng phổi bằng 45% nồng độ thuốc trong huyết tương [2] Isoniazid thấm được vào hang lao, thấm tốt vào trong chất bã

đậu, dễ dàng qua nhau thai và vào thai nhi [54],[23]

Isoniazid chuyển hoá ở gan bằng phản ứng acetyl hoá chủ yếu tạo thành acetylisoniazid và acid isonicotinic Trung bình 50% dân số châu Phi và châu

Âu thuộc loại chuyển hoá isoniazid chậm, ngược lại người châu á thuộc loại chuyển hoá nhanh

Xác định kiểu hình acetyl hoá bằng 2 phương pháp: xác định kiểu gen NAT2 hoặc định lượng trực tiếp isoniazid và acetyl isoniazid trong huyết tương sau khi uống isoniazid ở thời điểm 3h, dựa trên tỷ lệ isoniazid và acetyl isoniazid để xác định kiểu hình chuyển hoá acetyl hoá isoniazid nhanh hay chậm Vì vậy, trong điều kiện nước ta hiện nay, cần có nghiên cứu áp dụng phương pháp định lượng isoniazid và chất chuyển hoá để xác định tỷ lệ acetyl hoá nhanh hay chậm ở người Việt nam

Hiệu quả điều trị của isoniazid không khác nhau giữa các nhóm chuyển hoá nhanh và chậm, nếu isoniazid được dùng hàng ngày hoặc 2 - 3 lần trong tuần Tuy nhiên, hiệu quả điều trị sẽ giảm ở người chuyển hoá isoniazid nhanh nếu chỉ dùng isoniazid 1 lần/tuần [50],[52],[57] Nồng độ INH huyết tương ở người có kiểu hình chuyển hóa isoniazid chậm cao hơn so với người có loại hình chuyển hóa isoniazid nhanh[20, 30]

Thời gian bán thải của isoniazid ở bệnh nhân có chức năng gan, thận bình thường là 0,75 - 4,5h (chuyển hoá isoniazid nhanh: 0,75 - 1,8h, người chuyển hoá isoniazid chậm 2 - 4,5h) [19] và kéo dài hơn ở người suy giảm chức năng gan hoặc suy thận nặng Khi chức năng thận giảm, thải trừ isoniazid chỉ hơi chậm lại, nhưng điều này ảnh hưởng nhiều đến nhóm người bệnh chuyển hoá chậm Vì vậy, nếu bệnh nhân suy thận nặng Clearance creatinin < 25 ml/ phút mà người này lại thuộc loại chuyển hoá chậm thì nhất thiết phải giảm liều Khoảng 75 – 95% thuốc thải trừ qua thận trong vòng 24 giờ dưới dạng chất chuyển hoá không hoạt tính, một lượng nhỏ thải qua phân Thuốc có thể được loại khỏi máu bằng thận nhân tạo hay thẩm phân màng bụng [54]

1.2.3 Dược động học của PZA

PZA được hấp thu tốt qua đường tiêu hoá, nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt 2 h sau khi uống 1 liều 1,5g là 35àg/ml, với liều 3 g là 66 àg/ml

[2],[23] Khi uống với liều điều trị (20 - 25mg/kg) nồng độ đỉnh trong huyết

tương đạt khoảng 30 -50 àg/ml Nồng độ trong huyết tương của chất chuyển hoá còn hoạt tính pyrazinoic acid cao hơn so với nồng độ PZA và thời gian đạt nồng độ cao nhất của chất chuyển hoá này trong huyết tương là 4 - 8h sau khi uống.PZA không bị ảnh hưởng sinh khả dụng trong viên hỗn hợp nhiều thành phần [54]

Thuốc phân bố vào các mô và dịch cơ thể, kể cả gan, phổi, dịch não tuỷ Nồng độ thuốc trong dịch não tuỷ tương đương với nồng độ ổn định trong huyết tương ở những người viêm màng não Trong một nghiên cứu trên số ít bệnh nhân lao màng não, khi cho uống liều 41mg/ kg ở thời điểm 2 h sau khi uồng nồng độ đo được trong huyết tương là 52 àg/ml và trong dịch não tuỷ là

39 àg/ml, sau khi uống 5h nồng độ trong dịch não tuỷ bằng nồng độ trong huyết tương Cho đến nay chưa biết chắc rằng PZA có qua nhau thai và vào

sữa mẹ hay không [54]

PZA gắn với protein huyết tương khoảng 10% - 17%

PZA bị thuỷ phân ở gan thành chất chuyển hoá chính có hoạt tính là acid pyrazinoic, quá trình thuỷ phân có thể xảy ra ngay khi ở dạ dày hoặc ở trong mật Acid pyrazinoic bị hydroxyl hoá thành acid -5- hydroxy pyrazinoic

Thời gian bán thải của thuốc là 9 - 10h, dài hơn khi bị suy thận hoặc suy gan Thuốc đào thải qua thận, chủ yếu do lọc ở cầu thận Khoảng 70% liều uống đào thải trong vòng 24h Khoảng 4 - 14% thuốc được đào thải ở dạng không đổi, phần còn lại ở dạng chất chuyển hoá

1.3 Các nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân

Những nghiên cứu trước đây về dược động học của các thuốc chống lao

ở nước ngoài cũng như trong nước cho thấy có sự dao động rất lớn giữa các cá thể về nồng độ thuốc chống lao đạt được trong huyết tương

Về thời điểm lấy mẫu để định lượng nồng độ, Tmax của các thuốc chống lao thường vào khoảng 2h sau khi uống, tức là ở thời điểm này nếu lấy mẫu để

đo nồng độ thường đạt được nồng độ đỉnh trong huyết tương

Nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân nhằm ứng dụng hiệu chỉnh liều điều trị trong lâm sàng được Peloquin và cộng

sự thực hiện nhiều nghiên cứu tại Trung tâm nghiên cứu Y học Jewish, Denver, Colorado, Hoa Kỳ từ năm 1989 Các nghiên cứu chủ yếu để ứng dụng hiệu chỉnh liều điều trị cho bệnh nhân lao nhiễm các chủng vi khuẩn nhạy cảm, điều trị bằng các phác đồ chuẩn có giám sát trực tiếp nhưng đáp ứng điều trị kém Một số tác giả khác như Mehta và cộng sự (1991) [36], Jay

và cộng sự (2003) [56], Heysell (2010) [25], cũng đã tiến hành nghiên cứu khảo sát nồng độ các thuốc trên trong huyết tương ở bệnh nhân lao và sau đó

áp dụng hiệu chỉnh liều điều trị Dựa trên nồng độ khảo sát được, đánh giá

nồng độ thuốc đạt nồng độ trong phạm vi điều trị hay không để quyết định hiệu chỉnh liều điều trị

1.3.1 Các nghiên cứu khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương

Thực trạng nồng độ thuốc chống lao INH và RMP huyết tương thấp hơn phạm vi điều trị ở bệnh nhân điều trị bằng thuốc chống lao đã được một số nghiên cứu trên thế giới đề cập đến và là vấn đề đáng lo ngại [39],[44],[60],[73]

Kimerling và cộng sự (1998) [29] thuộc khoa Y, Trường Đại học Alabama tại Birmingham đã định lượng nồng độ RMP và INH sau 2h uống thuốc ở 22 bệnh nhân lao HIV(-) có các tiêu chuẩn: đáp ứng điều trị kém (sau

12 tuần điều trị kết quả nuôi cấy tìm vi khuẩn lao còn dương tính), điều trị thất bại hoặc tái phát Kết quả định lượng cho thấy 15 trong 22 bệnh nhân (68%) nồng độ INH thấp, 14 trong 22 bệnh nhân (64%) nồng độ RMP thấp hơn phạm

vi điều trị

Tại Australia, Ray và cộng sự (2003) [56] đã tiến hành định lượng nồng

độ RMP và INH huyết tương ở thời đểm 2h sau khi uống cho 84 bệnh nhân lao

đang điều trị tại bang New South Wales cho thấy nồng độ RMP trung bình của cả nhóm nghiên cứu là 10 ± 6 àg/ml, 46% số bệnh nhân có nồng độ < 8àg/ml

và có 3 bệnh nhân có nồng độ RMP huyết tương vượt quá phạm vi điều trị

(>24 àg/ml) Đối với INH, trong số 83 bệnh nhân được đo nồng độ INH, chỉ

có 11% bệnh nhân có nồng độ đạt trong phạm vi điều trị, 48% bệnh nhân có nồng độ thấp hơn phạm vi điều trị, trong khi 29% bệnh nhân có nồng độ cao hơn phạm vi điều trị Từ kết quả nghiên cứu, tác giả đã đặt vấn đề cần áp dụng

định lượng nồng độ RMP, INH huyết tương để hiệu chỉnh liều điều trị cho bệnh nhân lao

Nghiên cứu của van Crevel và cộng sự (2002) [71] trên 62 bệnh nhân lao Indonesia cho kết quả 60 bệnh nhân (97%) có nồng độ RMP huyết tương ở thời điểm 2h < 8 àg/ml và 70% bệnh nhân có nồng độ < 4 àg/ml Dựa trên kết

quả nồng độ RMP huyết tương ở bệnh nhân lao, tác giả của nghiên cứu này đã

đề cập đến vấn đề đánh giá sinh khả dụng của RMP trong chế phẩm thuốc chống lao bệnh nhân lao đang sử dụng

Tại Nam Phi, nghiên cứu của McIlleron và cộng sự (2002) [33] về nồng

độ RMP ở những bệnh nhân sử dụng chế phẩm thuốc có chứa RMP được nhập

từ ấn Độ trên 118 bệnh nhân lao đã cho thấy nồng độ Cmax RMP huyết tương

<4 àg/ml ở 44/118 bệnh nhân lao Kết quả nghiên cứu dược động học đã xác

định nguyên nhân là do giảm sinh khả dụng của chế phẩm mà bệnh nhân lao

sử dụng, chế phẩm đó đã bị rút khỏi thị trường

Nồng độ RMP trong huyết tương khảo sát ở 91 bệnh nhân lao phổi/HIV(+) tại Botswana trong nghiên cứu của Tappero và cộng sự (2005)[66] cho thấy 78% bệnh nhân có nồng độ < 8 àg/ml, 23% bệnh nhân có nồng độ RMP huyết tương <4àg/ml Các nghiên cứu khác về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao/HIV(+) cho thấy phần lớn nồng độ Cmax RMP, INH trong huyết tương ở những bệnh nhân này thấp hơn phạm vi

điều trị[53]

Nghiên cứu của Pinheiro và cộng sự (2006) [55] ở 18 bệnh nhân lao cho thấy nồng độ RMP ở 2h sau uống là 6,47 (median) (0 - 31,95), INH là 2.17 (0,8 - 3,77) Số bệnh nhân có nồng độ RMP < 8 là 16/18 và INH < 3 là 13/18 Nghiên cứu của McIlleron H và CS (2006) [35] ở 142 bệnh nhân lao phổi cho nồng độ INH (median) ở 2h là 5,0 àg/ml (0,4 - 13,6), PZA là 49,6 àg/ml (1,3 - 86,6), RMP là 4,4àg/ml (0 - 14,8)

1.3.2 Nghiên cứu về các yếu tố liên quan của nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương

1.3.2.1 Các yếu tố liên quan đến nồng độ INH huyết tương

INH là thuốc chống lao có tác dụng tiệt khuẩn Liều điều trị hàng ngày uống 300 - 450 mg/ngày thì nồng độ INH huyết tương cần đạt khoảng 3 - 6

àg/ml MIC của INH đối với M tuberculosis là 0,025 - 0,05 àg/ml

MBC/MIC khoảng bằng 1

Mức độ liên kết protein huyết tương của INH thấp (<10%) và không có vai trò quan trọng trong lâm sàng và động học

- Liều điều trị: tương quan thuận mức độ yếu với nồng độ INH huyết tương ở

thời điểm 2h sau khi uống ở các nghiên cứu của McIlleron và CS (2006), Um (2007) [69]

- Dạng chế phẩm: nồng độ INH ở những bệnh nhân uống chế phẩm hỗn hợp

cố định liều thấp hơn so với bệnh nhân uống dạng đơn lẻ[35]

- Loại hình chuyển hoá acetyl INH: Nghiên cứu của Conte JE (2002) [16] cho

thấy những bệnh nhân có loại hình chuyển hoá acetyl INH chậm sẽ có nồng

độ thuốc trong huyết tương cao hơn so với bệnh nhân có loại hình chuyển hoá acetyl INH nhanh Nồng độ INH ở thời điểm 1h cao hơn 4h sau khi uống

Nghiên cứu của Martina Kinzig-Schippers (2005) [30] cho thấy dược

động học của INH phụ thuộc vào enzym N-acetyltransferase type 2 Những

người mang gen NAT2*4/*4 genotype (2 NAT2 alleles hoạt độ cao) có nồng

độ INH thấp hơn các cá thể mang NAT2 genotype khác

Nghiên cứu của Gardiner và cộng sự (2006)[20] cho thấy nồng độ INH huyết tương ở 2h và 6h sau khi uống ở những người acetyl hóa chậm cao gấp 4

- 6 lần so với người có loại hình acetyl hóa nhanh

Nghiên cứu của Um (2007)[69] cho thấy tương quan rõ rệt giữa nồng độ INH huyết tương với liều điều trị và tỷ lệ acetyl INH/INH huyết tương ở thời

điểm 2h sau khi uống

- Giới: Conte JE (2002) [16], Um (2007) [69] cho thấy giới không ảnh hưởng

tới nồng độ INH huyết tương Tuy nhiên, nghiên cứu của McIlleron H và CS (2006) ở 142 bệnh nhân lao phổi lại cho thấy nồng độ INH liên quan rõ rệt với giới (nữ cao hơn nam) liều điều trị

- Tuổi (bệnh nhân già có nồng độ INH ở thời điểm 2h sau khi uống cao hơn

bệnh nhân trẻ), Um (2007), McIlleron H và CS (2006) [35], nhưng nghiên cứu của Woo (1995) lại cho thấy không có mối tương quan rõ rệt [76]

- Tình trạng nhiễm HIV: Conte JE (2002) [16] cho thấy tình trạng nhiễm HIV

không ảnh hưởng tới nồng độ INH huyết tương

- Nồng độ albumin huyết tương: Nghiên cứu của Um (2007) [69] cho nồng độ

albumin huyết tương tương quan với nồng độ INH huyết tương khi phân tích tương quan đơn biến (P<0,05), nhưng khi phân tích đa biến không thấy tương quan ở mức ý nghĩa thống kê (P>0,05)

1.3.2.2 Các yếu tố liên quan đến nồng độ RMP huyết tương

RMP là thuốc chống lao có tác dụng tiệt khuẩn đối với các vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào, tác dụng đối với quần thể vi khuẩn chuyển hoá chậm ở liều điều trị 450 - 600mg/ngày, nồng độ đỉnh của RMP cần đạt là 8 - 24àg/ml Mức độ liên kết với protein huyết tương của RMP cao khoảng 88%, bệnh nhân lao thường gầy và có albumin huyết tương thấp do đó mức độ đào thải RMP cao

- Liều điều trị: tương quan thuận mức độ yếu ở các nghiên cứu của McIlleron

H và CS (2006) [35], Um (2007) [69]

- Dạng bào chế: Nghiên cứu của McIlleron H và CS (2006) [35], van Crevel

(2002) [71] ở bệnh nhân lao phổi cho thấy nồng độ RMP và INH liên quan nghịch rõ rệt với dạng viên hỗn hợp FDC Những bệnh nhân uống chế phẩm hỗn hợp cố định liều có nồng độ RMP và INH thấp hơn so với bệnh nhân

uống dạng đơn lẻ

- Giới: theo kết quả nghiên cứu của McIlleron H và CS (2006) [35] nồng độ

RMP trung bình ở nhóm bệnh nhân nữ cao hơn so với ở nhóm bệnh nhân nam, nhưng nghiên cứu của Um (2007) [69] cho thấy không có mối liên quan rõ rệt

về nồng độ RMP huyết tương với giới

- Đái tháo đường mắc kèm: nồng độ RMP và INH ở bệnh nhân có bệnh đái

tháo đường mắc kèm thấp hơn so với nhóm bệnh nhân không có đái tháo

đường

- Chức năng thận: Nghiên cứu của Pinheiro và cộng sự (2006) [55] còn cho

thấy mặc dù sự bài tiết của thận ở bệnh nhân lao thấp hơn so với người khoẻ mạnh nhưng tỷ lệ bệnh nhân có nồng độ RMP, INH ở 2h sau khi uống thấp hơn phạm vi điều trị chiếm phần lớn

1.3.2.3 Các yếu tố liên quan đến nồng độ PZA huyết tương

Nghiên cứu của Um (2007) [69] cho thấy tuổi, giới, nồng độ albumin huyết tương không tương quan với nồng độ PZA huyết tương (khi phân tích tương quan đa biến) nhưng phân tích tương quan đơn biến cho thấy nồng độ ở bệnh nhân nam thấp hơn so với bệnh nhân nữ

Liều điều trị có tương quan thuận với nồng độ PZA ở thời điểm 2h sau khi uống (cả phân tích tương quan đơn biến và đa biến)

1.3.2.4 Một số yếu tố khác liên quan đến nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương

- Bệnh mắc kèm: Nghiên cứu của G.F Valeria và cộng sự [70], cho kết quả

nồng độ RMP và INH của nhóm bệnh nhân lao có bệnh lý tiêu hóa thấp hơn nhóm không có bệnh lý tiêu hóa

- Tình trạng nhiễm HIV: Nghiên cứu của S.H Choudhri và cộng sự (1997)

[15] trên 29 bệnh nhân lao có HIV (có tiêu chảy và không) và nhóm không có HIV, kết quả nghiên cứu này không tìm thấy mối tương quan có ý nghĩa thống

kê giữa nồng độ thuốc RMP, INH và PZA với tình trạng HIV và bệnh lý tiêu chảy Nghiên cứu này không lý giải được tại sao các nghiên cứu trước đó hầu hết cho kết quả những bệnh nhân có HIV, có bệnh tiêu chảy thường có nồng

độ đỉnh thuốc lao trong huyết tương giảm

- Các thuốc kháng virus dùng phối hợp: Nghiên cứu của W.J Burman và cộng

sự (1999) [14] về liên quan giữa hấp thu các thuốc chống lao với các thuốc

gây ra các tương tác phức tạp và khẳng định vai trò của theo dõi nồng độ của thuốc khi điều trị, đặc biệt có giá trị với các trường hợp có biểu hiện lâm sàng nặng

1.3.3 Nghiên cứu về liên quan giữa nồng độ thuốc chống lao và kết quả

điều trị

Tác dụng diệt khuẩn sớm (Early Bactericidal Activity - EBA) của INH liên quan rõ rệt với liều điều trị Nguy cơ thất bại điều trị liên quan rõ rệt với nồng độ INH thấp trong huyết tương, còn nồng độ RMP trong huyết tương thấp chưa có được mối liên quan rõ rệt với âm hoá đờm mà liên quan với tỷ lệ tái phát [18],[74]

Nghiên cứu của McIlleron và CS (2007) [34] ở 142 bệnh nhân lao phổi cho thấy nồng độ RMP, INH, PZA huyết tương không thấy liên quan rõ rệt với kết quả điều trị Riêng nồng độ RMP tương quan thuận với nồng độ IFNγ,

trong khi nồng độ IFNγ tương quan thuận với đáp ứng điều trị

Nghiên cứu của S Heysell và cộng sự (2010) [25] tại Virginia (Hoa Kỳ) cho thấy trong số 42 bệnh nhân đáp ứng điều trị kém, tỷ lệ bệnh nhân có nồng độ thấp hơn phạm vi điều trị đối với RMP 52%, INH 59%; riêng PZA có 100% số bệnh nhân nồng độ đạt phạm vi điều trị

Một số tác giả [36],[47],[56] dựa trên những thông số về nồng độ thuốc

đo được ở khoảng 2h sau khi uống thuốc (khoảng thời gian đạt Cmax) để hiệu chỉnh liều điều trị và thấy đáp ứng tốt Mehta JB và cộng sự (2001) [36], Peloquin (2002) [50], Jay và cộng sự (2003) [56] cho rằng, với phác đồ điều trị chuẩn hiện nay, đa số bệnh nhân đáp ứng tốt với điều trị, nhưng với số ít bệnh nhân đáp ứng điều trị kém thì ngoài những giám sát tuân thủ điều trị, cần phải định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương để chỉnh liều cho phù hợp

Phần 2

Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên 285 bệnh nhân lao phổi và lao màng phổi

điều trị tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên, Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hải Phòng

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân vào nghiên cứu

- Bệnh nhân từ 16 tuổi trở lên

- Chẩn đoán lao phổi AFB (+) hoặc chẩn đoán lao màng phổi

- Điều trị bằng phác đồ có RMP, INH, PZA

- Bệnh nhân điều trị nội trú tại Bệnh viện chuyên khoa lao

- Chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn chẩn đoán lao phổi AFB(+): dựa vào tiêu chuẩn của Hiệp hội bài

lao quốc tế và CTCLQG [1]: có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau:

- có tối thiểu 2 tiêu bản đờm dương tính từ 2 mẫu đờm khác nhau xét nghiệm bằng soi trực tiếp

- Hoặc: Có ít nhất 1 tiêu bản đờm dương tính kèm theo có hình ảnh bất thường nghi lao trên Xquang phổi

- Hoặc: có ít nhất 1 tiêu bản đờm dương tính và 1 mẫu đờm nuôi cấy tìm thấy vi khuẩn lao

Tiêu chuẩn chẩn đoán lao màng phổi (đơn thuần hoặc phối hợp lao phổi):

Chọc hút khoang màng phổi có dịch, kèm theo có ít nhất 1 trong các tiêu chuẩn sau:

o Tìm thấy AFB trong dịch màng phổi bằng phương pháp soi trực tiếp

o Có lao phổi AFB (+) phối hợp

o PCR vi khuẩn lao ở dịch màng phổi (+)

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Phụ nữ có thai

- Phụ nữ đang cho con bú

- Bệnh nhân có mẫu huyết tương bị hỏng không định lượng được nồng

độ, không có số liệu về nồng độ

2.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIấN CỨU

2.2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi

- Chất đối chiếu: RMP (hàm lượng 99,4%), INH (hàm lượng 100,1%), PZA (hàm lượng 99,2%) (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Hoá chất, dung môi:

+ Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN) loại dùng cho HPLC (Merck

- Đức)

+ Na2HPO4.12H2O loại dùng cho phân tích (Merck - Đức)

+ Cinnamaldehyd (PA- Merck)

+ Natri acetat (Vel – Bỉ)

+ Acid tricloacetic (Vel- Bỉ)

- Huyết tương trắng (Viện Huyết học truyền máu Trung ương)

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

- Hệ thống HPLC Thermo Finnigan, detector UV-DAD (Mỹ)

- Máy lắc xoáy Labinco (Hà Lan)

- Máy đo pH Mettler (Thụy Sĩ)

- Máy siêu li tâm lạnh Sigma (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler (Thụy Sỹ)

- Bộ màng lọc, đầu lọc đường kính lỗ lọc 0,45 àm; 0,2 àm