Nghiên cứu đánh giá hiệu lực interleukin 2 tái tổ hợp sản xuất tại việt nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư

Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài: Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú Chủ trì đề tài, giám sát toàn bộ hoạt động của đề tài, trực tiếp tham gia tiến hành tạo

Trang 1

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA

INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ”

(MÃ SỐ: KC.04.21/06-10)

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trương Nam Hải

8414

Hà Nội – 2010

Bản báo cáo hoàn thành ngày 08/12/2010

Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC.04.21/06-10

Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học

Trang 2

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA

INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ”

(MÃ SỐ: KC.04.21/06-10)

Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài:

PGS TS TRƯƠNG NAM HẢI

TL Bộ Khoa học và Công nghệ Giám đốc Văn phòng các chương trình

Trang 3

Chủ nhiệm Đề tài KC.04.21/06-10 xin chân thành cảm ơn Văn phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước, Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban Chủ nhiệm Chương trình KC 04/06-10, Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1, Học viện Quân Y 103, Khoa Sinh học – Trường Đại học KHTN Hà Nội, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, cùng toàn bộ các thành viên của

Đề tài đã tích cực tham gia và hỗ trợ cho công trình nghiên cứu này

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS TS Trương Nam Hải

Trang 4

1 PGS TS Trương Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm Đề tài

2 NCS Trần Ngọc Tân Viện Công nghệ sinh học Thư ký Đề tài

3 CN Nguyễn Thanh Thủy Viện Công nghệ sinh học Kế toán Đề tài

4 NCS Vũ Minh Đức Viện Công nghệ sinh học Tham gia

5 NCS Nguyễn Thanh Nhàn Viện Công nghệ sinh học Tham gia

6 NCS Bùi Khánh Chi Viện Công nghệ sinh học Tham gia

7 ThS Nguyễn Hồng Thanh Viện Công nghệ sinh học Tham gia

8 KS Lê Thi Lan Anh Viện Công nghệ sinh học Tham gia

7 TS Phạm Bích Hợp Viện Công nghệ sinh học Tham gia

8 TS Đỗ Thị Thảo Viện Công nghệ sinh học Tham gia

9 TS BS Lê Văn Đông Học viện Quân Y 103 Chủ nhiệm Đề tài nhánh

10 TS Đỗ Khắc Đại Học viện Quân Y 103 Tham gia

11 PGS TS Nguyễn Thị Quỳ Trường ĐH KHTN-HN Chủ nhiệm Đề tài nhánh

12 TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Trường ĐH KHTN-HN Tham gia

13 CN Bùi Thị Vân Khánh Trường ĐH KHTN-HN Tham gia

14 GS TSKH Nguyễn Thu Vân Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Chủ nhiệm Đề tài nhánh

15 ThS Lưu Anh Chiến Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

16 CN Nguyễn Minh Nga Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

17 CN Nguyễn Văn Cam Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

18 ThS Hoàng Văn Thái Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

19 Chu Văn Hanh Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

20 Vũ Thành Nam Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

Trang 5

22 TS Đỗ Thủy Ngân phẩm số 1 Tham gia

23 CN Nguyễn Hoàng Mai Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

24 ThS Nguyễn Thu Hằng Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 Tham gia

Trang 6

i

VIỆN KH&CN VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 tái

tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư”

Mã số đề tài: KC.04/06-10

Thuộc chương trình: “Nghiên cứu, ứng dụng và phát triển công nghệ

sinh học”

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Trương Nam Hải

Ngày, tháng, năm sinh: 01-04-1954 Giới tính: Nam

Học hàm, học vị: PGS TS

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp Chức vụ: Viện trưởng

Điện thoại: Tổ chức: (04) 37562790 Nhà riêng: (04)38388018

Mobile: 0903469219

Fax: 04 38363144 E-mail: tnhai@hn.vnn.vn

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Trang 7

Địa chỉ: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS Trương Nam Hải

Số tài khoản: 931-01-064

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước, Ba Đình, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài :

- Theo Hợp đồng đã ký kết : từ 1 tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2010

- Thực tế thực hiện : từ 6 tháng 2 năm 2009 đến tháng 12 năm 2010

1 Năm 2009 2000,00 Kỳ I: 14/10/09 879,101667

2 Năm 2010 1500,00 Kỳ II-IV: 19/08/10 1089,542333

Trang 8

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài: 3367,00322 tr.đ

+ Đăng ký bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ: 4,088.00 tr.đ

+ Kinh phí còn lại từ kiểm nghiệm trong nước và ngoài nước năm 2010 là: 115,492 tr.đ

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét

chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện

nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban hành

1 Số 1468/QĐ-BKHCN, ngày Quyết định phê duyệt Tổ chức và cá

nhân trúng tuyển thực hiện đề tài

Trang 9

6 Số 522/QĐ-CNSH, ngày

22/11/2010

Quyết định về việc thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở Đề tài khoa học cấp Nhà nước

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

Chủ trì đề tài, giám sát toàn bộ hoạt động của

đề tài, trực tiếp tham gia tiến hành tạo chủng vi sinh vật tái tỏ hợp, lên men và tinh chế IL-2 tái

tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, thiết lập các quy trình chuẩn để kiểm tra chất lượng và an toàn sản phẩm IL-2

Chủng vi sinh tái

tổ hợp tạo IL-2, các quy trình để sản xuất được IL-2 tái tổ hợp, các quy trình và phương pháp kiểm tra an toàn, chất lượng cho sản phẩm IL-2

Số 1

Sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên quy mô sản xuất thử nghiệm tại phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP

Các quy trình sản xuất trên qui mô sản xuất thử nghiệm, hồ sơ 05 loạt sản phẩm IL-2 tái tổ hợp

Tự nhiên,

Hà Nội

Thử nghiệm tiền lâm sàng với sản phẩm IL-2 trên động vật gây ung thư thực nghiệm

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của IL-2 tái tổ hợp với sản phẩm thương phẩm khác.

Trang 10

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10

người kể cả chủ nhiệm)

Số

TT

Tên cá nhân đăng ký theo

Thuyết minh Tên cá nhân đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chính

Ghi chú

1 PGS TS Trương Nam Hải PGS TS Trương Nam Hải Chủ nhiệm

2 TS Phạm Bích Hợp KS Lê Thi Lan Anh Tham gia (*)

3 TS Lê Thị Thu Hồng NCS Vũ Minh Đức Tham gia (*)

4 TS Đỗ Thị Thảo TS Đỗ Thị Thảo Tham gia

5 ThS Trần Ngọc Tân NCS Trần Ngọc Tân Thư ký

6 ThS Nguyễn Hồng Thanh ThS Nguyễn Hồng Thanh Tham gia

7 TS BS Lê Văn Đông TS BS Lê Văn Đông Tham gia

8 GS TSKH Nguyễn Thu Vân GS TSKH Nguyễn Thu Vân Tham gia

9 TS Nguyễn Tuyết Nga ThS Lưu Anh Chiến Tham gia (*)

10 PGS TS Nguyễn Thị Quỳ PGS TS Nguyễn Thị Quỳ Tham gia

- (*) Lý do thay đổi: Việc thay đổi cán bộ thực hiện Đề tài do sự thay đổi nhân sự của Cơ

quan chủ trì Đề tài chính và Đề tài nhánh

1

“Đánh giá phương pháp tối ưu

hóa chủng vi sinh vật tái tổ hợp

trên hệ thống lên men” (6/2009, 4

triệu, Viện CNSH)

“Đánh giá phương pháp tối ưu hóa chủng vi sinh vật tái tổ hợp trên hệ thống lên men” (6/2009, 4 triệu, Viện CNSH)

2 Đánh giá phương pháp tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp (11/2009,

4 triệu, Viện CNSH)

Đánh giá phương pháp tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp (11/2009, 4 triệu, Viện CNSH)

Trang 11

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 A Thiết kế lại gen IL-2 để biểu hiện

trong tế bào E coli 1/2009-3/2009 1/2009-3/2009 Trần Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê

Thị Lan Anh, Trương Nam Hải (Viện CNSH)

1 B Xác định các thông số kỹ thuật

của quá trình lên men 2 dòng tế

bào E coli và P pastoris từ quy

mô bình tam giác đến quy mô nồi

lên men.

3/2009- 5/2009

Trần Ngọc Tân,

Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh (Viện CNSH)

1 C Đánh giá và so sánh hiệu suất tổng

hợp sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ

hai dòng tế bào biểu hiện trên

5/2009- 6/2009 10/2009 5/2009- Trần Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê

Thị Lan Anh (Viện CNSH)

2.A Thiết lập các điều kiện, các chỉ

tiêu trong quy trình sản xuất IL-2

tái tổ hợp ở phòng thí nghiệm.

6/2009- 12/2010

2/2010

10/2009-Trần Ngọc Tân, Nguyễn Hồng Thanh, Vũ Minh Đức (Viện CNSH) 2.B Đánh giá chất lượng IL-2 tinh chế

ở quy mô phòng thí nghiệm theo

các tiêu chuẩn quốc tế

10/2009- 3/2010 10/2010 3/2010- Trương Nam Hải, Trần Ngọc Tân,

(Viện CNSH), Lưu Anh Chiến

(CTVX&SP) 2.C Triển khai áp dụng các điều kiện,

thông số kỹ thuật đã được thiết lập

để sản xuất thử nghiệm IL-2 tái tổ

2/2010- 9/2010

11/2010

7/2010-Trần Ngọc Tân, Nguyễn Hồng Thanh, (Viện

Trang 12

vii

hợp tại phòng sản xuất đạt tiêu

Chiến (CTVX&SP) 3.A Xác định hiệu lực của sản phẩm

IL-2 tái tổ hợp trên mô hình tế bào

nuôi cấy in vitro

1/2010- 10/2010

Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Hồng Thanh (Viện CNSH) 3.B Đánh giá hoạt tính sinh học của

sản phẩm IL-2 tái tổ hợp lên các tế

bào lympho người trong phòng thí

nghiệm.

7/2010 – 10/2010

11/2010

9/2010-Lê Văn Đông (Học viện Quân Y) Trần Ngọc Tân (Viện CNSH) 3.C Kiểm định được sản phẩm IL-2 tái

tổ hợp với các tiêu chuẩn chất

lượng và an toàn tại Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung Ương

10/2010

7/2010- 11/2010

9/2010-Trần Ngọc Tân (Viện CNSH) và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương 3.D Kiểm định chất lượng của sản

phẩm IL-2 tái tổ hợp tại nước

ngoài

8/2010- 10/2010 12/2010 9/2010- Công ty BioVison (Mỹ)

4.A Thử nghiệm hoạt tính kháng ung

thư của IL-2 tái tổ hợp trên động

vật gây ung thư thực nghiệm

10/2009- 10/2010

10/2010

6/2010-Nguyễn Thị Quỳ (ĐH-KHTN)

4.B So sánh được tác dụng của sản

phẩm IL-2 tái tổ hợp với sản phẩm

IL-2 thương phẩm trên động vật

gây ung thư thực nghiệm

7/2009- 10/2010

10/2010

6/2010-Nguyễn Thị Quỳ (ĐH-KHTN)

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

Trang 13

số kỹ thuật đúng theo yêu cầu

Ổn định và tạo ra sản phẩm với các thông số kỹ thuật đúng theo yêu cầu

2 Quy trình lên men

MWCB tổng hợp IL-2

tái tổ hợp

Ổn định và đủ các thông số kỹ thuật cần thiết và chi tiết về phương pháp tiến hành

Ổn định và đủ các thông số kỹ thuật cần thiết và chi tiết

về phương pháp tiến hành

(Vượt mức 200 mg/lít)

3 Quy trình tinh chế IL-2

ở quy mô phòng thí

nghiệm

Ổn định và đủ các thông số kỹ thuật cần thiết và chi tiết về phương pháp tiến hành để đạt kết quả

ổn định sau các lượt tinh chế khác nhau

Ổn định và đủ các thông số kỹ thuật cần thiết và chi tiết

về phương pháp tiến hành để đạt kết quả

ổn định sau các lượt tinh chế khác nhau

4 Quy trình chuẩn kiểm

tra độ tinh khiết IL-2 tái

tổ hợp

Ổn định, đầy đủ và chi tiết các thông số, trình tự tiến hành

tra tính vô khuẩn IL-2

tái tổ hợp

tra khối lượng phân tử

và tính miễn dịch IL-2

tái tổ hợp

tra hiệu lực sản phầm

IL-2 tái tổ hợp

8 Quy trình chuẩn xác

định độ quá mẫn

định độ độc tính cấp và

lâu dài

định chất gây sốt

Ổn định và đầy đủ và chi tiết các thông số,

Ổn định và đầy đủ

và chi tiết các thông

Trang 14

ix

trình tự tiến hành số, trình tự tiến hành

11 Quy trình sản xuất IL-2

ở quy mô sản xuất thử

nghiệm

Ổn định và có đủ các thông số kỹ thuật, ổn định, an toàn để sản xuất IL-2 tái tổ hợp đạt chuẩn GMP

Phương pháp nghiên cứu chi tiết, rõ ang

13 Bảng tiêu chuẩn cơ sở

cho IL-2 tái tổ hợp về

các mặt vô khuẩn, lý

hóa, an toàn, công hiệu

Chi tiết về thông số các mặt vô khuẩn, lý hoá, an toàn và công hiệu

14 Hồ sơ sản xuất 05 loạt

IL-2 tái tổ hợp Các đặc điểm chi tiết về quá trình sản xuất

và kiểm định

Các đặc điểm chi tiết

về quá trình sản xuất

và kiểm định

15 Hồ sơ đánh giá hoạt

tính sinh học của IL-2

lên tế bào lympho

người

Các kết luận về hàm lượng cytokine sinh

ra từ tế bào lympho khi kích thích bởi IL-

2 tái tổ hợp tự sản xuất

Các kết luận về hàm lượng cytokine sinh

ra từ tế bào lympho khi kích thích bởi IL-2 tái tổ hợp tự sản xuất

16 Hồ sơ kiểm định sản

phẩm IL-2 tái tổ hợp

Đạt chỉ tiêu do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương kiểm định

17 Hồ sơ kiểm định sản

phẩm IL-2 tái tổ hợp từ

cơ quan kiểm định

nước ngoài

Đạt tiêu chuẩn quốc

tế (theo dược điển

Trung Quốc)

Đạt một số tiêu chuẩn quốc tế và cơ

sở (theo dược điển

Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản)

khoa học

02 bài báo (trong nước)

04 bài báo (trong nước)

Tạp chí Công nghệ Sinh học, Tạp chí Y học, Hội nghị khoa học Quốc gia

Trang 15

Cấp đào tạo, Chuyên

hoạch Thực tế đạt được

Ghi chú (Thời gian kết thúc)

1 Cyclodextrin: Thành phần hữu hiệu trong công thức tạo sinh

phẩm IL-2 người tái tổ hợp

01 01 2012

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình

độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

- Đề tài đã ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử mới trong

việc tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất được IL-2

tái tổ hợp Trên cơ sở đó, triển khai áp dụng các quy trình khoa học liên

quan đến quá trình lên men chủng vi sinh tái tổ hợp, quá trình tinh chế

sản phẩm phức tạp trên các hệ sắc ký để thu được sản phẩm IL-2 tinh

khiết với độ sạch cao, tương đương với các sản phẩm Quốc tế

Trang 16

xi

- Triển khai áp dụng được các quy trình công nghệ mới liên quan đến sản phẩm tái tổ hợp sang Công ty sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP để tạo được sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm

- Góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu cho cán bộ tham gia Đề tài, tạo lối suy nghĩ mở rộng hơn trong việc áp dụng các kết quả từ nghiên cứu ra thực tiễn, đặc biệt là áp dụng triển khai các sinh phẩm tái tổ hợp

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

- Thúc đẩy khả năng tự sản xuất sinh phẩm IL-2 tái tổ hợp trong nước, giảm bớt chi phí trong quá trình nhập ngoại Theo ước tính sơ bộ của

Đề tài, trên quy trình sản xuất thử nghiệm nhỏ, sản phẩm IL-2 thành phẩm của Đề tài có giá khoảng 150 ngàn/liều (300.000 IU), trong khi giá sản phẩm IL-2 của Trung Quốc tương đương có giá khoảng 210 ngàn khi nhập về Việt Nam

- Góp phần thúc đẩy quá trình tự lực sản xuất được sản phẩm công nghệ cao là IL-2 tái tổ hợp trong nước Trên cơ sở đó, tạo triển vọng mới cho các sản phẩm khác cũng theo con đường công nghệ gen tái tổ hợp tại Việt Nam

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

Báo cáo định kỳ

I Lần 1:

(1) Dòng tế bào E coli mang

vector biểu hiện gen il-2

(2) Các thông số kỹ thuật của quá

trình lên men 2 dòng tế bào E

6/2009

(1) Dòng tế bào mang vector biểu hiện chứa đúng trình tự ADN mã hóa cho IL-2 tái tổ hợp

Trang 17

(3) Hoàn thành 02 chuyên đề khoa học

(4) Đã tổ chức hội thảo chuyên môn 1

Chủ trì: PGS TS Trương Nam Hải

Lần 2

trình lên men 2 dòng tế bào

(2) Bảng số liệu so sánh về khả

năng ảnh hưởng đến hiệu quả

lên men giữa 2 dòng tế bào E

phẩm IL-2 tái tổ hợp trên mô

hình tế bào nuôi cấy in vitro

(7) Thử nghiệm hoạt tính kháng

ung thư của IL-2 tái tổ hợp trên

động vật gây ung thư thực

nghiệm

12/2009

(1) Kết quả các thông số Ph, thời điểm cảm ứng, Feed tắng sinh khối cho quá trình lên men (04 chuyên đề khoa học)

(2) Kết quả về hiệu suất tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của 2

dòng tế bào E coli và P

pastoris

(5) Hoàn thành báo cáo hội thảo chuyên môn

(6) Duy trì được dòng tế bào CTLL2

(7) Duy trì và bảo quản được dòng tế bào ung thư và động vật thí nghiệm

II Kiểm tra định kỳ

Lần 1:

(1) Dòng tế bào E coli mang

7/2009 (1) Dòng tế bào mang vector

biểu hiện chứa đúng trình

Trang 18

xiii

vector biểu hiện gen il-2

trình lên men 2 dòng tế bào E

coli và P pastoris

(3) Các quy trình để tinh chế được

IL-2 tái tổ hợp từ MWCB

(4) Hội thảo chuyên môn

tự ADN mã hóa cho IL-2 tái tổ hợp

(4) Đã tổ chức hội thảo chuyên môn 1

Lần 2

trình lên men 2 dòng tế bào

(2) Bảng số liệu so sánh về khả

năng ảnh hưởng đến hiệu quả lên

men giữa 2 dòng tế bào E coli và

phẩm IL-2 tái tổ hợp trên mô hình

tế bào nuôi cấy in vitro

(7) Thử nghiệm hoạt tính kháng

ung thư của IL-2 tái tổ hợp trên

động vật gây ung thư thực nghiệm

1/2010

(1) Kết quả các thông số Ph, thời điểm cảm ứng, Feed tắng sinh khối cho quá trình lên men (04 chuyên

đề khoa học) (2) Kết quả về hiệu suất tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp

của 2 dòng tế bào E coli

và P pastoris

(5) Hoàn thành báo cáo hội thảo chuyên môn

(6) Duy trì được dòng tế bào CTLL2

(7) Duy trì và bảo quản được dòng tế bào ung thư và động vật thí nghiệm

Đề tài cần đẩy nhanh tiến độ Chủ trì: PGS TS Trương Nam Hải

đề khoa học

Đề tài cần đẩy nhanh tiến độ hơn nữa

Trang 19

xiv

IV Nghiệm thu cấp Nhà nước 01/2011

Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Trương Nam Hải

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

Trang 20

1

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 9

LỜI MỞ ĐẦU 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

1.1 Cytokine và ung thư 16

1.1.1 Cơ chế ung thư 17

1.1.2 Tình hình bệnh ung thư 18

1.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh ung thư 20

1.1.4 Liệu pháp điều trị bằng cytokine- hiện trạng và tương lai 22

1.2 Interleukin-2 24

1.2.1 Cấu trúc gen của IL-2 của người 25

1.2.2 Mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của IL-2 người 25

1.2.3 Ứng dụng của IL-2 trong điều trị 28

1.2.3.1 Điều trị ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính 29

1.2.3.2 Điều trị bệnh nhân nhiễm HIV 31

1.3 Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp 33

1.3.1 Công nghệ sản xuất trên thế giới 34

1.3.2 Sản xuất tại Việt Nam 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu 37

2.1.1 Vật liệu sinh học (chủng vi sinh vật, vector, động vật thí nghiệm) 37

2.1.2 Các loại vật tư, hóa chất và sinh phẩm 38

2.1.3 Máy móc và thiết bị 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 46

2.2.1 Kỹ thuật PCR 46

2.2.2 Tách dòng gen trong vecor đầu bằng pJET1/Blunt 46

2.2.3 Phương pháp cắt và nối ghép gen vào vector pET22b(+) 47

2.2.4 Phương pháp biến nạp gen vào tế bào E coli 48

2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 49

2.2.6 Phương pháp biểu hiện gen il-2 dạng đơn trong tế bào vi khuẩn E coli 50

2.2.7 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E coli 50

2.2.8 Phá tế bào E coli và xử lý IL-2 thô tiền tinh chế 51

Trang 21

2

2.2.9 Phương pháp biểu hiện gen il-2 trong tế bào P Pastoris 52

2.2.10 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào P pastoris 52

2.2.11 Phương pháp thu hồi và bảo quản sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thô sau lên men nấm men P pastoris 53

2.2.12 Phương pháp lọc – cô mẫu – trao đổi đệm qua hệ lọc tiếp tuyến MidJet 53

2.2.13 Phương pháp sắc ký lỏng nhanh trên hệ thống FPLC 54

2.2.14 Phương pháp tinh chế trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC 55

2.2.15 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE 55

2.2.16 Xác định hàm lượng protein bẵng kỹ thuật phân tích hình ảnh SDS-PAGE trên phần mềm chuyên dụng Quantity One 57

2.2.17 Kỹ thuật Western blot 58

2.2.18 Phương pháp kiểm tra hoạt tính IL-2 sau khi tạo công thức trên dòng tế bào đặc hiệu CTLL259 2.2.19 Định lượng độ ẩm tồn dư trong sản phẩm đông khô [76] 61

2.2.20 Phương pháp xác định tính vô trùng cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp 62

2.2.21 Phương pháp xác định an toàn chung cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp [76] 64

2.2.22 Thiết kế thí nghiệm để đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào lympho người 64

2.2.23 Tách tế bào lympho máu ngoại vi 65

2.2.24 Thử nghiệm nuôi cấy tăng sinh tế bào lympho 65

2.2.25 Thử nghiệm chế tiết cytokine 66

2.2.26 Hoạt hóa và nhân nuôi các dòng tế bào gây ung thư 67

2.2.27 Gây u thực nghiệm cho chuột 68

2.2.28 Tách tế bào từ khối u 68

2.2.29 Làm tiêu bản mô học 69

2.2.30 Gây u và tác động thuốc lên chuột 70

2.2.31 Xác định sự tăng trọng lượng của chuột trong quá trình thí nghiệm 71

2.2.32 Xác định tỷ số phát triển và tỷ số ức chế u 71

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73

3.1 Nghiên cứu tạo IL-2 tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm 74

3.1.1 Tách dòng gen il-2 trong tế bào E coli 75

3.1.2 Tạo vector biểu hiện gen pET22-IL2MN 76

3.1.3 Biểu hiện gen il-2 đơn trong tế bào E coli BL21 77

3.1.4 Kiểm tra lại dòng tế bào E coli sử dụng làm MCB 78

3.1.5 Tối ưu quá trình tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dạng thô 80

3.1.5.1 Tối ưu dòng tế bào vi khuẩn E coli 80

3.1.5.2 Tối ưu dòng tế bào nấm men P pastoris 87

3.1.6 Đánh giá và so sánh hiệu quả tổng hợp sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai dòng tế bào E coli và P pastoris 96

Trang 22

3.1.10 Tạo công thức sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế 118 3.2 Sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn GMP 123 3.2.1 Tiêu chuẩn GMP cho sản xuất thử nghiệm 124 3.2.1.1 Con người 125 3.2.1.2 Hệ thống nhà xưởng 125 3.2.1.3 Quy định hướng (chiều) đi của quy trình, con người và nguyên vật liệu 128 3.2.1.4 Vệ sinh khu sản xuất - trang thiết bị 132 3.2.2 Sản xuất thử nghiệm 05 loạt sản phẩm 133

3.2.2.1 Hồ sơ (Chi tiết kết quả xem thêm sản phẩm Hồ sơ sản xuất 05 loạt IL-2 tái tổ hợp) 133

3.2.3 Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp 137

3.2.4 Đánh giá chất lượng và an toàn cho sản phẩm đã sản xuất theo tiêu chuẩn cơ sở (chi tiết trong

sản phẩm dạng II - Hồ sơ kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp) 140

3.2.4.1 Cảm quan 141 3.2.1.2 Độ ẩm tồn dư (Hàm ẩm) 141 3.2.1.3 Độ pH 141 3.2.1.5 Vô khuẩn (vô trùng) 142 3.2.1.6 Nội độc tố vi khuẩn 142 3.2.1.7 Thử nghiệm an toàn chung (độc tính bất thường) 143 3.2.1.8 Độ tinh khiết (độ tinh sạch) 144 3.2.1.9 Đặc hiệu miễn dịch và trọng lượng phân tử 145 3.3 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên các dòng tế bào động vật và trên động vật thực nghiệm 146 3.3.1 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên các dòng tế bào lympho người 147 3.3.1.1 Thay đổi hình thái và số lượng tế bào 147 3.3.1.2 Thử nghiệm MTT 149 3.3.1.3 Phương thức đáp ứng của tế bào phụ thuộc liều của 2 chế phẩm IL-2 150 3.3.1.4 Thay đổi nồng độ cytokine trong dịch nuôi cấy tế bào được kích thích bằng hai chế phẩm IL-2 tái tổ hợp và PHA 152

Trang 23

4

3.3.2 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp trên động vật thực nghiệm 155 3.3.2.1 Kết quả hoạt hóa, nhân nuôi và duy trì các dòng tế bào ung thư 156 3.3.2.2 Kết quả gây u thực nghiệm cho động vật 158 3.3.2.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế khối u của IL-2 VN và IL-2 TQ trên động vật mang khối u thực nghiệm 161 3.4 Kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn cơ sở 166 3.4.1 Kiểm định trong nước 166 3.4.2 Kiểm định Quốc tế 167

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 169

4.1 Kết luận 169 4.2 Kiến nghị 170

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 171

PHỤ LỤC 177

1 Trình tự nucleotide của gen il-2 người và trình tự dịch mã ra amino acid của IL-2 sử dụng trong quá

trình biểu hiện gen 177

2 So sánh trình tự DNA của gen il-2 trong vector tác dòng với gen il-2 lý thuyết 180

3 Các sơ đồ vector sử dụng trong Đề tài 182

4 Kết quả kiểm nghiệm trong nước với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài 184

5 Kết quả kiểm nghiệm Quốc tế với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài 185

6 Các sáng chế liên quan đến sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Đề tài 190

7 Kiểm tra trình tự amino acid của IL-2 tái tổ hợp 191 7.1 r-IBinleukin-2 (IL-2 tái tổ hợp của Đề tài) 191 7.1.1 Phổ khối các peptide r-IBinleukin-2 được phân tích trên hệ LC-ESI-ion TRAP 191 7.1.2 Nhận diện protein rBInleukin-2 195 7.2 IL-2 tái tổ hợp của Trung Quốc 198 7.2.1 Phổ khối các peptide của sản phẩm IL2 của Trung Quốc được phân tích trên hệ LC-ESI-ion TRAP 198 7.2.2 Nhận diện IL2 thương phẩm của Trung Quốc 201

8 Tính giá thành sản phẩm r-IBinleukin-2 của Đề tài theo loạt sản xuất (1000 lọ/loạt) 203

9 Một số sản phẩm protein tái tổ hợp đã thương mại hóa mang amino acid Methionine ở đầu N 206 9.1 Somatrem Product 206 9.2 G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) 206 9.3 IL-2 human 207

Trang 24

5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

3LL Tế bào ung thư biểu mô phổi

Amp Ampicillin

BCG Baccillus Calmette-Gurin

BMGY Buffered Minimal Glycerol Media

BMMY Buffered Minimal Methanol Media

bp Base pair

CML Chronic Myeloid Leukaemia

CTL Cytolytic T lymphocyte (tế bào lympho T độc)

ĐCUT Đối chứng ung thư

DMEM Dulbecco‘s Modified Eagle Medium

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

dOT Dissolved oxygene tensions

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylen diamin tetra acid acetic

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

EPO Erythropoietin

FDA Food and Drug Administration

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor (yếu tố kích thích dòng bạch cầu

hạt) GFs Growth factors (các nhân tố sinh trưởng)

GM-CSF Granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( yếu tố kích thích

dòng bạch cầu hạt-đại thực bào) GMP Good Manuafacturing Practice (điều kiện thực hành sản xuất tốt)

GR% Tỷ số phát triển khối u

HIV Human immunodeficiency virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IARC The International Agenecy for Research on Cancer

LAK Lymphokine-activated killer (tế bào diệt hoạt hóa bởi lymphokine)

LH1 Lysyl hydroxylase 1

LS Lysate

Trang 25

6

MWCB Manufacturer’s Working Cell Bank

NK Natural killer (tế bào diệt tự nhiên)

P pastoris Pichia pastoris

PBS Phosphate Buffered Saline

PDGF Platelet-derived growth factor (yếu tố tăng trưởng tiểu huyết cầu) PMSF Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride

PVDF Polyvinylidene fluoride

Sar 180 Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBS Tris Buffered Saline

TBUT Tế bào ung thư

TEMED Tetramethylethylenediamine

TNF Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử ung thư)

YNB Yeast Nitrogen Base

YPD Yeast Peptone Dextrose

Trang 26

7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1: Thành phần môi trường M9 38 Bảng 2 2 Danh sách trang thiết bị sử dụng trong sản xuất IL-2 tái tổ hợp 41 Bảng 2 3: Bảng đánh giá hiệu lực của H Itokawa 72

Bảng 3 1: So sánh các thông số trong quá trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ hai nguồn E

coli và P pastoris 117

Bảng 3 2: Các thông số về kiểm tra hoạt tính IL-2 122

Bảng 3 3 Kết quả chuẩn bị chủng sản xuất E coli 133 Bảng 3 4 Kết quả OD sau nuôi cấy vi khuẩn E coli trên nồi lên men Marubishi 10L 134 Bảng 3 5 Kết quả thu hoạch sinh khối E coli sau lên men 135

Bảng 3 6 Kết quả thu được sau xử lý protein thô 135 Bảng 3 7 Kết quả thu IL-2 sau tinh chế HPLC 136 Bảng 3 8: Số lượng IL-2 thành phẩm thu được sau sản xuất 137 Bảng 3 9 Kết quả kiểm tra cảm quan của 05 loạt IL-2 141 Bảng 3 10 Kết quả đo độ ẩm tồn dư của 05 loạt IL-2 thành phẩm 141 Bảng 3 11 Kết quả pH của 05 loạt IL-2 thành phẩm 141 Bảng 3 12 Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học 05 loạt IL-2 thành phẩm 142 Bảng 3 13 Kết quả thử nghiệm vô khuẩn 05 loạt IL-2 142 Bảng 3 14 Kết quả kiểm tra nội độc tố vi khuẩn 143 Bảng 3 15 Kết quả kiểm tra an toàn chung của 05 loạt IL-2 144 Bảng 3 16 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của 05 loạt IL-2 144 Bảng 3 17 Tỷ lệ tạo khối u trên chuột nhắt 158 Bảng 3 18: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm trên mô hình u báng 161

Bảng 3 19: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm trên mô hình u rắn dưới da 161

Bảng 3 20: Bảng phân lô và lịch trình thí nghiệm theo dõi thời gian sống kéo dài thêm của chuột 161

Trang 27

8

Bảng 3 21: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng của IL-2 lên chuột mang u báng Sar .162 Bảng 3 22 So sánh hiệu lực kháng u rắn 3LL dưới da của IL-2 tái tổ hợp 164 Bảng 3 23 Thời gian sống trung bình (TGSTB) và thời gian sống kéo dài thêm (ILS) của chuột ở các lô thí nghiệm 165

Trang 28

9

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1 1: Mô hình quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường thành ung thư 18 Hình 1 2: Sự phân bố của bệnh ung thư trên toàn cầu 1 Hình 1 3: Cấu trúc không gian của Interleukin-2 1 Hình 1 4: Sự khác nhau giữa 3 loại thụ thể IL-2 hình thành nên 3 dạng 1 Hình 1 5: Minh họa 04 giai đoạn phát triển của ung thư biểu mô tế bào thận [43] 29 Hình 1 6: U hắc tố ác tính [48] 30 Hình 1 7: Sơ đồ miêu tả quá trình IL-2 kích hoạt các yếu tố miễn dịch trong bệnh nhân nhiễm HIV [55] 32 Hình 2 1: Hệ thống lên men Bioflo 110, bình 5 lít (NBS, Mỹ) 44 Hình 2 2: Hệ thống lọc tiếp tuyến MidJet (GE Healthcare) 1 Hình 2 3: Hệ sắc ký lỏng nhanh FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) 1 Hình 2 4: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC (Shimadzu, Nhật Bản) 1 Hình 2 5: Các loại cột được sử dụng để tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC 1 Hình 3 1: Sơ đồ quá trình nghiên cứu để sản xuất thử nghiệm sản phẩm 74 Hình 3 2: Điện di kiểm tra sản phẩm DNA trên gel agarose 0,8% 1 Hình 3 3: Kiểm tra sản phẩm DNA trong quá trình tạo vector biểu hiện trên gel agarose 0,8% .1

Hình 3 4: Kiểm tra sản phẩm IL2 biểu hiện dạng đơn trong tế bào E coli BL21 1 Hình 3 5: Hình thái tế bào E coli tái tổ hợp sử dụng làm MCB .1 Hình 3 6: Kiểm tra sự biểu hiện của dòng tế bào E coli mang gen il-2MN với các nồng độ

chất cảm ứng IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% .1

Hình 3 7: Kiểm tra sự biểu hiện của dòng tế bào E coli mang gen il-2MN ở các môi

trường khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% .1 Hình 3 8: Xác định sự biểu hiện IL-2 phụ thuộc điều kiện pH môi trường 1

Hình 3 9: Động thái trong quá trình lên men dòng tế bào E coli biểu hiện IL-2 tái tổ hợp

trên hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 lít .1

Trang 29

10

Hình 3 10: Kiểm tra sản phẩm IL-2 trên gel polyacrylamide 12,6% 1

Hình 3 11: Kiểm tra kiểu hình dòng tế bào P pastoris 1

Hình 3 12: Kiểm tra sản phẩm biểu hiện trên gel polyacrylamide 12,6% 1 Hình 3 13: Kiểm tra sản phẩm lên men ở các điều kiện pH khác nhau trên gel

polyacrylamide 12,6% .1 Hình 3 14: Kiểm tra sản phẩm lên men ở các điều kiện pH khác nhau bằng kỹ thuật Western Blot .1 Hình 3 15: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tạo ra theo thời gian bằng SDS-PAGE 1

Hình 3 16: Động thái của quá trình lên men IL-2 trên chủng P pastoris thể hiện qua các

thông số dO2 và OD 600 1 Hình 3 17: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tạo ra theo thời gian trên bằng kỹ thuật Western blot 1 Hình 3 18: So sánh chất lượng sản phẩm lên men thô IL-2 tạo ra từ các chủng vi sinh vật tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot 1 Hình 3 19: So sánh sản phẩm IL-2 tạo ra từ các chủng vi sinh tái tổ hợp khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 1 Hình 3 20: Phân tích phổ protein từ gel polyacrylamide 12,6% 1

Hình 3 21: Chiến lược tinh chế IL-2 từ sản phẩm lên men nấm men P pastoris 1

Hình 3 22: Kiểm tra sản phẩm protein trên gel polyacrylamide 12,6% .1 Hình 3 23: Sắc ký đồ tinh chế và kiểm tra sản phẩm đã tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nấm men trên cột Hitrap ANX 1

Hình 3 24: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 lần 2 từ tế bào P pastoris trên hệ thống HPLC 1

Hình 3 25: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế qua hệ thống HPLC trên gel polyacrylamide 12,6% .1

Hình 3 26: Chiến lược tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ sản phẩm lên men vi khuẩn E coli 1

Hình 3 27: Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng độ Gu-HCl khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% .1 Hình 3 28: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC 1 Hình 3 29: Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-PAGE .1 Hình 3 30: Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-PAGE .1

Trang 30

11

Hình 3 31: Kiểm tra độ sạch của các sản phẩm protein 1 Hình 3 32: Sơ đồ quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp thành phẩm tại Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 1 Hình 3 33: Sơ đồ khu vực sản xuất IL-2 tái tổ hợp tại Công ty Văcxin và sinh phẩm số 1 1 Hình 3 34: Chiều đi của quy trình sản xuất Interleukin-2 1 Hình 3 35: Chiều đi của nhân viên trong khu sản xuất 1 Hình 3 36: Đường vào của nguyên liệu đầu 1 Hình 3 37: Đường ra của rác thải – dụng cụ 1

Hình 3 38: Kết quả so sánh sinh khối vi khuẩn (OD) của 05 loạt lên men E coli 134

Hình 3 39: Các lọ sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm 1 Hình 3 40: Phân tích độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 1 Hình 3 41: Kiểm tra 05 loạt sản phẩm IL-2 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot .1

Hình 3 42: Hình thái tế bào đáp ứng với IL-2 và chất kích thích phân bào PHA 148

Hình 3 43: Hoạt tính gây đổi mầu cơ chất MTT 149 Hình 3 44: Đáp ứng của tế bào với nồng độ IL-2 khác nhau 151 Hình 3 45: Nồng độ 9 cytokine trong dịch nuôi cấy tế bào (n = 8) 153 Hình 3 46: Biến đổi nồng độ của 5 cytokine có thay đổi nồng độ (n = 8) 154 Hình 3 47: Hình ảnh TBUT Sar.180 sau 48h trong môi trường nuôi cấy (A) và trên tiêu bản dàn, nhuộm HE (B), độ phóng đại 600x 157 Hình 3 48: Hình ảnh TBUT dòng 3LL sau 24h (A) và 72h (B)trong môi trường nuôi cấy,

độ phóng đại 200x 157 Hình 3 49: Hình ảnh chuột Swiss mang u báng Sar.180 159 Hình 3 50: Hình ảnh chuột Swiss mang u rắn Sar.180 ở đùi phải 159

Hình 3 51: Hình ảnh chuột BALB/c mang u rắn 3LL ở đùi phải 159

Hình 3 52: Hình ảnh chuột BALB/c mang u rắn 3LL dưới da 159 Hình 3 53: Các đại thực bào (mũi tên) xuất hiện tại vùng mô bị xâm lấn bởi các tế bào ung thư (1000x) 160 Hình 3 54: Biểu đồ về tỷ số phát triển và ức chế u ở các lô thí nghiệm 163

Trang 31

12 Hình 3 55: Đồ thị tăng trưởng kích thước trung bình của u rắn ở các lô thí nghiệm 164 Hình 3 56: Đồ thị về tỷ lệ chuột sống sót ở các lô trong 33 ngày tiến hành thí nghiệm 166

Trang 32

13

LỜI MỞ ĐẦU

Cytokine là một sản phẩm của hệ miễn dịch, chúng do nhiều loại tế bào tiết ra, tác dụng đa hướng, đa năng, thậm chí có thể tác dụng ngược lên chính bản thân tế bào tiết ra chúng Đối với bệnh ung thư, cytokine được phát hiện

là có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thư mà còn liên quan đến khả năng chữa trị bệnh ung thư Sự chọn lựa chính xác các yếu tố liên quan đến quá trình hình thành và phát triển của bệnh ung thư mang tính quyết định đến việc sử dụng cytokine trong liệu pháp điều trị bệnh

Theo hướng ứng dụng để điều trị, các loại cytokine đã được nghiên cứu

và phát triển nhằm tạo ra được sản phẩm thương mại Trong số các cytokine

đó, Interleukin-2 tái tổ hợp là một trong những loại cytokine được thương mại hóa sớm nhất và cũng sớm được Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép sử dụng trong điều trị (1992) Ngoài việc điều trị ung thư đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính, loại cytokine này còn thể hiện được hiệu quả khi điều trị kết hợp với các loại thuốc khác đối trên bênh nhân mắc các bệnh ung thư khác như ung thư vú, ung thư phổi… Gần đây, các nhà nghiên cứu còn đang mở rộng khả năng điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV nhằm kích thích hệ miễn dịch, nâng cao số lượng tế bào CD8+

Trước nhu cầu ngày càng lớn về sinh phẩm Interleukin-2, đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tạo ra IL-2 tái tổ hợp với giá thành hợp lý hơn Trong thực tế, đã có một số công trình nghiên cứu thành công và chuyển giao cho các công ty để sản xuất ra được sản phẩm IL-2 thương phẩm Sản phẩm IL-2 thương phẩm đã thể hiện được tính ưu việt của một liệu pháp miễn dịch nên được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị bệnh ung thư và bổ trợ điều trị cho các bệnh khác cần tăng cường hệ miễn dịch

Trang 33

Tuy nhiên, trong thực tế, không chỉ có IL-2 tái tổ hợp mà các sinh phẩm tái tổ hợp nói chung vẫn chưa thể tự sản xuất tại Việt Nam Hầu hết các sản phẩm đó đều nhập ngoại với giá thành cao Đây cũng chính là lý do lý giải cho việc sử dụng liệu pháp điều trị miễn dịch như IL-2 tái tổ hợp vẫn còn

bị bỏ ngỏ

Xuất phát từ nhu cầu về dạng sinh phẩm tái tổ hợp trên, Viện Công nghệ sinh học đã tập trung nghiên cứu nhằm phát triển các sinh phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị nói chung và sinh phẩm IL-2 người tái tổ hợp nói riêng Năm 2005, Viện đã có thể tiến hành tạo ra được sản phẩm IL-2 tái tổ hợp ở quy mô thí nghiệm Tuy nhiên, sản phẩm tái tổ hợp này vẫn chưa thể đáp ứng được tiêu chí cho một sinh phẩm sử dụng trong điều trị là chất lượng

và an toàn Chính vì vậy, Đề tài “ Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của

Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư” được tiến hành với mục đích chính là tạo ra được sản phẩm IL-2 tái

tổ hợp đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho một sinh phẩm sử dụng trong điều trị

Cụ thể các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài như sau:

1) Xác định hệ vi sinh vật chủ (host cell) với khả năng biểu hiện tối ưu cho quá trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp

Trang 34

15 2) Chuẩn hóa quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp 3) Đánh giá hiệu lực sản phẩm Interleukin-2

Trang 35

Hầu hết các cytokine hoạt động hoặc được tạo ra dựa trên các tế bào bạch cầu Chúng là thành phần quan trọng trong việc điều khiển hệ thống miễn dịch và viêm của cơ thể Tất cả các cytokine đều có bản chất là glycoprotein hoặc protein Theo Thomson A.W., các cytokine được phân làm

04 nhóm chính sau [1]:

- Các Interferon (IFNs)

- Các Interleukin

- Các nhân tố hoại tử ung thư (TNFs)

- Các nhân tố sinh trưởng (GFs)

Ngoài ra, cytokine cũng có thể đặt tên dựa trên phụ thuộc vào nguồn gốc

tế bào tổng hợp ra chúng Ví dụ như lymphokine (các cytokine được tổng hợp bởi lymphocytes), monokine (cytokine được tổng hợp bởi tế bào đơn nhân – monocytes), chemokine (cytokine với các hoạt tính chemotactic) và interleukin (cytokine được tổng hợp bởi leukocyte và tác động lên các leukocytes khác)

Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào Tất

cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối

Trang 36

17

u (tumor) Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành

ác tính (malignant) Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis) Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [2] Đối với bệnh ung thư, cytokine được phát hiện là có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thư mà còn liên quan đến khả năng chữa trị bệnh ung thư Tùy thuộc vào các kiểu khối u khác nhau, các quy luật liên quan đến căn nguyên và cách điều trị bệnh ung thư có sự liên quan mật thiết đến các cytokine khác nhau Chính vì vậy, đối với mỗi bệnh ung thư, sự chọn lựa chính xác các yếu tố liên quan đến quá trình hình thành và phát triển của bệnh ung thư mang tính quyết định đến việc

sử dụng cytokine hay chất chống cytokine (anti-cytokine) trong liệu pháp điều trị bệnh

1.1.1 Cơ chế ung thư

Quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường sang tế bào ác tính hay yếu tố ung thư có thể diễn ra trong thời gian từ một vài tuần đến vài năm (hình 1.1) Sự biến đổi ác tính đó có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma Có vô số các biến cố có thể gây ra ung thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gen tiền ung thư (protooncogen), sự bất hoạt gen ức chế khối u, hay sự đột biến với gen sửa sai DNA trong chu kỳ tế bào Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường Quá trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư

Trang 37

18

và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường

Hình 1 1: Mô hình quá trình chuyển biến từ tế bào bình thường thành ung thư

Phân loại các dạng ung thư có thể dựa trên dạng tế bào khởi nguồn Các dạng ung thư phát triển từ các tế bào biểu mô được xác định là ung thư biểu bì (carcinomas) Ung thư bắt nguồn từ trung mô như ung thư hạch bạch huyết (lymphomas), ung thư máu (leukemias), hoặc ung thư mô liên kết (sarcomas) Ngoài ra, ung thư cũng có thể phân loại dựa trên dạng khối u Ví dụ, ung thư thể rắn như ung thư phổi, ung thư vú hoặc dạng bệnh máu ác tính như các dạng ung thư phát triển ở máu, ở tủy xương, hoặc bạch huyết [1]

1.1.2 Tình hình bệnh ung thư

Theo ghi nhận của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trong năm 2008, có hơn 12,4 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư mới (trong đó 6672000 nam giới, 5779000 nữ giới), 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư (4293000

Ung thư

Quá trình chuyển biến

- Các sai sót di truyền xảy

ra trong quá trình tái bản:

- Hoạt hóa gen ung thư

- Phát triển không kiểm soát.

- Di căn và xâm lấn sang các mô khác.

- Mất chức năng sinh học thông thường.

- Mất hoặc thay đổi chỉ thị tế bào bình thường

Trang 38

19

nam giới, 3300000 nữ giới) và 28 triệu người bị mắc bệnh ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm (hình 1.2) Theo ước tính đến năm 2030, khả năng mắc ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người khác bị chết vì ung thư và 75 triệu bệnh nhân bị ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm [3] Số lượng bệnh nhân bị ung thư đang tăng dần tại các nước đang phát triển

do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm trùng có xu hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn Hơn nữa, người dân ở những nước này đang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo

Theo Cơ quan nghiên cứu thế giới về ung thư IARC (The International Agency for Research on Cancer), trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư

và tử vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình

là những nơi chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn thế giới) Tỷ lệ dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức độ thu nhập

Hình 1 2: Sự phân bố của bệnh ung thư trên toàn cầu (Cảnh báo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008)

Trang 39

20

của các quốc gia, tập quán của người dân [4] Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da, ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng… [3]

Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam

Trước đây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật điển hình là của một nước thu nhập thấp, kém phát triển, có đời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí hậu nhiết đới nóng bức ẩm ướt, nên các bênh tật chủ yếu là những bệnh truyền nhiễm và các bệnh suy dinh dưỡng Hiện nay, cùng với sự thay đổi mạnh mẽ về kinh tế, mô hình bệnh tật đã có xu hướng của nước phát triển với các bệnh ung thư, tim mạch… Hơn nữa, cùng với quá trình phát triển của nền kinh tế cũng kéo theo một loạt các vấn đề nhức nhối khác, đặc biệt là vấn đề ô nhiễm môi trường, nguồn thức ăn Việc sống trong điều kiện môi trường ô nhiễm có thể là lý do chính để lý giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có chiều hướng gia tăng nhanh Theo số liệu thống kê, chỉ trong giai đoạn từ 1/1/2001 đến 31/12/2004 có 32.944 ca ung thư mới được ghi nhận trên 5 tỉnh thành Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên, Huế, Cần Thơ Ước tính trên cả nước, có khoảng 77.457 đến 112.842 ca ung thư mới mắc mỗi năm Những loại ung thư phổ biến nhất người bệnh thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, cổ tử cung…[5]

1.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh ung thư

Mặc dù ung thư được xác định là một căn bệnh nan y nhưng nếu được phát hiện sớm và được chữa trị kịp thời, bệnh hoàn toàn có thể chữa khỏi Hiện nay, có 5 phương pháp được sử dụng để điều trị ung thư bao gồm: phẫu trị, xạ trị, hoá trị liệu, hoocmon trị liệu, liệu pháp miễn dịch hay còn gọi là

Trang 40

21

liệu pháp sinh học Các phương pháp này không nhất thiết phải tách rời nhau

mà có thể phối kết hợp trong quá trình điều trị [6]

Trong các phương pháp điều trị ung thư, phẫu trị là phương pháp xuất hiện sớm nhất Bằng việc cắt bỏ khối u, bác sĩ có thể cắt bỏ một số mô xung quanh hoặc một số hạch bạch huyết gần khối u Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thước khối u, vị trí khối u, cách phẫu thuật và tình trạng của bệnh nhân [7] Biện pháp xạ trị và hóa trị liệu cũng được dùng khá phổ biến trong việc điều trị ung thư Biện pháp này sử dụng các tác nhân vật lý hay hóa học tác dụng trực tiếp vào vị trí bị ung thư

để tiêu diệt tế bào ung thư Điều trị bằng phương pháp này vừa tác động lên tế bào ung thư, vừa gây ra các tác động không mong muốn lên tế bào bình thường làm ảnh hưởng không tốt đến toàn bộ cơ thể Ngoài ra, trong trường hợp tế bào ung thư chịu ảnh hưởng bởi hoocmon do cơ thể chủ tiết ra, ung thư

có thể bị ức chế hoàn toàn mà chỉ cần sử dụng phương pháp hoocmon trị liệu

Ưu điểm chính của phương pháp hoocmon là hiệu quả tác dụng chính xác lên

tế bào ung thư Tuy nhiên, việc xử lý mất bất kỳ hoocmon nào trong cơ thể cũng đều gây nên nhưng hiệu quả không mong muốn

Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên, liệu pháp sinh học đã được áp dụng gần đây để điều trị một số bệnh ung thư Liệu pháp này

có thể sử dụng riêng lẻ, nhưng thông thường được sử dụng như một liệu pháp

hỗ trợ (nghĩa là dùng đồng thời hay dùng ngay sau liệu pháp điều trị khác kết thúc) để giúp thêm tác dụng chống ung thư của liệu pháp chính [6] Điểm nổi trội của liệu pháp điều trị mới này là khả năng điều trị ngăn chặn chính xác ung thư mà không cần phá hủy (ví dụ như các vaccine phòng ung thư), có thể giúp đưa tế bào ung thư trở lại bình thường (ví dụ các liệu pháp gen) hay có thể điều trị với cách tác động nhẹ nhàng hơn làm ức chế ung thư (ví dụ liệu

Tiêu đề	Nghiên cứu đánh giá hiệu lực interleukin 2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư
Người hướng dẫn	PGS. TS. Trương Nam Hải
Trường học	Viện Công nghệ sinh học, Viện Học viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
Chuyên ngành	Sinh học, Công nghệ sinh học
Thể loại	Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ
Năm xuất bản	2010
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	258
Dung lượng	10,71 MB