Nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực miền nam và ứng dụng điều trị bệnh ở người

MỞ ĐẦU Tế bào gốc TBG là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương vì nhiều nguyên nhân khá

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Tp Hồ Chí Minh – 03/2011

DANH MỤC TÀI LIỆU

1 VĂN BẢN XÁC NHẬN VỀ SỰ THOẢ THUẬN CỦA CÁC TÁC GIẢ

VỀ VIỆC SẮP XẾP THỨ TỰ TÊN TRONG DANH SÁCH THỰC HIỆN

2 DANH SÁCH CÁN BỘ KHOA HỌC THAM GIA ĐỀ TÀI

3 BÁO CÁO THỐNG KÊ ĐỀ TÀI

4 BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI

5 PHỤ LỤC BÁO CÁO KẾT QUẢ

CÔNG TY CỔ PHẦN HOÁ DƯỢC PHẨM

MEKOPHAR

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP NHÀ NƯỚC

(Danh sách những cá nhân đã đóng góp sáng tạo chủ yếu cho đề tài, dự án

được sắp xếp theo thứ tự đã thoả thuận)

1 Tên đề tài, dự án: Nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực miền Nam

và ứng dụng điều trị bệnh ở người

Mã số đề tài: ĐTĐL 2007/03

Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước (tên lĩnh vực KHCN): Y dược

2 Thời gian thực hiện (Bắt đầu - Kết thúc): Tháng 01/2007 – 12/2010

3 Tổ chức chủ trì: Công ty cổ phần hoá dược phẩm Mekophar

4 Cơ quan chủ quản: Bộ Khoa học và Công nghệ

5 Tác giả thực hiện đề tài/dự án trên gồm những người có tên trong danh sách sau (ghi không quá 10 người kể cả chủ nhiệm đề tài/dự án):

Số

TT

Chức danh khoa học, học vị,

họ và tên Tổ chức công tác Chữ ký

1 DS Đặng Thị Kim Lan Công ty Mekophar

2 TS.BS Lê Văn Đông Học viện Quân y

3 GS.TSKH Phạm Mạnh Hùng Ban Tuyên giáo trung ương

4 PGS.TS Phan Toàn Thắng Đại học Quốc gia Singapore

5 CN Trương Thị Thu Huyền Công ty Mekophar

6 TS.BS Phạm Việt Thanh Bệnh viện Từ Dũ

7 TS Bùi Xuân Nguyên Viện CNSH, Viện KHCNVN

8 TS.BS Đinh Văn Hân Viện Bỏng Quốc Gia

9 PGS.TS Chu Quốc Trường Bệnh viện YHCT Trung ương

10 PGS.TS Nguyễn Tấn Bỉnh Bệnh viện TM-HH Tp.HCM

Chủ nhiệm đề tài/dự án

Thủ trưởng tổ chức chủ trì đề tài

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN KHU VỰC MIỀN NAM VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH Ở NGƯỜI

MÃ SỐ: ĐTĐL 2007/03

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA ĐỀ TÀI

15 DS Võ Thị Thanh Vân - nt -

18 CN Tô Quang Hội - nt -

20 TS.BS Nguyễn Đặng Dũng Học viện Quân y

23 BS Nguyễn Ngọc Tuấn - nt -

24 BS Hoàng Trung Kiên - nt -

26 YS Nguyễn Xuân Trường - nt -

27 TS.BS Phạm Việt Thanh Bệnh viện Từ Dũ

28 BS CKII Huỳnh Văn Nhàn - nt -

29 BS Ngô Thị Phương Mai - nt -

30 BS Bùi Đặng Lan Hương - nt -

31 CN Phan Thị Phương Trinh - nt -

42 ThS.BS Nguyễn Xuân Vũ Bệnh viện 175

43 ThS.BS Lê Văn Hiền Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM

45 PGS.TS Phan Toàn Thắng Đại học Quốc gia Singapore

46 ThS Phạm Văn Phúc Đại học KHTN, ĐHQG Tp.HCM

47 ThS Trương Hải Nhung - nt -

48 TS Bùi Xuân Nguyên Viện CNSH, Viện KHCNVN

52 TS.BS Đinh Văn Hân Viện Bỏng Quốc Gia

54 YS Nguyễn Phong Thấu - nt -

56 PGS.TS Chu Quốc Trường Bệnh viện YHCT Trung ương

1.1.1 Tế bào gốc là gì và tại sao cần lập ngân hàng tế bào gốc 4

1.1.4 Tiêu chuẩn của ngân hàng TBG máu dây rốn 9

1.1.6 Quản lý dữ liệu ngân hàng TBG 15

1.2.1 Biệt hoá TBG tạo tế bào mỡ, tế bào giống tế bào thần kinh

1.3 Một số ứng dụng tế bào gốc trong điều trị vết thương

1.3.1 Các tế bào tham gia liền vết thương 17 1.3.2 Vết thương bỏng và vết loét do tiểu đường 17 1.3.3 Công nghệ mô làm lành vết thương 19 1.3.4 Vai trò của TBG trong liền vết thương 20 1.3.5 Khả năng chữa bệnh bằng tế bào gốc dây rốn 22

1.4 Văn bản pháp lý của Việt Nam có liên quan đến lĩnh vực

Chương II – ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU

2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng và vận hành ngân hàng

2.1.2 Nghiên cứu xây dựng cơ sở hạ tầng 25

2.1.4 Tuyển chọn và sàng lọc trẻ hiến dây rốn 28 2.1.5 Thu thập và bảo quản máu dây rốn 28 2.1.6 Xử lý máu dây rốn tách TBG máu dây rốn 29 2.1.7 Đánh giá chất lượng mẫu TBG máu dây rốn 31 2.1.8 Bảo quản đông lạnh TBG máu dây rốn 31 2.1.9 Thu thập, bảo quản và xử lý mô dây rốn 32

2.1.10 Nuôi cấy mô dây rốn phân lập TBG màng dây rốn 32 2.1.11 Bảo quản đông lạnh TBG màng dây rốn 33 2.1.12 Phân lập và bảo quản TBG trung mô từ đơn vị TBG máu dây rốn 33

2.1.15 Thiết kế phần mềm quản lý các mẫu TBG trong ngân hàng 34

2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG

màng dây rốn thành một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt 44

2.2.1 Biệt hóa TBG trung mô máu dây rốn thành tế bào mỡ 44 2.2.2 Biệt hóa TBG màng dây rốn theo hướng thành tế bào thần kinh 44 2.2.3 Biệt hóa TBG màng dây rốn theo hướng thành tế bào cơ tim 47

2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng TBG dây rốn để điều trị bệnh

2.3.2 Đánh giá tác dụng của TBG màng dây rốn lên vết bỏng 50 2.3.3 Đánh giá tác dụng của TBG màng dây rốn lên vết thương trên nền

2.3.5 Ứng dụng TBG máu dây rốn để điều trị bệnh trên lâm sàng 53

Chương III – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nội dung 1: Xây dựng và vận hành ngân hàng tế bào gốc dây rốn 62

3.1.2 Thu thập, xử lý và bảo quản TBG máu dây rốn 64 3.1.3 Chất lượng của các mẫu TBG máu dây rốn sau bảo quản đông lạnh 73 3.1.4 Phân lập và định danh TBG màng dây rốn 75

3.1.5 Phân lập TBG trung mô từ máu dây rốn 84

1.3.6 Xây dựng phần mềm quản lý ngân hàng TBG dây rốn 85

3.2 Nội dung 2: Biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG màng dây rốn

thành một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt 92

3.2.1 Biệt hóa TBG trung mô máu dây rốn thành tế bào mỡ 92 3.2.2 Biệt hóa TBG màng dây rốn theo hướng thành tế bào thần kinh 94

3.2.3 Biệt hóa TBG màng dây rốn theo hướng thành tế bào cơ tim 102

3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc dây rốn để

điều trị bệnh trên thực nghiệm và lâm sàng 106

3.3.1 Tác dụng của TBG màng dây rốn lên vết bỏng thực nghiệm 106 3.3.2 Tác dụng của tế bào gốc màng dây rốn lên vết thương trên nền

3.3.3 Bàn luận về kết quả điều trị vết thương thực nghiệm 144 3.3.4 Ứng dụng TBG máu dây rốn để điều trị bệnh trên lâm sàng 154

3.4 Báo cáo thống kê các sản phẩm KHCN đã tạo ra 168 3.5 Đánh giá hiệu quả do Đề tài mang lại 175

KIẾN NGHỊ 179

TÀI LIỆU THAM KHẢO 180

PHỤ LỤC

1 Sơ đồ phòng thí nghiệm ngân hàng TBG dây rốn

2 Danh mục thiết bị chính của ngân hàng TBG dây rốn

3 Mẫu hồ sơ đăng ký hiến dây rốn

4 Mẫu hồ sơ thu thập và xử lý tách và bảo quản TBG dây rốn

5 Danh sách sản phụ hiến dây rốn và kết quả xử lý để hoàn thiện qui trình thao tác của các mẫu được thu thập và xử lý ở giai đoạn 1

5 Danh sách sản phụ hiến dây rốn có lượng máu dây rốn đủ lớn để xử lý tách TBG lập ngân hàng

6 Danh sách các bé hiến dây rốn được khám và xét nghiệm kiểm tra sức khoẻ sau 1 tuổi

7 Bảng tổng hợp kết quả xử lý phân lập TBG dây rốn và bộ hồ sơ hoàn chỉnh của một sản phụ hiến dây rốn và các mẫu TBG thu được

8 Kết quả xét nghiệm HLA các mẫu TBG có trong ngân hàng

9 Một số hình ảnh kết quả nghiên cứu và hoạt động của Đề tài

bFGF Basic fibroblast growth factor (Yếu tố tăng trưởng nguyên

bào sợi căn bản)

CLMC Tế bào gốc trung mô màng dây rốn (Cord lining

mesynchymal stem cell)

CRC CellResearch Corporation

DMSO Dimethyl sulfoxide

EGF Yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor)

FACT Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

HES Hydroxyethyl starch

hGAPDH Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

HLA Kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen)

KGF Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng (Keratinocytes growth factor)

NMDP Chương trình người hiến tuỷ xương quốc gia (National

Marrow Donor Program)

NeuN Neuronal Nuclei

P Lần cấy chuyền (Passage)

PBS Dung dịch đệm phosphat (Phosphate Buffered Saline)

PDGF Yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu (Pletelet derived

Growth factor)

SHH Sonic hedgehog

SLTB Số lượng tế bào

SLTBCN Số lượng tế bào có nhân

SLTBĐN Số lượng tế bào đơn nhân

SLVK Số lượng vi khuẩn

SOX2 SRY (sex determining region Y)-box 2

SSEA Stage-Specific Embryonic Antigen

US FDA Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (United State

Food and Drug Administration)

VEGF Vascular endothelial growth factor (Yếu tố tăng trường nội

mô mạch máu)

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đánh giá biểu hiện gen của

các TBG dây rốn và tế bào biệt hoá từ TBG dây rốn 36

Bảng 2.2: Danh mục các kháng thể dùng đánh giá biểu hiện protein

của các TBG dây rốn và tế bào biệt hoá từ TBG dây rốn 40

Bảng 3.1: Tên các phòng thí nghiệm và trang thiết bị chủ yếu 58 Bảng 3.2: Cân nặng, tuổi thai và lượng máu máu dây rốn thu được 65 Bảng 3.3: Phân bố lượng máu dây rốn thu được theo tuổi thai, cân

nặng của trẻ và phương pháp thu thập 65

Bảng 3.4: Tỷ lệ các nguyên nhân phải loại bỏ mẫu máu dây rốn 67 Bảng 3.5: Kết quả xử lý tách TBG máu dây rốn 69 Bảng 3.6 : Kết quả đánh giá tế bào sau bảo quản đông lạnh 74 Bảng 3.7: Kết quả PCR với tế bào biệt hóa hướng tiền thần kinh 101

Bảng 3.8: Diễn biến vết bỏng sau ghép TBG biểu mô 107

Bảng 3.9: Thay đổi diện tích vết thương sau ghép TBG biểu mô 108

Bảng 3.10: Tốc độ biểu mô hoá vết thương ghép TBG biểu mô 108

Bảng 3.11: Liên quan thời gian và số vết thương khỏi hoàn toàn 109

Bảng 3.12: Tần suất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu 109 Bảng 3.13: Mật độ vi khuẩn ở các vết thương cấy khuẩn dương tính 111

Bảng 3.14: Thay đổi về hình thái cấu trúc mô vết thương 112 Bảng 3.15: Thay đổi số lượng tế bào viêm ở vết bỏng 113 Bảng 3.16: Thay đổi số lượng nguyên bào sợi mô vết thương 114 Bảng 3.17: Thay đổi chỉ số gián phân tế bào mầm biểu mô vết thương 114 Bảng 3.18: Thay đổi số lượng tân mạch vết bỏng 115 Bảng 3.19: Thay đổi các chỉ số huyết học của thỏ nghiên cứu 117 Bảng 3.20: Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu 118

Bảng 3.21: Diễn biến vết bỏng sau ghép TBG trung mô màng dây rốn 119 Bảng 3.22: Thay đổi diện tích vết thương bỏng 120

Bảng 3.24: Liên quan thời gian và số vết thương liền hoàn toàn 121

Bảng 3.25: Diện tích vết thương và diện tích vùng sẹo bỏng 121 Bảng 3.26: Tần suất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu 122 Bảng 3.27: Mật độ vi khuẩn các vết thương cấy khuẩn dương tính 122

Bảng 3.28: Đặc điểm hình thái mô vết thương tại các thời điểm 124 Bảng 3.29: Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương 125 Bảng 3.30: Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương 125 Bảng 3.31: Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương 126 Bảng 3.32: Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương 126

Bảng 3.34: Thay đổi nồng độ Glucose máu 130

Bảng 3.35: Thay đổi cân nặng chuột thí nghiệm 131 Bảng 3.36: Thay đổi diện tích vết thương 132 Bảng 3.37: Tốc độ thu hẹp vết thương 134 Bảng 3.38: Thời gian liền vết thương 135 Bảng 3.39: Sự thay đổi các chỉ số huyết học 136 Bảng 3.40: Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu chuột 137 Bảng 3.41: Danh sách bệnh nhân dự tuyển ghép TBG máu dây rốn 156 Bảng 3.42: Kết quả xét nghiệm HLA của bệnh nhân chỉ định ghép 159

Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu tác động của ghép TBG màng dây rốn lên

vết thương phần mềm trên chuột cống gây tăng đường máu thực nghiệm 53

Hình 2.4: Sơ đồ tiến hành cấy ghép TBG máu dây rốn 61 Hình 3.1: Sơ đồ tổng thể ngân hàng TBG dây rốn 62 Hình 3.2: Các TBG màng dây rốn mọc lan ra từ mô nuôi cấy sơ cấp 75

Hình 3.3: Biểu hiện gen Oct-4 và Nanog ở TBG biểu mô màng dây

rốn 76

rốn

Hình 3.5: Kết quả phân tích bằng kỹ thuật western blot biểu hiện của

các kháng nguyên hoà hợp mô HLA-G và HLA-E ở các TBG biểu mô và TBG trung mô màng dây rốn 78

Hình 3.6: Mức độ biểu hiện của một số gen ở TBG biểu mô màng dây

Hình 3.7: Biểu hiện của albumin ở TBG biểu mô màng dây rốn 80 Hình 3.8: Biểu hiện của và mucin-1 (CD227), CK18 và CK19ở TBG

biểu mô màng dây rốn 81

Hình 3.9: Tỷ lệ % tế bào trong chế phẩm TBG trung mô màng dây

rốn dương tính với các dấu ấn bề mặt khảo sát bằng flowcytometry 82

Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của một số dấu ấn bề mặt của TBG trung

mô màng dây rốn khảo sát bằng kỹ thuật flowcytometry 83

Hình 3.11: TBG trung mô máu dây rốn trong quá trình phân lập và cấy

Hình 3.18: Cửa sổ nhập dữ liệu HLA của bệnh nhân 89

Hình 3.19: Cửa sổ đọ dữ liệu HLA của bệnh nhân với mẫu tế bào gốc

Hình 3.20: Kết quả tìm kiếm mẫu TBG phù hợp về 2 allen HLA-DRB1 91

Hình 3.21: Mẫu báo cáo kết quả tìm kiếm mẫu TBG phù hợp HLA 91

Hình 3.22: Kết quả biệt hóa TBG trung mô thành tế bào mỡ 92

Hình 3.23: Kết quả phân tích PCR biểu hiện gen liên quan tế bào mỡ 93

Hình 3.24: Hình thái và kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang các

TBG màng dây rốn trước và sau biệt hoá theo hướng tạo tế

Hình 3.25 Kết quả PCR với TBG màng dây rốn biệt hóa theo hướng

tạo tế bào tiền thần kinh và tế bào cơ tim 100

Hình 3.26: Hình thái và kết quả nhuộm MD huỳnh quang các TBG

màng dây rốn trước và sau biệt hoá theo hướng tạo tế bào

Hình 3.27: Thay đổi cân nặng thỏ ghép TBG biểu mô màng dây rốn 106 Hình 3.28: Chủng loại vi khuẩn vết bỏng đắp tấm TBG biểu mô 110

Hình 3.29: Chủng loại vi khuẩn vết bỏng đắp màng transwell 110

Hình 3.30: Thay đổi cân nặng thỏ ghép TBG trung mô màng dây rốn 116 Hình 3.31: Chủng loại vi khuẩn vết thương vùng nghiên cứu 123

Hình 3.32: Chủng loại vi khuẩn vết thương vùng đối chứng 123

Hình 3.33: Hình thái cấu trúc mô vết thương vùng A trước ghép TB 127

Hình 3.34: VT vùng A ngày nghiên cứu thứ 5 127

Hình 3.35: Mô vết thương vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10 128

Hình 3.36: Thay đổi nồng độ Glucose máu chuột 130 Hình 3.37: Thay đổi diện tích vết thương 133 Hình 3.38: Hình ảnh giải phẫu bệnh gan chuột nghiên cứu 138 Hình 3.39: Hình ảnh giải phẫu bệnh thận chuột nghiên cứu 139 Hình 3.40: Hình ảnh vết thương trên da chuột 140 Hình 3.41: Hình ảnh giải phẫu bệnh da chuột nghiên cứu 141

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương vì nhiều nguyên nhân khác nhau, vì vậy có thể sử dụng TBG để tạo ra các tế bào mới thay thế cho các tế bào bị tổn thương hoặc mất chức năng, đem lại triển vọng chữa được nhiều bệnh nan y Ghép TBG từ tuỷ xương, từ máu ngoại vi hay từ máu dây rốn đã được tiến hành để chữa thành công nhiều bệnh

về cơ quan tạo máu, bệnh chuyển hoá và suy giảm miễn dịch bẩm sinh Bên cạnh đó một số thử nghiệm lâm sàng ứng dụng TBG để chữa các bệnh nan y khác như tiểu đường týp I, bại não, suy tim sau nhồi máu cơ tim, liệt do chấn tương tuỷ sống, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen v.v cũng đang được triển khai ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam

Dây rốn và nhau thai nối thai nhi với hệ thống tuần hoàn của người mẹ, có chức năng đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ Các nghiên cứu về TBG cho thấy dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm các TBG tạo máu, TBG biểu mô, TBG trung

mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton (Wharton’s jelly) hay trong lớp màng bao dây rốn Các TBG này có thể dùng ngay để chữa bệnh hay làm nguyên liệu để nghiên cứu biệt hoá tạo ra các chế phẩm tế bào phục vụ cho chữa bệnh hoặc phát triển thuốc

Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép TBG tạo máu cũng đã khoảng 300-500 trường hợp Nhu cầu điều trị các

dụng trị liệu TBG khác trong tương lai là con số lớn hơn Nếu thành lập được ngân hàng TBG dây rốn (cả TBG từ máu và nhu mô) thì ngay từ bây giờ nhiều bệnh viện lớn đã có thể tiến hành ghép TBG máu dây rốn cho bệnh nhân trong nước, vừa có hiệu quả đồng thời lại giảm đáng kể chi phí cho người bệnh Bên cạnh đó, cho dù công nghệ ứng dụng các TBG từ nhu mô còn chưa được phát triển, nhưng việc bảo quản lưu giữ ngay các TBG của những người mới sinh ra là vô cùng cần thiết, vì một khi đã loại bỏ chúng ta không bao giờ lấy lại được những tế bào đặc biệt này Với dân số gần 90 triệu người và mức tăng dân số khoảng 1,4 triệu người/năm Nếu chỉ tính 1% số ca sinh có nhu cầu giữ hoặc hiến dây rốn mỗi năm đã có 14.000 mẫu TBG dây rốn lưu giữ để có thể điều trị cho bệnh nhân khi cần

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, Đề tài này được triển khai nhằm mục tiêu chung là xây dựng được Ngân hàng TBG dây rốn khu vực Miền Nam, và các mục tiêu cụ thể là:

1 Xây dựng được Ngân hàng TBG dây rốn (bao gồm TBG từ máu dây rốn và TBG từ màng dây rốn) tại Công ty cổ phần hoá dược phẩm Mekophar

2 Áp dụng thành công các qui trình thu thập, xử lý, bảo quản và biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG màng dây rốn

3 Xây dựng được qui trình quản lý nguồn TBG dự trữ lâu dài

4 Áp dụng được qui trình sử dụng TBG tạo máu từ máu dây rốn để điều trị một số bệnh cơ quan tạo máu ở người và TBG từ màng dây rốn để điều trị vết thương thực nghiệm trên động vật

Đề tài cụ thể hoá các mục tiêu nghiên cứu đặt ra thành ba nhóm nội dung khoa học công nghệ, được đơn vị chủ trì và các đơn vị tham gia Đề tài phối hợp thực hiện như sau:

1 Nghiên cứu xây dựng và vận hành Ngân hàng TBG dây rốn Do

Công ty cổ phần hoá dược phẩm Mekophar, Học viện Quân y, Bệnh viện Từ Dũ, Bệnh viện An Sinh, Khoa Phụ sản Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM, Phòng thí nghiệm tế bào gốc thuộc trường Đại học KHTN Đại học Quốc gia Tp.HCM, Phòng thí nghiệm CellResearch Corporation (Đại học Quốc gia Singapore) phối hợp thực hiện

2 Nghiên cứu biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG màng dây rốn thành

một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt Do Phòng thí nghiệm tế

bào gốc thuộc trường Đại học KHTN Đại học Quốc gia Tp.HCM và Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện

3 Nghiên cứu ứng dụng TBG dây rốn để điều trị bệnh trên thực

nghiệm và lâm sàng Do Viện Bỏng Quốc gia, Bệnh viện Y học cổ

truyền Trung ương và Bệnh viện Truyền máu-Huyết học Tp HCM thực hiện

Thành công của Đề tài này trước hết là giữ được những loại tế bào đặc biệt từ máu và từ màng dây rốn để phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học và chữa bệnh sau này Sản phẩm là các mẫu TBG mà Đề tài tạo ra còn có thể đem trao đổi giữa các cơ sở nghiên cứu, điều trị khác nhau trong nước cũng như quốc tế Điều này được minh chứng bằng ứng dụng điều trị bệnh ở người mà Đề tài đã thực hiện Người còn cơ hội cất giữ hoặc hiến TBG dây rốn giúp cứu chữa người cần TBG để điều trị nhưng đã lỡ cơ hội cất giữ TBG trước đó, đây là ý nghĩa nhân đạo và xã hội cao cả của Đề tài Bên cạnh đó, các kết quả biệt hoá TBG từ máu và màng dây rốn và thử nghiệm điều trị các vết thương thực nghiệm, tuy mới chỉ là bước đầu nhưng cũng là tiền đề cần thiết cho nghiên cứu tiếp theo hướng tới điều trị một số loại bệnh lý thiếu hụt

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 TẾ BÀO GỐC VÀ NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC

1.1.1 Tế bào gốc là gì và tại sao cần lập ngân hàng tế bào gốc

Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng

có khả năng tăng sinh mạnh mẽ, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới Nhờ những đặc điểm này mà TBG

đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng để chữa một số bệnh của

cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu, và có nhiều hứa hẹn dùng để chữa được nhiều bệnh nan y như tiểu đường, liệt do chấn tương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen [12, 14, 15, 27, 41, 85, 93] Để thực hiện được các ứng dụng này, cần phải thực hiện 3 nhóm công việc chính của công nghệ TBG là:

- Phân lập, bảo quản các loại TBG từ các nguồn khác nhau

- Tăng sinh và biệt hoá các TBG thành một số loại chế phẩm tế bào đã biệt hoá có hình thái và chức năng khác nhau

- Ứng dụng TBG và các tế bào biệt hoá từ TBG vào nghiên cứu cơ bản trong y sinh học, nghiên cứu phát triển thuốc và điều trị bệnh

Có nhiều cách phân loại và gọi tên TBG khác nhau tuỳ theo tiêu chí phân loại, ví dụ như dựa trên nguồn gốc, thời điểm phân lập, tiềm năng biệt hoá Dựa theo nguồn gốc và/hoặc thời điểm phân lập, có thể chia các TBG hiện đang được quan tâm thành các loại sau [27, 85, 189]:

- TBG phôi (embryonic stem cell): được phân lập từ phôi

- TBG thai (fetal stem cell): được phân lập từ các thai sau nạo phá thai

- TBG nhũ nhi (infant stem cell): được phân lập từ trẻ sơ sinh hoặc từ dây rốn và nhau thai

- TBG từ người trưởng thành (adult stem cell): được phân lập từ các mô của người trưởng thành

- Tế bào giống TBG phôi (embryonic like stem cell) hay TBG vạn tiềm năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPS): được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như TBG phôi

Hình 1.1: Phân loại TBG theo nguồn gốc và thời điểm phân lập

Mỗi loại TBG kể trên có tiềm năng biệt hoá khác nhau và do vậy triển vọng ứng dụng khác nhau Việc phân lập và duy trì mỗi loại TBG này cũng đòi hỏi những kỹ thuật và công nghệ khác nhau Trên phương diện đạo đức y sinh học, việc thu thập nguồn cung cấp tế bào, tách và sử dụng mỗi loại TBG trên cũng có những tác động khác nhau Nhìn bao quát nhiều khía cạnh thì mỗi loại TBG kể trên đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định Do đó việc lựa chọn loại TBG nào để nghiên cứu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó mục tiêu sử dụng thường là yếu tố quyết định [12, 14, 15, 27, 85, 93]

Trên phương diện Miễn dịch, cho dù các chế phẩm TBG có được chế tạo hoàn hảo đến đâu, kỹ thuật cấy ghép có thuần thục đến mấy, nhưng nếu các tế bào ấy là của người khác thì khi cấy ghép vào cơ thể người nhận có đặc điểm

di truyền khác với của các TBG đều xảy ra quá trình nhận diện và tấn công miễn dịch theo hướng cơ thể người nhận phát hiện và loại bỏ tế bào ghép (đáp ứng thải ghép) hoặc các TBG được ghép vào tạo ra các tế bào miễn dịch mới tấn công cơ thể người nhận (bệnh mô ghép chống túc chủ) Mức độ khốc liệt của quá trình tấn công miễn dịch này tỷ lệ thuận với mức độ khác biệt về di truyền giữa chủ nhân sinh học của các TBG và người được cấy ghép TBG Vì thế việc cấy ghép mô và tế bào nói chung, TBG nói riêng, luôn mong muốn

có được các tế bào có nguồn gốc từ chính cơ thể người nhận hoặc người có đặc điểm di truyền giống với người nhận Để đạt được điều này thì cần phải lấy các TBG ra khỏi cơ thể (đặc biệt là lấy ngay từ khi còn trẻ và chưa bị bệnh) đem bảo quản trong những điều kiện đặc biệt, duy trì chúng là các tế bào sống và không bị thay đổi theo thời gian bảo quản dưới dạng ngân hàng TBG Các tế bào này khi cần có thể lấy ra để điều trị cho chính chủ nhân sinh học của các TBG đó hoặc những người khác trong gia đình và cộng đồng có đặc điểm di truyền phù hợp Ngoài ra, các TBG này còn có thể dùng trong các mục đích nghiên cứu khác [12, 27, 43, 61, 66, 95]

1.1.2 Tế bào gốc dây rốn

Dây rốn dài khoảng 40 tới 60 cm, có chức năng đảm bảo sự liên tục giữa thai nhi với bánh nhau, từ đó thực hiện quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và

cơ thể mẹ Nghiên cứu phôi thai học và HLA cho thấy các tế bào của dây rốn

có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ [10, 66]

Máu dây rốn đã được các nhà huyết học trong nước cũng như quốc tế nghiên cứu và phát hiện thấy có nhiều TBG tạo máu tương tự như các TBG tạo máu ở tuỷ xương Từ đó, máu dây rốn đã được sử dụng để điều trị hàng loạt bệnh về cơ quan tạo máu và bệnh di truyền bẩm sinh có liên quan đến chuyển hoá và thiếu hụt miễn dịch Cùng với tuỷ xương và máu ngoại vi, máu dây rốn đã trở thành một trong ba nguồn cung cấp TBG tạo máu chính đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng [4, 5, 6, 7, 10, 30, ,66, 140]

Sau các nghiên cứu về TBG tạo máu trong máu dây rốn, các nghiên cứu khác cũng đã phát hiện và phân lập được các TBG trung mô từ máu dây rốn,

từ gel Wharton, từ thành mạch máu dây rốn cũng như cả trong dịch ối và màng ối [26, 78, 92, 112, 118, 127, 150, 176, 177, 185]

Năm 2004, PGS.TS Phan Toàn Thắng và cộng sự tại Đại học Quốc gia Singapore đã thành công trong việc xác định và phân lập được các TBG biểu

mô và TBG trung mô từ màng dây rốn Theo nhóm tác giả này, ưu điểm chính của việc phân lập TBG từ màng dây rốn so với các phần khác của bánh nhau

và dây rốn là thao tác kỹ thuật thuận tiện hơn, đồng thời thu được các TBG phong phú hơn cả về số lượng và chủng loại tế bào Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trường nuôi cấy đặc trưng chưa hề bị biệt hoá, vẫn giữ được đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [80, 112, 141, 168]

1.1.3 Ngân hàng tế bào gốc dây rốn

Sau những thành công của ghép TBG máu dây rốn để điều trị bệnh về máu

và bệnh di truyền bẩm sinh ở người, qua đó đã chứng tỏ lợi ích của việc cất giữ TBG máu dây rốn Cho đến nay rất nhiều ngân hàng máu dây rốn (hay còn gọi

là ngân hàng TBG máu dây rốn) đã được xây dựng ở hầu hết các nước phát triển và một số nước đang phát triển (trong đó có Việt Nam) Có ngân hàng đã lưu giữ tới hàng trăm ngàn đơn vị TBG máu dây rốn như các ngân hàng TBG máu dây rốn Seoul (Hàn Quốc), Cord Blood Registry (Mỹ), hệ thống ngân hàng CordLife (Singapore, Hồng Kông, Úc, Ấn Độ, Indonesia) [5, 31, 44, 95,

Các ngân hàng TBG máu dây rốn thường hoạt động dưới hai hình thức: Ngân hàng TBG máu dây rốn của người hiến tặng (thường là miễn phí cũng như không đòi hỏi quyền lợi gì từ cả phía người hiến và phía ngân hàng) để sử dụng cho cộng đồng (tạm gọi là ngân hàng TBG công) và ngân hàng TBG máu dây rốn của người yêu cầu cất giữ riêng (thường phải đóng phí dịch vụ) để sử dụng cho chính em bé có dây rốn đó hoặc các thành viên trong gia đình (tạm gọi là ngân hàng TBG tư) Có ngân hàng chỉ thực hiện một hình thức, có ngân hàng thực hiện cả hai hình thức trên Nhìn chung các ngân hàng TBG công thường do các chính phủ đầu tư, sau đó vận hành bằng kinh phí chính phủ hoặc kinh phí tài trợ từ các quĩ, các hiệp hội chuyên ngành hoặc từ người hảo tâm còn các ngân hàng tư thường có yếu tố tư nhân [27, 133, 181, 191, 192]

Vào thời điểm năm 2007, trước khi đề tài này được triển khai, trên thế giới mới chỉ có các ngân hàng TBG máu dây rốn Sau khi được cấp bản quyền quốc

tế về công nghệ phân lập TBG biểu mô và TBG trung mô từ màng dây rốn, công ty CellResearch Corporation (Singapore) đã giao quyền khai thác công nghệ này cho một số ngân hàng TBG máu dây rốn ở Đài Loan, Hồng Kông (Trung Quốc), Ấn Độ và các ngân hàng này bắt đầu đưa thêm dịch vụ lưu giữ TBG màng dây rốn vào danh mục TBG mà họ lưu giữ Một số ngân hàng ở Châu Âu và Mỹ (trong đó có Cord Blood Registry), mặc dù không phân lập và bảo quản TBG màng dây rốn nhưng cũng đã triển khai dịch vụ lưu giữ nguyên

cả mô dây rốn để chờ sau này khi có công nghệ trong tay hoặc khi bệnh nhân cần thì mới phân lập TBG từ màng dây rốn [192, 196]

1.1.4 Tiêu chuẩn của ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn

Hiện nay có một số hệ thống tiêu chuẩn được các tổ chức chuyên môn như Asia-Cord, NetCord-FACT, AABB ban hành và tổ chức thẩm định cấp chứng chỉ hợp chuẩn [46, 135, 197] Tiêu chí chung của các tổ chức này là đưa ra các

cứ thêm vào các yếu tố khác như luật pháp sở tại và các vấn đề về sức khoẻ có tính chất khu vực để đưa thêm các tiêu chuẩn khác vào tiêu chuẩn của ngân hàng TBG sở tại Nhìn chung 3 hệ thống tiêu chuẩn này về cơ bản là tương tự nhau, trong đó theo trình tự công việc, mỗi ngân hàng TBG máu dây rốn cần tiến hành những nội dung công việc và áp dụng các tiêu chuẩn cơ bản sau:

1.1.4.1 Tuyển chọn sản phụ và trẻ sơ sinh hiến dây rốn

Yêu cầu đâu tiên là sản phụ hiến dây rốn phải trên 18 tuổi và tự nguyện hiến bánh nhau và dây rốn của con mình sau khi sinh Mặc dù bình thường dây rốn và bánh nhau là sản phẩm bỏ đi sau khi sinh dưới dạng rác y tế và do vậy thuộc quyền xử lý của bệnh viện, nhưng hiện nay việc thông báo trước cho sản phụ và để có sự đồng thuận và tự nguyện hiến bánh nhau và dây rốn của con họ sau khi sinh có xu hướng trở thành yêu cầu bắt buộc Nguyên nhân

là vì ngoài việc thu thập máu dây rốn, ngân hàng cần thu thập thêm cả các thông tin về tiền sử gia đình, tình trạng sức khoẻ thai sản của sản phụ Điều này càng rõ ràng hơn nữa khi tiến hành lấy máu dây rốn trước xổ nhau, lấy thêm máu của sản phụ để xét nghiệm sàng lọc và lưu trữ cùng mẫu máu dây rốn cũng như cần theo dõi tiếp em bé sau khi sinh đề phát hiện các bất thường

về di truyền bẩm sinh mà ngay khi sinh chưa phát hiện ra

Các sản phụ hiến dây rốn phải cung cấp thông tin về tiền sử sức khoẻ của bản thân và gia đình, phải được kiểm tra sức khoẻ tổng quát, đánh giá các yếu

tố nguy cơ và khả năng mang các bệnh nhiễm trùng có thể chuyển qua nhau thai Các sản phụ cần được xét nghiệm ngay trước hoặc sau khi sinh để sàng lọc một số bệnh nhiễm trùng bao gồm HBsAg, Anti-HBcAg, Anti-HCV, Anti-HIV, Anti-HTLV1/2, Anti-CMV và giang mai

Với trẻ sơ sinh hiến dây rốn phải có tuổi thai trên 37 tuần, cân nặng trên 2.600 gam, thời gian từ khi vỡ ối đến khi sinh không quá 24 giờ và người mẹ không sốt cao trên 38°C vào thời điểm sinh ra bé

1.1.4.2 Thu thập máu dây rốn

Thông thường có 2 cách thu thập máu dây rốn là thu thập trước xổ nhau

(khi bánh nhau còn nằm ở trong tử cung - in utero) và thu thập sau xổ nhau (khi bánh nhau đã bong và đã được đưa ra khỏi tử cung - ex utero) Ở Việt

Nam, từ năm 1997 đến nay các nhà khoa học của Bệnh viện TM-HH Tp.HCM đã tiến hành thu thập hàng ngàn mẫu máu dây rốn và đã triển khai

cả hai cách thu thập này Thu thập trước xổ nhau luôn bảo đảm được chắc chắn thu được máu dây rốn, thao tác đơn giản, không tốn nhiều dụng cụ nhưng đòi hỏi phải thao tác nhanh và có thể có nguy cơ về nhiễm trùng cho người mẹ; có sự xâm lấn đối với cơ thể người mẹ; đòi hỏi phải có sự thoả thuận chặt chẽ giữa đơn vị thu thập máu dây rốn và sản phụ; thao tác thu thập đòi hỏi độ thành thục cao hơn Trong khi đó, thu thập máu dây rốn sau xổ nhau có ưu điểm là việc thu thập tiến hành hoàn toàn bên ngoài cơ thể người

mẹ nên giảm tối đa được nguy cơ đối với sản phụ và nhân viên thu thập, đồng thời thao tác thu thập tương đối đơn giản hơn Tuy nhiên phương pháp này sẽ tốn nhiều chi phí hơn bởi vì cần phải có thêm nhiều dụng cụ và người tham gia hơn Cho đến nay, chưa có báo cáo nào về các bất lợi nghiêm trọng cho cả

2 phương pháp thu thập trước và sau xổ nhau [5, 30, 156]

1.1.4.3 Xử lý tách chiết/phân lập TBG máu dây rốn

Mục tiêu của việc xử lý tách chiết/phân lập TBG máu dây rốn là làm giảm bớt thể tích đơn vị máu dây rốn, loại bớt các tế bào hồng cầu và qua đó làm giàu các tế bào có nhân trong đơn vị máu dây rốn (trong đó có chứa các loại TBG máu dây rốn - nên còn được gọi là đơn vị TBG máu dây rốn) Các đơn

vị TBG máu dây rốn lưu trữ đông lạnh thường được giảm bớt thể tích xuống còn từ 20-25 mL và được bảo quản trong các túi plastic chuyên dụng làm bằng nhựa chịu được nhiệt độ lạnh sâu ở -196°C Giảm bớt thể tích sẽ có lợi

làm giảm nguy cơ tan máu cấp khi mẫu TBG máu dây rốn và người nhận khác nhau về nhóm máu Lượng TBG được làm giàu sẽ có khả năng phục hồi

số tế bào sống tốt hơn sau khi bảo quản đông lạnh và giải đông lạnh

Có nhiều phương pháp loại bớt hồng cầu và tách chiết/phân lập các TBG

từ máu dây rốn như:

- Phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng đơn thuần “top and bottom method” hoặc ly tâm với ficoll hypaque

- Phương pháp tiêu hồng cầu với dung dịch amonium chloride

- Phương pháp kết lắng hồng cầu với sự có mặt của hydroxyethyl starch (HES), gelatin, pentastarch, dextran, methylcellulose, polygeline

- Phương pháp tuyển tế bào bằng chọn lọc dương tính những tế bào có dấu ấn CD34+

- Phương pháp xử lý bằng bộ lọc tế bào

- Tách chiết bằng các hệ thống máy tự động như Sepax của hãng BioSafe (Thuỵ Sỹ), hay AXP (Auto Xpress Plasform) của hãng Thermogenesis (Mỹ) chế tạo

Tuỳ theo mục đích tách chiết tế bào và lượng tế bào cần tách chiết mà phương pháp nào được lựa chọn để sử dụng Với mục đích tách chiết tế bào

để bảo quản trong các ngân hàng TBG máu dây rốn, các phương pháp thường được sử dụng là phương pháp thủ công loại bỏ hồng cầu bằng chất HES và các phương pháp tách chiết tế bào tự động [5, 30, 44, 95, 133]

1.1.4.4 Bảo quản đông lạnh tế bào gốc

Bảo quản tế bào ở nhiệt độ thấp dưới 0°C thì được gọi là bảo quản đông lạnh Nguyên lý chung của bảo quản đông lạnh là đưa tế bào từ điều kiện sinh

lý trong môi trường thường xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp như -80°C trong

tủ lạnh âm sâu hoặc -196°C trong nitơ lỏng Tuy nhiên ở nhiệt độ này mọi hoạt động sinh học sẽ ngừng lại và một số cấu trúc tế bào bị phá huỷ do các tinh thể nước hình thành bên trong tế bào dẫn đến chết tế bào, do vậy cần có các qui trình tối ưu cho mỗi loại tế bào, bao gồm việc sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) và kiểm soát tốc độ hạ lạnh, giúp tế bào không chết và cũng không bị tổn thương cấu trúc và chức năng sau quá trình bảo quản và giải đông lạnh Các chất bảo vệ đông lạnh thường được sử dụng là DMSO nồng độ thông thường từ 5-10%, HES nồng độ 6% và albumin người nồng độ 4% Ngoài ra việc bổ sung thêm các protein của huyết tương, một số thành phần muối vào dung dịch bảo vệ cũng cải thiện được sự sống của TBG Hầu hết các trung tâm lưu trữ tế bào nói chung và TBG máu dây rốn nói riêng đều phải được trang bị hệ thống hạ lạnh và giải đông tế bào tuỳ theo mục đích sử dụng khác nhau Các thiết bị đó có khả năng hạ lạnh chậm và giải đông nhanh, nhằm tránh các tổn thương cơ học, mất nước do hình thành các tinh thể nước đá trong quá trình hạ lạnh và giải đông

Sau khi tốc độ đông lạnh được kiểm soát với sự hiện diện của chất bảo quản, các TBG được đông lạnh bằng cách nhúng chìm trong nitơ lỏng hoặc pha hơi của nitơ lỏng ở nhiệt độ siêu lạnh thấp hơn -135°C Ở nhiệt độ này các tế bào có thể được bảo quản trong khoảng thời gian không hạn định [27,

30, 44, 55, 95, 133]

1.1.4.5 Đánh giá số lượng và chất lượng tế bào

Sau khi một đơn vị TBG máu dây rốn được xử lý thành công sẽ tiếp tục được đánh giá và kiểm tra chất lượng nhằm xác định sự phù hợp với các tiêu chuẩn đề ra, đảm bảo cho sự an toàn và khả năng cấy ghép sau này Bên cạnh

đó, đánh giá chất lượng mẫu TBG còn giúp kiểm tra mọi thao tác kỹ thuật trong suốt quá trình nhiều bước từ thu thập, xử lý đến bảo quản tế bào Tuỳ

rốn phải được kiểm tra và đánh giá đúng tiêu chuẩn với phác đồ điều trị đó Chính vì vậy việc đánh giá kiểm tra số lượng và chất lượng các TBG trước khi bảo quản đông lạnh và trước khi lấy ra để cấy ghép là việc làm cực kỳ quan trọng và bắt buộc

Các chỉ số quan trọng cho việc đánh giá một đơn vị TBG máu dây rốn bao gồm: số lượng tế bào có nhân, tỷ lệ tế bào sống, mật độ và số lượng tuyệt đối các TBG tạo máu CD34+/CD45dim, khả năng tạo bào lạc (colony forming), trạng thái vô trùng thông qua cấy khuẩn cấy nấm [5, 27, 30, 44, 95, 133] Với các TBG từ màng dây rốn, cho đến nay chưa có ngân hàng hoặc tổ chức chuyên môn nào đưa ra tiêu chuẩn đánh giá cụ thể Nhìn chung, giống như bất kỳ một mẫu tế bào nào được bảo quản, các chỉ tiêu tối thiểu cần đánh giá gồm số lượng tế bào, tỷ lệ tế bào sống và trạng thái vô trùng

1.1.5 Định danh tế bào gốc

Cơ thể người được cấu tạo bởi nhiều loại tế bào, mỗi loại có đặc điểm hình thái, chức năng, đặc điểm biểu hiện gen, biểu hiện các protein khác nhau, trong đó mỗi tế bào đều có những dấu ấn đặc trưng Xác định dấu ấn đặc trưng về hình thái, đặc điểm tế bào học là những cách thường được sử dụng nhất để để định danh các tế bào nói chung và TBG nói riêng Các dấu ấn của

tế bào có thể phát hiện ở nhiều mức độ khác nhau từ cấp độ phiên mã đến cấp

độ dịch mã Ở cấp độ phiên mã, các dấu ấn được phát hiện dựa vào sự biểu hiện mức mRNA bằng các kĩ thuật như RT-PCR, realtime RT-PCR Ở mức

độ dịch mã, các dấu ấn được phát hiện dựa vào sự tồn tại của protein trong tế bào hoặc trên bề mặt tế bào Ngoài ra, với các TBG, các thử nghiệm để chứng minh tính “gốc” của tế bào như các thử nghiệm đánh giá chức năng TBG

thông qua nuôi cấy tạo các bào lạc, thử nghiệm biệt hoá in vitro cũng thường

được dùng làm tiêu chuẩn để khẳng định đó là TBG [27, 189]

1.1.6 Quản lý dữ liệu ngân hàng TBG

Nhiệm vụ của ngân hàng TBG là phân lập, bảo quản lâu dài và cung cấp các mẫu TBG cho yêu cầu điều trị và nghiên cứu khoa học Bên cạnh các yêu cầu về quản lý chất lượng TBG, các yêu cầu về quản lý thông tin cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động của ngân hàng Theo yêu cầu của Chương trình người hiến tuỷ xương quốc gia (NMDP, Mỹ), một ngân hàng TBG máu dây rốn tối thiểu phải có từ 100 mẫu TBG trở lên, trong đó mỗi mẫu tế bào phải có đầu đủ các thông tin sau [132, 194]:

- Mỗi mẫu TBG cần có một mã số riêng biệt, với các thông tin rõ ràng và đầy đủ cho phép tìm kiếm và truy nguyên nguồn gốc của mẫu TBG

- Kết quả xét nghiệm HLA-A, HLA-B và HLA-DRB1, trong đó HLA-A

và HLA-B có thể xét nghiệm bằng phương pháp huyết thanh học hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử còn HLA-DRB1 được xét nghiệm bằng phương pháp sinh học phân tử

- Kết quả xét nghiệm nhóm máu ABO và Rh

- Kết quả xét nghiệm kiểm tra nhiễm trùng, nếu có nhiễm thì cần có kết quả kháng sinh đồ trước khi mẫu tế bào được đem ra sử dụng

- Thông tin về sức khoẻ và kết quả xét nghiệm kiểm tra các bệnh nhiễm trùng của người mẹ ngay trước hoặc sau khi sinh

- Thông tin về thể tích mẫu lưu trữ và số lượng các tế bào có nhân

- Hồ sơ liên quan đến việc tự nguyện hiến dây rốn của người mẹ

- Qui trình tìm kiếm và cung cấp mẫu TBG, trong đó có các công cụ tìm kiếm mẫu tế bào dựa trên các tiêu chí khác nhau, đặc biệt là công cụ đọ kết quả HLA và đánh giá mức độ phù hợp về HLA giữa người nhận

1.2 BIỆT HOÁ IN VITRO TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN

1.2.1 Biệt hoá tế bào gốc tạo tế bào mỡ, tế bào giống tế bào thần kinh và

tế bào giống tế bào cơ tim

Nhờ tính đa tiềm năng, các TBG có thể được biệt hoá in vitro thành các

loại tế bào khác nhau Khả năng có thể biệt hoá được thành loại tế bào khác cũng được coi là một chỉ tiêu thể hiện tính “gốc” của TBG và biệt hoá TBG cùng là một trong ba mảng công việc lớn của công nghệ TBG

Nguyên tắc chung để biệt hoá in vitro TBG thành loại tế bào mong muốn

là đặt các TBG vào vi môi trường gồm các tế bào và/hoặc phân tử có tác dụng định hướng TBG phát triển thành tế bào cần biệt hoá Các tín hiệu cảm ứng biệt hoá có thể đến từ các tác nhân tế bào thông qua các quá trình đồng nuôi cấy TBG và tế bào phát ra các tín hiệu cảm ứng biệt hoá; có thể là các phân tử sinh học như các cytokine và các chất tăng trưởng; hoặc có thể là các chất hoá học đóng vai trò là hoá chất cảm ứng biệt hoá [27, 81, 85, 93]

Cảm ứng biệt hoá theo hướng tạo tế bào mỡ là nghiên cứu thường được tiến hành nhất đối với các TBG trung mô và cũng thường được các nhóm nghiên cứu sử dụng như một thử nghiệm để nhận diện các TBG [26, 81]

Theo hướng tạo tế bào giống tế bào thần kinh, Woodbury và CS (2000) đã biệt hoá thành công TBG tuỷ xương người thành tế bào thần kinh [183]; Yan

và CS (2005) biệt hoá được TBG phôi thành tế bào tiết dopamin [184] Bomeke và CS (2009) tạo ra được tế bào thần kinh và tế bào thần kinh nhỏ từ

tế bào mầm phôi [59]

Cảm ứng biệt hoá TBG thành tế bào cơ tim cũng đã được Catalin và CS (2001) thực hiện thành công với các TBG trung mô [70], Laflamme và CS (2005, 2007) thực hiện từ các TBG phôi [115, 116]

1.2.2 Biệt hoá tế bào gốc dây rốn

Các TBG từ dây rốn mang các đặc trưng chung của TBG là có thể biệt hoá được thành các loại tế bào chức năng khác Đã có một số nghiên cứu mô tả biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG từ gel Wharton thành tế bào giống tế bào thần kinh mà có biểu hiện các dấu ấn của tế bào thần kinh (Mitchell và CS,

2003 [127]; Yang và CS, 2005 [185]) Theo Weiss và CS (2003), sau khi cấy chuyển vào não chuột từ hai đến sáu tuần, một tập hợp các TBG dây rốn lợn

đã được tìm thấy có hình thái giống tế bào thần kinh và có biểu hiện các dấu

ấn đặc trưng cho tế bào thần kinh lợn [178]

1.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG VÀ BỆNH LÝ CƠ QUAN TẠO MÁU

1.3.1 Các tế bào tham gia liền vết thương

Thành phần tế bào của da người gồm hai loại chính là nguyên bào sợi (fibroblasts) và tế bào sừng (keratinocytes) Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì da Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thương da Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện để tế bào sừng

từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt làm liền vết thương [164, 179] Quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng

là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương Do đó quan niệm hiện nay trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các tế bào tổn thương cần phải được thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh [13, 149]

1.3.2 Vết thương bỏng và vết loét do tiểu đường

Các vết thương khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết thương đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt Khi vết thương có

mô hạt tốt thì các tế bào biểu mô từ bờ mép vết thương mới tăng sinh và di cư vào phía trung tâm vết thương để làm lành hoàn toàn vết thương hoặc phải ghép da nếu đường kính tổn thương trên 5 cm Các yếu tố ảnh hưởng tốt tới việc hình thành mô hạt sẽ góp phần làm vết thương mau lành và ngược lại Thông thường vết bỏng sâu hoặc vết thương mất da sẽ có tổ chức hạt tốt sau 10-15 ngày nếu vết thương không bị nhiễm khuẩn và sạch hoại tử Hình thành

mô hạt sớm sẽ tạo điều kiện để ghép da tự thân sớm, che phủ đóng kín vết thương, hạn chế các biến chứng như suy mòn, nhiễm khuẩn, hoặc vết thương vết bỏng chuyển thành mạn tính rất khó liền [39, 45, 48, 83, 124]

Khi vết thương vết bỏng trở thành mạn tính chúng có đặc điểm là giai đoạn tăng sinh của quá trình liền vết thương bị gián đoạn do giảm số lượng các nguyên bào sợi (là tế bào quan trọng nhất của pha tăng sinh); các nguyên bào sợi còn lại bị chuyển dạng; các quai mạch máu thoái triển trở nên thưa thớt; các tế bào nội mô giảm phân chia làm giảm tân mạch nên mô hạt kém chất lượng; các tế bào biểu mô quanh vết thương giảm hoặc ngừng phân bào, các tế bào này không phát triển được vào phía trung tâm vết thương; giảm các thành phần đệm gian bào do nguyên bào sợi tạo ra là các sợi laminin, decorin, fibronectin là thành phần để cho các tế bào biểu mô bám vào và trượt trên

đó để di cư vào vết thương thực hiện quá trình biểu mô hoá che phủ tổn thương, hậu quả là việc điều trị trở nên khó khăn [39, 49, 50, 62, 83]

Những biến chứng thường xuyên nhất tác động lên bệnh nhân tiểu đường

là các tổn thương bệnh lý ở võng mạc, thận và suy cầu thận Tuy nhiên, vết thương ở những bộ phận ngoại vi của cơ thể như tay và chân cũng là những tác nhân chính ảnh hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân tiểu đường Các vết

loét do tiểu đường chủ yếu là mạn tính, hầu hết thường gặp ở chân Những vết thương này rất khó liền và việc điều trị gặp rất nhiều khó khăn Trở ngại chính của các vết loét do tiểu đường là tổn thương mạch máu ngoại vi ở những vết thương, vết loét Đây là nguyên nhân chính gây ra những bệnh về thần kinh của bệnh nhân tiểu đường Điều trị vết thương mất da, đặc biệt là những vết thương mạn tính trên bệnh nhân tiểu đường, hiện còn gặp rất nhiều khó khăn Những nghiên cứu điều trị vết thương khó liền bằng ghép tế bào hiện nay tỏ ra là một trong những phương pháp tiên tiến có nhiều triển vọng tốt cho điều trị [64, 94, 144]

1.3.3 Công nghệ mô làm liền vết thương

Trong những trường hợp tổn thương bỏng diện tích rộng, các tế bào có chức năng liền vết thương của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thương thì cần phải ghép da tự thân Tuy nhiên, nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên ghép da tự thân cũng chỉ cứu được những bệnh nhân có diện tích bỏng nhỏ hơn 50% diện tích cơ thể là chủ yếu Ngoài bỏng, chúng ta còn gặp các loại vết thương mạn tính rất khó lành như các vết loét do tiểu đường, loét do nguyên nhân tĩnh mạch, loét điểm tỳ đè, loét sau xạ trị… mà không thể can thiệp bằng phẫu thuật ghép da cho những bệnh nhân này vì nguy cơ thất bại rất cao do khả năng tiếp nhận mảnh ghép của vết thương rất kém và tình trạng bệnh nhân không cho phép phẫu thuật

Để khắc phục hạn chế trên, công nghệ nuôi cấy tế bào da phát triển Từ 30 năm trước, khi Rheinwald và Green mô tả việc nuôi cấy tạo ra được dòng tế bào sừng từ 1 tế bào, thì một số nhà nghiên cứu đã cho rằng điều trị vết thương vết bỏng trong tương lai sẽ trở nên đơn giản, nhanh chóng và dễ dàng chỉ bằng che phủ tổn thương sau cắt hoại tử Nhưng trên thực tế, điều này còn rất xa vời Thập kỷ tiếp theo xuất hiện những khái niệm về “công nghệ mô”