Nghiên cứu quy trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới

Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại: a. Hiệu quả về khoa học công nghệ: - Xác định được các đặc điểm cấu trúc và siêu cấu trúc ống sinh tinh của các bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) bao gồm cảazoospermia do tắc và không do tắc. - Xác định được qui trình phân lập các tếbào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tếbào dòng tinh từmào tinh. - Xác định sự biến đổi của các tế bào dòng tinh trong môi trường nuôi cấy. - Xác định khảnăng thụtinh của tinh trùng và tinh tửtrưởng thành sau nuôi cấy và hiệu quả của việc nuôi cấy các tế bào dòng tinh trong điều trịvô sinh. - Trên cơsở đó đềxuất các biện pháp điều trị. Kết quảnuôi cấy các tếbào dòng tinh không chỉ được áp dụng trong điều trịcho các bệnh nhân azoospermia mà còn được áp dụng cho các bệnh nhân sau điều trịhóa chất, tia xạ, áp dụng trong quá trình bảo vệcác loài vật quí hiếm. b. Hiệu quảvềkinh tếxã hội: - Người được hưởng lợi trực tiếp là các cặp vợchồng vô sinh, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc. Qua đó đềtài có đóng góp hết sức to lớn vềmặt nhân văn và kinh tếxã hội cho Việt Nam. - Mởra hướng điều trịmới cho các bệnh nhân không có tinh trùng, đặc biệt là các bệnh nhân a

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA

TẾ BÀO GỐC SINH TINH ĐỂ ĐIỀU TRỊ VÔ SINH

NAM GIỚI

MÃ SỐ: ĐTĐL2009T/27

Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Đình Tảo

8999

HÀ NỘI - 2011

- Nghiên cứu qui trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để điều trị

vô sinh nam giới

- Mã số: ĐTĐL2009T/27

- Thời gian thực hiện: tháng 1/2009 đến tháng 12 /2011

2 Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng

104 đường Phùng Hưng – Phúc La – Hà Đông – Hà Nội

Điện thoại: 069.566100/069.566101

Cơ quan phối hợp: Trung tâm Y học sinh sản và Nam học - Đại học Munster

– CHLB Đức, Bệnh viện Phụ sản Trung ương

3 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Đình Tảo

Địa chỉ : Trung tâm Công nghệ phôi – Học viện Quân y

Điện thoại: 33 545 034 Nhà riêng: 3 8536029 Mobile: 0912217808

Fax: 33 545 034 E-mail: ndtao@yahoo.com

4 Thư ký khoa học: TS Trịnh Thế Sơn

Địa chỉ : Trung tâm Công nghệ phôi – Học viện Quân y

- Kinh phí từ nguồn tự có của tổ chức: 112 triệu đồng

- Kinh phí từ nguồn khác: 135,273 triệu đồng

Thời gian (Tháng, năm

Kinh phí (Triệu đồng)

Ghi chú

(Số đề nghị

quyết toán)

2009-2011 4417,273 2009-2011 4417,273 4417,273

c Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

3 Các văn bản chính trong quá trình thực hiện đề tài:

Quyết định về việc phê duyệt tổ chức

và cá nhân chủ trì đề tài, dự án sản xuất thử nghiệm đốc lập cấp nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009

Nội dụng tham gia chủ yếu

Sản phẩn chủ yếu đạt được

Ghi chú

9346742 Địa chỉ: 43 Tràng

-Tư vấn về đề cương nghiên cứu

- Viết báo cáo chuyên đề

- Đề cương nghiên cứu được thông qua

- Đạt và được nghiệm thu

Tràng Thi - Hà

Nội - Việt Nam

Thi - Hà Nội - Việt Nam

Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức

- Đào tạo cán

bộ

- Đánh giá một số chỉ tiêu tế bào gốc sinh tinh

Đào tạo 01 cán bộ

Nắm được

kỹ thuật chuyên môn

về nuôi cấy

tế bào gốc

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

a Thành viên chính

1 PGS.TS Nguyễn Đình Tảo Chủ nhiệm đề tài

2 TS Trịnh Thế Sơn Thư ký đề tài

3 PGS.TS Quản Hoàng Lâm Trung tâm CNP – Học viện Quân y

4 PGS.TS Nguyễn Viết Tiến Bệnh viện Phụ sản TW

5 TS Lê Thị Hường Cục Phòng chống HIV/AIDS, Bộ YT

6 TS Nguyễn Viết Trung Khoa sản – BV 103

7 TS Nguyễn Thanh Tùng Trung tâm CNP – Học viện Quân y

8 ThS Trịnh Quốc Thành Trung tâm CNP – Học viện Quân y

9 ThS Dương Đình Hiếu Trung tâm CNP – Học viện Quân y

10 TS Trần Hồng Sơn Trung tâm CNP – Học viện Quân y

11 ThS Đoàn Thị Hằng Trung tâm CNP – Học viện Quân y

b Cán bộ tham gia

1 Nguyễn Thị Thục Anh Trung tâm CNP – Học viện Quân y

2 Lê Thị Thanh Huyền Trung tâm CNP – Học viện Quân y

3 Nguyễn Minh Lượng Trung tâm CNP – Học viện Quân y

4 Chu Thanh Tú Trung tâm CNP – Học viện Quân y

5 Nguyễn Thị Hà Trung tâm CNP – Học viện Quân y

6 Phạm Văn Đạt Trung tâm CNP – Học viện Quân y

7 Hà Thị Dung Trung tâm CNP – Học viện Quân y

8 Lê Hải Yến Trung tâm CNP – Học viện Quân y

9 Nguyễn Thị Thu Trang Trung tâm CNP – Học viện Quân y

10 Phùng Thị Thu Hiền Trung tâm CNP – Học viện Quân y

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số

đoàn, số lượng người tham gia)

Nội dung: Nghiên cứu phân lập

và nuôi cấy các TB gốc sinh tinh

Năm 2009

Nội dung: Nghiên cứu phân lập và

nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh

Thời gian: 02 tháng

Kinh phí: theo thuyết minh

Tên tổ chức tiếp nhận:

Đại học Seoul, Hàn Quốc

Tên cán bộ Việt Nam:

ThS Dương Đình Hiếu

Thời gian: 02 tháng Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận:

Đại học Seoul, Hàn Quốc

Tên cán bộ Việt Nam:

ThS Dương Đình Hiếu

2 Năm 2010

Nội dung: Nghiên cứu nuôi cấy,

đánh giá và xác định các tế bào

gốc sinh tinh và các phương pháp

thu mẫu mô tinh hoàn

Thời gian: 02 tháng Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận:

GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức

Tên cán bộ Việt Nam:

TS Trịnh Thế Sơn

3 Năm 2010

Nội dung: Bảo quản mô tinh

hoàn và các tế bào gốc sinh tinh

Thời gian: 8 ngày

Năm 2010

Nội dung: Bảo quản mô tinh hoàn

và các tế bào gốc sinh tinh

Thời gian: 8 ngày

Kinh phí: theo thuyết minh

TS Nguyễn Viết Trung

Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận:

GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức

Tên cán bộ Việt Nam:

PGS.TS Vũ Huy Nùng, PGS.TS Nguyễn Đình Tảo,

TS Nguyễn Viết Trung

B Đoàn vào

Năm 2011

Nội dung: Chuyển giao kỹ thuật

phân lập, nuôi cấy, bảo quản mô tinh hoàn và các tế bào gốc sinh tinh

Thời gian: 8 ngày Kinh phí: Nguồn khác Tên cán bộ nước ngoài:

GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số TT Theo kế hoạch Thực tế Đạt được

1 Nội dung: Hội thảo khoa học

tổng kết kết quả thực hiện

nhiệm vụ

Thời gian: 10/2011

Địa điểm: Trung tâm Công

nghệ phôi – Học viện Quân y

Thành viên: các cán bộ khoa

học tham gia đề tài và những

người quan tâm

Nội dung: Hội thảo khoa học tổng kết kết quả thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 10/10/2011

Địa điểm: Phòng họp, Trung tâm Công nghệ phôi – Học viện Quân y Thành viên: Chủ trì hội thảo

PGS.TS Nguyễn Đình Tảo cùng các cán bộ khoa học tham gia đề tài

và những người quan tâm

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và ngoài nước)

Thời gian

Số

TT

Các nội dung, công việc

chủ yếu cần được thực hiện

(Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế

hoạch

Thực tế đạt được

Cá nhân,

tổ chức thực hiện

1 Xây dựng đề cương nghiên

cứu chi tiết

8/2008 - 10/2008

8/2008 - 10/2008

PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, PGS.TS Quản

Hoàng Lâm và nhóm nghiên cứu

12/2010

1/2009-PGS Nguyễn Đình Tảo, ThS Trịnh Quốc Thành, ThS.Dương Đình Hiếu, TS

Nguyễn Thanh Tùng

12/2010

1/2009-TS Nguyễn Thanh Tùng, ThS.Dương Đình Hiếu, ThS Đoàn Thị Hằng

- Tiến hành thăm khám tinh

hoàn, mào tinh, ống dẫn tinh

12/2010

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, PGS.TS Nguyễn Viết Tiến, TS Nguyễn Viết Trung, TS Trịnh

Thế Sơn, ThS Trịnh Quốc Thành, ThS.Dương Đình Hiếu

- Sinh thiết tinh hoàn và làm

tiêu bản cấu trúc và siêu cấu

trúc các mẫu mô tinh hoàn để

thu được các tiêu bản cấu

trúc và siêu cấu trúc

12/2010

12/2010

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, TS Nguyễn Viết Trung, TS Trịnh Thế Sơn, ThS Trịnh Quốc Thành

- Đọc tiêu bản cấu trúc và

siêu cấu trúc tinh hoàn, đánh

giá cấu trúc ống sinh tinh và

cấu trúc các tế bào dòng tinh

12/2011

12/2011

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo,

PGSTS Quản Hoàng Lâm, TS Nguyễn Thanh Tùng

3 Nội dung 2

- Nghiên cứu xây dựng quy

trình phân lập tế bào gốc sinh

tinh từ mào tinh hoàn và ống

sinh tinh

6/2011

6/2011

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo,

PGS.TS Quản Hoàng Lâm, TS Nguyễn Thanh Tùng

4 Nội dung 3

- Nghiên cứu xây dựng qui

trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào

gốc sinh tinh

6/2011

6/2011

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo,

PGS.TS Nguyễn Viết Tiến,

PGS.TS Quản Hoàng Lâm, TS Trịnh Thế Sơn

5 Nội dung 4

- Đánh giá chất lượng, tiêu

chuẩn các tế bào sau nuôi cấy

bao gồm: hình thái, số lượng,

6/2011

1/2009-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo

PGS.TS Quản Hoàng Lâm, PGS.TS Nguyễn Viết Tiến, TS Nguyễn Thanh Tùng, TS Trịnh Thế Sơn

6 Xử lý số liệu

5/2011-6/2011

6/2011

5/2011-TS Nguyễn Thanh Tùng, TS Trịnh Thế Sơn

8/2011-11/2011

11/2011

8/2011-PGS.TS Nguyễn Đình Tảo,

PGS.TS Quản Hoàng Lâm

Đình Tảo, PGS.TS Quản Hoàng Lâm

III SẢN PHẨN KH CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Tinh trùng được nuôi cấy,

biệt hoá từ tế bào gốc có

nguồn gốc từ ống sinh tinh

Mẫu 50 50 50

2 Tinh trùng được nuôi cấy,

biệt hoá từ tế bào dòng tinh

có nguồn gốc từ mào tinh

Mẫu 50 50 50

1 Qui trình: Thu gom, phân

lập tế bào gốc sinh tinh từ

ống sinh tinh

Đủ về số lượng

2 Qui trình: Thu gom, phân

lập tế bào dòng tinh từ mào

tinh

Đủ về số lượng

3 Qui trình: Nuôi cấy, biệt

hóa tế bào gốc sinh tinh từ

ống sinh tinh

Đủ về số lượng

4

Qui trình: Nuôi cấy, biệt

hóa tế bào dòng tinh từ mào

tinh

Đủ về số lượng

5 Tiêu chuẩn đánh giá tế bào

gốc sinh tinh và tinh trùng

sau nuôi cấy

Đủ về số lượng

6 Qui trình: Qui trình bảo

quản các tế bào gốc sinh

tinh

Đủ về số lượng

Thực tế đạt được

Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản)

1 Kết quả điều trị vô

sinh nam do không

Trung tâm Công

tr 22-25

d Kết quả đào tạo:

Kết quả

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế

hoạch

Thực tế đạt được

Số lượng, nơi công bố (Thời gian kết thúc)

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1

Phương pháp phân lập tế

bào gốc sinh tinh từ ống

sinh tinh của tinh hoàn

Đã có QĐ chấp nhận đơn hợp lệ của Cục Sở hữu trí tuệ

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a Hiệu quả về khoa học công nghệ:

- Xác định được các đặc điểm cấu trúc và siêu cấu trúc ống sinh tinh của các bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) bao gồm cả azoospermia do tắc và không do tắc

- Xác định được qui trình phân lập các tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh

- Xác định sự biến đổi của các tế bào dòng tinh trong môi trường nuôi cấy

- Xác định khả năng thụ tinh của tinh trùng và tinh tử trưởng thành sau nuôi cấy và hiệu quả của việc nuôi cấy các tế bào dòng tinh trong điều trị vô sinh

- Trên cơ sở đó đề xuất các biện pháp điều trị Kết quả nuôi cấy các tế bào dòng tinh không chỉ được áp dụng trong điều trị cho các bệnh nhân azoospermia mà còn được áp dụng cho các bệnh nhân sau điều trị hóa chất, tia xạ, áp dụng trong quá trình bảo vệ các loài vật quí hiếm

b Hiệu quả về kinh tế xã hội:

- Người được hưởng lợi trực tiếp là các cặp vợ chồng vô sinh, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc Qua đó đề tài có đóng góp hết sức

to lớn về mặt nhân văn và kinh tế xã hội cho Việt Nam

- Mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh nhân không có tinh trùng, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc Qui trình khoa học còn được

áp dụng trong giải quyết vấn đề sinh sản cho các bệnh nhân nam sau tia xạ, hóa chất

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:

I Báo cáo định kỳ

Lần 1 15/9/2009 Đã thực hiện đủ nội dung

đặt ra theo tiến độ và hợp đồng

Lần 2 15/03/2010 Đã thực hiện đủ nội dung

đặt ra theo tiến độ và hợp đồng

Lần 3 15/9/2010 Đã thực hiện đủ nội dung

đặt ra theo tiến độ và hợp đồng

Lần 4 15/03/2011 Đã thực hiện đủ nội dung

đặt ra theo tiến độ và hợp đồng

đặt ra theo tiến độ và hợp đồng

II Kiểm tra định kỳ

Lần 1 15/9/2009 Kết luận của đoàn kiểm tra:

các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng

Lần 2 15/03/2010 Kết luận của đoàn kiểm tra:

các nội dung hoàn thành

theo đúng hợp đồng

Lần 3 15/9/2010 Kết luận của đoàn kiểm tra:

các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng

Lần 4 15/03/2011 Kết luận của đoàn kiểm tra:

các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng

Lần 5 7/7/2011 Kết luận của đoàn kiểm tra:

các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng

III Nghiệm thu Quy trình 4/11/2011 Đạt yêu cầu 5/5 = 100%

IV Nghiệm thu cơ sở 30/11/2011 Đạt yêu cầu 7/7 = 100%

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký) (Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

PGS TS Nguyễn Đình Tảo

MỤC LỤC

Nội dung Trang CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 28 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31

2.1 Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh 31 2.2 Tổng quan về tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh 41 2.3 Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trong quá trình nuôi cấy 57 2.4 Về bảo quản tế bào dòng tinh 73 CHƯƠNG III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 85 3.1 Đối tượng nghiên cứu: 85 3.2 Phương pháp nghiên cứu 86 3.3 Trang bị, hóa chất 102 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 105 4.1 Nghiên cứu về phân lập tế bào dòng tinh từ mào tinh 105 4.2 Nghiên cứu về phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh 107 4.3 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào dòng tinh 111 4.3.1 Đặc điểm bệnh nhân 111 4.3.2 Đặc điểm cấu trúc ống sinh tinh của các bệnh nhân azoospermia 1114.3.3 Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh từ mào tinh trong quá trình nuôi cấy 1124.3.4 Biến đổi số lượng các tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh trong

quá trình nuôi cấy 1154.3.5 Đánh giá tế bào gốc sinh tinh bằng GPF 1214.3.6 Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kỹ thuật FISH 1234.3.7 Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kính hiển vi điện tử 1254.3.8 Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ

thuật ICSI trên thực nghiệm (n = 100 noãn): 126

4.3.9 Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ

thuật ICSI trên lâm sàng (n = 125 noãn): 1274.4 Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 129 4.4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 1304.4.2 Thể tích tinh hoàn 1304.4.3 Kết quả nghiên cứu trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ mào tinh 1314.4.4 Kết quả nghiên cứu trữ lạnh mô tinh hoàn 1324.5 Các qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh 138 CHƯƠNG V BÀN LUẬN 157 5.1 Về lựa chọn bệnh nhân qua xét nghiệm mất đoạn nhỏ ở vùng AZF trên NST

Y 157 5.2 Về quá trình phân lập tế bào gốc sinh tinh 163 5.3 Nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ mào tinh 164 5.4 Nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh 165 5.5 Vai trò của tế bào Sertoli trong nuôi cấy 166 5.6 Phương pháp nuôi cấy 166 5.7 Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy 167 5.8 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 168 5.9 Thể tích tinh hoàn và tế bào gốc sinh tinh lập 168 5.10 Trữ lạnh các tế bào dòng tinh thu nhận từ mào tinh 169 5.11 Trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh trong mô tinh hoàn của bệnh nhân 176 KẾT LUẬN 182 KIẾN NGHỊ 184 TÀI LIỆU THAM KHẢO 185 PHỤ LỤC 201

- Danh sách bệnh nhân PESA, MESA

- Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh và mô tinh hoàn

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ART Assisted Reproductive Technology (Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản)

AID Artificial insemination by donor (Thụ tinh nhân tạo bằng tinh

trùng của người cho)

CPA Cryoprotective agents: Các chất bảo vệ tế trong quá trình đông lạnh

AZF Azoospermic factor

CS Cộng sự

CSF Cryosurvival factor: chỉ số sống sau trữ lạnh của tinh trùng

DMSO Dimethyl sulphoxide

G Glycerol

HE Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin- Eosin

IVF In Vitro Fertilization (Thụ tinh trong ống nghiệm)

ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection (Tiêm tinh trùng vào trong bào

tương trứng)

NOA Non-Obstructive Azoospermia

MESA Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration

OA Obstructive Azoospermia

PESA Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration

TESE Testicular Sperm Extraction

TEM Transmission electron microscopy: Kính hiển vi điện tử truyền qua TTTON Thụ tinh trong ống nghiệm

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới )

DANH MỤC BẢNG

Nội dung Trang

Bảng 4.1 Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các nhóm bệnh nhân 105Bảng 4.2 Nồng độ một số hormone của bệnh nhân 105Bảng 4.3 Kết quả thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh 106Bảng 4.4 Tuổi và thời gian vô sinh của bệnh nhân nghiên cứu 111Bảng 4.5 Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm

nuôi cấy trong môi trường không bổ sung các hormone 113Bảng 4.6 Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm

nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các hormone 114Bảng 4.7 So sánh kết quả nuôi cấy các tế bào ở mào tinh trong môi trường nuôi

cấy có bổ sung và không bổ sung các hormone 114Bảng 4.8 Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh chuột trong môi trường nuôi

cấy 116Bảng 4.9 Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh người trong môi trường nuôi

cấy 118Bảng 4.10 Khả năng thụ tinh của tinh tử chuột sau nuôi cấy 126Bảng 4.11 Sự phát triển phôi chuột ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy 126Bảng 4.12 Sự phát triển phôi chuột ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy 127Bảng 4.13 Khả năng thụ tinh của tinh tử sau nuôi cấy 127Bảng 4.14 Sự phát triển phôi ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy 128Bảng 4.15 Sự phát triển phôi ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy 129Bảng 4.16 Tuổi, thời gian vô sinh của bệnh nhân 130Bảng 4.17 Đặc điểm thể tích tinh hoàn của bệnh nhân nghiên cứu 130Bảng 4.18 Kết quả độ di động của tinh trùng thu nhận từ mào tinh trước, sau trữ

lạnh và nuôi cấy 131Bảng 4.19 Tỉ lệ sống của tinh trùng trước trữ lạnh và sau rã đông 131

Bảng 4.20 Hình thái tinh trùng trước và sau rã đông 132Bảng 4.21 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh nhóm sử dụng chất bảo quản

Glycerol (Sperm freeze) 133Bảng 4.22 Kết quả sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng Glycerol (Sperm Freeze) 133Bảng 4.23 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh ở nhóm sử dụng chất bảo quản

DMSO 135Bảng 4.24 Kết quả sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng DMSO 135Bảng 4.25 Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh trong môi trường trước và

sau bảo quản bằng DMSO 137Bảng 5.1 Kết quả độ di động, tỉ lệ sống của tinh trùng thu nhận từ mào tinh

trước và sau trữ lạnh của các tác giả 172

DANH MỤC HÌNH

Nội dung Trang

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình sinh tinh trùng 58Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc một phần ống sinh tinh của người bình thường 60Hình 2.3 Cấu trúc ống sinh tinh của người bình thường (x600) 66Hình 2.4 Cấu trúc ống sinh tinh BN do tắc (nhuộm HE, X600) 66Hình 2.5 Cấu trúc ống sinh tinh BN không do tắc (nhuộm HE, x600) 67Hình 2.6 Các tế bào dòng tinh từ bệnh nhân azoospermia không do tắc 68Hình 2.7 Hình ảnh ống sinh tinh và các tế bào thu được khi tách từ ống

sinh tinh 69Hình 2.8 Các tế bào dòng tinh nuôi cấy 70Hình 2.9 Các tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy đang phân chia giảm phân chụp dưới

kính hiển vi điện tử 71Hình 4.1 Mẫu mô tinh hoàn sau thu hồi 107Hình 4.2 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia cắt ngang (HE, x400) 107Hình 4.3 Các tế bào sau phân lập bằng cách 1 (soi nổi, x100) 108Hình 4.4 Các tế bào sau phân lập bằng cách 3 (soi nổi, x100) 109Hình 4.5 Các tế bào gốc sinh tinh thu từ môi trường nuôi cấy 109Hình 4.6 Hệ thống phân lập tế bào dựa vào lực từ tính (MACS) 110Hình 4.7 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia do tắc (HE, x600) 111Hình 4.8 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia không do tắc (HE, x600) 112Hình 4.9 Các tinh tử được phân lập (x600) 115Hình 4.10 Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x100 117Hình 4.11 Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x400 118Hình 4.12 Ngày 1 nuôi cấy x400 trên vi trường chỉ thấy tinh nguyên bào và tinh

bào 1 119Hình 4.13 Hình ảnh nuôi cấy 10 ngày x600 120

Hình 4.14 Các tế bào dòng tinh sau 20 ngày nuôi cấy 120Hình 4.15 Hình ảnh các tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy với GFP x400 122Hình 4.16 Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X và NST Y 123Hình 4.17 Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X và NST Y 124Hình 4.18 Hình ảnh tinh tử tròn dưới kính hiển vi điện tử x5000 125Hình 4.19 Hình ảnh tinh tử đã kéo dài x3000 125Hình 4.20 Tinh trùng trong nhuộm Papanicolaou (x1000) 132Hình 4.21 Mô tinh hoàn tổn thương nặng sau trữ lạnh bằng Glycerol (x200) 134Hình 4.22 Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản Glycerol (x400) 134Hình 4.23 Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản DMSO (x400) 136Hình 4.24 Siêu vi thể đầu tinh trùng sau trữ lạnh sử dụng DMSO x5000 136

CHƯƠNG I

MỞ ĐẦU

Theo các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam, thì tỷ lệ vô sinh chung từ 5

- 13%, trong đó vô sinh nam chiếm khoảng 40% [4] Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam Trong đó nguyên nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm khoảng 10-20% và là nguyên nhân khó điều trị nhất

Ở Việt Nam, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã được áp dụng một cách có hiệu quả và đã mang lại hạnh phúc cho hàng ngàn cặp vợ chồng vô sinh Cùng với sự phát triển chung của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản của thế giới, các kỹ thuật mới đã được triển khai và điều trị cho vô sinh nam và vô sinh nữ như các kỹ thuật IVF, ICSI, các kỹ thuật thu tinh trùng cho các bệnh nhân không

có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia)

Trong điều trị vô sinh nam, mặc dù có nhiều tiến bộ, nhưng đối với các bệnh nhân azoospermia, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không

do tắc thì hầu như phải xin tinh trùng Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới Trong đó phân lập các tế bào gốc sinh tinh là một bước quan trọng, là cơ sở cho những bước tiếp theo Đã có nhiều tài liệu công bố về nhiều phương pháp phân lập các tế bào dòng tinh khác nhau Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm khác nhau

Ngày nay, với các thành tựu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, các bệnh nhân azoospermia có thể có con của chính mình bằng tinh trùng thu được từ mào tinh hay ống sinh tinh Tuy nhiên, các trường hợp không có tinh trùng trong ống sinh tinh và mào tinh vẫn chờ đợi và gặp nhiều khó khăn để có đứa

con của chính mình Trước sự phát triển của khoa học và công nghệ trên thế giới, đã biến những cái không thể thành có thể, nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào dòng tinh Từ đó nhờ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm-tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (IVF-ICSI) đã hé mở những hy vọng mới cho những trường hợp không có tinh trùng không do tắc (non-obstructive azoospermia)

Nuôi cấy các tế bào dòng tinh (In Vitro culture of Spermatogenesis cells): là phương pháp điều trị có nhiều triển vọng trong tương lai cho các bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch không do tắc NOA (Non Obstructive Azoospermia) Hiện nay trên thế giới một số tác giả đã tiến hành nuôi cấy và đã có được một số thành công bước đầu Để nâng cao hiệu quả, tính an toàn của phương pháp này, chúng tôi tiến hành phân lập, nuôi cấy tế bào gốc sinh tinh Kết quả bước đầu cho thấy tế bào gốc sinh tinh phát triển trong môi trường nuôi cấy, phân chia giảm nhiễm tạo thành các tinh tử tròn, tinh tử đang kéo dài và tinh tử đã kéo dài Tuy nhiên chất lượng tế bào này như thế nào là vấn đề còn tiếp tục được nghiên cứu

Trữ lạnh các tế bào dòng tinh nói chung và tế bào gốc sinh tinh nói riêng giúp cho việc bảo tồn khả năng sinh sản cho nam giới trước khi điều trị các bệnh ác tính bằng phẫu thuật, hoá chất, tia xạ cũng như một số bệnh lý mạn tính như tiểu đường, rối loạn miễn dịch Ngoài ra trữ lạnh tinh trùng lấy

từ mào tinh và mô tinh hoàn giúp cho tránh khỏi sinh thiết tinh hoàn nhiều lần

dế gây ra các biến chứng và tạo áp lực lớn về tâm lý cho bệnh nhân [26] Việc trữ lạnh tinh trùng đã trở thành thường qui trong các trung tâm hỗ trợ sinh sản, tuy nhiên việc trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh còn nhiều vấn đề còn tiếp tục nghiên cứu

Ðây là một nghiên cứu có khoa học, tính nhân văn Kết hợp với quá trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh, mở ra triển vọng cho những bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch có thể có cơ hội có

những đứa con của chính mình Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài với 3 mục tiêu như sau:

1 Xây dựng qui trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh ở bệnh nhân nam giới vô sinh do không có tinh trùng,

2 Xây dựng qui trình bảo quản, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh thành tinh trùng,

3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và tinh trùng được biệt hoá từ tế bào gốc sinh tinh

Mục tiêu cụ thể là xây dựng các qui trình và tiêu chí đánh giá tế bào như sau:

1 Qui trình thu gom, phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,

2 Qui trình thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh từ mào tinh,

3 Qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,

4 Qui trình nuôi cấy, biệt hóa các tế bào dòng tinh từ mào tinh,

5 Tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và các tế bào dòng tinh sau nuôi cấy,

6 Qui trình bảo quản các tế bào gốc sinh tinh

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh

Thông thường người ta chia azoospermia làm 2 loại là azoospermia do tắc (obstructive azoospermia) và azoospermia không do tắc (non-obstructive azoospermia)

Azoospermia do tắc: nhóm bệnh nhân này bao gồm bệnh nhân thắt ống dẫn tinh, không có ống dẫn tinh, biến chứng tắc ống dẫn tinh sau các phẫu thuật, tắc hệ thống dẫn tinh sau các viêm nhiễm Ở các bệnh nhân này, trong tinh hoàn vẫn xảy ra quá trình sinh tinh bình thường

Azoospermia không do tắc: là nhóm bệnh nhân mà không thể thu được tinh trùng từ mào tinh Ở các bệnh nhân này, trong tinh hoàn không xảy ra quá trình sinh tinh bình thường [4]

Ngày nay, đối với các bệnh nhân azoospermia do tắc (obstructive azoospermia), bệnh nhân có thể thu tinh trùng từ mào tinh hoặc tinh hoàn để tiến hành làm phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

(intracytoplasmic sperm injection- ICSI) Kỹ thuật ICSI được thực hiện thành

công trên thế giới vào năm 1992 [17] Hiện nay, kỹ thuật ICSI có thể áp dụng cho tất cả trường hợp vô sinh do nam giới, trừ những trường hợp hoàn toàn không có tinh trùng trong ống sinh tinh ICSI có thể thực hiện với tinh trùng

từ tinh dịch, tinh trùng hút từ mào tinh hay tinh trùng sinh thiết từ tinh hoàn Hiện nay, ICSI được xem là phương pháp điều trị vô sinh nam hiệu quả nhất,

tỉ lệ có thai của một chu kỳ điều trị thường trên 30%

Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc (non-obstructive azoospermia), một số ít bệnh nhân vẫn có thể thu được tinh trùng từ ống sinh tinh nhờ phương pháp TESE hoặc micro-TESE Các bệnh nhân còn lại phải xin tinh trùng, lượng bệnh nhân loại này rất lớn

Bên cạnh đó, hàng năm có rất nhiều bệnh nhân nam giới bị ung thư các loại khác nhau, đặc biệt là giai đoạn trước tuổi dậy thì, các bệnh nhân này không thể có tinh trùng để lưu trữ giống như các bệnh nhân trưởng thành Sau quá trình điều trị hóa chất và phóng xạ, các bệnh nhân này sẽ trở thành vô sinh thứ phát, không có khả năng có con sau này Việc phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh của các bệnh nhân này và lưu trữ các tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa rất quan trọng không chỉ đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc và còn rất quan trọng đối với các bệnh nhân nam giới trước tuổi dậy thì sau quá trình điều trị ung thư, mở ra hy vọng có con cho họ sau này

+ Lớp áo xơ bao phủ ống sinh tinh gồm vài lớp nguyên bào sợi và nguyên bào sợi - cơ

+ Thành ống tạo nên bởi 2 loại tế bào: tế bào Sertoli và các tế bào dòng tinh, các tế bào dòng tinh xếp thành 4 - 8 lớp kể từ màng đáy cho đến lòng ống sinh tinh, bao gồm: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II, tinh tử và tinh trùng

* Các tế bào dòng tinh

Tinh nguyên bào nằm thành một lớp trên màng đáy, đó là tế bào tương đối nhỏ, kích thước khoảng 12 µm và nhân có nhiều hạt nhiễm sắc Trong bào tương có bộ máy Golgi nhỏ, các ty thể hình cầu và rất nhiều Ribosom tự do Trong thời kỳ trưởng thành các tinh nguyên bào trải qua một loạt quá trình gián phân Kết quả, chúng tạo thành các tế bào giống như các tế bào ban đầu gọi là tinh nguyên bào nhóm A, đây là nguồn duy trì tiếp tục của tinh nguyên bào Chúng cũng có thể phân chia và phát triển thành tế bào lớn hơn tinh nguyên bào lúc đầu gọi là tinh nguyên bào nhóm B, các tế bào này tiếp tục phát triển trở thành tinh bào I

Ngay sau khi được tạo thành, các tinh nguyên bào nhóm B bước vào kỳ đầu lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân, lúc này các tinh bào I có

46 nhiễm sắc thể Quá trình phát triển của tinh bào I kéo dài đến hết lần 1 của giảm phân, dài 22 ngày Tinh bào I có kích thước lớn nhất trong các tế bào dòng tinh và đặc trưng bởi sự có mặt của các nhiễm sắc thể ở các giai đoạn khác nhau của quá trình xoắn bên trong nhân tế bào

Qua lần giảm phân đầu tiên, tinh bào I trở thành các tế bào nhỏ hơn, gọi

là tinh bào II Tinh bào II có 23 nhiễm sắc thể Tinh bào II rất khó quan sát trên tiêu bản tinh hoàn vì chúng tồn tại trong thời gian rất ngắn, rồi tham gia quá trình giảm phân thứ hai

Kết quả của quá trình phân chia tinh bào II tạo ra tiền tinh trùng Đó là các

tế bào có kích thước nhỏ, đường kính 7 – 8 µm, có một hạt nhân với vùng nhiễm sắc thể dày đặc Vị trí của tiền tinh trùng là ở gần lòng ống sinh tinh

Tiền tinh trùng phải trải qua một quá trình biệt hoá phức tạp gọi là quá trình tạo tinh trùng, bao gồm các quá trình như sau:

- Bất hoạt bộ gen để bảo toàn sự hoạt động của toàn bộ gen sau này

- Nhiễm sắc thể đóng xoắn lại, thuận lợi cho quá trình di chuyển và làm nhân nhỏ lại Cụ thể trong quá trình này, histone ở nhân được thay thế bằng protamine, đây là chất giúp sắp xếp lại chuỗi ADN ở nhân gọn hơn Nhân tế bào tinh tử nhỏ lại và nằm sau thể cực đầu Sau khi thụ tinh, các protamine ở nhân tinh trùng lại được thay thế bằng histone Tesarik và CS (2000) cho rằng: sự thiếu hụt protamine sẽ cản trở quá trình hoàn thiện nhân trong giai đoạn này [113]

- Sự hình thành các bộ phận làm thuận lợi cho sự tự vận động của tinh trùng như đuôi được hình thành, đồng thời loại bớt bào tương, một trung thể

sẽ đến gắn vào 1 cực của nhân tinh trùng, đối diện với cực có cực đầu, để hình thành sợi trục Các ty thể sẽ biệt hóa thành những cấu trúc hình ống, xếp dọc theo sợi trục, đóng vai trò là cơ quan tạo năng lượng cho hoạt động của đuôi tinh trùng

- Biệt hoá các cấu trúc giúp tinh trùng nhận diện được noãn và có khả năng thụ tinh được với noãn như hình thành cực đầu Kết thúc quá trình này, tinh trùng được hình thành có hình dạng và cấu trúc đặc thù ở mức độ biệt hoá cao và được giải phóng vào lòng ống sinh tinh

Khoảng thời gian của quá trình từ tinh nguyên bào biệt hoá thành tinh trùng là 72 ngày Tuy nhiên để trưởng thành hoàn toàn về mặt chức năng, tinh trùng phải trải qua một giai đoạn cuối cùng tại mào tinh khoảng 12 - 21 ngày Quá trình sinh tinh xảy ra không đồng thời cũng không đồng bộ ở các ống

sinh tinh Điều này giải thích tại sao có thể gặp tinh trùng ở một số nơi của ống sinh tinh, trong khi đó lại gặp tiền tinh trùng ở chỗ khác [1]

* Tế bào Sertoli

Tế bào Sertoli là một trong 2 loại tế bào cấu tạo nên biểu mô ống sinh tinh Hiện nay, tế bào Sertoli được xác định có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hoá cơ quan sinh dục trong giai đoạn phôi thai Đặc biệt, tế bào Sertoli có vai trò rất lớn quyết định đến quá trình sinh tinh của tinh hoàn

2.1.3 Quá trình sinh tinh

Quá trình sinh tinh trải qua 3 giai đoạn sau:

+ Sinh tinh bào: là quá trình tinh nguyên bào phân chia, tạo ra tinh bào + Giảm phân: sản xuất ra các tế bào tiền tinh trùng hay còn gọi là tinh tử + Tạo tinh trùng: là quá trình biệt hoá tiền tinh trùng thành tinh trùng

2.1.4 Các tế bào gốc sinh tinh

Tế bào gốc (stem cell) là quần thể các tế bào có khả năng tự phân chia

và tự đổi mới vô hạn định, ngoài ra còn có khả năng biệt hoá thành nhiều dạng tế bào của các mô khác nhau

Các tế bào gốc phôi, có ở phôi vào khoảng từ 3 đến 5 ngày sau thụ tinh Các tế bào này có khả năng tăng sinh vô hạn định và có thể tự biệt hoá thành tất

cả các dạng mô trong cơ thể Vì vậy, các tế bào này được gọi là tế bào gốc vạn

năng (có khả năng biệt hoá thành dạng mô bất kỳ - pluripotent stem cell) [20]

Các tế bào gốc trưởng thành thì có tính đặc hiệu mô hơn, khả năng phân chia và biệt hóa ít hơn Do đó, các tế bào này được gọi là tế bào gốc đa

năng (chỉ có khả năng biệt hoá thành một số dạng mô cụ thể với số lượng hạn chế – multipotent stem cell) [18]

Tính “thường biến” của tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành là

do các tế bào này có khả năng biệt hoá thành nhiều mô khác biệt với nguồn gốc ban đầu của chúng Vì vậy có khả năng phát triển qua lớp mầm phôi Khả năng tự tái tạo của tế bào gốc là đặc điểm rất quan trọng của chúng Do đó các

tế bào gốc là nguồn tế bào chưa biệt hoá sơ khai Ngược lại, hầu hết tế bào sinh dưỡng có khả năng tự tái tạo hạn chế do đoạn cuối (telomere) của thể nhiễm sắc bị co ngắn lại [35]

Hiện nay chúng ta có thể thu được tế bào gốc từ nhiều nguồn khác nhau Khả năng tạo ra nhiều chuỗi thế hệ của tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành đã được nghiên cứu và mô tả kỹ lưỡng qua nhiều nghiên cứu khoa học Cho dù tiềm năng của tế bào gốc phôi là vô cùng to lớn, nhưng việc

sử dụng các tế bào này gây ra nhiều vấn đề đạo đức đang còn tranh cãi Do vậy, đã có nhiều đề xuất dùng các tế bào gốc không phải từ phôi mà được lấy

từ chất đệm tuỷ xương, mô mỡ, bì, máu dây rốn và đặc biệt là trong các ống sinh tinh làm nguồn tế bào có nhiều ứng dụng Những tế bào này có thể biệt hoá thành tế bào sụn, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo xương, nguyên bào cơ, tế bào

cơ tim, tế bào thần kinh đệm hình sao, tế bào gân và tinh tử, thậm chí tinh trùng trong điều kiện in vitro và trải qua quá trình biệt hoá in vivo và điều đó làm cho các tế bào gốc này được coi là những nguồn tế bào đầy triển vọng cho việc sửa chữa khuyết tật ở trung phôi bì và phòng ngừa bệnh tật Đặc biệt việc phân lập và nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh sẽ mở ra hy vọng mới cho các bệnh nhân azoospermia không do tắc và các bệnh nhân ung thư nam trẻ tuổi sau điều trị hóa chất và tia xạ

Ở người và động vật nhóm linh trưởng, Tinh nguyên bào có 2 loại là tinh nguyên bào A và tinh nguyên bào B Tinh nguyên bào A phân chia để tạo thành tinh nguyên bào Apale và tinh nguyên bào Adark Tinh nguyên bào Apalelại tiếp tục phân chia, ở người tế bào này cứ 16 ngày lại phân chia 1 lần Tinh nguyên bào Adark là nguồn dự trữ tế bào gốc Một nghiên cứu về tinh nguyên bào, khi cho khỉ rhesus chiếu xạ, người ta nhận thấy số lượng tinh nguyên bào

Apale giảm sau 9 ngày chiếu xạ, trong khi đó số lượng tinh nguyên bào Adark không đổi Điều này cho thấy được sự khác nhau giữa khả năng phân chia tế bào của các tế bào này Vì tia xạ chỉ phá hủy các tế bào đang phân chia Khi

có sự thiếu hụt tế bào, tinh nguyên bào Adark mới biến thành tinh nguyên bào

Apale và tiếp tục phân chia Như vậy sự nằm im, không phân chia của tinh nguyên bào Adark có chức năng giữ cho AND không bị tổn thương (khác với động vật không phải linh trưởng) [3]

Vì vậy việc phân lập tốt các tế bào này rất quyết định đến khả năng thành công sau nuôi cấy và cấy ghép sau này [17]

Các tế bào gốc sinh tinh là các tế bào nằm sát với màng đáy của ống sinh tinh Tế bào có nhân hình oval, hạt nhân nằm sát với màng nhân Bào tương sẫm màu với bộ máy Golgi nhỏ, ít ty thể và nhiều Ribosom tự do Ngày nay các nghiên cứu cho thấy CD24 và CD9 (CD9 còn có ở các tế bào gốc ở vị trí khác) có ở tế bào gốc sinh tinh, không có CD34 [25]

Theo Shosei Yoshida, 2010 tỷ lệ các tế bào gốc sinh tinh của biểu mô ống sinh tinh rất ít chỉ chiếm < 1% tổng số tế bào Hiện nay người ta đã nghiên cứu và nhận thấy có rất nhiều gen quyết định quá trình sinh tinh như gen Plzf, một gen ức chế (transcriptional repressor) Nếu chuột mất gen này thì quá trình sinh tinh không bình thường Ngoài ra gen Bcl6b cũng giúp cho việc duy trì sự tồn tại các stem cell Ngoài ra các gen khác khi bị biến đổi cũng làm thay đổi như Taf4b, Utp14b Nhưng gen Etv5 ngoài tác động lên tế bào stem cell còn tác động đến tế bào Sertoli Gần đây người ta nhận thấy gen nanos2 có vai trò then chốt trong việc duy trì và phát triển của stem cell [122]

Ở người tinh nguyên bào Adark được biết đến là tế bào có chức năng dự trữ, rất ít phân chia trong điều kiện bình thường Tinh nguyên bào Apale có chức năng sinh ra các tế bào tiếp theo đó là tinh nguyên bào B; để sau đó thành tinh bào [8]

Tanaka Atsushi, 2003 cho rằng tiêu chuẩn chọn tinh bào: đó là các tế bào hình tròn, đường kính từ 12-15µm Mito Kanatsu-Shinohara, 2004 cho rằng CD9 chính là marker bề mặt để phát hiện các tinh nguyên bào ở chuột [22], [104]

2.1.5 Mào tinh

Ống mào tinh là một ống đơn, cong queo, độ dài khoảng 4 - 6m Chính ống này cùng mô liên kết xung quanh và mạch máu tạo nên thân và đuôi của mào tinh hoàn Biểu mô của mào tinh hoàn là biểu mô trụ cao giả tầng, gồm

có các tế bào đáy hình tròn và tế bào chính hình trụ Các tế bào này nằm trên màng đáy và bao quanh bên ngoài màng đáy là các tế bào cơ trơn và mô liên kết lỏng lẻo giàu mạch máu Sự co bóp của tế bào cơ trơn giúp tinh trùng di chuyển dọc theo chiều dài của ống Bề mặt của tế bào chính có các vi nhung mao dài, không đều gọi là stereocilia Các vi nhung mao này không có cả thể gốc lẫn cấu trúc vi ống ở bên trong, trái lại, lông chuyển bình thường thì lại có

cả hai cấu trúc trên Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, trong bào tương của tế bào chính, lưới nội bào có hạt phát triển phong phú và bộ Golgi lớn nằm bao quanh nhân không có hạt chế tiết trong bào tương Các tế bào chính tiết glycerophosphocholine, chất có thể ức chế quá trình tạo chất (Capacitation), một quá trình chuẩn bị cho tinh trùng để thụ tinh Đồng thời các tế bào này cũng sản xuất ra glycoprotein, mà glycoprotein này gắn chặt vào màng bào tương của tinh trùng nhưng chức năng của hiện tượng này chưa

rõ Biểu mô của ống mào tinh tham gia vào quá trình hấp thu và tiêu hoá các chất thải được bài tiết ra trong quá trình sinh tinh Các tế bào đáy nhìn chung

là không được biệt hoá và có thể là tiền thân của tế bào chính Bao xung quanh biểu mô là lớp tế bào cơ trơn, mà càng về cuối ống mào tinh thì càng trở nên dày hơn Sự co bóp của tế bào cơ trơn có tác dụng đẩy tinh trùng ra ngoài ống mào tinh Chính vì vậy tại ống mào tinh không có các tế bào gốc sinh tinh [1], [4], [14]

2.1.6 Các phương pháp phân lập tế bào gốc sinh tinh

Việc nghiên cứu phân lập các tế bào gốc sinh tinh đã có từ thập kỷ 60 của thế kỷ XX [47] Cho đến nay đã có nhiều phương pháp phân lập tinh nguyên bào khác nhau, với kết quả cũng rất khả quan

2.1.6.1 Phương pháp Percoll

- Được các tác giả Bucci và CS, 1986; Morena và CS, 1996, Koh và

CS, 2004 thực hiện theo nguyên lý các tế bào có kích thước khác nhau sẽ bị giữ lại khi đi qua lớp Percoll có nồng độ khác nhau [19] Theo phương pháp này, tỉ lệ làm giầu tinh nguyên bào có thể lên đến trên 80% Tuy đây là phương pháp có hiệu quả chưa cao, nhưng dễ áp dụng

2.1.6.2 Phương pháp STAPUT

- Được Dirami và CS thực hiện 1999 Đây là phương pháp phân lập tinh nguyên bào có dùng các enzyme EDTA-trypsin và DNase I để tách rời các tế bào ở biểu mô ống sinh tinh Sau đó, các tế bào được đưa vào buồng phân tách tế bào (Staput chamber) với nguyên lý hoạt động dựa vào trọng lượng khác nhau của các loại tế bào Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp không cao [19]

2.1.6.4 Phương pháp sử dụng màng nền (màng đáy – laminin)

Phương pháp này được Pasi P tiến hành vào năm 1985, theo nguyên lý các tinh bào và tế bào Sertoli bám vào màng đáy khi nuôi cấy còn các tinh nguyên bào thì không bám vào màng đáy, do đó nổi lên trên Theo một số tác giả hiệu quả của phương pháp này có thể đạt 80 – 95%, do vậy đây là phương pháp phân lập tế bào gốc sinh tinh khá hiệu quả và dễ thực hiện [92]

2.1.6.5 Phương pháp dùng lực từ tính MACS

Phương pháp MACS (Magnetic cell sorting) do Von Schonfeldt và CS thực hiện 1999; Vander Wee và CS thực hiện 2001; Buageaw và CS thực hiện