Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyên hóa di truyền ở trẻ em

Đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình nghiên cứu 2. Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người 3. Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người bằng phản ứng miễn dịch tế bào 4. Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt trắng.

BỘ Y TẾ -

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN

BỘ Y TẾ

-

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN HÓA DI TRUYỀN Ở

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tế bào gốc 5

1.1.1 Định nghĩa 5

1.1.2 Phân loại 5

1.1.3 Tiềm năng ứng dụng 6

1.2 Tế bào gan phôi thai người 8

1.2.1 Định nghĩa 8

1.2.2 Nguồn gốc và đặc điểm 8

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng 10

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước ghép tế bào gan 11

1.3.1 Nghiên cứu ở nước ngoài 11

1.3.2 Nghiên cứu tại Việt Nam 12

CHƯƠNG II: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phân lập tế bào gan phôi thai người 13

2.2.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 14

2.2.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang 14

2.2.4 Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro 15

2.2.5 Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm 15

2.2.6 Mô và tế bào học 16

2.2.7 Thu thập và phân tích số liệu 16

2.3 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 16

3.1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 17

3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 17

3.1.2 Quy trình xử lý và phân lập tế bào gan phôi thai người 17

3.1.3 Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người 19

3.1.4 Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang 20

3.1.5 Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST 21

3.1.6 Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm 22

3.1.7 Quy trình phân tích mô và tế bào học 24

3.1.8 Thu thập và phân tích số liệu 24

3.2 Kết quả phân lập tế bào gan phôi thai người 25

3.3 Kết quả nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 25

3.4 Kết quả hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào 27

3.5 Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST 28

3.6 Ghép tế bào gan vào mô hình chuột thí nghiệm 29

3.7 Phân tích mô bệnh học 32

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 34

4.1 Phân lập tế bào gan phôi thai người 34

4.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 34

4.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào 35

4.4 Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST 36

4.5 Ghép tế bào gan trên mô hình chuột thí nghiệm 37

4.6 Phân tích mô bệnh học 39

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: "Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em"

Thuộc: Bệnh Viện Nhi Trung Ương

- Chương trình: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Nguyễn Thanh Liêm

Ngày, tháng, năm sinh: Năm 1952 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Giáo sư, Tiến sỹ, Bác sỹ

Chức vụ: Giám Đốc Bệnh Viện Nhi TW

Điện thoại: Tổ chức: 04.62738566 Mobile: 091542652

Fax: 04.62738573 E-mail: liemnhp@hotmail.com

Tên tổ chức đang công tác: Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Địa chỉ tổ chức:18/879 Đường La Thành, Đống Đa, Hà nội, Việt Nam

Địa chỉ nhà riêng: P303, nhà C, The Manor, Mỹ Đình, Từ Liêm, Hà nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Điện thoại: 04.62738573 Fax: 04.62738573

E-mail: nip_vn@hn.vnn.vn

Website: http://www.nhp.org.vn

Địa chỉ: 18/879 Đường La Thành, Đống Đa, Hà nội, Việt Nam

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Thanh Liêm

Số tài khoản:

Ngân hàng:

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Y Tế

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 9 năm 2009

- Thực tế thực hiện: từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 9 năm 2010

- Được gia hạn (nếu có):

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm

vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh

phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị

điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

hành văn bản Tên văn bản Ghi chú

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Cung cấp mẫu cho nghiên cứu invitro

Đã cung cấp

62 mẫu nghiên cứu theo yêu cầu

Bicetre, Paris

Cung cấp mẫu cho nghiên cứu invivo

Đã cung cấp

15 mẫu và động vật nghiên cứu

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không

quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Nguyễn

Thanh Liêm

Nguyễn Thanh Liêm

Chủ nhiệm đề tài

Nghiệm thu đề tài

2 Ngô Diễm

Ngọc

Ngô Diễm Ngọc

Thư ký đề tài Thực hiện

nghiên cứu

3 Nguyễn Huy

Bạo

Nguyễn Huy Bạo

Hợp tác cung cấp mẫu cho nghiên cứu invitro

Cung cấp 62 mẫu cho nghiên cứu invitro

4 Tô Minh

Hương

Tô Minh Hương

Hợp tác cung cấp mẫu cho

Cung cấp 62 mẫu cho nghiên

nghiên cứu invitro

cứu invitro

Tân Sinh

Tư vấn thực hiện nghiên cứu

Tư vấn lấy và bảo quản mẫu

6 An Thùy Lan Nuôi cấy tế

Phân lập tế bào

8 Đoàn Thanh

Hương

Đoàn Thanh Hương

Kế toán đề tài Kế toán đề tài

9 Ann Weber Ann Weber Cung cấp

mẫu cho nghiên cứu invivo

Cung cấp 15 mẫu và động vật thí nghiệm

- Lý do thay đổi ( nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức

người tham gia )

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1 Hội thảo tại BV Nhi TW "Xây dựng quy trình nghiên

cứu invitro"- BV Nhi 20/5/2007-23/5/2007-

TW-2 Hội thảo tại BV Nhi TW "Xây dựng quy trình nghiên

cứu invivo"- BV Nhi 2/7/2007-5/7/2007

TW Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Người, cơ quan thực hiện

1 Xây dựng quy trình nghiên

cứu

12/2007

9/2006-5/2007

12/2006-GS.TS Nguyễn Thanh Liêm

BS Ngô Diễm Ngọc

2 Thu thập mẫu nghiên cứu

Phân lập mẫu và nuôi cấy

tế bào gan

5/2008

09/2006-9/2010

12/2006-BS Ngô Diễm Ngọc

BS An Thùy Lan

3 Phản ứng miễn dịch tế bào

9/2006-12/2008

5/2007

12/2006-BS Ngô Diễm Ngọc

ThS Vũ Đình Quang

4 Đánh dấu tế bào bằng

HOECHST

9/2009

12/2009

12/2008-Bs Ngô Diễm Ngọc

5 Ghép tế bào trên chuột thí

nghiệm

9/2009

9/2010

1/2009-BS Ngô Diễm Ngọc

6 Phân tích số liệu, viết

nghiệm thu

9/2009 12/2010 GS.TS Nguyễn

Thanh Liêm

Bs Ngô Diễm Ngọc

- Lý do thay đổi (nếu có):

1 Do gặp phải một số khó khăn trong quá trình thực hiện phân lập tế bào từ mẫu nghiên cứu, nên thời gian thực hiệnmục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự kiến

2 Do khó khăn trong quá trình thực hiện ghép tế bào vào chuột thí nghiệm nên , nên thời gian thực hiện mục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự kiến, cũng gây ảnh hưởng đến thời gian thu thập mẫu và phân lập mẫu phục vụ cho nghiên cứu invivo

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN SXTN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

a) Sản phẩm Dạng I:

Số Tên sản phẩm và Đơn vị đo Số lượng Theo kế Thực tế đạt

Ghi chú

1 Xây dựng quy trình

nghiên cứu

Hoàn thành quy trình

2 Thu thập, phân lập mẫu

Hoàn thành

5 Đánh dấu tế bào bằng

HOECHST

Thực hiện thành công

Hoàn thành

6 Ghép tế bào trên chuột

thí nghiệm

Thực hiện thành công

Hoàn thành với giúp đỡ của

(Tạp chí, nhà

xuất bản)

1 Viết bài báo Bài báo: "Nghiên cứu

phân lập và nuôi cấy tế

Tạp chí nghiên cứu Y Học

bào gan phôi thai

người"

ISSN 202X

0868-2

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế

hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Thạc sỹ

2 Tiến sỹ

3 BS Nội trú

4 BS CKI; CKII

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

1 Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh đã và đang là một trong những định hướng nghiên cứu của khoa học hiện đại Dựa trên kết quả nghiên cứu bước đầu về tế bào gan phôi thai người, có thể mở ra các nghiên cứu sử dụng các nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành tế bào gan, ứng dụng cho điều trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn

2 Ghép tế bào nói chung và ghép tế bào gan là một cách thức điều trị mới, đã và đang được nghiên cứu khá rộng rãi ở nước ngoài do một số ưu điểm của phương pháp này như giảm can thiệp phẫu thuật, giải quyết vấn đề người cho, giảm chi phí thực hiện Do vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này cần thiết được tiếp tục triển khai để có thể đưa các nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm đến gần hơn với thử nghiệm lâm sàng, phục vụ cho mục đích điều trị bệnh

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ, VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh Tiếng Việt Viết tắt

Stem cells Tế bào gốc

Embryonic stem cells Tế bào gốc phôi ESAdult stem cells Tế bào gốc trưởng thành ASPluripotent Tế bào gốc vạn tiềm

năng Multipotent Tế bào gốc đa tiềm năng

Hepatoblast Tế bào gan phôi thai

Cholangiocyte Tế bào đường mật

Epithelial stem cells Tế bào gốc biểu mô ECsMeschymal stem cells Tế bào gốc trung mô MCsInstitut national de la sante and de

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI

Hình 1.3 Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người 10

Hình 1.4 Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử 11

Hình 3.1 Tế bào gan thai người ngày thứ 3 sau khi nuôi cấy 26

Hình 3.2 Tế bào gan thai người ngày thứ 4 và thứ 5 sau nuôi

cấy

27

Hình 3.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker 28

Hình 3.4 Đánh dấu tế bào gan thai người bằng HOECHST 29

Hình 3.5 Bộc lộ vùng gan và tĩnh mạch cửa và cắt gan thùy

phải

31

Hình 3.6 Ghép tế bào gan vào tĩnh mạch cửa 31

Hình 3.7 Các tế bào gan sau khi ghép mắc lại ở khoảng cửa 32

Hình 3.8 Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mô gan chuột

tế bào được ghép là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng thải ghép hay thành công của cuộc ghép

Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn với nhiều

ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch

Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến hành với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình nghiên cứu

2 Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người

3 Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người bằng phản ứng miễn dịch tế bào

4 Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt trắng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc:

1.1.1 Định nghĩa:

Tế bào gốc (stem cells) là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc

tự làm mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, tổ chức khác nhau trong cơ thể [1] Tế bào gốc có mặt trong tất cả các giai đoạn phát triển của cơ thể, từ giai đoạn phôi, thai, có trong máu dây rốn, có trong nhiều loại mô và

cơ quan khác nhau của cơ thể đã trưởng thành, nơi các tế bào này được duy trì dưới dạng chưa biệt hoá trong suốt cuộc đời của cơ thể đó [2]

những tê bào trong nhiều loại mô và cơ quan của cơ thể từ sau khi được sinh

ra đến lúc trưởng thành Đây là những tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc đa tiềm năng (Multipotent), có khả năng biệt hoá thành một số loại tế bào khác nhau của cơ thể, như tế bào gốc tạo máu trong tuỷ xương [4] Ngoài ra, còn có những tế bào gốc phân lập từ các mô và tổ chức của giai đoạn thai Những tế bào này có thể là tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc tế bào gốc đa tiềm năng, như

tế bào gốc của gan thai nhi (Hepatoblast), tế bào gốc máu dây rốn (Cord Blood Stem cells) [5]

Hình 1.2 Phân loại tế bào gốc

(Nguồn từ http://stemcells.nih.gov/StemCells)

1.1.3 Tiềm năng ứng dụng:

Tế bào gốc hiện nay được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể được

sử dụng trong việc khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và

cơ quan trong một số bệnh lý mạn tính và nan y Với mục đích này, tế bào gốc được sử dụng để biệt hoá invitro và invivo thành các các tế bào của các mô và

cơ quan đặc hiệu

Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay tập trung chủ yếu vào việc tìm hiểu và

làm rõ vai trò của tế bào gốc, đặc biệt xây dựng các mô hình biệt hoá tế bào gốc invitro và invivo thành các loại tế bào khác nhau của cơ thể như: tế bào

da, xương, máu, gan, tuỵ…

Trong bối cảnh đó, các nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc thành tế bào gan là một trong những hướng nghiên cứu mới đang được quan tâm và mang nhiều triển vọng Gan là một trong những cơ quan lớn nhất và mang nhiều chức năng nhất của cơ thể, đặc biệt là chức năng chuyển hoá Có rất nhiều bệnh lý bẩm sinh và mắc phải gây nên tình trạng suy tế bào gan, rối loạn chuyển hoá của gan, nếu không được điều trị sẽ nhanh chóng dẫn đến tử vong

Những phương pháp điều trị như cắt bỏ gan đến nay đã không còn được áp dụng vì như vậy chỉ còn lại rất ít các tế bào có khả năng đảm nhiệm các chức năng bình thường của gan Ghép gan hiện này là phương pháp điều trị hiệu quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng Theo một nghiên cứu về thực trạng ghép gan của Mỹ năm 2003, trong năm 1997 có khoảng 500 trường hợp được tiến hành ghép gan, đến năm 2002 con số này chỉ dừng lại ở khoảng

550 trường hợp Trong khi đó, số trường hợp trong danh sách chờ ghép gan tăng nhanh từ khoảng 400 năm 1997 lên 700 năm 2002, và số trường hợp đăng ký ghép gan mới tăng từ khoảng 1200 đến 1700 trường hợp Do vậy với

số lượng người cho gan ngày càng hạn chế, kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao, nên các phương pháp điều trị khác vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành

tế bào gan (hepatocytes like cells) được xem như một hướng điều trị mới đầy triển vọng

Có nhiều nguồn tế bào gốc được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan (hepatocyte-like cell), tuy nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã

và đang là một thách thức với các nhà nghiên cứu Tế bào gốc phôi (ES) lần đầu tiên được phân lập là từ phôi thai chuột [6] Tế bào gốc phôi mặc dù mang nhiều đặc điểm ưu việt nhất của tế bào gốc, nhưng nghiên cứu sử dụng

tế bào gốc phôi hiện nay đang gặp phải nhiều trở ngại về vấn đề đạo đức Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay chủ yếu sử dụng nguồn tế bào gốc từ thai hoặc nguồn tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell) Đầu tiên, là các nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương (BM)

để sửa chữa các tổn thương gan invivo Petersen và CS [7] đã chỉ ra rằng việc cấy ghép tuỷ của chuột đực vào gan của chuột cái bị chiếu xạ liều gây chết, và gan bị gây tổn thương bằng 2-acetylaminofluorene và CCl4, thì có thể cứu con chuột cái này khỏi việc bị diệt tuỷ bởi tia xạ và đồng thời có một số lượng nhỏ của các tế bào gốc gan có nguồn gốc từ tuỷ xương được tạo thành Sau đó, có rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện đã khẳng định vai trò của những tế bào này trong việc sửa chữa vùng gan bị tổn thường từ các tế bào gốc có nguồn gốc từ tuỷ xương [8],[9],[10]

Các nghiên cứu về tế bào gốc trong nước hiện nay chủ yếu tập trung vào hướng tìm kiếm các nguồn tế bào gốc khác nhau trong mục đích sử dụng chúng để biệt hoá thành các loại tế bào như: máu, da, xương, sụn Có một số nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tạo máu trong điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh máu

1.2 Tế bào gan phôi thai người:

1.2.1 Định nghĩa:

Gan phôi thai người ở giai đoạn 8-13 tuần tuổi được cấu tạo bởi các tế bào nhu mô gan phôi thai (hepatoblast) Đây là những tế bào gốc đa tiềm năng (bipotential stem cells), có khả năng biệt hóa thành hai dòng tế bào riêng biệt:

tế bào gan và tế bào đường mật

1.2.2 Nguồn gốc và đặc điểm:

Trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú, gan được hình thành

từ mầm của lá thai trong (tuần thứ 3 của thai kỳ ở người), cùng với sự ra đời một phần của tụy, phổi và tuyến giáp Những tế bào tại vùng này tự nhân lên, phát triển, hình thành một phần chính là nguồn gốc của gan, bao gồm các tế

bào gan phôi thai Sau đó, những tế bào này sẽ biệt hóa thành tế bào gan và tế bào đường mật

Tế bào gan phôi thai sử dụng cho mục đích nghiên cứu được phân lập từ gan thai nhi trong khoảng từ 8 đến 13 tuần tuổi của những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén Đây là những tế bào có kích thước nhỏ ~15µm Các marker bề mặt của loại tế bào này là các marker của tế bào gan như: Albumine, Alpha -1-antitrypsine, và các marker của tế bào đường mật như: Cytokeratine 7 và 19 Ngoài ra các tế bào này còn thể hiện một loại marker đặc hiệu của các tế bào biểu mô là E-Cadherine

Xét về khả năng ứng dụng trong ghép tế bào để điều trị một số bệnh gan, tế bào gan phôi thai người có nhiều ưu điểm hơn so với tế bào gan trưởng thành [12]:

- Tế bào gan phôi thai có kích thước nhỏ hơn (15µm) so với tế bào trưởng thành (30µm), điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc các tế bào sau khi ghép di chuyển qua các xoang tĩnh mạch vào nhu mô gan

dễ dàng hơn

- Tế bào gan phôi thai có khả năng tăng sinh rất lớn ngay cả khi đã được đưa vào nhu mô gan Điều này có thể mang lại một lợi thế lớn trong ứng dụng điều trị, vì chỉ cần đưa một lượng tế bào nhỏ hơn mà có thể thu được hiệu quả lớn hơn so với tế bào gan trưởng thành

- Tế bào gan phôi thai có tinh miễn dịch thấp hơn tế bào gan trưởng thành do đặc tính của tế bào non, chưa biệt hóa hoàn chỉnh

Hình 1.3 Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người

Ttheo IMSERM 00-20, Paris 2006)

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng :

Một số năm gần đây, các thử nghiệm ghép tế bào gan trưởng thành vào điều trị cho các bệnh nhân mắc suy gan cấp hoặc mạn tính, hay một số bệnh gan chuyển hóa di truyền đã được thực hiện ở một số nước như Pháp và Mỹ [13] Trong một số trường hợp, khi các tế bào gan chưa bị thay đổi về cấu trúc, và gan chưa có thay đổi về mặt giải phẫu, chỉ có chức năng của tế bào gan bị tổn thương, thì liệu pháp ghép tế bào trở thành một liệu pháp có nhiều ưu thế

- Ghép tế bào gan giúp giữ được vị trí cấu trúc của mạch máu và đường mật trong gan của người nhận, chỉ thay thế những tế bào bị tổn thương bằng những tế bào khỏe mạnh của người cho

- Bệnh nhân không phải chịu một cuộc phẫu thuật nặng nề, nhiều nguy

cơ

- Những tế bào gan của một người cho duy nhất, có thể cho một vài người nhận nếu có cùng một điều kiện hòa hợp về miễn dịch, có thể giải quyết được cơ bản vấn đề thiếu tạng ghép

- Chi phí cho một cuộc ghép tế bào gan thấp hơn 10% so với một cuộc

phẫu thuật ghép gan

Hình 1.3 Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử (a) Sơ đồ khoảng cửa trong gan (b) (Nguồn từ www.liverfoundation.org)

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ghép tế bào gan

1.3.1 Nghiên cứu nước ngoài:

Các thực nghiệm về ghép té bào gan trên mô hình động vật thí nghiêm (chuột, thỏ, linh trường) được gây mắc một số bệnh lý về gan đã được thực hiện từ những năm 1970 [14] Các thí nghiệm này đã chỉ ra rằng việc cấy ghép các tế bào gan trưởng thành cùng loài hoặc tự thân sau khi các tế bào gan bệnh được lấy ra khỏi cơ thể, sửa chữa gen bên ngoài cơ thể và đưa trở lại cơ thể sống,

đã cải thiện phần nào những rối loại chuyển hóa ở các cơ thể mang bệnh này Tuy nhiên, hiệu quả rõ rệt của những cải thiện này vẫn còn chưa thực sự đầy

đủ và thuyết phục

Các thử nghiệm lâm sàng về ghép tế bào gan được thực hiện từ năm 1995 Công bố năm 2004 của nhóm bác sỹ người Pháp là thành công của ghép tế bào gan trên một bệnh nhi 10 tuổi mắc hội chứng Crigler-Najjar (suy giảm bilirubin-uridine diphosphoglucuronate glucuronosyltransferase) [15] Tế bào gan được truyền vào cơ thể bệnh nhân qua đường tĩnh mạch cửa Bệnh nhi tỉnh táo suốt quá trình truyền tế bào và xuất viện sau đó 20 giờ Sau ghép, nồng độ bilirubin trong máu từ 400-460µmol/l đã giảm xuống còn 180-240µmol/l, và giữ ở mức độ này trong vòng hơn 1 năm Nồng độ UGT1A1

1µm

hoạt hóa tăng từ 0.4% lên 5.5% so với nồng độ bình thường Kết quả đáng chú ý này đã chỉ ra rằng những thuận lợi về mặt lý thuyết của ghép tế bào gan

có thể ứng dụng thành công trên người

Tuy nhiên trên thực tế, vẫn còn nhiềiu trở ngại trong lĩnh vực này Mặc dù kết quả ghép tế bào trên bệnh nhân Crigler-Najjar, nhưng trên một số bệnh nhân khác có xuất hiện các dấu hiệu phức tạp về tim mạch và hô hấp, cũng như các vấn đề khó khăn trong việc kiểm soát tình trạng suy giảm miễn dịch

Hơn nữa, nếu ghép tế bào gan trở thành một liệu pháp hiệu quả và rộng rãi cho các bệnh nhân có tổn thương gan mạn tính thì việc dự trữ tế bào gan cho nhu cầu này cần phải được thúc đẩy Do đó, hoặc phải sử dụng ngay phần gan sau khi lấy ở người cho, phân lập xử lý và sử dụng ngay cho người nhận, hoặc phải phân lập thành tế bào để bảo quản, dự trữ, vận chuyển Điều này đặt ra những thách thức cho các labo nghiên cứu bảo quản tế bào, để đảm bảo khả năng nhân lên và phát triển của chúng trong giới hạn cho phép sử dụng lại cho lâm sàng

1.3.2 Nghiên cứu trong nước:

Hiện tại chưa có tài liệu nghiên cứu hay báo cáo của tác giả nào về phân lập, nuôi cấy tế bào gan phôi thai người cho mục đích điều trị bệnh tại Việt Nam

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

- 62 mẫu thai trong khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội

- 15 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris

- Tế bào gan phôi thai người phân lập từ thai nhi 8-13 tuần tuổi thu thập

- Môi trường với yếu tố tăng trưởng cho tế bào tế bào HHF: HAM'S F12 Williams E (Sigma)

DMEM Các hóa chất và sinh phẩm dùng để định danh các tế bào sau khi phân lập bằng phân tích các protein bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và flow cytometry

- Động vật : 10 chuột nhắt trắng trưởng thành và 7 chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi dùng để khảo sát khả năng cấy ghép tế bào

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phân lập tế bào gan phôi thai người:

Gan của thai nhi trong khoảng 9-13 tuần tuổi từ những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén, được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội, phục vụ cho các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Chương trình này đã được sự thống nhất của lãnh đạo giữa hai bệnh viện

Gan của thai nhi trong khoảng 9-13 tuần tuổi từ những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén, được thu thập tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris, phục

vụ cho các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm Chương trình này nằm trong khuôn khổ hợp tác giữa phòng thí nghiệm 00-20 của Bệnh Viện Kremlin Bicetre, với Khoa Di truyền và SHPT Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Tổ chức thai nhi sau khi thu thập, được xử lý theo quy trình của INSERM

00-20 Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris Gan của thai nhi được phân lập từ tổ

chức thai, rửa sạch bằng HEPES, và xử lý bằng Collagenase type 3 với nồng

độ phù hợp với tuổi thai, trong điều kiện tiêu chuẩn (370C trong 1 giờ) Sau 1 giờ, thêm dung dịch với sự có mặt của huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine Serum-FBS) để kết thúc quá trình xử lý với Collagenase Hỗn hợp tế bào sau khi xử lý được lọc qua một màng lọc vô trùng kích thước 70µm, và được ly tâm trong 5 phút ở 500 vòng/phút Khối tế bào thu được được tiếp tục rửa 3 lần trong môi trường đặc biệt cho tế bào gan thai người Cuối cùng, các tế bào đựợc đánh giá khả năng sống bằng phản ứng nhuộm nhân với Trypan, đánh dấu các tế bào chết trên tiêu bản Malasser

2.2.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người:

Các tế bào sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy tế bào (Corning 35mm) với môi trường pha chế cho tế bào gan thai người Sau ngày đầu tiên của quá trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đầu tiên được thay thế và bổ sung thêm một số chất nuôi dưỡng khác, trong vòng 5 ngày Môi trường nuôi cấy

tế bào gan thai người bao gồm những thành phần sau: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche)

2.2.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang:

Tế bào gan phôi thai người sau khi rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco), được cố định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho gắn kháng thể kháng cytokeratine, hoặc cố định trong PBS-PFA (Paraformaldehyde 4%) chuẩn bị cho gắn một số kháng thể khác Sau đó, tế bào được rửa 3 lần trong PBS 1X và xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng

1 giờ để làm tăng tính thấm màng tế bào Sau đó, tế bào được ủ với một số loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin

người, gắn trực tiếp với FUTC (fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thể đơn dòng của thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako) Ngoài ra, marker màng tế bào E-Cadherin cũng được phân tích bằng kháng thể đơn dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako) Sau khi ủ với kháng thể, tế bào được rửa 3 lần với PBS 1X để loại bỏ đi những kháng thể thừa không được gắn trên màng tế bào Những kháng thể này được phát hiện nhờ việc gắn thêm một kháng thể thứ hai kháng lại kháng thể đầu tiên, gắn với FITC (1/1500) Tiêu bản sau khi hoàn thành được phủ một lớp DAPI cho phép nhuộm nhân tế bào thành màu xanh, và phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang

2.2.4 Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro:

Để thực hiện mục tiêu theo dõi sự phát triển của tế bào gan sau khi ghép vào

cơ thể vật chủ, tế bào gan trước khi ghép cần được đánh dấu bằng chất đánh dấu huỳnh quang Chúng tôi sử dụng HOECHST, là một chất đánh dấu nhân huỳnh quang cho các tế bào trong nghiên cứu

Ủ 20x106 tế bào trong 2ml môi trường không có FBS với 10µl HOECHST (Sigma) trong vòng 30 phút ở 370C Thêm vào đó FBS theo tỷ lệ 1/10 để kết thúc quá trình đánh dấu tế bào Rửa khối tế bào 3 lần, mỗi lần đều cần chuyển khối tế bào sang các ống đựng mới, để loại trừ lượng chất đánh dấu dư thừa đọng lại trên thành ống đựng tế bào cũ Những tế bào sau khi đánh dấu được phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang để đánh giả tỷ lệ phần trăm số tế bào được đanh dấu trên tổng số tế bào đã có

2.2.5 Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm:

Kỹ thuật gây mê: Pha 0.9ml Ketamin (Imagene) và 0.2% Xylastin

(Rampoun) trong 3.8ml nước muối sinh lý Tiêm vào khoang màng bụng của chuột nhắt trắng trưởng thành với hàm lượng 1ml/20mg trọng lượng Thời

gian tác dụng ước tính trong vòng 30 phút

Kỹ thuật ghép tế bào:

- Chuột trưởng thành: Sau khi gây mê, chuột được cắt 40% gan ở thùy phải

Sau đó tế bào đã được đánh dấu được tiêm vào trực tiếp vào tĩnh mạch cửa nhờ một catheter 29G trong vòng 10 phút Nồng độ tế bào ước tính 8x105 tế bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng,

- Chuột sơ sinh: Tế bào gan sau khi đánh dấu được tiêm trực tiếp vào lách

của chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi bằng một sering Halminton 10µl qua đường dưới da, không qua gây mê Nồng độ tế bào ước tính 4x105 tế bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng,

2.2.6 Mô và tế bào học:

Chuột sau khi được ghép được nuôi sống trong vòng 2 tuần Sau đó toàn bộ gan của chuột đựoc ghép được thu hoạch Gan sau khi thu hoạch được làm đông lạnh trong isopentan, và được giữ ở -800C

Gan đựợc cắt lạnh 7µm, dán trên lam kính, và được phân tích dưới kính hiển

vi huỳnh quang

2.2.7 Thu thập và phân tích số liệu:

Đếm số lượng tế bào được đanh dấu trên mỗi lam kính

Phân tích số liệu: Xác định phần trăm số tế bào cấy đựoc vào gan chuột = (số

tế bào đếm được trên tiêu bản/100/450)x100

2.3 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành dựa trên sự hợp tác giữa Bệnh Viện Nhi TƯ và phòng thí nghiệm 00-20, với sự đồng ý của hội đồng y đức ký kết giữa Bệnh Viện Kremlin Bicetre và phòng thí nghiệm 00-20

Nghiên cứu cũng nhận được sự hợp tác với Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội trong việc cung cấp mẫu nghiên cứu từ những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén ở tuần thai 8-13 tuần Các thông tin sản phụ không được thu thập lưu trữ trong nghiên cứu này

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng quy trình nghiên cứu:

3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu:

62 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội cho các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Các sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén trong khoảng 9-13 tuần thai, sau khi làm các thủ tục đăng ký tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội, sẽ được tiến hành đình chỉ thai nghén theo quy trình của Bệnh Viện

Mẫu nghiên cứu được thu thập về Bệnh Viện Nhi TƯ, đựng trong chai Duran 250-500ml tùy theo số lượng mẫu được thu thập, vô trùng Mẫu nghiên cứu được tiến hành xử lý phân lập ngay hoặc được giữ trong nhiệt độ +40, tại ngăn mát tủ lạnh cho đến khi được phân lập trong vòng 6h kể từ khi nhận mẫu

15 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Khoa Sản Bệnh Viện Kremlin Bicetre,

và tiến hành xử lý tại phòng thí nghiệm 00-20, phục vụ cho mục đích nghiên cứu trên động vật thí nghiệm

3.1.2 Quy trình xử lý mẫu và phân lập tế bào gan phôi thai người:

Chuẩn bị dụng cụ:

- Khu vực xử lý mẫu sạch

- Tủ an toàn sinh học bậc II

- Khay thủy tinh vô trùng

- Dao mổ, panh gắp và kéo vô trùng

- Tube Corning vô trùng 15ml x 3 chiếc, 50ml x 2 chiếc

- Máy khuấy từ có gia nhiệt

- Máy ly tâm góc văng

Chuẩn bị hóa chất:

- PBS 1X x 1000 ml đã khử trùng

- HEPES

- Collagenase type III (PAA)

- Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche)

Quy trình xử lý và phân lập tế bào:

- Tổ chức thai được đặt trên khay thủy tinh, rửa qua bằng PBS 1X

- Gan của thai nhi được phân lập từ tổ chức thai bằng mắt thường, sử dụng panh kéo và dao cắt

- Các mảnh gan được thu thập vào tube Corning 15ml vô trùng, đựng sẵn dung dịch HEPES

- Ly tâm ống 15ml 3 lần với HEPES,

- Chuẩn bị máy khuấy từ 370C, cóng Scott đựng 50ml HEPES có Collagenase type 3, nồng độ 1-2mg/ml tùy theo tuổi thai

- Cho các mảnh gan vào dung dịch trên, khuấy trên máy khuấy từ 370C trong 1 giờ

- Sau 1 giờ, thêm 50ml môi trường nuôi cấy tế bào gan để kết thúc quá trình xử lý với Collagenase

- Hỗn hợp tế bào sau khi xử lý được lọc qua một màng lọc vô trùng kích thước 70µm, và được ly tâm trong 5 phút ở 500 vòng/phút

- Khối tế bào thu được được tiếp tục rửa 3 lần trong môi trường cho tế bào gan thai người

- Cuối cùng, các tế bào đựợc đánh giá khả năng sống bằng phản ứng nhuộm nhân với Trypan, đánh dấu các tế bào chết trên tiêu bản Malasser

3.1.3 Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người:

Chuẩn bị dụng cụ:

- Tủ an toàn sinh học bậc 2

- Đĩa nuôi cấy 35mm (Corning)

- Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml, 25ml

Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người:

- Tế bào gan sau khi phân lập với Collagenase được đánh giá về số lượng

tế bào sống bằng phản ứng nhuộm Trypan, đánh dấu tế bào chết trên lam kính Malasser

- Cấy tế bào vào đĩa Corning 35mm2 với mật độ 25,000 tế bào/cm2

- Đặt vào tủ cấy 370C CO2 5%

- 24h sau khi cấy tế bào, đánh giá lại tình trạng mọc của tế bào qua kính hiển vi soi ngược