Góp phần xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc xin viêm não nhật bản bằng giám sát huyết thanh học bệnh viêm não nhật bản ở một số tỉnh thành miền bắc

TÓM TẮT KẾT QUẢNGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu được thực hiện nhằm đạt được các mục đích sau: (1) Lựa chọn bộ sinh phẩm phát hiện IgM trong chẩn đoán căn nguyên vi rút viêm não Nhật Bản (VNNB) gây hội chứng não cấp (HCNC); (2) Xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc xin VNNB. Để đạt được những mục đích nghiên cứu này, đề tài nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật phát hiện IgM kháng vi rút VNNB để xác định căn nguyên vi rút VNNB gây hội chứng não cấp, nhằm khẳng định hiệu quả phòng bệnh của vắc xin trên thực địa. Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu cắt ngang và sửdụng mẫu ngẫu nhiên đơn. Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút. Tiêu chuẩn lấy mẫu từ những bệnh nhân này theo tiêu chí đề nghị của Tổchức Y tế thế giới: một bệnh nhân lấy 1 mẫu dịch não tuỷtrong giai đoạn cấp, huyết thanh kép được thu thập trong giai đoạn cấp và giai đoạn lui bệnh. Cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu là 788 mẫu. Đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên các tiêu chí sau: (1) so sánh độ nhậy đểphát hiện IgM kháng vi rút VNNB của các bộ sinh phẩm MAC-ELISA (do Viện Vệ Sinh Dịch Tễtrung ương sản xuất), bộ sinh phẩm PEN TAX (do viện Các bệnh truyền nhiễm quốc gia, Tokyo sản xuất); bộsinh phẩm Panbio do dựán PATH cung cấp; (2) Xác định các căn nguyên vi rút khác gây HCNC; (3) Xác định độnhậy của kỹthuật MAC-ELISA với những mẫu huyết thanh và dịch não tuỷcủa bệnh nhân lấy trong 7 ngày đầu của bệnh; (4) So sánh độnhậy của kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3; (5) Kiểm tra kết quảchẩn đoán VNNB của một sốphòng thí nghiệm ở3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá; (6) Xác định căn nguyên vi rút VNNB phân bốtheo nhóm tuổi và mối liên quan với tỷlệtiêm phòng; (7) Xác định mối liên 2 quan giữa tỷlệtiêm phòng vắc-xin VNNB các trường hợp VNNB và HCNC do vi rút ở tỉnh Bắc Giang định hướng cho việc phát hiện vi rút mới gây HCNC. Trong nghiên cứu này, sinh phẩm và trang thiết bị cần thiết cho nghiên cứu được cung cấp đầy đủ. Số liệu thu thập được xửlý theo phương pháp thống kê. Tính tỷ lệ bảo vệ của vắc xin ở3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá được tính theo công thức: VE % = [(P1 – P2) : P1] x 100. (Chú giải: VE là hiệu quả phòng bệnh của vắc xin; P1 tỷlệmắc bệnh ởnhóm trẻkhông tiêm vắc xin; P2 tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm trẻ đã tiêm vắc xin).

BỘ Y TẾ

ViÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

GÓP PHẦN XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ PHÒNG BỆNH

CỦA VẮC-XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN (VNNB)

BẰNG GIÁM SÁT HUYẾT THANH HỌC BỆNH VNNB

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

TÊN ĐỀ TÀI: GÓP PHẦN XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ PHÒNG BỆNH CỦA

VẮC-XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN (VNNB) BẰNG GIÁM SÁT HUYẾT

THANH HỌC BỆNH VNNB Ở MỘT SỐ TỈNH THÀNH MIỀN BẮC

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS PHAN THỊ NGÀ

Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: Góp phần xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin viêm não Nhật Bản (VNNB) bằng giám sát huyết thanh học bệnh VNNB ở một số tỉnh thành miền Bắc

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS PHAN THỊ NGÀ

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế

5 Thư ký đề tài: KS Bùi Minh Trang

6 Phó chủ nhiệm đề tài hoặc ban chủ nhiệm đề tài (nếu có):

7 Danh sách những người thực hiện chính:

- PGS TS Phan Thị Ngà

- BS Đỗ Phương Loan

- CN Nguyễn Việt Hoàng

- KS Bùi Minh Trang

- KTV Lê Thị Hiền Thu

Côn trùng tiết túc Complement ADN Enzym Linked Immunosorbent Assay Eagle Minimum Essential Medium Reverse Transcriptase polymerase chain reaction Hội chứng não cấp

Tế bào có nguồn gốc thận chuột Hamster mới đẻ (Baby Hamster Kidney cells)

Tế bào ung thư có nguồn gốc từ nguyên bào cơ vân (Rhabdomyosarcoma)

Tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi Viêm não Nhật Bản

MỤC LỤC

PHẦN A: Báo cáo tóm tắt

1 Tóm tắt kết quả nghiên cứu

2 Bản tự đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài

PHẦN B: Báo cáo chi tiết

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài

1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

Chương 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế nghiên cứu

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

Kết quả kiểm định quốc tế bộ sinh phẩm MAC-ELISA

Các bài báo liên quan đến đề tài (3 bài)

PHẦN A BÁO CÁO TÓM TẮT

1 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được thực hiện nhằm đạt được các mục đích sau: (1) Lựa chọn bộ sinh phẩm phát hiện IgM trong chẩn đoán căn nguyên vi rút viêm não Nhật Bản (VNNB) gây hội chứng não cấp (HCNC); (2) Xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc xin VNNB Để đạt được những mục đích nghiên cứu này,

đề tài nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật phát hiện IgM kháng vi rút VNNB để xác định căn nguyên vi rút VNNB gây hội chứng não cấp, nhằm khẳng định hiệu quả phòng bệnh của vắc xin trên thực địa Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu cắt ngang và sử dụng mẫu ngẫu nhiên đơn Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút Tiêu chuẩn lấy mẫu từ những bệnh nhân này theo tiêu chí đề nghị của Tổ chức Y tế thế giới: một bệnh nhân lấy 1 mẫu dịch não tuỷ trong giai đoạn cấp, huyết thanh kép được thu thập trong giai đoạn cấp

và giai đoạn lui bệnh Cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu là 788 mẫu

Đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên các tiêu chí sau: (1) so sánh độ nhậy để phát hiện IgM kháng vi rút VNNB của các bộ sinh phẩm MAC-ELISA (do Viện Vệ Sinh Dịch Tễ trung ương sản xuất), bộ sinh phẩm PEN TAX (do viện Các bệnh truyền nhiễm quốc gia, Tokyo sản xuất); bộ sinh phẩm Panbio do dự án PATH cung cấp; (2) Xác định các căn nguyên vi rút khác gây HCNC; (3) Xác định độ nhậy của kỹ thuật MAC-ELISA với những mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân lấy trong 7 ngày đầu của bệnh; (4) So sánh độ nhậy của kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3; (5) Kiểm tra kết quả chẩn đoán VNNB của một số phòng thí nghiệm ở 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá; (6) Xác định căn nguyên vi rút VNNB phân

bố theo nhóm tuổi và mối liên quan với tỷ lệ tiêm phòng; (7) Xác định mối liên

quan giữa tỷ lệ tiêm phòng vắc-xin VNNB các trường hợp VNNB và HCNC do

vi rút ở tỉnh Bắc Giang định hướng cho việc phát hiện vi rút mới gây HCNC Trong nghiên cứu này, sinh phẩm và trang thiết bị cần thiết cho nghiên cứu được cung cấp đầy đủ Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê Tính tỷ lệ bảo vệ của vắc xin ở 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá được tính theo công thức: VE % = [(P1 – P2) : P1] x 100 (Chú giải: VE là hiệu quả phòng bệnh của vắc xin; P1 tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm trẻ không tiêm vắc xin; P2

tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm trẻ đã tiêm vắc xin)

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xác định: trong số 671 bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút, tỷ lệ thu thập được 3 mẫu bệnh phẩm rất thấp chỉ có 6,7 %; tỷ lệ thu thập được mẫu huyết thanh kép trong nghiên cứu này là 12 %; phần lớn các mẫu thu thập để nghiên cứu là mẫu đơn dịch não tuỷ hoặc huyết thanh Kết quả nghiên cứu xác định sự phù hợp về chẩn đoán VNNB bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA (do Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương sản xuất) và

bộ sinh phẩm PEN TAX (do Viện Các bệnh Truyền nhiễm Quốc gia, Tokyo sản xuất) là 99 % Ngược lại, sự sai khác về kết quả chẩn đoán của hai bộ sinh phẩm này với bộ sinh phẩm Panbio (do tổ chức PATH cung cấp) là trên 24 % Hơn thế nữa, bộ sinh phẩm Panbio được thiết kế để phát hiện IgM trong huyết thanh còn độ nhậy phát hiện IgM trong dịch não tuỷ thấp, cho thấy bộ sinh phẩm này không đáp ứng được tiêu chí phát hiện IgM trong dịch não tuỷ là

“tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán VNNB So sánh kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục, kết quả cho thấy bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA có thể phát hiện được 92% (24/26) số mẫu dương tính và bằng bộ sinh phẩm PEN TAX có thể phát hiện được 96% (25/26) số mẫu dương tính Sử dụng hai bộ sinh phẩm này

để phát hiện IgM trong mẫu dịch não tuỷ lấy trong giai đoạn cấp (7 ngày đầu của bệnh), kết quả phát hiện được 96 % (25/26) số mẫu dương tính Như vậy,

nếu sử dụng mẫu dịch não tuỷ lấy trong giai đoạn cấp để chẩn đoán có thể chỉ

bỏ sót khoảng 4 %, kết quả này khẳng định tính ưu việt về độ nhậy của phương pháp phát hiện IgM theo nguyên lý capture Kỹ thuật MAC-ELISA không phức tạp, cho đến nay, kỹ thuật này đã được phổ cập ở các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh để chẩn đoán và giám sát VNNB Đối chiếu kết quả chẩn đoán VNNB ở 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá với kết quả chẩn đoán VNNB ở Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA, kết quả cho thấy

tỷ lệ % biến thiên kết quả nằm trong giới hạn cho phép < 10 %, mặc dù trong những năm gần đây, người chuyên trách chẩn đoán VNNB ở các tỉnh có sự thuyên chuyển và thay đổi do việc chia tách Trung tâm phòng chống HIV/AIDS

ra khỏi Trung tâm Y tế dự phòng Tuy nhiên, trong những năm tới cần tăng cường năng lực xét nghiệm cho các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh để tỷ lệ % biến thiên kết quả < 5 %, đạt giá trị lý tưởng Nghiên cứu cũng cho thấy không có sự sai khác về kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB bằng kháng nguyên VNNB genotyp 1 và genotyp 3 Cho thấy, không cần thiết phải thay thế kháng nguyên chẩn đoán được sản xuất từ chủng vi rút VNNB genotyp 3, mặc dù có

sự xuất hiện thêm vi rút VNNB genotyp 1 ở miền Bắc Việt Nam trong những năm đầu thế kỷ 21 Trong các năm 1998 – 2007, xác định có 45,5 % căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC Trong số những mẫu dịch não tuỷ đã xác định

âm tính với kháng nguyên VNNB, bằng kỹ thuật ELISA phát hiện IgM đã xác định có khoảng 11,8 % HCNC là do vi rút Nam Định; chưa xác định có mẫu nào dương tính với vi rút West Nile Trong các năm 1998 – 2007, các trường hợp xác định VNNB chưa được tiêm phòng vắc-xin VNNB chiếm 93,1 % tổng

số mắc (284/305); những trường hợp có tiêm phòng vắc-xin nhưng không theo hướng dẫn sử dụng vắc xin bị VNNB chiếm 6,2 % tổng số mắc (19/305) ; chỉ

có 2 trường hợp đã sơ chủng đủ 3 liều vắc-xin VNNB nhưng vẫn bị VNNB chiếm 0,7 % tổng số mắc (2/305) Theo kết quả thống kê số trẻ từ 1 đến 5 tuổi

của 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá là 496.600 trẻ, trong số này có 440.304 trẻ đã tiêm vắc-xin VNNB, chỉ còn 56.296 trẻ chưa được tiêm vắc-xin VNNB Theo kết quả chẩn đoán và giám sát bệnh VNNB xác định trong nhóm trẻ chưa tiêm vắc-xin có 30 trẻ bị VNNB, tỷ lệ mắc VNNB của nhóm trẻ chưa tiêm vắc-xin là 0,0533 (P1); Trong nhóm trẻ đã tiêm vắc-xin có 3 trẻ bị VNNB,

tỷ lệ mắc VNNB của nhóm trẻ đã tiêm vắc-xin là 0,0007 (P2) Như vậy tỷ lệ bảo vệ của vắc-xin VNNB tinh khiết bất hoạt từ não chuột ở 3 tỉnh Bắc Giang,

Hà Tây và Thanh Hoá trong các năm 1998 - 2007 là 98,6 % Vắc-xin VNNB được đưa vào Chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) để tiêm phòng cho trẻ em từ năm 1997 Trong những năm đầu, vắc-xin được dùng chủ yếu ở các vùng trọng điểm dịch của miền Bắc như Hà Tây, Thanh Hoá Riêng tỉnh Bắc Giang, vắc-xin VNNB mới được đưa vào sử dụng từ năm 2000 sau vụ dịch lớn viêm não mùa hè ở Bắc Giang 1999 Tuy nhiên, đến năm 2003 trên 90 % trẻ em

ở tỉnh Bắc Giang đã được tiêm phòng vắc-xin VNNB, còn Hà Tây và Thanh Hoá đến năm 2006 mới đạt được tỷ lệ tiêm phòng trên 90 % Kết quả giám sát căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC thấp nhất là ở Bắc Giang 20,6 %; tiếp đến

là ở Hà Tây 32,0 % và cao nhất ở Thanh Hoá 65,2 % Phân tích đánh giá hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin VNNB gián tiếp cho thấy tỷ lệ số mắc VNNB theo nhóm tuổi trước giai đoạn tiêm phòng vắc-xin VNNB (1990 – 1995) và sau giai đoạn có sử dụng vắc-xin VNNB (1998 – 2005) đã giảm trên 50 % trong nhóm tuổi từ 1 đến 4 ở tỉnh Hà Tây, khẳng định hiệu quả phòng bệnh bằng vắc-xin VNNB Tương tự như vậy, so sánh tỷ lệ tiêm vắc-xin VNNB cho nhóm trẻ từ 1 – 5 tuổi và tỷ lệ xác định căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC ở tỉnh Thanh Hoá, cho thấy có tương quan tỷ lệ nghịch Tỷ lệ tiêm phòng vắc-xin VNNB và

tỷ lệ xác định căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC ở tỉnh Bắc Giang cũng theo mối tương quan tỷ lệ nghịch Tuy nhiên, số các trường hợp HCNC nghi ngờ do

vi rút về mùa hè ở tỉnh Bắc Giang không giảm, khoảng 2 – 3 năm lại có một vụ

dịch lớn Kết quả nghiên cứu cho thấy ở Bắc Giang, ngoài vi rút VNNB gây HCNC còn có tác nhân vi rút khác cũng gây dịch viêm não về mùa hè mới được phát hiện năm 2004

Các kết quả khác của đề tài liên quan với khoa học, kỹ thuật và kinh tế

- Đã đào tạo được 01 cử nhân sinh học có nghiên cứu liên quan đến đề tài

- Có ba bài báo liên quan đến đề tài đã được công bố trên tạp chí quốc gia

- Đã xây dựng được mạng lưới chẩn đoán phòng thí nghiệm bệnh VNNB bằng

kỹ thuật MAC-ELISA, quy trình đánh giá để củng cố hệ thống chẩn đoán

- Khẳng định được chất lượng bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán VNNB do Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương sản xuất có chất lượng cao tương đương với

bộ sinh phẩm PEN TAX của Viện Các bệnh Truyền nhiễm Quốc gia, giá thành phù hợp với khả năng chi trả của tuyến tỉnh (có kết quả kiểm định quốc tế tại Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia, Tokyo, Nhật Bản)

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể đưa ra kết luận sau:

1 Đánh giá chất lượng bộ sinh phẩm phát hiện IgM để chẩn đoán căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC đã khẳng định:

- Bộ sinh phẩm MAC-ELISA, PEN TAX có độ nhạy cao có thể phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong mẫu dịch não tuỷ lấy trong giai đoạn cấp là 96,1 %,

tỷ lệ bỏ sót dưới 4 %

- Trong các năm 1998 – 2007, tỷ lệ xác định căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC ở một số tỉnh miền Bắc trung bình là 45,5 % Ngoài ra, đã xác định có 11,8 % HCNC do vi rút Nam Định; tuy nhiên chưa phát hiện được HCNC do vi rút West Nile

2 Xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin VNNB khẳng định:

- Tỷ lệ bảo vệ của vắc-xin VNNB ở 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá trong các năm 1998 – 2007 là 98,6 %, cho thấy khả năng khống chế bệnh VNNB bằng vắc xin

2 BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

a Tiến độ:

• Đúng tiến độ

• Rút ngắn thời gian nghiên cứu

Tổng số thời gian rút ngắn: tháng

• Kéo dài thời gian nghiên cứu

Tổng số thời gian kéo dài tháng

Lý do phải kéo dài

b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đưa ra

• Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra

• Thực hiện được các mục tiêu nhưng không hoàn chỉnh

• Chỉ thực hiện một số mục tiêu đề ra

• Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)

c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong bản đề cương

• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong bản đề cương

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạ

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả không đạt chất lượng

• Tạo ra được một sản phẩm đạt chất lượng

• Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)

X

X

X

d Đánh giá việc sử dụng kinh phí

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 120 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học 120 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: không

Toàn bộ kinh phí đã thanh quyết toán: 116,5 triệu

Chưa thanh quyết toán xong: 3,5 triệu

Lý do (ghi rõ): chưa thanh toán tiền nghiệm thu đề tài

e Các ý kiến đề xuất

Đề xuất về tài chính: Không

Đề xuất về quản lý khoa học: Không

Đề xuất liên quan đến đề tài:

1 Có thể sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA hoặc PEN TAX để phát hiện IgM cho chẩn đoán VNNB

2 Có thể giám sát bệnh VNNB bằng một mẫu dịch não tuỷ

3 Cần phát triển sinh phẩm chẩn đoán đối với các vi rút khác gây HCNC mới được phát hiện ở Việt Nam

PHẦN B: BÁO CÁO CHI TIẾT

Về lâm sàng, HCNC do vi rút VNNB rất đa dạng, dễ nhầm với HCNC do các căn nguyên vi rút khác Do vậy, việc chẩn đoán xác định dựa chủ yếu dựa vào kết quả phân lập vi rút hoặc phát hiện kháng thể đặc hiệu Trên thực tế, việc phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng rất khó đạt kết quả và phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố khách quan như thời gian lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu, dòng tế bào dùng để phân lập và kỹ năng phân lập Cho nên, việc chẩn đoán xác định căn nguyên vi rút VNNB thường dựa vào kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu Trước đây, các kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu, kỹ thuật kết hợp bổ thể hoặc kỹ thuật trung hoà thường được ứng dụng để chẩn đoán phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng vi rút VNNB; tuy nhiên, để chẩn đoán VNNB bằng các kỹ thuật này cần có mẫu máu kép lấy đúng thời gian quy định

Trên thực tế, trong số mẫu thu thập để làm xét nghiệm chỉ có khoảng 10 % số mẫu bệnh phẩm thu thập được lựa chọn để làm xét nghiệm [21, 27, 29, 34, 51, 53] Kỹ thuật MAC-ELISA phát hiện IgM kháng vi rút VNNB có độ nhạy, đặc hiệu cao, là kỹ thuật chuẩn thức trong chẩn đoán VNNB, đặc biệt ở những nơi

có lưu hành cả vi rút Dengue, vi rút VNNB – hai vi rút cùng nhóm flavi [2, 40,

43, 49] Tuy nhiên, trong số mẫu lấy trong những ngày đầu của bệnh, có khoảng

20 % số mẫu không phát hiện được IgM kháng vi rút VNNB [2, 29] Để tránh

bỏ sót trong chẩn đoán VNNB, yêu cầu lấy mẫu máu kép cũng được đề cập đến; theo tiêu chuẩn dự thảo của Tổ chức Y tế thế giới về giám sát VNNB trong giai đoạn khống chế bệnh VNNB trong giai đoạn 2010 - 2015: đặt ra mục tiêu cần đạt ≥ 80 % bệnh nhân được lấy 3 mẫu bệnh phẩm bao gồm có mẫu DNT, mẫu máu lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn lui bệnh Trong nhiễm vi rút arbo

có hướng tính thần kinh, kháng thể qua hàng rào máu não để bảo vệ hệ thần kinh trung ương, do vậy hiệu giá IgM kháng vi rút VNNB trong DNT thường cao hơn trong máu bệnh nhân – kết quả phát hiện được IgM trong DNT là bằng chứng của sự mới nhiễm vi rút và là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán VNNB [29, 51, 73] Hiện tại, chưa có bộ sinh phẩm phát hiện IgM kháng vi rút VNNB thương mại trên thị trường quốc tế, các nước sử dụng sinh phẩm và bộ sinh phẩm chẩn đoán là sinh phẩm và bộ sinh phẩm tự sản xuất, như ở Việt Nam sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán VNNB là một sản phẩm nghiên cứu của đề tài cấp Nhà nước (1991 – 1994)

Cho đến nay, người ta đã xác định vi rút VNNB có 5 nhóm genotyp; tuy nhiên, chỉ có vi rút VNNB genotyp 3 được xác định lưu hành rộng rãi nhất, ngược lại trước những năm 90 vi rút VNNB genotyp 1 được xác định lưu hành chủ yếu ở Thái Lan Do vậy một số chủng vi rút VNNB thuộc nhóm genotyp 3

đã được chọn để sản xuất vắc-xin phòng bệnh như các chủng Nakayama, Beijing-1, SA-14-14 và các chủng Nakayama, Beijing 1 và JaGA-01 thường

được sử dụng để sản xuất kháng nguyên cho chẩn đoán VNNB ở nhiều nước [25, 36, 56, 64, 68, 80, 83] Trong những năm gần đây, có sự xuất hiện của vi rút VNNB genotyp 1 ở Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Miền Bắc Việt Nam, cho thấy sự cần thiết xác định lại độ nhậy của kháng nguyên vi rút VNNB genotyp

3 trong chẩn đoán VNNB Hơn thế nữa, ngoài vi rút VNNB gây HCNC, một số tác nhân vi rút do muỗi truyền cũng mới được phân lập từ dịch não tuỷ bệnh nhân HCNC như vi rút Nam Định được phân lập từ bệnh nhân sống ở tỉnh Nam

Định năm 2002, vi rút Banna (thuộc họ Reoviridae) được phân lập từ bệnh nhân

ở tỉnh Gia Lai năm 2005 Hiệu quả của chương trình tiêm chủng có thể được đánh giá căn cứ vào các trường hợp lâm sàng được ghi nhận hoặc tình hình bệnh dịch; khi số các trường hợp lâm sàng giảm hoặc dịch không xẩy ra là bằng chứng để khẳng định hiệu quả của chương trình tiêm chủng Tuy nhiên, việc đánh giá hiệu quả của chương trình tiêm chủng dựa trên những thông tin này là cảm tính mặc dù sự bảo vệ không mắc bệnh là kết quả thực sự của việc sử dụng vắc-xin Do vậy, giám sát huyết thanh học trong chương trình tiêm chủng mở rộng là đảm bảo cho việc đánh giá hiệu quả của chương trình một cách khách quan nhất [5, 12, 14, 15, 23]

Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Góp phần xác định hiệu

quả phòng bệnh của vắc-xin viêm não Nhật Bản (VNNB) bằng giám sát huyết thanh học ở một số tỉnh miền Bắc”

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài:

Có cần phải lấy một mẫu dịch não tuỷ và hai mẫu huyết thanh để chẩn đoán VNNB nếu có được bộ sinh phẩm có độ nhạy cao? Nên lựa chọn bộ sinh phẩm nào để chẩn đoán VNNB?

Có thể sử dụng vắc-xin VNNB để khống chế bệnh VNNB ở Việt Nam trong tương lai?

1.3 Mục tiờu nghiờn cứu:

- Đỏnh giỏ chất lượng bộ sinh phẩm phỏt hiện IgM để chẩn đoỏn căn nguyờn vi rỳt VNNB gõy HCNC

- Xác định hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin VNNB

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

2.1.1 Tác nhân gây bệnh, tình hình bệnh VNNB, khả năng dự phòng bằng vắc-xin:

Lâm sàng bệnh VNNB được mô tả rất sớm ở Nhật Bản từ những năm

1871 nhưng phải hơn nửa thế kỷ sau, năm 1935 tác nhân gây bệnh – vi rút VNNB mới được phân lập từ não tử thi của một bệnh nhân ở Tokyo, Nhật Bản (chủng Nakayama), tiếp đó năm 1937 vi rút VNNB được phân lập từ não ngựa

ốm và năm 1938 vi rút VNNB được phân lập từ Culex tritaeniorhynchus

Những nghiên cứu tiếp theo ở Nhật đã xác định lợn và chim là những vật chủ

chính nhiễm vi rút huyết qua Culex truyền đến người [29, 32, 33, 35, 56, 68,

81, 87]

Vi rút VNNB là vi rút Arbo do muỗi truyền, thuật ngữ Arbo xuất phát từ tiếng lóng của phòng thí nghiệm được sử dụng từ những năm đầu 1940 trong số những nhà nghiên cứu ở California để chỉ một loại vi rút động vật được truyền cho động vật có xương sống từ những loài véc-tơ chân đốt hút máu [9, 29, 38]

Vi rút VNNB thuộc chi vi rút Flavi, trên cơ sở phân loại bằng huyết thanh học,

vi rút VNNB thuộc về phân nhóm vi rút West Nile [29, 39, 45] Các vi rút thuộc chi vi rút Flavi gây bệnh cho người với ba hội chứng chính: nhóm các vi rút Flavi gây hội chứng viêm não cấp tiên phát như vi rút VNNB, vi rút West Nile ; nhóm các vi rút Flavi gây sốt, viêm khớp, phát ban tiên phát như vi rút Dengue các typ và nhóm các vi rút Flavi gây sốt xuất huyết tiên phát như vi rút sốt vàng Các vi rút Flavi gây HCNC gồm có vi rút viêm não do ve, viêm não thung lũng Murray, viêm não St Louis, vi rút West Nile và vi rút VNNB tuy nhiên tùy theo đặc điểm sinh thái của các vùng địa lý khác nhau, sự

lưu hành của các loại vi rút này cũng khác nhau tuỳ từng châu lục [20, 30, 50,

52, 62]

Cho đến nay, vi rút VNNB được xác định chủ yếu lưu hành ở các vùng nông thôn đồng bằng và miền núi ở Châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn Đông, hầu hết các nước ở Đông Nam Châu Á,

Ấn Độ và miền Bắc nước Úc, nhưng chưa thấy vi rút VNNB xuất hiện ở châu

Âu, châu Mỹ và châu Phi [78, 79] Vi rút VNNB là căn nguyên hàng đầu gây HCNC có tỷ lệ tử vong và di chứng cao cho trẻ em ở khu vực châu Á, Thái Bình Dương Theo số liệu thống kê, hàng năm có khoảng 30.000 - 50.000 trường hợp mắc VNNB, khoảng 10.000 tử vong [68, 78] Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm vi rút VNNB không có biểu hiện lâm sàng (nhiễm ẩn)/tỷ lệ nhiễm vi rút VNNB có triệu chứng khác nhau tuỳ từng vùng địa lý dao động trong khoảng: 25 : 1 – 1000 : 1 [68, 78] Dịch VNNB bùng phát trong những

điều kiện sinh thái nhất định phù hợp cho sự phát triển của các loài Culex với

mật độ cao Do vậy VNNB xẩy ra thành dịch vào mùa hè ở những vùng cận nhiệt đới như Nhật Bản, Hàn Quốc, miền Bắc Việt Nam, miền Bắc Thái Lan, còn ở vùng nhiệt đới các trường hợp VNNB xảy ra rải rác quanh năm như Malaysia, Ấn Độ, miền Nam Việt Nam, miền Nam Thái Lan [1, 4, 7, 10, 17, 30, 78]

Trong những vùng có vi rút VNNB lưu hành, trẻ em là đối tượng có nguy

cơ mắc cao Tỷ lệ mắc VNNB ở trẻ em dưới 10 tuổi chiếm 87,7%, hiếm khi gặp

ở trẻ sơ sinh [4, 38, 48] Đối với những người sống ngoài vùng lưu hành vi rút VNNB, nguy cơ mắc bệnh VNNB đối với các lứa tuổi là ngang nhau Khách du lịch tới Châu Á rất dễ bị nhiễm vi rút VNNB, tuy nhiên nguy cơ này còn phụ thuộc rất nhiều yếu tố như mùa du lịch, nơi đến, thời gian sống trong vùng có vi rút VNNB lưu hành, nguy cơ tiếp xúc với muỗi truyền bệnh [60, 78]

Các nghiên cứu cũng đã xác định các loài chim hoang dại hoặc chim di

cư là ổ chứa vi rút qua giám sát huyết thanh học hoặc bằng kết quả phân lập vi rút [20, 29, 78] Điều tra về sự liên quan giữa các trường hợp VNNB và tỷ lệ lợn có kháng thể kháng vi rút VNNB bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu cho thấy chúng có mối liên quan mật thiết tỷ lệ thuận: ở những nơi tỷ lệ kháng thể kháng vi rút VNNB thấp khoảng 50 % trong quần thể lợn thì không phát hiện được trường hợp nào bị VNNB [8, 52, 55]

Hiện tại, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu bệnh VNNB, nên điều trị triệu chứng là chủ yếu Do vậy, phòng bệnh VNNB là biện pháp tốt nhất Về nguyên

lý, phòng bệnh là cắt đứt một trong ba mắt xích của dây chuyền dịch tễ: ổ chứa

vi rút (chim, lợn), vec-tơ truyền bệnh (các loài muỗi Culex) và đối tượng cảm

nhiễm người [29, 36, 38, 78] Trên thực tế, loại trừ vi rút từ ổ chứa không thể kiểm soát được vì các loài chim di cư bị nhiễm vi rút sẽ mang các vi rút từ vùng này đến vùng khác, mặt khác những nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh vi rút VNNB tồn tại ở chim qua mùa đông [38, 45, 54, 78]; việc tiêm phòng văc-xin cho đàn lợn cũng khó thực hiện vì sự luân chuyển liên tục của đàn lợn trong khoảng vài tháng Biện pháp diệt trừ muỗi trưởng thành và bọ gậy không thể triệt để vì muỗi truyền vi rút VNNB thường sống ngoài đầm lầy, đồng ruộng, chuồng gia súc và những vật dụng khác nên khó tiêu diệt sự thay đổi hệ thống tưới tiêu nước có thể hạn chế được sự phát triển của véc-tơ truyền bệnh, nhưng biện pháp này chủ yếu được thực hiện ở những nước kinh tế phát triển như Nhật Bản Do vậy, biện pháp phòng bệnh có hiệu quả là sử dụng vắc-xin để phòng bệnh cho các đối tượng có nguy cơ cảm nhiễm [18, 32, 46, 55, 78, 81, 87]

Kháng thể kháng vi rút VNNB được tạo ra sau nhiễm tự nhiên hoặc sau tiêm phòng vắc-xin VNNB (trừ một số trường hợp thiểu năng miễn dịch), tuy

nhiên sự xuất hiện và tồn lưu của kháng thể trong nhiễm tự nhiên có biểu hiện lâm sàng khác với nhiễm tự nhiên không có biểu hiện lâm sàng và tiêm phòng vắc-xin VNNB [29, 45, 63, 85, 86] Trong nhiễm tự nhiên, hoạt động của hệ thống miễn dịch tạo kháng thể thường xẩy ra trước khi có triệu chứng lâm sàng Thông thường, trong dịch não tủy không có kháng thể do cơ chế hàng rào

“máu-não”, nhưng khi có vi rút xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương, kháng thể sẽ qua hàng rào “máu-não” để thực hiện chức năng bảo vệ Trong các trường hợp nhiễm vi rút Arbo có hướng tính thần kinh, nếu không phân lập được vi rút trong dịch não tuỷ, nhưng phát hiện được sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng vi rút trong dịch não tuỷ đã đủ tiêu chuẩn để xác định được vai trò gây bệnh của vi rút Kết quả phát hiện được kháng thể trong dịch não tủy được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán các nhiễm vi rút Arbo có hướng tính thần kinh nói chung và nhiễm vi rút VNNB nói riêng Theo cơ chế bệnh học, kháng thể xuất hiện trong dịch não tủy để diệt trừ vi rút, bảo vệ hệ thần kinh trung ương trước sự tấn công của vi rút Do vậy, hiệu giá kháng thể kháng

vi rút VNNB trong dịch não tủy thường cao hơn trong máu [3, 6, 16, 22, 37, 45, 51] Trong trường hợp nhiễm ẩn (hoặc tiêm phòng vắc-xin), vi rút VNNB không xuất hiện trong hệ thống thần kinh trung ương nên cơ thể không có biểu hiện bệnh lý gì và trong dịch não tủy không có kháng thể, nhưng sự nhiễm ẩn được ghi nhận bằng sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng vi rút VNNB trong huyết thanh

Có ít nhất 3 loại kháng thể được tạo ra sau khi nhiễm vi rút, đó là kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu, kháng thể kết hợp bổ thể và kháng thể trung hoà Mỗi kháng thể có đặc trưng riêng về thời gian xuất hiện, sự gia tăng hiệu giá, thời gian tồn tại và tính đặc hiệu Tuy nhiên về bản chất kháng thể là các

globulin miễn dịch gồm 5 lớp, trong đó IgG và IgM là các kháng thể chiếm tỷ lệ chủ yếu trong dịch thể IgM xuất hiện sớm sau khi nhiễm vi rút và tồn tại khoảng 30 - 90 ngày tuỳ theo nhiễm tiên phát hay nhiễm thứ phát IgG xuất hiện muộn hơn và tồn tại trong một thời gian khá dài có khi suốt đời Do vậy việc phát hiện được IgM kháng vi rút trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng là bằng chứng của sự mới nhiễm vi rút [22, 43, 45, 46, 51, 67, 86]

Trong chẩn đoán VNNB trước đây thường sử dụng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu, kỹ thuật kết hợp bổ thể Tuy nhiên, để chẩn đoán bằng những kỹ thuật này cần có cặp máu kép lấy trong khoảng thời gian nhất định sau khi khởi bệnh Do vậy, thường chỉ có khoảng 10 – 20 % số mẫu nhận được đáp ứng yêu cầu cho chẩn đoán, mặt khác thời gian thực hiện phản ứng kéo dài

vì các mẫu huyết thanh phải xử lý trước khi làm phản ứng [2, 3, 21] Trong những năm đầu của thập kỷ 80, nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA được đề xuất cho việc phát hiện IgM trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng Chính vì vậy, nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA được ứng dụng trong trong chẩn đoán nhiều loại vi rút như trong chẩn đoán vi rút Sởi, vi rút Dengue, vi rút VNNB Cho đến nay, có rất nhiều kỹ thuật được phát triển để ứng dụng trong chẩn đoán VNNB như kỹ thuật DOT BLOT , đặc biệt kỹ thuật ngưng kết hạt được các nhà khoa học Nhật Bản phát triển trong những năm đầu của thế kỷ 21 là kỹ thuật dựa trên nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA và kỹ thuật ngưng kết, nên có

ưu điểm phát hiện được nhanh IgM trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng không cần

xử lý mẫu như kỹ thuật MAC-ELISA, kết quả đọc bằng mắt thường như kỹ thuật ngưng kết, rất thích hợp để triển khai kỹ thuật ở những vùng nông thôn nghèo Tuy nhiên kỹ thuật MAC-ELISA vẫn chiếm ưu thế và là kỹ thuật chuẩn thức trong chẩn đoán sự nhiễm các vi rút Arbo, đặc biệt ở những nơi có lưu

hành cả vi rút Dengue và vi rút VNNB – cùng chi Flavi như ở Việt Nam, Thái Lan [37, 46, 49, 51, 58, 59, 73]

Tương tự như các vi rút trong chi Flavi, vi rút VNNB có vật liệu di truyền khoảng 11 Kb, mã hoá cho 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc Các protein này có những đặc tính kháng nguyên đặc trưng và liên quan đến tính chất gây bệnh của vi rút [19, 71, 76, 82] Phân tích về sự phát triển tiến hoá của vi rút VNNB dựa vào kết quả so sánh trình tự toàn bộ vùng gen vỏ đã xác định vi rút VNNB có 5 nhóm genotyp Trong 5 genotyp này, genotype 4 được ghi nhận có độc lực thấp nhất Sự phân vùng của các genotyp cũng khác nhau tuỳ theo từng giai đoạn, trước những năm 1990, vi rút VNNB genotyp 1 chủ yếu lưu hành ở Thái Lan, các chủng vi rút VNNB genotyp 1 được phân lập phần lớn từ muỗi và lợn, chỉ có 5 chủng vi rút VNNB genotyp 1 được phân lập

từ bệnh nhân ở Thái Lan trong những năm 1970; ngược lại các chủng vi rút VNNB genotyp 3 phân bố rộng rãi hơn ở hầu khắp các nước trong khu vực châu Á Đây chính là cơ sở để lựa chọn chủng vi rút VNNB thuộc genotyp 3 để sản xuất vắc-xin VNNB để phòng bệnh trên thế giới [19, 26, 31, 42, 47, 57, 64,

66, 68, 80]

Trong những năm gần đây, sự lan rộng của vi rút VNNB đã được xác định bằng kết quả phân lập vi rút ở những vùng trước đây bệnh VNNB không được ghi nhận như miền bắc nước Úc, hoặc có sự mới xuất hiện vi rút VNNB genotyp 1 ở Nhật Bản, Nam Triều Tiên và miền bắc Việt Nam Lý do cho sự lan rộng của vi rút VNNB và mới xuất hiện của vi rút VNNB genotyp 1 cho đến nay có nhiều giả thiết, một trong những giả thiết đó là do chim di cư, nhưng cho đến nay vẫn chưa có công bố nào về kết quả phát hiện được vi rút VNNB từ các

loài chim di cư [26, 42, 50, 56, 61, 62, 68, 80, 88] Việc chưa tìm ra câu trả lời thoả đáng cho sự lan rộng và mới xuất hiện của vi rút VNNB ở nhiều nước là một lo ngại cho việc phòng bệnh trong tương lai

2.1.2 Nghiên cứu vắc-xin VNNB, các loại vắc-xin hiện nay đang sử dụng, hướng dự kiến cho vắc-xin VNNB toàn cầu

Vi rút VNNB gây HCNC có tỷ lệ tử vong và di chứng cao nên nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh được Mitamura và cộng sự quan tâm nghiên cứu thử nghiệm sản xuất vắc-xin VNNB từ não chuột vào năm 1936 (sau một năm vi rút VNNB được xác định ở Nhật Bản) Quy trình sản xuất vắc-xin VNNB từ não chuột ngày càng được cải tiến nâng cao, đến năm 1965 quy trình sản xuất vắc-xin VNNB từ não chuột kết hợp hai phương pháp hoá- lý: xử lý bằng protamin sulfate, bất hoạt bằng formalin và siêu ly tâm để có được vắc-xin VNNB tinh khiết, an toàn và có công hiệu cao [65, 66, 78, 81]

Hiện tại, có 3 loại vắc-xin VNNB đang được sử dụng, nhưng loại vắc-xin

sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới khoảng 30 năm nay vẫn là vắc-xin bất hoạt sản xuất từ não chuột bằng chủng vi rút Nakayama [18, 38, 46, 55, 65, 78, 84] Loại vắc-xin bất hoạt sản xuất từ não chuột lần đầu tiên được phép sử dụng ở Nhật Bản năm 1954 Vắc-xin VNNB bất hoạt từ não chuột được sản xuất từ chủng Nakayama và chủng Beijing-1 là vắc-xin duy nhất hiện nay được quốc tế công nhận, hiệu lực bảo vệ sau 2 liều là 80 – 91 % Cho đến nay, công nghệ sản xuất này đã được chuyển giao cho một số nước trong khu vực châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Việt Nam và Thái Lan Loại vắc-xin bất hoạt trên tế bào thận chuột đất vàng (BHK) được sản xuất từ chủng P3 ở Trung Quốc

từ năm 1967, hiệu lực bảo vệ của vắc-xin khoảng 76 – 95 % Do vậy, việc sản xuất vắc-xin này đã giảm dần trong nhiều năm qua với sự phát triển song song

một loại vắc-xin sống giảm độc lực sản xuất ở Trung Quốc từ chủng

SA-14-14-2 trên tế bào thận chuột đất vàng Những kết quả thử nghiệm vắc-xin này cho thấy tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh là 99 – 100 % sau 2 liều và hiệu quả bảo vệ là

98 – 99,8 %, không có trường hợp nào bị viêm não do vắc-xin được ghi nhận Như vậy, chỉ cần tiêm nhắc lại lần thứ hai là đảm bảo có miễn dịch suốt đời, giá thành một liều vắc-xin thấp [18, 38, 46, 66, 77, 78, 81] Vắc-xin bất hoạt ưu điểm an toàn, nhưng kháng thể tạo ra bởi vắc-xin thường giảm dần theo thời gian, nên sau khi tiêm đủ 3 liều cơ bản cần có sự tiêm nhắc lại khoảng 3 - 4 năm / lần cho đến khi trẻ 15 tuổi Mặt khác giá thành một liều vắc-xin bất hoạt tinh khiết sản xuất từ não chuột thường cao Do vậy, cho đến nay mới chỉ có một số nước có nền kinh tế phát triển như Nhật Bản, Nam Triều Tiên sử dụng vắc-này rộng rãi để khống chế bệnh Vắc-xin sống giảm độc lực có ưu điểm là tạo được miễn dịch bền vững sau khi tiêm, tuy nhiên vắc-xin này mới chỉ được công nhận ở cấp quốc gia, chưa được quốc tế công nhận, nên hiện tại vắc-xin mới được sử dụng ở một số nước Trung Quốc, Nepal và Triều Tiên, cho thấy cần tiến hành thử nghiệm vắc-xin này ở nhiều nước khác ở châu Á như Việt Nam, Thái Lan để xác định lại phản ứng phụ và hiệu quả bảo vệ của vắc-xin [29, 66, 78, 81, 84] Như vậy nguồn vắc-xin VNNB rất phong phú, tuy nhiên để khống chế bệnh VNNB ở khu vực châu Á, rất cần có một loại vắc-xin phòng VNNB an toàn, có số lượng lớn đáp ứng nhu cầu sử dụng và là vắc-xin có tính miễn dịch cao trong cả đời tiêm không quá hai liều

2.1.3 Điểm lại các nước đã khống chế bệnh VNNB bằng vắc-xin:

Nếu không có vắc-xin, bệnh VNNB có thể là một trong những vấn đề y

tế nghiêm trọng nhất ở châu Á Giám sát bệnh VNNB trước và sau tiêm phòng vắc-xin VNNB ở một số nước như Nhật Bản, Triều Tiên là một minh chứng cho nhận định này Ở Triều Tiên, trước khi sử dụng vắc-xin phòng bệnh (1949

– 1958) số các trường hợp VNNB trung bình hàng năm là 1.669, nhưng sau giai đoạn tăng cường sử dụng vắc-xin phòng bệnh (1986 – 2000) số các trường hợp VNNB trung bình hàng năm là 1,1 – giảm 99,9 % nhờ sử dụng vắc-xin VNNB

để phòng bệnh Tương tự như vậy, ở Nhật Bản trước khi sử dụng vắc-xin VNNB để phòng bệnh (1949 – 1958), số các trường hợp VNNB trung bình hàng năm là 2.882, nhưng sau giai đoạn tăng cường sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho tất cả các đối tượng cảm nhiễm (1986 – 2000), số các trường hợp VNNB trung bình hàng năm là 12,6 – giảm 99,6 % các trường hợp VNNB Còn

ở Trung Quốc, vụ dịch VNNB lớn đầu tiên được ghi nhận vào năm 1966 với 150.000 trường hợp, vụ dịch VNNB lớn thứ hai xẩy ra sau đó năm năm với số mắc lên đến 180.000 trường hợp; tuy nhiên, trong những năm gần đây số mắc VNNB ở Trung Quốc đã giảm, còn khoảng 20.000 – 40.000 trường hợp/năm nhờ kết quả tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB [38, 66, 78, 81] Như vậy, việc

sử dụng vắc-xin VNNB để phòng bệnh rất hiệu quả, cho thấy có thể khống chế bệnh VNNB trong tương lai nếu có đủ vắc-xin để phòng bệnh

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

2.2.1 Tình hình bệnh VNNB ở Việt Nam, các biện pháp phòng bệnh:

Ở Việt nam, năm 1959 dịch viêm não mùa hè đầu tiên được xác định là

do vi rút VNNB bằng chẩn đoán huyết thanh học tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương Năm 1964 chủng vi rút VNNB được phân lập lần đầu tiên từ não

tử thi một bệnh nhân sống ở Đông Anh ngoại thành Hà Nội, chủng vi rút có ký hiệu HN-60, được xác định thuộc genotyp 3, có vật liệu di truyền tương tự như chủng vi rút Nakayama [11, 31]

Hàng năm ước tính có khoảng 2000 – 3000 trường hợp bị HCNC nghi ngờ do vi rút; cho đến nay có nhiều loại vi rút gây HCNC đã được phát hiện ở Việt Nam nhưng theo kết quả giám sát vi rút học cho thấy vi rút VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây HCNC có tỷ lệ tử vong và di chứng cao, chiếm tỷ lệ khoảng 30% - 50 % trong số các trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút, các tác nhân khác với những tỷ lệ được xác định khác nhau tuỳ từng năm, như có khoảng 6 – 20 % do vi rút Nam Định trong các năm 1998 - 2004, khoảng 5 %

do vi rút herpes và khoảng 2 % do vi rút đường ruột trong năm 2003, số còn lại chưa rõ căn nguyên [5, 7, 10, 13, 15] Bệnh VNNB lưu hành ở hầu khắp các tỉnh đồng bằng, miền núi, trung du Các ổ dịch lớn phần lớn tập trung tại các vùng đồng bằng trồng lúa nước hoặc vùng bán sơn địa ở miền Bắc như: Thái Bình, Bắc Ninh, Hải Dương, Ninh Bình, ngoại thành Hà Nội, Hải Phòng Cho đến nay đã xác định có sự lưu hành của vi rút VNNB ở tất cả các miền của Việt Nam; tuy nhiên do điều kiện sinh thái khác nhau, bệnh VNNB xẩy ra thành dịch vào mùa hè ở miền Bắc; ở miền Nam, các trường hợp VNNB xẩy ra rải rác quanh năm [1, 7, 10, 17, 38]

Theo số liệu thống kê, tỷ lệ HCNC nghi ngờ do vi rút dao động trong khoảng 4,16 – 4,78/100.000 dân trong các năm 1994 – 1996 Do tác động của việc tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB phòng bệnh trong chương trình tiêm chủng mở rộng từ năm 1997, tỷ lệ này có xu hướng giảm trong các năm gần đây, dao động trong khoảng 2,16 – 2,96/100.000 dân trong các năm 1998 –

2005 và năm 2006 chỉ còn 1,96/100.000 dân (theo số liệu thống kê dịch tễ của Viện Vệ sinh Dịch tế Trung Ương

Dựa vào kết quả phân lập, đã xác định chim hoang dại (chim Liếu điếu), lợn là những ổ chứa vi rút trong tự nhiên và gần người Những nghiên cứu về

sinh thái sự tồn tại của vi rút VNNB trong tự nhiên đã xác định sự chuyển đổi kháng thể ở lợn được ghi nhận quanh năm ở miền Bắc Việt Nam Hơn thế nữa,

vi rút VNNB cũng được phân lập từ máu lợn trong cả mùa đông là minh chứng gián tiếp xác định sự tồn tại của vi rút trong tự nhiên qua mùa đông ở muỗi; mặt

khác, bằng kết quả phân lập được vi rút từ Culex tritaeniorhynchus F1 nuôi trong phòng thí nghiệm đã khẳng định vi rút VNNB được duy trì tự nhiên ở một

số loài muỗi bằng cách truyền vi rút sang thế hệ sau qua trứng [11, 55] So sánh tần suất nhiễm vi rút VNNB trong quần thể lợn ở miền Bắc (Hà Tây) và Tây Nguyên (Gia Lai) cho thấy tần suất nhiễm vi rút VNNB trong quần thể lợn ở miền Bắc chủ yếu tập trung trong các tháng 4, 5, 6 và 7; tỷ lệ nhiễm vi rút VNNB trong quần thể lợn ở Hà Tây được xác định cao nhất trong tháng 6 với tỷ

lệ dương tính là 82 %, ngược lại tần suất nhiễm vi rút VNNB trong quần thể lợn

ở Tây Nguyên thấp, rải rác quanh năm Đối chiếu tần suất nhiễm vi rút trong quần thể và các trường hợp VNNB cho thấy có tương quan tỷ lệ thuận với các

vụ dịch VNNB thường xẩy ra vào mùa hè từ tháng năm đến tháng bảy ở miền Bắc, ở miền Nam, Tây Nguyên dịch mang tính chất tản phát quanh năm [7, 8, 10]

Bệnh VNNB có tỷ lệ tử vong và di chứng cao, gây hậu quả nặng nề cho gia đình và xã hội Nghiên cứu dịch tễ huyết thanh học xác định vùng trọng điểm dịch, chẩn đoán phát hiện sớm có ý nghĩa quan trọng định hướng cho việc phòng bệnh có hiệu quả Từ năm 1988, theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới, kỹ thuật MAC-ELISA đã được ứng dụng trong chẩn đoán VNNB ở Việt Nam thay thế cho kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu và kết hợp bổ thể Song song với việc tiếp nhận kỹ thuật mới, nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm MAC-ELISA và chuyển giao kỹ thuật MAC-ELISA chẩn đoán VNNB cho các phòng xét nghiệm của bệnh viện, trung tâm Y tế dự phòng các tỉnh cũng được thực

hiện từ những năm 1995 góp phần xác định vùng trọng điểm dịch cho hoạch định chiến lược sử dụng vắc-xin để phòng bệnh [3, 73]

2.2.2 Nghiên cứu tiếp nhận công nghệ sản xuất vắc-xin VNNB ở Việt Nam:

Phòng bệnh bằng vắc-xin VNNB là biện phát duy nhất có hiệu quả, tuy nhiên do Việt Nam chưa sản xuất được vắc-xin nên trước những năm 90 việc phòng bệnh chủ yếu là kiểm soát các véc-tơ truyền bệnh Thực tế cho thấy có vắc-xin để phòng bệnh là một nhu cầu cấp thiết, nhờ sự tài trợ của Tổ chức Y tế thế giới, công nghệ sản xuất vắc-xin VNNB tinh khiết bất hoạt từ não chuột đã được chuyển giao từ Viện BIKEN, Nhật Bản và đến năm 1993 những loạt vắc-xin VNNB đầu tiên sản xuất tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ chủng Nakayama đã được cấp phép thử nghiệm lâm sàng [18, 55] Quy mô sản xuất vắc-xin VNNB cũng ngày càng mở rộng, từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy

mô công nghiệp để đáp ứng ngày càng cao nhu cầu sử dụng vắc-xin VNNB không những ở trong nước mà còn để xuất khẩu Mặt khác, nghiên cứu chuyển đổi chủng sản xuất vắc-xin VNNB từ chủng Nakayama sang chủng Beijing -1 cũng được thực hiện trong những năm đầu của thế kỷ 21 để có vắc-xin VNNB

có tính kháng nguyên cao Tuy nhiên, dự kiến phát triển một vắc-xin mới từ tế bào để thay thế vắc-xin bất hoạt sản xuất từ não chuột cũng đã được đề xuất

2.2.3 Tình hình khống chế bệnh VNNB bằng vắc-xin ở Việt Nam:

Trong những năm 1986 – 1988, kết quả thử nghiệm vắc-xin VNNB sản xuất tại Viện BIKEN, Nhật Bản thực hiện tại huyện Đông Anh, ngoại thành Hà Nội đã góp phần làm giảm các trường hợp VNNB tại huyện này: trong các năm

1990 - 1995 không có trường hợp nào tiêm phòng vắc-xin VNNB bị bệnh, số các trường hợp VNNB ở Đông Anh đã giảm chỉ còn một vài trường hợp trong các năm 2000 [5, 7, 17]

Thử nghiệm vắc-xin VNNB sản xuất tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã được thực hiện tại huyện Gia Lương, Hà Bắc trong các năm 1993 –

1994, kết quả đã làm giảm số các trường hợp bị VNNB, trong các năm 1998 -

1999 không có trường hợp VNNB nào được ghi nhận [5, 77] Sau kết quả thử nghiệm này, vắc-xin VNNB được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng để phòng bệnh cho trẻ em từ năm 1997 Tuy nhiên do kinh phí còn hạn hẹp nên trước năm 2000 vắc-xin VNNB được ưu tiên sử dụng cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi trong các vùng trọng điểm dịch ở miền bắc với 3 liều sơ chủng (hiện tại chưa có kinh phí để tái chủng) Việc sử dụng vắc-xin VNNB cho em từ 1 đến 5 tuổi đã được triển khai trong cả nước, ước tính có khoảng 60% trẻ em từ 1 đến 5 tuổi được tiêm phòng vắc-xin VNNB đã góp phần làm giảm có ý nghĩa số mắc VNNB trong nhóm tuổi này từ 37 % trong các năm 1989 – 1995 xuống còn 17

% trong các năm 2001 – 2002 [7, 10]

Chương 3 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế nghiên cứu:

Trong nghiên cứu này thiết kế nghiên cứu được thực hiện là nghiên cứu cắt ngang và sử dụng mẫu ngẫu nhiên đơn

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu:

3.2.1 Chọn mẫu:

Mẫu huyết thanh, mẫu dịch não tuỷ lấy từ bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút từ năm 1998 - 2007, các mẫu được lấy và bảo quản theo quy định chung cho việc lấy mẫu để chẩn đoán các bệnh do nhiễm vi rút Arbo có hướng tính thần kinh như vi rút West Nile, vi rút VNNB Các mẫu huyết thanh sử dụng trong chẩn đoán không bị huyết tán hoặc nhiễm trùng

Chọn mẫu theo tiêu chuẩn lý tưởng đối với một bệnh nhân HCNC nghi ngờ

do vi rút: có được mẫu dịch não tuỷ và mẫu huyết thanh kép lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục Đối với các mẫu đơn dịch não tuỷ và huyết thanh được chọn trong nghiên cứu là những mẫu máu được lấy sau mắc bệnh 7 ngày 3.2.2 Cỡ mẫu:

Cỡ mẫu dự kiến thực hiện là 700 mẫu, mỗi mẫu được xét nghiệm 2 lần với kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3 Thực tế số mẫu sử dụng cho nghiên cứu là 788 mẫu được thu thập từ 671 bệnh nhân trong các năm 1998

- 2007 bao gồm: có 300 bệnh nhân chỉ thu thập được một mẫu dịch não tuỷ, 290 bệnh nhân chỉ thu thập được một mẫu huyết thanh, 45 bệnh nhân thu thập được mẫu huyết thanh kép, 36 bệnh nhân thu thập được mẫu dịch não tuỷ và mẫu huyết thanh kép

Mẫu để so sánh độ nhạy của các bộ sinh phẩm phát hiện IgM kháng vi rút VNNB: chọn 100 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân viêm não vi rút thu thập trong năm 2007 ở Thái Bình để chẩn đoán VNNB

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu:

Những bệnh nhân HCNC có chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ do vi rút với điều kiện dịch não tuỷ trong, không mầu

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu:

- Xác định độ nhạy của kỹ thuật MAC-ELISA đối với những mẫu máu và dịch não tuỷ của cùng một bệnh nhân lấy trong 7 ngày đầu của bệnh

- So sánh độ nhạy và đặc hiệu của kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3 trong chẩn đoán VNNB

- So sánh độ nhạy của bộ sinh phẩm MAC-ELISA, PEN TAX và PanBio phát hiện IgM trong mẫu huyết thanh và DNT

- Xác định căn nguyên vi rút VNNB gây HCNC trong số trẻ trẻ chưa tiêm xin VNNB và trong số trẻ đã tiêm vắc-xin VNNB Trên cơ sở đó, ước tính: tỷ lệ mắc VNNB trong số trẻ chưa tiêm vắc-xin VNNB trong nhóm trẻ từ 1 đến 5 tuổi, tỷ lệ mắc VNNB trong số trẻ đã tiêm vắc-xin VNNB trong nhóm trẻ từ 1 –

vắc-5 tuổi (kể cả các trường hợp tiêm không đúng quy định như không tiêm đủ 3 liều vắc-xin cơ bản)

- Xác định căn nguyên vi rút Arbo khác gây HCNC mới được phát hiện ở Việt Nam như vi rút Nam Định

3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:

Các chỉ tiêu nghiên cứu xác định dựa trên cơ sở nguyên lý kỹ thuật tóm bắt IgM để chẩn đoán VNNB

- Những trường hợp dương tính với kháng nguyên VNNB được kiểm tra xác định lại với kháng nguyên vi rút Dengue 4 typ để loại trừ các trường hợp HCNC do vi rút Dengue

- Xác định tỷ lệ có kết quả chẩn đoán phù hợp và không phù hợp giữa 3 loại bộ sinh phẩm

3.3.2.1 Nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA phát hiện IgM [3, 37, 51]:

Kh¸ng IgM g¾n trªn b¶n nhùa

KN VNNB

MÉu: IgM kh¸ng VNNB

IgG kh¸ng VNNB g¾n HRPO

Hình 3.1 Sơ đồ kỹ thuật MAC-ELISA của VNNB

Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB (JE IgM capture ELISA) gọi tắt theo tiếng Anh là MAC – ELISA dựa trên nguyên lý sử dụng một IgG kháng IgM người đặc hiệu chuỗi µ gắn trên phiến nhựa; IgM người có trong mẫu xét nghiệm kết hợp với IgG kháng IgM có trong mẫu xét nghiệm; khi cho tiếp xúc với kháng nguyên VNNB, nếu trong mẫu xét nghiệm có IgM

kháng vi rút VNNB, sẽ có phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể; khi cho tiếp xúc với cộng hợp là IgG kháng vi rút VNNB gắn enzym HRPO, phản ứng kết hợp sẽ xẩy ra Phát hiện phản ứng kháng nguyên kháng thể được thực hiện khi cho một dung dịch cơ chất không mầu Otho - Phenylenediamin / Hydrogen Peroxide, với sự xúc tác của Hydrogen Peroxide và sự có mặt của kháng thể gắn enzym HRPO, dung dịch cơ chất sẽ chuyển từ không màu thành màu vàng Dừng phản ứng bằng a xít, màu vàng chuyển thành màu nâu Sự có mặt của IgM đặc hiệu kháng vi rút VNNB trong mẫu được xác định gián tiếp qua sự chuyển màu và được ghi lại bằng máy đọc ELISA ở bước sóng phù hợp

về sự thay dổi mật độ quang học (optical density viết tắt OD)

* Phát hiện IgM kháng vi rút West Nile trong các mẫu dịch não tuỷ bằng kỹ thuật MAC-ELISA

* Phát hiện IgM kháng vi rút Nam Định trong các mẫu dịch não tuỷ bằng kỹ thuật ELISA IgM gián tiếp

3.3.2.2 Tiêu chuẩn nhận định kết quả:

a Tiêu chuẩn xác định mẫu xét nghiệm dương tính:

Chọn giá trị ngưỡng là 2, với điều kiện các chứng: OD blank ≅ OD chứng

âm ≤ 0, 200; OD chứng dương / OD chứng âm ≥ 2 Các mẫu thử dương tính khi: OD mẫu xét nghiệm / OD chứng âm ≥ 2 (tỷ số P/N ≥ 2)

Huyết thanh bệnh nhân được pha với tỷ lệ: 1/100, dịch não tuỷ của bệnh nhân được pha với tỷ lệ 1/10; ở độ pha loãng này nếu IgM kháng vi rút VNNB trong mẫu xét nghiệm được phát hiện với giá trị P/N ≥ 2, kết quả xét nghiệm dương tính; những mẫu có giá trị < 2, kết quả xác định âm tính

Trong những trường hợp OD blank, OD chứng âm ≤ 0.05, kết quả dương tính được tính theo giá trị ngưỡng trên: OD mẫu xét nghiệm ≥ 5 x OD chứng

âm, kết quả âm tính được tính theo giá trị ngưỡng dưới: OD mẫu xét nghiệm ≤

3 x OD chứng âm; mẫu có trị nằm trong khoảng [OD chứng âm x 3 < OD

mẫu xét nghiệm < 5 x OD chứng âm], cần lấy mẫu lần thứ hai để kiểm tra lại

b Tiêu chuẩn xác định bệnh nhân bị VNNB dựa trên kết quả xét nghiệm phát hiện IgM kháng vi rút VNNB

Tiêu chuẩn xác định bệnh nhân VNNB: có kết quả phát hiện IgM kháng

vi rút trong dịch não tuỷ dương tính, xác định có sự thay đổi (tăng hoặc giảm) hiệu giá kháng thể IgM đối với cặp mẫu huyết thanh kép

Trên cùng một bệnh nhân xét nghiệm mẫu dịch não tuỷ và huyết thanh được lấy cùng ngày, nếu kết quả xét nghiệm huyết thanh dương tính, kết quả xét nghiệm dịch não tuỷ âm tính, sẽ được kết luận bệnh nhân không bị VNNB

Trên cùng một bệnh nhân, không có sự thay đổi hiệu giá kháng thể IgM giữa mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và huyết thanh lấy trong giai đoạn lui bệnh sẽ được kết luận bệnh nhân không bị VNNB

3.3.3 Các công cụ nghiên cứu cụ thể

3.3.3.1 Sinh phẩm:

Bản nhựa: gắn IgG kháng IgM người đặc hiệu chuỗi µ

Kháng nguyên: kháng nguyên VNNB chế tạo bằng phương pháp

Sucrose-Axeton Kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 được chế tạo từ chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt Nam năm 2002 từ muỗi có ký hiệu 02VN105 Kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 3 được chế tạo từ chủng vi rút VNNB Nakayama (phân lập ở Nhật Bản)

Chứng dương: huyết thanh người có IgM kháng vi rút VNNB, kiểm tra âm tính

với kháng nguyên vi rút viêm gan B và vi rút HIV

Chứng âm: huyết thanh người không có IgM và IgG kháng vi rút VNNB, kiểm

tra âm tính với kháng nguyên vi rút viêm gan B và vi rút HIV

Cộng hợp: IgG chuột kháng vi rút Flavi gắn enzym peroxydaza

Cơ chất hiện màu: Ortho – Phenylendiamin (OPD) tinh thể

Dung dịch đệm pha cơ chất: dung dịch đệm photphat – citrat có chứa 0,03%

hydrogenperoxide

Dung dịch rửa bản nhựa: PBS – T

Dung dịch pha loãng: PBS pH 7,2, BSA, đỏ phenol, 0,1%Tween

Dung dịch dừng phản ứng: H2SO4.4N

Bộ sinh phẩm PEN TAX phát hiện kháng thể IgM kháng vi rút VNNB; bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán Dengue do Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm (NIID) Tokyo, Nhật Bản cung cấp; Bộ sinh phẩm Pan-Bio do tổ chức PATH cung cấp, kỹ thuật thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.3.3.2 Dụng cụ và trang thiết bị:

Pipet tự động hoặc bán tự động loại: 10–40 µl, 20–200 µl và 100–1000 µl; ống đong 500 ml hoặc 1000 ml; hệ thống máy rửa, máy ủ, máy đọc ELISA và các dụng cụ cần thiết khác

3.4 Phương pháp xử lý số liệu:

Phân tích và xử lý kết quả theo phương pháp thống kê Y học

Đánh giá tỷ lệ bảo vệ của vắc-xin theo công thức:

VE (%) = [(P1 – P2) : P1] x 100

VE: hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin

P1: tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm trẻ không tiêm vắc-xin

P2: tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm trẻ tiêm vắc-xin

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Đánh giá chất lượng bộ sinh phẩm phát hiện IgM để chẩn đoán căn nguyên vi rút gây HCNC

4.1.1 Loại mẫu bệnh phẩm thu thập để phát hiện IgM kháng vi rút VNNB

Có 788 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm được thu thập từ 671 bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút, trong số này có 36 (5,3 %) bệnh nhân thu thập được

cả 3 loại mẫu bệnh phẩm: dịch não tuỷ, và mẫu huyết thanh kép; có 46 (6,9 %) bệnh nhân thu thập được mẫu huyết thanh kép–như vậy số bệnh nhân thu thập được mẫu huyết thanh kép rất thấp, chiếm khoảng 12 % (6,9 % + 5,2 %), phần lớn bệnh phẩm thu thập để phát hiện kháng thể IgM kháng vi rút VNNB chỉ có một mẫu dịch não tuỷ (chiếm 44,7 %) hoặc một mẫu huyết thanh (43,2 %) Kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong các bệnh nhân chỉ thu thập được mẫu đơn dịch não tuỷ là 49,6 %, mẫu đơn huyết thanh là 33,8 %; ngược lại, trong số các bệnh nhân thu thập được mẫu huyết thanh kép hoặc thu thập được mẫu huyết thanh kép và dịch não tuỷ, tỷ lệ xác định IgM kháng vi rút VNNB trên 70 %

Bảng 4.1 Kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB

từ các loại mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật MAC-ELISA, 1998 - 2007 Loại bệnh phẩm Số trường hợp

xét nghiệm (%)

Số mẫu (+)

Số mẫu ( - )

Như vậy trong số 671 bệnh nhân được thu thập mẫu để xét nghiệm phát hiện IgM kháng vi rút VNNB có 305 trường hợp xác định dương tính chiếm tỷ

lệ trung bình là 45,5 %

4.1.2 Đánh giá chất lượng bộ sinh phẩm phát hiện IgM kháng vi rút VNNB

Bảng 4.2 Sự phù hợp kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA, PEN TAX và Pan-Bio

Trong số 100 mẫu huyết thanh đơn và dịch não tuỷ, xét nghiệm bằng ba

bộ sinh phẩm MAC-ELISA, Pan-Bio và PEN TAX, có 99 mẫu (99 %) có kết quả chẩn đoán phù hợp nhau bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA và PEN TAX; nhưng có 24 mẫu có kết quả trái ngược nhau về kết quả chẩn đoán bằng bộ sinh phẩm Pan-Bio nếu so sánh với kết quả chẩn đoán bằng hai bộ sinh phẩm MAC-ELISA và PEN TAX; các mẫu xác định âm tính bằng bộ phẩm MAC-ELISA và PEN TAX nhưng chẩn đoán dương tính bằng bộ sinh phẩm Pan Bio là những mẫu huyết thanh, ngược lại những mẫu xác định dương tính bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA và PEN TAX nhưng lại có kết quả xét nghiệm âm tính là những mẫu dịch não tuỷ

Có 36 bệnh nhân HCNC thu thập được mẫu huyết thanh kép và dịch não tuỷ để chẩn đoán VNNB; so sánh kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB

bằng bộ sinh phẩm PEN TAX và bộ sinh phẩm MAC-ELISA, hai bộ sinh phẩm này cho kết quả chẩn đoán phù hợp nhau bằng mẫu huyết thanh kép: xác định

10 trường hợp âm tính với kháng nguyên vi rút VNNB, 26 trường hợp HCNC được xác định do vi rút VNNB Tuy nhiên khi phân tích riêng rẽ từng lô mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục cho kết quả như sau: đối với mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp (lấy trong 7 ngày đầu của bệnh), kết quả phát hiện IgM bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA là 24/26 (92,3

%), bằng bộ sinh phẩm PEN TAX là 25/26 (96,1 %); với mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn hồi phục, kết quả phát hiện IgM bằng hai bộ sinh phẩm này phù hợp với nhau 26/26 (100 %) mẫu huyết thanh thu thập lần thứ hai phát hiện được IgM kháng vi rút VNNB So sánh hiệu giá IgM kháng vi rút VNNB của cặp mẫu huyết thanh có sự biến động hiệu giá kháng thể chênh nhau trên 4 lần

Bảng 4.3 Kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục Loại mẫu

huyết thanh

Loại bộ sinh phẩm

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu (+)

Số mẫu ( - )

kháng vi rút VNNB, tỷ lệ không phát hiện được IgM kháng vi rút VNNB trong giai đoạn cấp bằng bộ sinh phẩm này là 7,7 %(2/26 mẫu); bằng bộ sinh phẩm PEN TAX phát hiện được 25 mẫu có IgM kháng vi rút VNNB, tỷ lệ không phát hiện được IgM kháng vi rút VNNB trong giai đoạn cấp bằng bộ sinh phẩm này

là 3,8 % (1/26 mẫu)

Bảng 4.4 Kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong các

mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ lấy trong giai đoạn cấp

Mẫu lấy trong giai

đoạn cấp

Loại bộ sinh phẩm

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu (+)

Số mẫu ( - )

Phát hiện IgM kháng vi rút VNNB từ 788 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ bằng kỹ thuật MAC-ELISA với kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và

genotyp 3, kết quả xác định có 787 mẫu có kết quả phù hợp chẩn đoán bằng hai loại kháng nguyên này chiếm tỷ lệ là 99,9 % (410 mẫu dương tính và 377 mẫu

âm tính), chỉ có 1 mẫu có sự sai khác kết quả giữa hai loại kháng nguyên này chiếm tỷ lệ 0,1 %

Giám sát kết quả chẩn đoán VNNB bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA ở các tỉnh Bắc Giang, Hà Tây và Thanh Hoá, kết quả cho thấy sự sai khác kết quả chẩn đoán bằng bộ sinh phẩm này thấp nhất ở tỉnh Thanh Hoá (6,7 %), tiếp đến

là Bắc Giang (7,6 %) và Hà Tây là 9,3 % (sự sai khác về chẩn đoán giữa hai điểm chẩn đoán khác nhau cho phép < 10 %)

Bảng 4.5 Giám sát kết quả chẩn đoán VNNB bằng bộ sinh phẩm MAC-ELISA ở một số tỉnh

4.1.3 Độ nhậy của kháng nguyên vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3:

Sử dụng kháng nguyên VNNB genotyp 1 và genotyp 3 để phát hiện IgM kháng vi rút VNNB trong các mẫu bệnh phẩm, đã xác định sự phù hợp về kết quả phát hiện IgM kháng vi rút VNNB của 2 loại kháng nguyên này là 99,9 %