Phát triển và áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhanh một số căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy

Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đơn mồi xác định trực tiếp một số căn nguyên gây tiêu chảy: Escherichia coligây tiêu chảy, Shigellaspp., Salmonella spp., Vibrio cholerae. 2. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR) trong xác định trực tiếp Escherichia coligây tiêu chảy, Shigellaspp., Salmonella spp., Vibrio cholerae. 3. Nghiên cứu triển khai áp dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong xác định trực tiếp một số căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân

BOYTE

BAo cAo KET QuA NGHIEN coo at TAl CAP BO

Ten de tili:

Chu nhiem de t?ii: TS Nglly~n

Co quan (t6 chuc) chu trl de t?ii: TruOng D~i b(}c

Ma so de t?ii

Nam 2010

BAO CAO KET QUA NGHIEN COl] DE TAl CAP BO

Ten de tid:

Co quan (t6 chilc) chii tn de ali: TruOng D~i b4;)c Y Ha

Cap qmln ly:

Ma

Thffi gian th\fC hi~n:

T6ng kinh phi' th\fc hi~n de tid: 350 tri~u

Ngu6n khac:

Nam2010

DtS hoan thanh duqc cong trinh nay, thay m~t nh6m nghien cUu, toi xin bay t610i dun

OIl sfiu sac t6i:

- Lanh dc~lO Bq Y tc!, Vl;! Khoa hQC va Dao t~o, Vl;! tai chinh kc! toan: Co quan chu quan de tai da cho phep, c!p kinh phi va t~o mQi dieu ki¢n cho de tai

- Ban Giam hi¢u TnrOng D~i hQc Y Ha Nqi, BQ mon Vi sinh, Phong Quan Iy

Nghien cUu khoa hQc, Phong Tai chinh kc! toan, Phong Giao tai, cac Phong ban lien quan: Co quan chu tri de tai da cho phep, t~o dieu ki¢n thu~n lqi ve thOi gian, kinh phi, tu v!n, dQc ban thao, g6p ycho nh6m nghien CUu dtS de tai c6 thtS duqc hoan thanh

- Ban lanh d~o Vi¢n Cac b¢nh Truyen nhiem va Nhi¢t d6i Qu6c gia (nay la B¢nh vi¢n B¢nh Nhi¢t d6i Trung uOIlg, Khoa Xet nghi¢m da cho phep, ung hq, t~o dieu ki¢n cho thanh vien nh6m nghien CUu tht;rc hi¢n mqt phan cong vi¢c trong

de taL

- cac thay, co, cac nha khoa hQc trong va ngoai BQ mon Vi sinh, trong va ngoai TruOng D~i hQc Y Ha Nqi da dQc, g6p y, thong qua cac bai bao khoa hQc, cac bu6i thong qua de cUOIlg, bao v¢ Khoa lu~n, Lu~n van duqc tht;rc hi¢n trong nghien CUu nay

- cac thanh vien nh6m nghien CUu da hc!t long tham gia va d6ng g6p cong suc, tri tu¢ cho nghien coo nay

Ha Nqi, ngay 18 thang 1 nam 2010 Chu nhi¢m de tai

/&4~'/

TS Nguyen Vii Trung

BOVTt CONG HoA XA HOI cnu NGHiA VltT NAM

Hil Nri, ngay (;,2 {hangJ l1am 200n

QUYETDlNH

Vevi~c phe duy~t de tiii khoa hQc cong ngh~ cap B(>

Can cu Nghi dinh s6 49/2003/ND-CP ngay 15/5/2003 eua Chfnh phu quy d!nh ve

nang, nhi¢m VI:', quy~n h<,ln va co eau t6 ehue B¢ Y

Can eu Qui d,nh s6 16/2003/QD-BKHCN ngay 18/7/2003 eua B¢ Khoa hQe Ceng

ve vi~e tuy~n

va trien khai kg

ky tuy~n ehQn t6 ehue va eel nhan dang ky eM tri de tai KHCN cap B¢ dtrqe tMnh

Xet de ngh! eua Gng VI;! tnrang VI;! Khoa hQc - Dao t~o,

, Q UYET DlNH

Dieu 1 Phe duy¢t de tai khoa h9C c6ng ngh¢ cap BQ: Phdf friln va dp d~mg ky

thucJt peR Irong cha'n dodn nhanh m(Jt s6' clin nguyen gay fieu

- Chu nhi¢m de tai: TS Nguyen va

- Dan vi chu trl de t~ti: Tntirng D~/i hpc Y Ha

- Kinh phf dl! toan: 350000 OOOd (Ba tram nam mum' fri¢u dong)

tir ngiln sach sl! nghi¢p khoa h9c

- Thai gian thl!C hi¢n: 36 thdng (2006 - 20(9)

Dieu 2 Thu trUang dan vi chu trl va chu nhi¢m de tai c6 wkh nhi¢m tri~n khai cac n¢i dung nghien cUu theo de cuang d1:l dUQ'c phe duy¢t, djnh ky bao cao ket qua

' ',,­

ve co quan quan ly va thl!c hi¢n m9i quy djnh hi¢n hanh cua Nha nu6c ve ho~t d¢ng

Khoa h<;>c c6ng ngh¢ va chi lieu tai chinh

Dieu 3 Quyet dinh nay co hi¢u Il!c k~ llr ngay kyo

Dieu 4 Cac Ong, Ba V~I truang V~I Khoa h9C va Dao tl;lo, VI:! truang V~I Ke

hO',lch -Tai chinh, Thtl truang Dan vi chu lrl va chu nhi~m de tai ch!u (rach nhi¢m

thi hanh quyel d~nh nay

BOYTE CONG HoA XA HOI CHU NGHIA VItT NAM

Doc lap - Tu do -Danb pbuc

so: ~Al.5l /BYT-K2DT

vIv gia hi;Ul thl;lc hi¢n de tai Ha N¢i, ngay 2 i thtmg 12 nam 2009

NCKHc&pB¢

IKHANj

BQ y te nh~n duqc cong van s6 853/CV-YHN-NCKH ngay 14 thang 9 nam

2009 cua Truemg D/;\i hQc Y ha NQi ve vi~c xin gia h/;\n thgc hi~n de tai KHCN

cap BQ: Phat trien ky thu~t PCR trong chan doan nhanh mQt s6 can nguyen tieu chay

BQ Y te dong yde chu nhi~m de tai va truemg D/;\i hQC Y Ha NQi keo dai thOi gian thgc hi¢n de tai den 2/2010 vi nhiffig ly do khach quan De nghi thit trubng co quan chit trl chi d/;\o chu nhi~m de tai va nh6m nghien cUu khan truang

hoan thi¢n cac nQi dung nghien cUu de de tai duqc nghi¢m thu dung thOi h/;\n

tren

- Nhutn!n;

IT Nguyen Thi Kim Tien (hie); // / ' ,.;;;,;y;;!

TruOng D:;li hQc Y Hil N e)i CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VI:eT NAM

•

1 Ten de tili: "Phat triln kj thu(it peR trong chtin doan nhanh m()t so' cdn

nguyen gay tieu chdy"

2 Chu nhi~m de tili: TS Nguyen va Trung

3 Co quan chu tfi de tili: Truang D~i hQC Y Ha NQi

4 ThOi gian thqc hi~n de tili: 6/2006 - 2/2010 (c6 gia h~n de tai kern theo)

5 T6ng kinh phi thqc hi~n de tili: 350 tri¢u dong; trong d6 kinh phi tit ngan sikh

.\ ,,-~~

crrf34~

PhI} ll}c 4

(Danh sach nhfrng ca nhan da dong gop sang

duQ'c s~p x6p thea thu tl,l' da thoa

1 Ten D~ tai: Phat tri~n va ap dl}ng ky thu~t PCR trong ch§n doan nhanh mQt s6 din nguyen vi khu§n gay tieu chay

• Mii s6:

2 Thuqc Chuang trinh (n6u co):

3 Thai gian thl,l'c hi~n: Til thang 8 nam 2006 d6n thang 1 nam 2010

4 Co quan chu tri: TruOng D~i hQc Y Ha Nqi

5 Bq chu quan: Bq Y t~

6 Danh sach tac gia:

HQc ham, hQc vi, hQ va ten

r:;z" ,/ !

TS Nguy~n va Trung

3 CN Nguy~n Thi H6ng Nhung

4 CN Le Thi Hai

r~

-11:fol

BOYTE CONG HoA xA H(H CHU NGHIA V[~T NAM

TRDONG DA.I HOC Y HA N(H DQc l~p - TJ! do - H~nh phuc

S6: UO /QD-YHN-NCKH

Hd NQi, ngdy~O t)zfmg 01 nam 2010

QUYETD~NH

Vi vi¢c thanh ltJ,p H~i dong Khoa hqc cong ngh¢

nghi¢m thu cu sa de' tai cap Bf)

Hlltu TRUONG TRUONG D~I HOC Y HA N(H

- Can Cll ngh! dinh 56

nhi¢m V\l,

- Can Cll Quyet dinh 56 13/2004/QD ngay 25/5/2004 cua B¢ Khoa h9C Cong ngh~

hfmh qui dinh danh gia va nghi~m thu de tai khoa h9C va cong

- Thea de ngh! cua Gng chu nhi~m de tai ci:lp B¢, GngTruang phong Qmin 1y

QUYETBlNH

Dh!u 1 Nay thanh l~p HQi dong co s6 nghi~m thu d~ tai cap bQ :

" Phtit triin va tip d",ng kj thutJ-t peR trong chdn doan nhanh mf)t so ciin nguyen

vi khudn gay tieu chdy"

Chll nhi~m d~ tai: TS Nguyen Vo Trung

(co danh stich H¢i d6'ng kern theo)

Dieu 2 HQi dong nghi~m thu co nhi~m VlJ t8 chuc danh gia ket qua nghien CUu clla d~ tai thea qui dinh v~ th~ thuc danh gia va nghi~m thu cac d~ tai khoa h9C cong ngh~ do B9 Khoa h9C Cong ngh~ ban hanh

Dieu 3 Quyet dinh nay co hi~u l\l'c k~ tu ngay ky ,HQi dong se giai th~ sau khi hoan thanh nhi~m V\!

Dieu 4 Ong chu nhi~m d~ tai, ong truOng phong QL.NCKH va cac ong (ba) co ten

trang di~u 1 chiu trach nhi~m thi hanh quyet dinh nay

can nguyen vi khuftn gay tieu chay

Chu nhi¢m de tai: TS Nguyen Vii Trung

1 GS.TS Le Huy Chinh

2 PGS TS Bui Khac H~u

B¢nh vi~n nhi~t

HQc vi~n

Thu ki hc)i dong: ThS.Vii Th! V1!f1g

BS Nguyen Trung Hie'u

Nh~n Nh~n

UYVie~

BOYTE CONG HoA xA HOI CHU NGHIA VIeT NAM

HQi d6ng khoa hQc cong ngh~ nghi~m thu co sa dS tai c~p BQ duQ'c tha.nh l~p theo quy~t dinh 220/QD-YHN ngay 20 thing 01 nam 2010 cua Hi~u tWOng twang

D~i hQc Y Ha NQi da ti8n hanh phien hQp van h6i 14hOO ngay 28 thing 1 nam 2010 Ten d~ tai: Phat tri~n va ap dyng ky thu~t PCR trong chAn doan nhanh mQt sA din nguyen vi kh uAn tieu chay

Cho nhi~m d~ tai: TS NguySn Vii Trung - D~i hQc Y Ha NQi

Dia di@m hQp: HQi twang tfuIg 3 nha AI, Truong D~i hQc Y Ha NQi

ThiYi gian hQp: Ngay 28 thing 01 nam 2010

Cac thanh vien HQi d6ng thea quy~t dinh 220/QD-YHN, ngay 20/0112010

Trong do s3 thanh vien co rn~t/tbng s3: 7 thanh vien va 2 thu kY RD

S3 thanh vien v~ng m~t: 0 nguai

Khach mai :

- Cac thanh vien tham gia d8 tai:

Cac thanh vien hQi d6ng da phat biSu y ki~n:

1 VS muc dQ hoan thanh cua d8 tai: d~y du vS s3 luqng va chUng lo~ thea d8

cuang M\lc tieu so v6i dS cuang trong bao cao nghi~rn thu tac gia da chi ti8t xay

1

dl:mg thanh 3 ffil,lC tieu cl,l thS: (]) Nghien ctm pha" triSn ky thu~t PCR dun m6i xac

d!nh tn;l'c tiSp 111Qt 86 dm nguyen gay tieu chay (2) Phat triSn ky thu~t PCR da m6i

trong xcic dinh tqrc ti6p E coli gay tieu chay (3)Nghien clm triSn khai ap d\lng ky

thu~t PCR da m6i trong xac djnh trgc tiSp mQt s6 din nguyen vi khuk gay tieu chay

til' b~nh phAm phan

2 VG phuO'ng phap nghien ctm, bao cao khoa hQc, tai li~u cong ngh~: Dam bao

thea yeu cAu dG cuO'ng, phuung phap nghien clm khoa hQc Phuung phap nghien CLru

chu~n, d?t dQ chinh xac ca~ Hoan thi~n dAy du cac nQi dung nghien clm

3 VG tinh mai cua dS Uti: Day la dG tai dAu tien, mQt qui trinh PCR dun va da m6i xac dinh tfl;l'c tiSp E coli, Shigella, Salmonella trgc tiSp tir phan khong qua buac nuoi cdy dugc phat triSn thanh congo Qui trinh dun gian dS thgc hi~n, nhanh, khong

t6n kern co kha nang ap dl,lng rQng rai anhiSu cO' so vi sinh him sang

4 VS muc dQ trao d6i thong tin: DS tai co 2 bai bao dangtren TCNCYH Co trao d6i vai Vi~n Karolinska, Thuy' DiSn dS xin cac chung chu~n Bao cao neu dugc cac

kSt qua n6i b~t cua dG tai la xay dgng qui trinh xu ly tach chiSt ADN tir b~nh ph~m

phan va phat triSn qui trinh PCR xac djnh trgc tiSp cac lo?i vi khu~n

5 Cac kSt qua n6i b~t khac lien quan trgc tiSp dSn kSt qua nghien clm cua dS tai

Co gia trj khoa hQc xu§.t s~c va so sanh dugc vai kSt qua nghien Clru tuung tt! trinh

dQ qu6c tS

6 Ch§.t lugng san ph~m nghien CLru, trinh dQ cong ngh~ cua san ph~m: Qui trinh

PCR dun m6i va da m6i d?t dQ nh?y va dQ d~c hi~u tuung duung vai nuac ngoai

7 Quy mo ap d\lng kSt qua nghien ctm: Co thS ap d\lng rQng rai cho cac co so vi sinh lam sang 6 b~nh vi~n tuySn tinh trong nuac

8 T6 chuc quan ly dS tai: da dugc gi§.y xac nh~n cua phong Tai chfnh kS toan cua

Nha truOng vS chi tieu tai chinh DG tai da th\lc hi~n ch~m tiSn dQ so v6i dS cuung

dang ky nhung da dugc phep gia h?n thai gian thgc hi~n dS tai dSn thang 02/2010

9 Danh gia kSt qua dflO t?o: dao t?O 1 cao hQc, 1 sinh vien lam khoa lu~n t6t

nghi~p cu nhan ky thu~t y hQc

Danh sach nguai tham gia thl!c hi~n de Uti la nhfrng nguoi trgc tiSp triSn khai de

taL

Neu ro so sanh giua nuoi d.y va lam PCR dS lam nai b~t kSt qua dS tai

Tra 1M coa Ban cho nhiem d~ tai:

TiSp thu ykh~n cua HQi d6ng dS sua chua hoan thi~n ban bao cao truac khi nghi~m thu d.p BQ

Chu nhi~m da dS tai lam ro 1 s6 cau hoi cua cac thanh vi en trong HQi d6ng va cac phAn lam ro da duQ'c HQi d6ng chAp nh~n

3 HQi dAng k@t lu~n Cho nhi~m d~ tai cAn sua chua bin bao cao theo cac DQi dung sau:

BS tai da hoan thanh cac nQi dung dang kY thea dS cucmg (m\lc tieu, nQi dung, cac san phfun) CAn lam ro them mQt s6 vAn dS,ma HQi d6ng neu ra Sua chua mQt s6 16i chinh ta trong bao cao

III K@t qua danh gia coa HQi dAng:

HQi d6ng da ti~n hanh bo phi~u kin k~t qua nhu sau :

? ' , , '\

T13ng s13 phieu biiu:

- Tang s6 phi~u ph8.i ra: 7 phi~u

- Tang s6 phi~u thu vS: 7 phi~u

- Tang s6 phi~u hqp 1~ : 7 phi~u

Kit qua ilanh gia:

BiSm trung binh: 38,7 diSm

BiSm nQi dung 1: 7,7 q:iSm

K~t lu~n cua HQi d6ng d~ tai d'ilt lo'lli: d~t yeu cAu muc A

Phien hQp HQi d6ng k~t thuc h6i '17hOO, ngay 28 thang Olnam 2009

Ha N{ii, ngay 28 thang OJ nam 2010

(Ky va ghi ro hQ ten)

k

GS TS Le HuyChinh ThS Vfi Thi V\IDg BS.Nguy~n Trung Hi~u

3

TRU'(}NG HAl HOC Y HA NOI CONG HoA xA HOI CHir NGH[A VIf,T NAM H<)i d6ng KHCN d~nh gia k~t ql;a DQc l~p - TIf do - H~nh phuc

d~ tai cAp B<)

KIEM PHIEU CHAM DIEM

Ten D~ tai dUQ'c danh gia: Phat tri~n va ap dVng ky thu~t peR trong chtln doan

nhanh m¢t s6 din nguyen vi khufin gay tieu cha.y

Chit nhi¢m tlJ tiIi: TS Nguyin Vii Trung

- Dan vi chu tri d€ tai: TruOng D?i hQc Y Ha NQi

Diem trung binh cua cac thanh vien HD

-Ket qua xep A ? / I d O~I e al: A t'

Muc B Muc C

Bao cao k@t qua nghien ClfU d~ tai cAp B9

1 Ten d~ Uti: Phat tri~n va ap d\lng ky thu3t peR trong chin doan nhanh mOt s6 can nguyen vi khuin gay tieu chay

3 CO' quan chu tri d~ Uti: TruOng £)~i hQc Y Ha NQi

4 CO' quan quan ly d~ tai: BQ Y t~

6 Ph6 chu nhiem d~ tai ho~c ban chu nhiem d~ tai (n~u c6):

7 Danh sach nhfrng nguai th\lc hien chinh:

- TS Nguy~n Vii Trung

- Ths Le Thi Tuy~t Trinh

- CN Nguy~n

- CN Nguy~n Thi Minh Thu

8 Cac d~ tai nhanh (d~ m\lc) cua d~ tai (n~u c6)

(a) £)~ tai nhanh 1 (d~ m\lc 1)

- Ten d~ tai nhanh:

- Chu nhiem d~ tai nhanh:

(b) £)~ tai nhanh 2

- Ten d~ tai nhanh

- Chu nhiem d~ tai nhanh

9 Thai gian th\lc hien d~ tai til thang 8 nam 2006 d~n thang 1 nam 2010

Ml,;lC ll,;lc

Trang

Chuong I: T6ng quan

1.1 Tieu chay va din nguyen gay b~nh lieu chay

1.1.1 E coli gay b~nh tieu ehay (DEC)

1.1.2 Shigella spp, Salm o nella spp, va V cholerae

1.2 Ky thu~t peR

1.3 Cae nghien elm trong nu6e thuQc IInh V\XC nghien Clm

Chuong II: 86i tugng, v~t li~u va phuong phap nghien clm

2 1 D6i tugng nghien Clm

2 1 1 Cac chung vi khufin chufin

2.2 V~t li~u nghien Clm

2.2.1 V~t li~u dung cho nuai c~y va xac dinh vi khufin

2.2.2 Sinh phfim, hoa ch~t va may moc dung trong PCR

2.3 Phuong phap nghien clm

2.3.1 Nghien Clm thu nghi~m trong phong thi nghi~m

2.3.1.2 Chufin bi cac m~u phan

2.3.1.3 Ky thu~t tach chi~t ADN cua vi khu~n tf\XC ti~p tu phan

2.3.1.4 Ky thu~t PCR don m6i

2.3.1.5 Ky thu~t PCR da m6i

2.3.2 Nghien Clm rna ta lo~i di~u tra ngang

2.3.2.1 CO-m~u nghien clm cua di~u tra ngang

2.3.2.2 Phuong phap thu th~p s6 li~u

2.3.2.3 Phuong phap thu th~p b~nh phfim phan

2.3.2.4 Phuong phap nuai cay phan I~p

2.3.2.5 Nghien Clm ap d\lng ky th\lat PCR trong xac dinh tf\XC ti~p mQt s6

can nguyen gay tieu chay tu b~nh

2.3.3 Xu Iy s6 li~u

2.3.3.1 Dinh lugng ADN

2.3.3.2 Danh gia k~t qua PCR

2.3.3.3 Thu th~p va xu Iy s6 li~u

2.4 NQi dung nghien Clm

s6 vi

s6 vi khufin gay tieu chay thuo-ng g~p nhu: E

2.4.1.Nghien Clm phM tri~n ky thu~t PCR don m6i xac dinh tf\XC ti~p mQt

2.4.2.Nghien Clm phM trien ky thu~t PCR da m6i xac dinh tr\Xc ti~p mQt

2.4.3 Nghien Clm trien khai ky thu~t PCR trong xac dinh cac can nguyen

vi khufin gay tieu chay tf\XC ti~p tu b~nh

2.5 D~o duc trong nghien Clm

2.6 Thai gian nghien cuu

2.7 E>ia di€m nghien elm

Sa d6 qui trinh nghien Clm

3.1 Nghien cUu ph<it tri€n ky thu~t PCR dan m6i xac dinh tI1Jc ti€p mQt s6

vi khwln gay tieu chay: E coli gay d

3.1.1 K€t qua ki€m tra chung

3.1.2 K€t qua ki€m tra cac m~u phan

3.1.3 K€t qua ph<it tri€n qui trinh tach chi€t AND cua vi khufrn tI1Jc ti€p

3.1.3.1 T6i Uti hoa IUQ'ng nuac d.t d€ hoa tan 200 mg phan

3.1.3.2 Ph<it tri€n qui trinh tach chi€t ADN tI1JC ti€p t u phan

3.1.4 K€t qua phat tri€n ky thu~t PCR dan m6i xac dinh tI1JC ti~p mQt s6

vi khufrn gay tieu chay: E coli

Salmonella spp, V

3.2 Ph<it tri€n ky thu~t PCR da m6i xac dinh tI1Jc ti€p E coli gay tieu

3.2.1 Ph<it tri€n qui trinh

3.2.2 DQ nh~y (giai h~n ph<it hi~n) va dQ d~c hi~u clla PCR da m6i

3.2.2.1 Xac dinh dO nh~y Clla h~ th6ng PCR da m6i

3.2.2.2 Xac dlnh dO d~c hi~u clla h~ th6ng PCR da m6i

3.3 Nghien CUu tri€n khai ky thu~t PCR trong xac dinh tI1Jc ti~p mQt s6 din nguyen vi khufrn gay tieu chay tu b~nh

Chuang IV: Ban lu~n

4.1 Nghien Clm ph<it tri€n ky thu~t PCR dan m6i xac dinh tI1JC ti~p E coli

gay tieu chay, Shigella spp, Salmonella spp, V ch ole

4.1.1 Ph<it tri€n qui trinh tach chi~t ADN Clla vi khufrn tI1JC ti~p tu phan

4.1.2 Phat tri€n ley thu~t PCR dan m6i xac dinh tI1JC ti€p E coli gay tieu

chay, Shigella spp, Salmonella

4.2 Nghien cuu ph<it tri€n ky thu~t PCR da m6i xac dinh tI1Jc ti~p E coli

4.2.1 Ph<it tri€n ky thu~t PCR da m6i xac dinh tI1JC ti~p E coli gay tieu chay, Shigella spp, Salmonella

4.2.2 Xac dinh dO nh~y Clla h~ th6ng PCR da m6i

4.2.3 Xac dinh dO d~c hi~u clla h~ th6ng PCR da m6i

4.3 Nghien Clm tri€n khai ap d\lng ky th\lat PCR da m6i trong xac dinh tI1JC ti~p mOt s6 din nguyen vi khufrn gay tieu chay tu b~nh

P hI} l ~c 2

V~ t inh hi nh thl}'c hi~n va nhung d on g gop

cua d~ tai kh& c n cfip

1 Ten d~ tai: Phat tri~n va ap dl}ng ky t bu ~t peR tro ng ch in d o an nh an b mQt sa

din n guyen vi kbu ~n gay tieu chay

2 Thu(>c Chuong trinh (n~u c6):

3 Chu nhi~m d~ tai: TS N guy~n va T run g

4 Co quan chu tri d~ tai: Truang D~i hQc Y H a N(>i

5 Thai gian thlJC hi~n (BD-KT): 8 / 2006 d~n 112010 (c6 quy~t dinh gia h~)

6 T6ng kinh phi thlJc hi~n D~ tai: 350 000 000 d6ng

Trong d6, kinh phi tu NSNN: 350 000 000 d6ng

7 Tinh hinh thlJc hi~n d~ tai so vai d~ cuong:

7.1 1V~ muc d(> hoan thanh kh6i lm;mg cong vi~c

D~ tai da thlJc hi~n dfry du cac ml,lc tieu va n(>i nghien el IU d~ ra trong d~ cuong

, h' '~

7.21 vi i khoa h - - - - b ' - h~mKHCN ­

Sa n pb Am du kien tbeo de CUO'lle Sa n phA m dil t b\f c hien duO'c

Qui trinh cong ngh~: Qui tr~nh cong ngh~ (co kha nang ap dl,lng I

+ Qui trinh ley thu~t PCR don m6i xac thlJc te):

dinh trlJc ti~p E coli gay tieu chay, + Qui trinh Icy thu~t PCR don m6i xac

ph~ phan Shigella, Salmonella, V cholerae tu b~nh

+ Qui trinh ky thu~t PCR da m6i xac dinh ph~m phan

trlJC ti~p E coli gay tieu chay, Shigella, + Qui tri nh ley thu~t PCR da m6i xac dinh

phan

Cac bang so li~u: Cac bang so li~u (Khoa hQc, chinh xac)

+ Bang s6 li~u v~ ki~m tra chung, k~t qua + Bang s6 li ~u v~ ki~m tra chung, k~t qua

PCR, d(> nh~y, d(> d~c hi~u PCR, d(> nh~y, d(> d~c hi~u

+ Bang s6 li~u v~ k~t qua PCR vai cac + Bang s6 li~u v~ k~t qua PCR vai cac b~nh 2.h~m tren lam sang b~nh ph~ tren lam sang

+ Co 2 bai bao dang tren t~p chi co uy tin

uy tin trong nuac

+ it nh~t co 2 bai bao dang tren t~p chi co

trong nuac

I

+ 1 h9c vien cao h9C

+ 1 sinh vien nghien Clm khoa h9C

thanh cong):

+ 1 h9C vien cao h9C + 1 sinh vien nghie n Clm kh oa h9C bao v~ khoa Iu~n t6t nghi~p d~i h9C

Bao t~o can bi) ve ky thu~t PCR xac dinh tI1JC ti~p mi)t s6 din nguyen vi khu~n gay tieu chay

-Chuyen giao va dang ap dl,mg ky thu~t

PCR da m6i xac dinh E coli gay tieu

7.3 / V~ ti~n di) thlJc hi~n

B~ tai da duQ'c gia h~n them 6 thang d~n thang 2 / 2010

Tren co so so sanh v6i nhfrng thong tin da duQ'c cong b6 tren cac ~n ph~m trong

va ngoai nu6c d~n thai di~m k~t thuc d~ tai , d€ tai co nhfrng

8 1I V€ giai phap khoa h9C - cong

L~n d~u tien, mi)t qui trinh PCR danJda m6i xac dinh tn,rc t i~p E coli, Shigella

thanh congo Qui trinh dan gian, d~ thlJc hi~n, nhanh, kh ong t6n kern ,

ft;1ld7 1 ,ngayljthcmg ,-/ nam A,{J/u

CHU NH I~M DE TAl

4r~ \tt?'fo~~

2003 Tỷ lệ tử vong do tiêu chảy cũng giảm 2,4% ; 1,4% và 0,7% trong lần lượt các năm 1986-1987, 1990-1991, và 2003[7]

Có nhiều tác nhân vi sinh vật gây tiêu chảy như vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng Trong đó, các căn nguyên vi khuẩn đóng vai trò quan trọng Một số vi khuẩn hay

gây tiêu chảy thường gặp là Salmonella spp; Shigella spp; Escherichia coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic Escherichia coli-DEC) Đặc biệt gần đây, vai trò của DEC

đang thu hút được sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng và các nhà vi sinh [29]

Có nhiều phương pháp xác định các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy: Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu; Phương pháp thử nghiệm trên động vật thí nghiệm; Phương pháp miễn dịch; Phương pháp sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào; Các phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như lai ADN, phản ứng khuyếch đại gen - Polymerase Chain Reaction (PCR) Trong số các phương pháp trên, PCR rất hay được dùng vì kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao [29,

40, 53] Tuy nhiên cho tới nay, phần lớn các qui trình sử dụng PCR để xác định các

vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây tiêu chảy nói riêng, đều thông qua bước cấy bệnh phẩm phân trên các môi trường đặc, rồi tiến hành chọn lựa các khuẩn lạc để

2

tách chiết ADN của vi khuẩn cho phản ứng PCR Nh− vậy, cần ít nhất 24-30 giờ để phát hiện đ−ợc sự có mặt của vi khuẩn gây tiêu chảy trong phân [40, 46, 54]

Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn có ý nghĩa rất quan

trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân Nếu có

thể sử dụng kỹ thuật PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân sẽ giúp cho qui

trình xác định căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy chỉ còn vài gìơ Điều này sẽ góp phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán và điều trị Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm 3 mục tiêu:

1 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đơn mồi xác định trực tiếp một số căn

nguyên gây tiêu chảy: Escherichia coli gây tiêu chảy, Shigella spp., Salmonella spp., Vibrio cholerae

2 Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR) trong xác định trực tiếp

Escherichia coli gây tiêu chảy, Shigella spp., Salmonella spp., Vibrio cholerae

3 Nghiên cứu triển khai áp dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong xác định trực tiếp một số căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân

3

CHƯƠNG i: TổNG QUAN

1.1 Tiêu chảy và căn nguyên gây bệnh tiêu chảy

Tiêu chảy là một vấn đề y tế toàn cầu Hàng năm, có khoảng 1 tỷ trường hợp

bị tiêu chảy, trong đó, từ 2 đến 4 triệu trường hợp tử vong Bệnh chủ yếu gặp ở trẻ

em dưới 5 tuổi [3, 7, 29, 52] Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân hàng đầu

về tỷ lệ mắc và tử vong ở trẻ em, đặc biệt tại các nước đang phát triển Các căn nguyên vi sinh vật có thể gây tiêu chảy bao gồm virus, vi khuẩn, và ký sinh trùng Trong đó, căn nguyên vi khuẩn đóng vai trò quan trọng vì bệnh tiêu chảy do vi khuẩn gây ra chiếm một tỷ lệ cao, nhiều trường hợp có thể chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và điều trị bằng kháng sinh Ngoài ra, việc phòng bệnh tiêu chảy do vi khuẩn rất hiệu quả Các vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy

bao gồm các Escherichia coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic Escherichia coli-DEC),

Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni và Bacteroides fragilis sinh độc tố ruột [3, 7, 29, 40, 52] Tỷ lệ phân lập được các

DEC từ bệnh phẩm phân trong một số nghiên cứu từ 22% đến 30%, có nơi tới

60,3% Tỷ lệ này cao hơn so với các căn nguyên khác như Shigella spp., 4,7-6,1%;

Salmonella spp., 0,9-6%; Campylobacter spp., 7%; Bacteroides fragilis sinh độc tố

ruột, 7,3% (1,8,9)

1.1.1 E coli gây bệnh tiêu chảy (DEC)

Trong số các căn nguyên kể trên, các DEC đóng vai trò quan trọng E coli thuộc vi

khuẩn chí đại tràng của người Chúng bắt đầu xâm nhập và cư trú tại đó chỉ vài giờ

sau khi đứa trẻ ra đời E coli là loài vi khuẩn điển hình thuộc họ

Enterobacteriaceae, giống Escherichia E coli có nhiều vai trò quan trọng như góp

phần tiêu hóa thức ăn, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn đường ruột, tổng hợp một số

vitamin như E, K và phân giải muối mật Tuy nhiên, một vài loại E coli có các yếu

tố độc lực đặc thù đã tăng khả năng thích nghi ở các vị trí thuận lợi và có thể gây

bệnh Ba hội chứng lâm sàng hay gặp trong nhiễm trùng do các chủng E coli gây

4

bệnh là nhiễm trùng đường tiêu hoá/tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm

khuẩn huyết/viêm màng não (10) Có 5 loại DEC đã được xác định Chúng là E

coli bám dính kết tập ở đường ruột (enteroaggregative E coli-EAEC), E coli gây

xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E coli-EHEC), E coli xâm nhập

đường ruột (enteroinvasive E coli-EIEC), E coli gây bệnh lý đuờng ruột (enteropathogenic E coli-EPEC), và E coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E

coli-ETEC) [39] Các E coli này được phân loại dựa vào sự có mặt của một hay

nhiều loại gen độc lực khác nhau Các gen này mã hóa cho các protein đặc thù giúp cho sự bám dính, nhân lên, tiết ra độc tố và phá hủy các tế bào niêm mạc ruột, cũng như làm rối loạn các cơ chế hấp thu và bài tiết nước và điện giải trong lòng ruột [29] Hậu quả là bệnh nhân bị tiêu chảy Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy vai trò của DEC trong gây bệnh tiêu chảy ở người, đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi Aranda và cộng sự đã phân lập được các DEC với tỷ lệ 23% [15] Tỷ lệ căn nguyên này trong nghiên cứu của Okeke là trên 30% [44] Điều đó chứng tỏ rằng, các DEC

đóng vai trò vô cùng quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em Các gen độc lực

đã được xác định của các DEC bao gồm: gen tham gia điều hòa đặc tính bám dính kết tập của EAEC (aggregative adherence regulator-aggR), gen sản xuất ra độc tố gây độc tế bào Vero (Verotoxin-VT1, VT2), gen qui định sự xâm nhập của vi khuẩn vào biểu mô ruột (invasive antigen locus-ial) của EIEC, gen sản xuất ra các

protein gây tổng thương kiểu bám dính và xóa các nhung mao (eae, bfp) của EPEC,

gen qui định độc tố ruột LT (labile toxin), ST (stable toxin) của ETEC

E coli sống ở đại tràng của người và nhiều động vật khác nhau Vi khuẩn

theo phân ra ngoài và hiện diện trong đất, nước và không khí Tuy nhiên, một số

chủng E coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các

bệnh lý khác nhau Vào những năm 40 của thế kỉ trước, người ta xác định được khả

năng nhiễm trùng đường tiêu hoá, gây tiêu chảy của E coli

Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết thanh

và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC được chia làm 5 nhóm chính:

5

EPEC

Chủng E coli gây bệnh đường ruột loại này được phát hiện vào năm 1948

bởi Bray và Giles [29]

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

- EPEC gây tổn thương mô học dạng bám và gây thoái hoá (A/E) Sự bám của vi khuẩn vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hoá các vi nhung mao, tác động gây rối loạn quá trình hấp thu nước và điện giải

- Cơ chế gây tiêu chảy:

+ Tác động của EPEC trên niêm mạc ruột dẫn đến đứt gãy các sợi actin trong lõi của vi nhung mao Các vi nhung mao của các tế bào biểu mô bị thoái hoá, mất diềm bàn chải, gây kém hấp thu ở lòng ruột

+ Mặt khác, khi nồng độ Ca++ trong tế bào tăng sẽ ức chế quá trình hấp thu ion Na+ và kích thích quá trình bài tiết Cl-

+ Sự thay đổi trong cơ chế vận chuyển của các ion trong tế bào, và do đáp ứng với các phản ứng làm giảm khả năng vận chuyển màng, đã dẫn đến tăng tính thấm của tế bào biểu mô ruột

* Bệnh cảnh lâm sàng

- Thời kỳ ủ bệnh ngắn, khoảng 9-12 giờ (nghiên cứu trên người tình nguyện)

- Bệnh cảnh lâm sàng thường là tiêu chảy phân toàn nước, không có nhầy và máu;

6

+ Các gen mã hoá cho CFA nằm trên plasmid, và plasmid này chứa đồng thời các gen mã hoá cho các độc tố ruột không chịu nhiệt-labile toxin (LT) và chịu nhiệt-stable toxin (ST)

- độc tố ruột:

Gồm độc tố ruột LT và độc tố ST Cả hai đều mang tính chất của ngoại độc

tố Một chủng ETEC có thể chỉ có LT, hoặc ST hoặc cả 2

* Bệnh cảnh lâm sàng

- Thời gian ủ bệnh từ 14 - 50 giờ Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi

- Biểu hiện lâm sàng thường đột ngột với tiêu chảy phân toàn nước, không có nhầy, máu; ít khi kèm theo nôn và sốt

EIEC

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập niêm mạc ruột Cơ chế xâm nhập của EIEC thông qua plasmid pInv có trọng lượng phân tử 140 MDa, trong đó, chứa một

số các gen mxi, spa mã hoá cho những protein cần thiết cho quá trình gây bệnh

gồm Ipa A, Ipa B, Ipa C và Ipa D

- Cơ chế gây bệnh: EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu huỷ các hạt vùi trong không bào, nhân lên trong nguyên tương và chúng xâm lấn sang các

tế bào biểu mô kế cận Kết quả, tại niêm mạc đại tràng xảy ra phản ứng viêm, gây nên các tổn thương khu trú và có thể còn dẫn đến những tổn thương dạng loét

+ Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, có các gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể Có hai loại Stx: Stx1 và Stx2.

- Cơ chế gây bệnh:

+ Cơ chế gây tiêu chảy: Sau khi gắn vào tế bào, độc tố ruột của EHEC đi vào trong tế bào, chuyển tới bộ Golgi, sau đó được vận chuyển tới lưới nội sinh chất Tại đó, nó ức chế quá trình tổng hợp protein trong bào tương (làm chết các tế bào này) Stx huỷ hoại một cách có chọn lọc trên các tế bào mang chức năng hấp thu,

và bảo tồn các tế bào bài tiết vùng kẽ Cơ chế này kết hợp với tổn thương A/E làm tăng tính thẩm thấu của ruột, dẫn đến tiêu chảy

* Bệnh cảnh lâm sàng

EHEC gây tiêu chảy phân có hoặc không có máu, hội chứng HUS (Heamolytic Uremic Syndrome) là biểu hiện của bộ ba triệu chứng: suy thận cấp - giảm tiểu cầu - thiếu máu tán huyết

EAEC

Là loại E coli có kiểu cách bám dính kết tập trên tế bào Hep-2 Đây là loại

DEC mới được phát hiện và nghiên cứu trong 20 năm gần đây

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

- Phần lớn các yếu tố độc lực của EAEC nằm trên một plasmid có trọng lượng phân

tử 60 MDa Plasmid này có vai trò quan trọng trong kiểu cách bám dính kết tập (aggregative adherence) của EAEC, ký hiệu là plasmid AA-pAA

- Cơ chế gây bệnh của EAEC có 3 giai đoạn: Bám dính, tiết nhày và gây độc tế bào

8

* Bệnh cảnh lâm sàng

- Thời gian ủ bệnh khoảng 7-22 giờ

- Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy phân nhiều nước lẫn nhiều nhầy, sốt nhẹ và thường không nôn

* Các phương pháp xác định E coli gây tiêu chảy trong phòng thí nghiệm

Hiện nay, có một số phương pháp để xác định các DEC

- Thử nghiệm trên môi trường nuôi cấy tế bào (cho EAEC), trên môi trường nuôi cấy phân lập SMAC (cho EHEC), trên chuột lang (cho EIEC), quai ruột thỏ (cho ETEC)…

- Thử nghiệm tạo váng trên bề mặt môi trường canh thang Muller- Hinton Đây là thử nghiệm đơn giản, rẻ tiền (cho EAEC)

- Phương pháp miễn dịch (cho EHEC, EIEC, ETEC, EPEC…)

- Mẫu dò ADN: Thường sử dụng đoạn nucleotide pCVD432 trên plasmid pAA (cho EAEC); Stx1,2 (cho EHEC), gen ial, ipaH (cho EIEC)… [16, 18, 19, 29]

- Kỹ thuật PCR: Thiết kế đoạn mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide pCVD432

có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và Stx2,

pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC) [17, 23, 24,

29, 34, 43] Trong đó, xác định các DEC bằng PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, đạt gần 100% Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho kết quả nhanh chóng, chỉ sau 16 giờ nuôi cấy

1.1.2 Shigella spp, Salmonella spp, và V cholerae

Ngoài các DEC, Salmonella spp, Shigella spp, và V cholerae là những căn nguyên

gây tiêu chảy đã và đang được nghiên cứu nhiều Các nghiên cứu sau đây đã chứng

tỏ vai trò của các căn nguyên này trong gây bệnh tiêu chảy ở người Kaneko và

cộng sự trong tổng kết 10 năm từ 1985 đến 1995 cho thấy, tỷ lệ Salmonella các loài Salnonella khác nhau gây tiêu chảy xác định được trong bệnh phẩm phân

spp.-từ 5 đến 70% trong một cộng đồng ở Nhật [31] ở Malaysia, Massi tiến hành nghiên cứu những bệnh nhân vào viện với các biểu hiện của thương hàn, tỷ lệ bệnh

9

phẩm dương tính với Salmonella spp là 63% [37] Cùng với Salmonella gây bệnh thương hàn, các Shigella, tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn hoặc tiêu chảy, đặc biệt

ở trẻ em cũng là một căn nguyên quan trọng ở các nước đang phát triển Có 4 loài

Shigella Vai trò của các loài này cũng khác nhau tùy thuộc vào từng vùng địa lý

hoặc các nhóm nghiên cứu Tỷ lệ xác định được Shigella trong phân trẻ em trong

nghiên cứu tại Thái Lan năm 1989-1990 là 49% [22] Trong một nghiên cứu ở trẻ

em Ai Cập năm 2004, Abu và cộng sự đã xác định được 4 loài Shigella với tỷ lệ rất cao trong phân trẻ bị tiêu chảy: Shigella flexneri (55%), S sonnei (22%), S dysenteriae (19%), and S boydii (2%) [13] Ngoài DEC, Shigella spp., và Salmonella spp., Vibrio cholerae (V cholerae-phảy khuẩn tả) là vi khuẩn gây bệnh

tả, một bệnh rất nguy hiểm, xảy ra thành dịch và nguy cơ gây tử vong Trong lịch

sử, đã xảy ra nhiều vụ dịch tả trên thế giới làm cho hàng triệu người tử vong Trước

đây, V cholerae typ huyết thanh O1 là căn nguyên chính của các vụ dịch tả Tuy

nhiên, những vụ dịch kể từ 1992 trở lại đây, typ huyết thanh O139 đang đóng vai

trò quan trọng V cholerae chủ yếu gây dịch ở các nước đang phát triển, đặc biệt ở

một số nơi như Bangladesh, ấn Độ, Brazil, Chile, Peru [25, 47] Trong một nghiên

cứu ở ấn Độ, tỷ lệ phân lập được V cholerae từ bệnh phẩm phân tiêu chảy là 10%

[27] Còn ở Peru, tỷ lệ này là 3,5% trong nghiên cứu của Gil và cộng sự [25] Các nghiên cứu tại các vùng dịch tễ khác nhau cho các kết quả khác nhau về tỷ lệ phân lập vi khuẩn tả từ các bệnh phẩm phân tiêu chảy Nhưng tất cả đều khẳng định vai trò quan trọng của vi khuẩn tả trong bệnh tiêu chảy nói chung và bệnh tả nói riêng Hiện nay, để chẩn đoán các căn nguyên gây tiêu chảy, một số kỹ thuật vi sinh thông thường đã và đang được áp dụng tại các phòng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Đó là kỹ thuật nuôi cấy phân lập xác định dựa trên các đặc điểm về hình thể, tính chất bắt màu khi nhuộm và các đặc điểm chuyển hóa Ngoài ra, người ta cũng có thể dùng các phản ứng ngưng kết của vi khuẩn với các kháng thể đặc hiệu Một kỹ thuật khác dựa trên các đặc điểm về độc lực như thử nghiệm vai trò của độc tố trên

quai ruột của thỏ, của chuột lang, hay trên nuôi cấy tế bào Các kỹ thuật nêu trên

có những nhược điểm như độ nhạy và độ đặc hiệu thấp (nuôi cấy phân lập), tốn

10

nhiều thời gian-có khi tới vài ngày và công sức (nuôi cấy phân lập, phản ứng ngưng kết), hay tốn kém và chỉ thực hiện được ở một số labo chuẩn thức (kỹ thuật dựa trên các đặc điểm độc lực)

1.2 Kỹ thuật PCR

Gần đây, do sự phát triển của sinh học phân tử, một số kỹ thuật đã được nghiên cứu

và bước đầu áp dụng trong việc xác định các căn nguyên vi khuẩn nói chung và vi

khuẩn gây tiêu chảy nói riêng Trong đó, PCR (Polymerase Chain Reaction) là

một kỹ thuật có nhiều ưu điểm như độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (gần 100%), thời gian xác định rất ngắn (chỉ vài giờ hoặc trong vòng 24 giờ), có thể xác định cùng một lúc nhiều căn nguyên, và chi phí không quá tốn kém Trên thế giới, PCR

đã và đang được nghiên cứu cũng như áp dụng để chẩn đoán các căn nguyên gây

bệnh tiêu chảy hay gặp như E coli gây tiêu chảy, Salmonella spp., Shigella spp., V

cholerae, C jejuni và enterotoxigenic Bacteroides fragilis [15, 16, 28, 30, 33, 37,

38, 57] Nhờ có kỹ thuật này, tỷ lệ xác định các vi khuẩn nói trên cao hơn nhiều so

với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông thường Ngoài ra, kỹ thuật PCR còn giúp phân biệt căn nguyên gây tiêu chảy với các vi khuẩn tương tự thuộc khuẩn chí trong

đại tràng, giúp tiết kiệm thời gian, do vậy, nó góp phần quan trọng vào việc chẩn

đoán sóm và điều trị kịp thời bệnh tiêu chảy

PCR hoạt động giống như quá trình nhân đôi ADN trong tế bào của cơ thể Nền tảng của quá trình tổng hợp ADN là cấu trúc của nó theo mô hình của Watson và Crick Có 4 nucleotide là thành phần cơ bản, cấu trúc nên phân tử ADN: Thymin (T), Adenine (A), Cytosine (C) và Guanine (G) Trong đó, A luôn luôn ghép cặp với T và G luôn luôn ghép cặp với C Điều đó có nghĩa là, một trong hai sợi của phân tử ADN sẽ bổ xung cho sợi kia Như vậy, khi hai sợi của phân tử ADN được tách ra khỏi nhau, mỗi một nucleotide (thuộc một trong 4 loại A, T, G và C) sẽ

được ghép cặp với các nucleotide bổ xung cho nó Kết quả là một đoạn ADN mới

được hình thành Tuy nhiên, để khởi đầu quá trình tổng hợp một đoạn ADN nào đó,

chúng ta cần hai đoạn oligonucleotide gọi là đoạn mồi (primer) Đoạn ADN mồi

này sẽ gắn đặc hiệu vào một vị trí nào đó trên đoạn ADN mà ta muốn tổng hợp (gọi

11

là đoạn ADN đích, hay đoạn khuôn mẫu) Sự gắn đặc hiệu này cũng theo nguyên tắc bổ xung Đoạn ADN mồi này được kéo dài về một đầu nhờ enzyme có tên là ADN polymerase Quá trình này cứ lặp đi, lặp lại nhiều lần Kết quả chúng ta có một lượng lớn đoạn ADN khuôn mẫu cần tìm

PCR là kỹ thuật tổng hợp ADN trong ống nghiệm Nó sử dụng nguyên lý bổ xung trong quá trình tổng hợp ADN ở tế bào sống Điều khác biệt là các điều kiện cho quá trình này được tạo ra nhân tạo trong phòng thí nghiệm

Một chu kỳ tổng hợp ADN bằng PCR gồm có các bước sau:

1 Giai đoạn biến tính: Trong giai đoạn này, đoạn ADN kép được tách đôi dưới tác dụng của nhiệt độ Thường là 940C, trong một khoảng thời gian nhất

định

2 Giai đoạn gắn đoạn mồi: Khi hai sợi của phân tử ADN được tách ra, hai đoạn mồi sẽ gắn vào vị trí đặc hiệu của đoạn ADN mà chúng ta cần tổng hợp Nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn này thường từ 400 đến 720C Tuỳ theo độ dài, thành phần của đoạn ADN làm mồi, cũng như một số yếu tố khác mà nhiệt độ cũng như thời gian cho giai đoạn gắn mồi sẽ khác nhau

3 Giai đoạn kéo dài: Khi hai đoạn mồi đã gắn vào vị trí đặc hiệu trên đoạn ADN đích, các deoxynucleotide sẽ gắn đặc hiệu vào các vị trí bổ xung cho

nó trên đoạn ADN đích, giúp kéo dài đoạn mồi Nhiệt độ thích hợp cho giai

đoạn này thường là 720C

Chu kỳ này được lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng các chu kỳ, thời gian mỗi chu

kỳ phụ thuộc vào từng giai đoạn của chu kỳ, độ dài, đặc điểm đoạn ADN đích Sau mỗi chu kỳ, xét về mặt lý thuyết, số lượng các đoạn ADN đich sẽ tăng lên theo hàm số mũ Sau khoảng 25 đến 40 chu kỳ, lượng ADN đích được khuếch đại (hàng triệu bản) sẽ đủ để phát hiện dưới ánh sáng của đèn cực tím sau khi điện di trên thạch agarose và nhuộm bằng ethidium bromide

12

1.3 Các nghiên cứu ở trong nước thuộc lĩnh vực nghiên cứu

Salmonella spp., Shigella spp., V cholerae là các vi khuẩn gây nhiễm trùng đường

tiêu hóa, đặc biệt là tiêu chảy ở trẻ em Việt Nam Theo một số nghiên cứu, Tại Việt

nam, tỉ lệ phân lập Shigella spp, trong nghiên cứu của Hoàng Tiến Mỹ là 13,48%

và của Nguyễn Thanh Bảo là 8,96% [1, 8] Trước đây, Salmonella spp và V

cholerae được phân lập với tỷ lệ khá cao Nhưng gần đây, tỷ lệ phân lập được các

vi khuẩn này đã giảm đi Theo Hoàng Tiến Mỹ, tỷ lệ Salmonella spp., và V

cholerae lần lượt là 0,43 và 0,96% [8]

Nghiên cứu về các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy nêu trên đã được quan tâm từ lâu ở Việt Nam Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật được sử dụng rộng rãi hiện nay tại các phòng xét nghiệm vi sinh đều dựa vào kỹ thuật nuôi cấy phân lập cùng với phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu trên phiến kính Chính vì vậy, phát triển kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt là PCR nhằm xác định các căn nguyên này với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán có ý nghĩa vô cùng quan trọng Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã có những nghiên cứu bước đầu về PCR

trong chẩn đoán một số căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy [40, 55, 56] Tuy nhiên,

việc đưa kỹ thuật này vào sử dụng đại trà cũng như phát triển các kỹ thuật PCR

để chẩn đoán cùng một lúc nhiều căn nguyên, hoặc xác định vi khuẩn không qua nuôi cấy vẫn còn là một vấn đề đang cần được nghiên cứu sâu thêm

PCR là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao Về lý thuyết, PCR có thể phát hiện một đoạn gen đặc hiệu từ một tế bào vi khuẩn trong bệnh phẩm Như vậy, nó

không những góp phần trong quá trình chẩn đoán, điều trị, phòng bệnh mà còn là

một kỹ thuật được dùng trong những nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các căn nguyên gây bệnh Nó là cơ sở cho việc nghiên cứu và phát triển vaxcin dựa trên các yếu tố độc lực của các vi khuẩn này

Hầu hết các kỹ thuật PCR được sử dụng hiện nay đều là các PCR đơn mồi, tức là

dùng một cặp mồi trong một phản ứng Mỗi một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn gen của một vi khuẩn nào đó Chính vì vậy, nếu phối hợp nhiều cặp mồi trong một

13

phản ứng-PCR đa mồi, chúng ta có thể phát hiện nhiều căn nguyên vi khuẩn cùng

một lúc (từ một phản ứng) Điều này giúp làm giảm thời gian chẩn đoán, tiết kiệm rất nhiều nguyên vật liệu

Tuy nhiên, các ứng dụng kỹ thuật PCR thường phải phối hợp với bước nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trường đặc Qui trình này cần ít nhất 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc sau khi cấy bệnh phẩm Trên thực tế lâm sàng, nhiều bệnh lý tiêu chảy tiến triển rất nhanh, trong khi do phải chờ đợi kết quả xét nghiệm, việc quyết định phương hướng điều trị gặp rất nhiều khó khăn Điều này cho thấy, việc xác định nhanh căn nguyên gây tiêu chảy có ý nghĩa rất quan trọng

Phát triển và hoàn thiện một qui trình PCR xác định nhanh vi khuẩn từ bệnh phẩm phân là vấn đề cần thiết Nó giúp giải quyết việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, giúp bác sĩ lâm sàng và dịch tễ có các biện pháp xử

lý và điều trị kịp thời - thích hợp Tuy nhiên, vấn đề cơ bản là tách chiết ADN của

vi khuẩn trực tiếp từ phân để sử dụng cho phản ứng PCR

Tuy nhiên, sự có mặt của một số chất trong phân như sắc tố mật, muối mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đã tiêu hoá , một số chất chưa được biết sẽ có thể ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách chiết và tinh sạch được ADN của

các chủng E coli, Shigella spp; Salmonella spp và V cholerae trực tiếp từ bệnh

phẩm

Đã có một số phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN trực tiếp từ phân như phương pháp tách chiết dùng ethanol; phương pháp sắc ký lỏng cao áp; phương pháp dùng bi thuỷ tinh hoặc bi silic Đơn cử như phương pháp dùng phenol và chloroform của Viện Quân y Mỹ (AFRIMS) [7, 52] Qui trình cụ thể cũng khá phức tạp Hiện nay trên thị trường có một số bộ kit thương phẩm như bộ sinh phẩm

“QIAamp DNA Stool Mini Kit” của hãng QIAGEN [48] Trong bộ kit này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản xuất đã đưa ra qui trìnhgồm

có các bước sau:

14

- Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL Tế bào vi khuẩn

và những tế bào bệnh lý khác trong phân, được ly giải đồng nhất ở 70oC trong 5 phút (nếu cần thiết có thể tăng lên 950C)

- Hấp phụ tạp chất: sử dụng 1 viên InhibitEX được cung cấp trong bộ kit, để hấp phụ hết những chất ức chế phản ứng PCR

- Thuần khiết DNA:

+ Sử dụng Proteinase K, Buffer AL, ethanol để làm biến tính protein + Gắn kết ADN lên một màng silica-gel có sẵn trong ống QIAamp

+ Rửa màng bằng dung dịch Buffer AW1, Buffer AW2 để loại bỏ những

chất không thuần khiết

+ Sử dụng dung dịch Buffer AE để hoà tan ADN gắn trên màng

Tuy nhiên, các phương pháp này hoặc là quá phức tạp, hoặc quá đắt và chỉ thực hiện được ở những phòng xét nghiệm được trang bị máy móc hiện đại Vì thế, một phương pháp tách chiết ADN trực tiếp từ phân đơn giản, nhanh, hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong hoàn cảnh ở Việt Nam, là chìa

khoá đối với kỹ thuật PCR xác định nhanh và trực tiếp các chủng E coli gây tiêu chảy, Shigella, Salmonella và V cholerae cũng như các vi khuẩn khác trực tiếp từ

phân

15

Chương II: đối tượng, vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Các chủng vi khuẩn chuẩn

+ Các chủng chuẩn E coli gây tiêu chảy

Các chủng DEC do GS Andrej Weintraub, khoa Vi sinh lâm sàng, Viện Karolinska, Thụy Điển và GS James Nataro (Khoa Nhi-Vi sinh vật, Trung tâm phát triển Vacxin, Đại học Y Maryland, Baltimore, Mỹ) cung cấp

Bảng 1 Các chủng chuẩn E coli gây tiêu chảy

E coli ATCC 11775 Chủng không có gen độc lực

Các chủng này là các chủng chuẩn quốc tế và đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới

+ Các chủng Salmonella spp, Shigella spp., V cholerae do Đề án Lưu giữ nguồn

gen Vi sinh vật, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội cung cấp

Chủng V cholerae 245P phân lập từ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp nguy hiểm tháng

12 năm 2007 tại Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia NĐQG)

(CBTN-16

Chủng S typhi 165M phân lập từ máu của bệnh nhân bị thương hàn điều trị tại

Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia (nay là Bệnh viện Bệnh Nhiệt

đới Trung ương) năm 2007

Chủng Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,

Enterobacter spp, và 5 chủng E coli đã được xác định không gây tiêu chảy Các

chủng này do Đề án Lưu giữ Nguồn gen Vi sinh vật Y học, Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội cung cấp

Các chủng này được sử dụng để phát triển kỹ thuật PCR đơn và PCR đa mồi trong chẩn đoán sớm các căn nguyên tiêu chảy

- Các vi khuẩn dùng trong nghiên cứu đều được định danh lại trên máy định danh

tự động Vitek-32 (BioMerieux, Inc., Mỹ) với các sinh phẩm mua từ chính hãng

Gia đình trẻ không chấp nhận tham gia vào nghiên cứu

+ Quá trình tuyển chọn đối tượng:

Hình thức: Tuyên truyền, vận động

Khi bệnh nhân được bố mẹ hoặc người bảo trợ đưa đến khám và điều trị tại phòng khám Bệnh viện Saint-Paul Bố mẹ hoặc người bảo trợ của trẻ được giải thích về đề tài, mục tiêu nghiên cứu của đề tài, ích lợi của việc tham gia nghiên cứu, quyền lợi tham gia tự nguyện hoặc rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào mà bố/mẹ hoặc người bảo trợ của trẻ muốn Nếu bố/mẹ hoặc người bảo trợ của trẻ

đồng ý, bác sĩ nhi khoa tham gia vào nghiên cưu sẽ hỏi các thông tin về tuổi, tình trạng tiêu chảy của trẻ, kết hợp với việc khám tình trạng chung cho trẻ Những trẻ

đạt tiêu chuẩn sẽ được chọn vào nghiên cứu

17

300 bệnh phẩm phân thu thập và chuyển về Khoa Vi sinh, bệnh viện Saint-Paul Các bệnh phẩm phân này được thu thập kèm theo các thông tin về trẻ như tuổi, giới, đặc điểm phân bị tiêu chảy, số lần tiêu chảy trong 24 giờ trước khi vào viện Các bệnh phẩm này đã được tiến hành nhuộm soi, nuôi cấy, phân lập theo thường qui tại khoa Vi sinh bệnh viện Saint-Paul Số lượng phân còn thừa (ít nhất là 1g)

được giữ ở 4-80C trước khi được chuyển về Khoa Xét nghiệm, Viện CBTN-NĐQG

để phân tích

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn

- Môi trường dùng trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey (SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA)

- Các loại tube, đĩa petri

2.2.2 Sinh phẩm, hoá chất, và máy móc dùng trong PCR

+ Sinh phẩm, hóa chất

- Cặp mồi (primer) đặc hiệu cho các E coli gây tiêu chảy, Shigella spp, Salmonella spp và V cholerae (Invitrogen-Mỹ)

- Đệm, nước khử ion

- PCR master mix (Epicentre-Đức) trong đó có dung dịch đệm, dNTPs, MgCl2, Taq polymerase (Invitrogen-Mỹ)

- Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng BBL

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gel

- TAE (Tris Acetate EDTA)

- PBS (Phosphate Buffer Saline)

+ Dụng cụ và máy móc

- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Beckman, Mỹ)

- Bộ điện di ngang Horizon58 (Gibco-BRL, Mỹ)

18

- Máy soi và chụp gel Geldoc (BioRad, Mỹ)

- Máy đo nồng độ ADN Biophotometer (Eppendorf-Đức)

Bảng 2 Các primer dùng trong nghiên cứu Primer

Gen

đích

Số truy cập trung ngân hàng gen

Trình tự

Sản phẩm (bp)

eae eaeA AE005595 5’-CACACGAATAAACTGACTAAAATG-3’ 376

ctxB [20] 5'-GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT G-3'

5'-GGT TGC TTC TCA TCATCG AAC CAC-3'

19

2.3.1.1 Kiểm tra chủng vi khuẩn chuẩn

Đối với các chủng E coli: Bao gồm các DEC và không phải DEC

* Kiểm tra bằng phương pháp định danh kinh điển

- Kiểm tra độ thuần của các chủng E coli bằng cách cấy trên môi trường SMAC

Độ thuần của chủng được đánh giá bằng hình thái khuẩn lạc, hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram

- Xác định tên chủng bằng bộ sinh phẩm API 20E

* Kiểm tra các chủng E coli bằng phản ứng PCR

- Tiến hành tách chiết ADN từ vi khuẩn qua cấy phân (Theo quy trình của Viện Karolinska- Thụy Điển) [40]

+ Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ đĩa môi trường SMAC cho vào 500 l nước cất khuấy đều bằng máy Vortex để tạo thành huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland 4 (tương đương với nồng độ 109 vi khuẩn/ml)

+ Đun sôi cách thủy trong 20 phút để giải phóng ADN

+ Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút

+ Chuyển phần nước nổi (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới

+ ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ -200C nếu không tiến hành phản ứng ngay

- Kiểm tra các chủng E coli bằng phản ứng PCR [40]

+ Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,2% với dung dịch

đệm là TAE

Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: Đun sôi cho tan hoàn toàn agarose trong đệm TAE bằng lò vi sóng Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 56-600C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (6 x 5,5 cm hoặc 6 x 11 cm tuỳ theo số lượng mẫu cần điện di) Phiến được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược

Để gel đông lại (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE

Dùng micropipette cho các sản phẩm PCR vào các giếng của bản gel Với các gel

sử dụng răng lược nhỏ, dùng 10 l mẫu cho mỗi giếng

20

Điện di với hiệu điện thế 120V, cường độ dòng điện 100 mA trong thời gian 30 phút

Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và dương

Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc

+ Nhuộm ADN và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide 1% pha trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để khử ethidium bromide bám không đặc hiệu vào thạch Sau khi nhuộm, các vạch ADN trên bản gel sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím

Đọc kết quả bằng máy GelDoc (BioRad) với phần mềm chuyên dụng

Đối với các chủng vi khuẩn đường ruột khác:

Kiểm tra bằng phương pháp định danh kinh điển

- Cấy các chủng trên môi trường, độ thuần của chủng được đánh giá bằng hình thái khuẩn lạc, hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn qua nhuộm Gram

- Xác định các chủng:

+ Qua tính chất sinh vật hóa học bằng bộ hóa chất API 20E

+ Khả năng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu

2.3.1.2.Chuẩn bị các mẫu phân

Chúng tôi chọn 10 mẫu phân không có DEC, Shigella spp; Salmonella spp ; và V

cholerae Các mẫu phân này được xác định không có các loại vi khuẩn nói trên

bằng nuôi cấy phân lập theo thường qui vi sinh và PCR như sau:

+ Sử dụng các bệnh phẩm phân khác nhau, trộn đều Lấy 1 ăng bệnh phẩm đầy cấy lên trên môi trường SMAC và TCBS, để 370C, 16-18 giờ

+ Sau khi có các khuẩn lạc mọc, lấy que cấy lấy một phần các khuẩn lạc trên đĩa cấy, hòa vào 500 μl nước cất Đun sôi cách thuỷ 1000C trong 20 phút để giải phóng ADN

+ Chọn 10 mẫu phân có kết quả âm tính sau 3 lần xác định liên tiếp Đây là 10

mẫu phân được coi là không có DEC, Shigella spp; Salmonella spp; và V cholerae

+ Trộn đều các mẫu phân này, chia nhỏ thành các phần 200mg Bảo quản trong tủ – 200C

+ Sử dụng các mẫu phân này trong quá trình:

+ Phát triển qui trình tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân

+ Phát triển qui trình PCR đơn mồi, đa mồi

2.3.1.3 Kỹ thuật tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân

Dựa vào một số nghiên cứu trước đây [21, 26, 45, 49, 51, 53] chúng tôi dự kiến qui

trình như sau:

- Ly tâm với tốc độ thấp để loại bỏ các chất có kích thước lớn trong phân

- Ly tâm với tốc độ cao hơn để lấy vi khuẩn và loại bỏ các chất hoà tan trong phân

- Đun huyền dịch vi khuẩn để giải phóng ADN

- Ly tâm lấy nước nổi chứa ADN làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

Các bước thực hiện của qui trình:

- Theo thiết kế ban đầu:

Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ cặn, nước nổi chứa ADN

Làm tương tự đối với các DEC khác, và các chủng Shigella, Salmonella và V

cholerae

Nước nổi chứa ADN:

+ Đo nồng độ ADN, xác định độ tinh sạch

+ ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

Yêu cầu của qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân: