Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư và bệnh thối cuống ở quả bơ và bước đầu nghiên cứu khả năng bảo quản quả bơ bằng dịch chiết lá trầu

Phân lập nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư và bệnh thối cuống ở quả bơ và bước đầu nghiên cứu khả năng bảo quản quả bơ bằng dịch chiết lá trầu

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng rất thuận lợi cho việc trồng các loại rau quả kể cả các loại rau thuộc vùng khí hậu ôn đới vì vậy, nước ta là một trong các nước có các sản phẩm rau quả phong phú và đa dạng trên thế giới Các sản phẩm rau quả của nước ta không chỉ phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn trở thành mặt hàng xuất khẩu vào các thị trường trên thế giới

Cây bơ (Persea americana) là một trong những loại cây ăn quả có khả

năng xuất khẩu mang lại giá trị kinh tế cao Các sản phẩm từ bơ cũng được sử dụng hết sức đa dạng Nó không những là nguồn thực phẩm giàu giá trị dinh dưỡng, mang lại giá trị cảm quan, giá trị kinh tế cao và còn có tác dụng trong việc chữa trị bệnh Đặc biệt, tinh dầu chiết xuất từ quả bơ có tác dụng trong việc tái tạo và giữ ẩm làn da, góp phần vào việc chăm sóc sắc đẹp và sức khỏe

Mặc dù, đất đai, thời tiết khí hậu một số vùng ở nước ta thuận lợi cho sự phát triển của bơ, song sản suất bơ ở nước ta vẫn gặp nhiều khó khăn Năng suất

và phẩm chất của bơ vẫn còn thấp so với tiềm năng Nguyên nhân chủ yếu là tình trạng tổn thất sau thu hoạch do các nấm bệnh gây ra, trong đó bệnh thán thư

và bệnh thối cuống là bệnh thường gặp và gây hại nghiêm trọng nhất đối với bơ, làm mất giá trị thẩm mỹ đồng thời làm giảm phẩm chất của quả bơ gây tổn thất cho người trồng, ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng

Để hạn chế nấm bệnh gây hư hỏng quả sau thu hoạch và nhằm bảo quản rau quả nói chung, bơ nói riêng thì việc sử dụng hóa chất rất phổ biến Tuy nhiên, xã hội ngày càng phát triển hiện đại hơn thì xu thế của con người là hướng đến việc sử dụng các hợp chất tự nhiên, hạn chế tối đa việc đưa các nguồn độc hại vào cơ thể qua đường ăn uống càng thể hiện rõ hơn Các loại sản phẩm được bảo quản bằng các chế phẩm sinh học thật sự an toàn hơn, không độc hại đến sức khỏe người sử dụng và còn thân thiện với môi trường

Lá trầu không chứa 0,8-1,8% tinh dầu thơm gồm chủ yếu là hai phenol: betel- phenol là đồng phân của của eugenol và chavicol kèm theo nhiều hợp chất phenolic khác, có nhiều đặc tính sinh học quan trọng như: kháng khuẩn, kháng nấm, [4] Theo sự phát triển của khoa học người ta đã bắt đầu nghiên cứu các tính chất của trầu không để ứng dụng trong y học, kháng khuẩn và kháng nấm…

Một trong những phương pháp bảo quản nông sản sau thu hoạch hiện nay

là tạo màng bao để bảo quản và chitosan có khả năng tạo màng và bám dính rất cao Chitosan được điều chế từ chitin là hợp chất polymer sinh học ngoài ra còn

có nhiều ưu điểm khác như: không độc hại, dễ dàng bị phân hủy nên không gây

dị ứng và các phản ứng phụ, đồng thời thân thiện với môi trường lại có tính kháng nấm và kháng khuẩn tốt [1] Nhờ các đặc tính đó mà chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp: kháng khuẩn, kháng nấm, màng bao bảo quản quả (xoài, đu đủ, mận, )

Việc nghiên cứu sử dụng kết hợp dịch chiết lá trầu không và màng bao chitosan trong bảo quản quả bơ là hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Từ những vấn đề nêu trên tôi thực hiện đề tài: “Phân lập nấm

Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư và bệnh thối cuống ở quả bơ

và bước đầu nghiên cứu khả năng bảo quản quả bơ bằng dịch chiết lá trầu’’ 1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư và bệnh thối cuống ở

quả bơ và khả năng bảo quản quả bơ bằng dịch chiết lá trầu

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quả bơ và nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư và

thối cuống trên quả bơ

- Dịch chiết lá trầu

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và làm thuần nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư trên

quả bơ

- Xác định hình thái và định danh loài bằng phương pháp sinh học phân tử

- Xác định thời gian nảy nầm bào tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lá trầu đến khả năng ức chế bệnh

trong điều kiện invitro.

- Xác định một số thành phần hóa học của quả bơ trước khi bảo quản.

- Nghiên cứu khả năng bảo quản của quả bơ bằng dịch chiết từ lá trầu: + Tỷ lệ quả hư hỏng (thối cuống hay thán thư)

+ Thời gian bảo quản

+ Sự thay đổi của các tính chất lý hóa trong quá trình bảo quản: cường độ

hô hấp, hàm lượng chất khô hòa tan, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng axit, tổn thất khối lượng, độ cứng, hàm lượng Vitamin C, hàm lượng lipit

+ Chất lượng của quả bơ sau bảo quản: các chỉ tiêu trên và giá trị cảm quan

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập và đinh danh loài

2.3.1.1 Phương pháp thu mẫu bệnh

- Mẫu bệnh thu từ những quả bơ có triệu chứng vết bệnh ban đầu đến điển hình được rửa sạch bằng nước để loại tạp chất Tiếp theo khử trùng bằng cồn 70°C sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng

- Mẫu bệnh được ủ trong hộp và bọc túi PE và ghi các thông tin cần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…)

2.3.1.2 Phương pháp phân lập và định danh loài

Phân lập nấm bằng phương pháp Koch trên môi trường PDA được làm thuần và gởi đi định danh loài bằng phương pháp sinh học phân tử

2.3.2 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ lá trầu [2]

- Cân 100g bột lá vào 300ml dung môi methanol: cho 100g bột lá vào bình tam giác có chứa 300ml methanol, đậy kín miệng bằng giấy bạc tránh nhiễm vi sinh vật

- Ngâm và lắc: Tiến hành ngâm và lắc dung dịch trên bằng máy lắc ở 250 vòng/phút trong 24 giờ để dung môi ngấm kiệt vào lá

- Ly tâm và thu dịch chiết : để tách cặn, thu dịch chiết ta đem đi li tâm lạnh ở 4000 vòng/ phút trong 40 phút Sau khi li tâm thu được dịch chiết lá chiết xuất trong dung môi methanol Dịch chiết thu được được chứa trong bình tam giác vô trùng

- Dịch chiết được đem đi cô quay chân không ở nhiệt độ 40°C cho đến khối lượng không đổi Thu dịch chiết chứa trong bình vô trùng

- Bảo quản ở nhiệt độ 4°C

2.3.3 Xác định thời gian nảy mầm bào tử

Trên đĩa môi trường đã cấy nấm C gloeosporioides đặt trong tủ ấm

28°C, sau 7 ngày ta tiến hành thu bào tử vào eppendorf, nuôi và giữ bào tử trong

tủ ấm Cứ sau 1h lấy 2 μl bào tử từ eppendorf làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi để xác định thời gian nảy mầm của bào tử

2.3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ lá trầu đến đường kính tản nấm.

2.3.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ lá trầu kết hợp với chitosan trong bảo quản quả bơ

2.3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm bảo quản bơ sau thu hoạch

Các công thức trên được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp và cứ 2 ngày phân tích các chải tiêu 1 lần

2.3.4.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa

Cứ 2 ngày phân tích các chỉ tiêu 1 lần, 3 lần lặp lại cho mỗi chỉ tiêu để quan sát sự thay đổi của các tính chất lý hóa trong quá trình bảo quản

* Xác định độ cứng

 Nguyên lý:

Dưới tác dụng của cùng một lực không đổi trong một đơn vị thời gian xuất hiện phản lực phản lực trở lại và giá trị lực được ghi nhận trên màn hình hiển thị độ cứng của quả

 Thiết bị: Thiết bị đo độ cứng Shimpo Đơn vị đo Newton (N)

 Tiến hành:

- Bật nút khởi động “On”

Qủa bơ Rửa sạch (cồn 70°, nước cất)

Bảo quản (25°C)

Tạo màng

bao chitosan

0,5% kết

hợp dịch

chiết lá trầu

nồng độ

0,00 g/ml

Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết lá trầu nồng độ 0,04 g/ml

Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết lá trầu nồng độ 0,16 g/ml

Tạo màng bao chitosan 0,5% kết hợp dịch chiết lá trầu nồng độ 0,08 g/ml

- Thiết lập đơn vị đo (N)

- Thiết lập máy về 0 N

- Cho mẫu quả bơ cần đo vào phía dưới đầu mũi đâm và dũng một lực nhất định ấn cần gạt xuống xuyên vào thịt quả

- Đọc kết quả hiển thị trên máy

- Tiến hành đo 3 lần, đo ở 3 vị trí khác nhau và lấy kết quả trung bình

*Xác định cường độ hô hấp

 Nguyên lý:

Cường độ hô hấp của quả là số mg khí CO2 tạo ra do quả hô hấp trong một đơn vị thời gian trên một đoen vị khối lượng quả Khi đặt mẫu quả trong một hộp kín trong một khoảng thời gian nhất định sẽ tích tụ một lượng CO2 do chính quả hô hấp tạo ra

 Thiết bị: ICA -250/153

 Tiến hành:

Mẫu bơ được chọn ngẫu nhiên tù các mẫu được thí nghiệm Cân khối lượng quả rồi cho vào các hộp kín có cùng thể tích nhất định Trên nắp hộp có nút cao su để hút khí tạo thành trong qua trình hô hấp, sau đó chuyển toàn bộ lượng khí tạo thành vào thiết bị đo nhờ hệ thống bơm có trong thiết bị Các hộp được đặt trong điều kiện bảo quản sau 3 giờ ở nhiệt độ phòng ở 25°C thì tiến hành đo hô hấp của quả Cách đo như sau:

- Khởi động thiết bị

- Điều chỉnh trị số của máy về tiêu chuẩn của không khí (21% O2, 0% CO2)

- Khởi động hệ thống bơm và cắm đường ống dẫn khí qua nút cao su trên nắp hộp Bấm nút cho bơm hút không khí từ trong hộp quả

- Kết quả đo cường độ hô hấp được hiển thị là nồng độ CO2 (%) trên màng hình của thiết bị (đọc và ghi giá trị lớn nhất)

 Tính kết quả:

Trong đó:

R: Cường độ hô hấp của quả (mg CO2/kg.h)

Vtd: Thể tích tự do của hộp (ml) (Vtd= Vhộp – Vquả)

mq: khối lượng quả công thức đem đo

% CO2: nồng độ phần trăm CO2 đo được trên máy

T: thời gian từ lúc đậy hộp chứa mẫu đến lúc đo (h)

*Xác định hàm lượng ethylene

 Nguyên lý:

Ethylen là một loại hormone thực vật được tạo ra thành trong giai đoạn phát triển của cây trồng đặc biệt là giai đoạn chín của quả Khi đặt mẫu quả trong một hộp kín trong một khoảng trời gian sẽ tích tụ một lượng ethylen do chính quả tạo ra

 Thiết bị: ICA -56.

 Tiến hành:

Mẫu bơ được chọn ngẫu nhiên từ các mẫu được thí nghiệm Cân khối lượng quả rồi cho vào các hộp kín có cùng thể tích nhất định Trên nắp hộp có nút cao su để hút khí (C2H2 ) thành trong quá trình chin của quả, sau đó chuyển toàn bộ lượng khí tạo thành vào thiết bị đo nhờ hệ thống bơm có trong thiết bị Các hộp được đặt trong điều kiện bảo quản sau 3 giờ ở nhiệt độ phòng ở 25°C thì tiến hành đo đọ chín của quả Cách đo như sau:

- Khởi động thiết bị

- Điều chỉnh trị số của máy về 0

- Khởi động hệ thống bơm và cắm đường ống dẫn khí qua nút cao su trên nắp hộp Bấm nút cho bơm hút khí từ trong hộp quả

- Kết quả đo được hiển thị là nồng độ C2H4 (ppm) trên màng hình của thiết bị (đọc và ghi giá trị lớn nhất)

 Tính kết quả:

Trong đó:

E: Cường độ sản sinh ethylene của quả (µC2H4/kg.h)

e: nồng độ ppm của C2H4.

Vtd: Thể tích tự do của hộp (ml) (Vtd= Vhộp – Vquả)

mq: khối lượng quả công thức đem đo

T: thời gian từ lúc đậy hộp chứa mẫu đến lúc đo (h)

*Xác định hàm lượng chất khô hòa tan

Sử dụng chiết quang kế cầm tay để xác định hàm lượng chất khô hòa tan, biểu thị bằng độ Brix (°Bx) giới hạn 0-32°Bx

 Nguyên lý:

Chất khô hòa tan trong dịch quả có khả năng khúc xạ ánh sáng Thông qua việc xác định hệ số ánh sáng của dịch ép tính nồng độ chất rắn hòa tan trong nguyên liệu

 Tiến hành:

Nghiền nhỏ mẫu Lấy 1 phần hỗn hợp cho vào miếng vải mịn, ép lấy 1-2 giọt lên lăng kính

 Kết quả:

Là chỉ số hiện khi quan sát ống kính, cộng thêm sai số của nhiệt độ lúc tiến hành đo.Hàm lượng chất khô hòa tan là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại đối với mỗi nồng độ theo dõi

*Xác định chỉ số Vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ Iốt [3]

 Nguyên lý:

Vitamin C có khả năng khử dung dịch Iốt Từ lượng Iốt bị khử bởi Vitamin C có trong mẫu suy ra hàm lượng Vitamin C

 Tiến hành:

Cân chính xác 5g mẫu bơ, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HCl 5%, cho vào bình định mức dẫn đến vạch 100ml bằng nước cất, khuấy đều, tiến hành lọc mẫu Lấy 20ml dich lọc cho vào bình tam giác, cho thêm 2-3 giọt tinh bột 1% rồi tiến hành chuẩn độ bằng Iốt 0,01N đến khi dung dịch có màu xanh nhạt thì dừng lại

 Tính toán kết quả:

Trong đó:

V: số ml dung dịch iod 0,01N dùng chuẩn độ

V1: thể tích dịch mẫu thí nghiệm (100 ml)

V2: thể tích dịch mẫu lấy để xác định (10 ml)

m: khối lượng mẫu (g)

0,00088: số gam Vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch Iốt 0,01N

*Xác định hàm lượng axit tổng số [3]

 Nguyên lý:

Axit hữu cơ dễ hòa tan trong nước Nước quả chiết rút được chuẩn độ bằng NaOH hay KOH 0,1N để trung hòa hết các axit trong quả bằng chỉ thị phenolphthalein 1%

 Tiến hành:

- Cân chính xác 15g mẫu bơ, nghiền nhỏ trong cối sứ với cho vào bình tam giác 250 ml, thêm nước cất đến vạch 150ml, khuấy đều, đun cách thủy ở 80°C trong 15 phút, sau đó làm nguội

- Chuyển toàn bộ dich mẫu vào bình định mức 250ml, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ, để lắng sau đó lọc mẫu bằng giấy lọc

- Lấy 25 ml dịch lọc vòa bình tam giác 100ml, thêm 3 giọt phenolphthalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 15 giây

- Ghi lại số ml NaOH 0,1N đã dung để chuẩn độ

- Lặp lại chuẩn độ 3 lần, lấy kết quả trung bình ta được V (ml) dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ axit

 Tính toán kết quả:

Trong đó:

V: số ml dung dịch NaOH 0,01N dùng chuẩn độ (ml).

V1: thể tích dịch mẫu thí nghiệm (ml)

V2: dung tích bình định mức (ml)

m: khối lượng mẫu (g)

K: hệ số axit tương ứng

*Xác định tỉ lệ tổn thất

Tỉ lệ tổn thất bằng tổng của tỉ lệ hao hụt khối lượng và tỉ lệ hư hỏng

 Tiến hành:

Dùng cân kỹ thuật để xác định khối lượng mẫu tại các lần đo, từ đó tính ra

tỉ lệ hao hụt khối lượng so với ban đầu

 Tính toán kết quả:

Trong đó:

X: Tỉ lệ hao hụt trọng lượng quả theo thời giam bảo quản (%)

M1: Khối lượng quả trước khi xử lý (g)

M2: Khối lượng quả tại ngày phân tích (g)

*Xác định hàm lượng đường tống số bằng phương pháp Bertrand [3]

 Nguyên lý:

Dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa đường khử với ion kim loại để xác định hàm lượng đường glucose có trong nguyên liệu

 Tiến hành:

Chuẩn bị dung dịch glucose

-Lấy một ít mẫu bơ nghiền trong cối chày sứ

-Cho 5 gam mẫu đã nghiền vào bình tam giác 250ml, sau đó thêm 50ml nước cất và 5ml HCl tinh khiết và thực hiện thủy phân trên nồi cách thủy ở nhiệt

độ 70°C trong 5 phút

-Sau khi thủy phân cần làm lạnh ngay dưới vòi nước chảy

-Trung hòa lại bằng NaOH 0,1N

Định lượng đường khử

- Cho vào bình nón dung tích 250ml: dung dịch Felling A 25 ml, dung dịch Felling B 20ml và đun sôi

-Cho vào tiếp tục 10 ml dung dịch glucose đã chuẩn bị ở trên và 20 ml nước cất, tiếp tục đun sôi, giữ trong 2 phút

- Lấy bình ra để cho nghiêng cho Cu2O lắng xuống Dung dịch bên trên lớp cặ phải có màu xanh của Cu(OH)2 Nếu dung dịch bên trên có màu lục, màu vàng hoặc nâu nghĩa là không đủ lượng đồng cần thiết, phải làm lại và lấy một lượng dung dịch glucose ít hơn, cuối cùng thêm nước cất vào để thu được khoảng 50 ml dung dịch

- Khi kết tủa Cu2O thì thực hiện quá trình rửa kết tủa trên phễu Bucne có gắn với máy lọc hút chân không như sau:

+ Chắc từ từ dung dịch Felling qua phễu Bucne, cẩn thận giữ tủa Cu2O ở trong bình nón luôn ngập trong dung dịch để Cu2O không bị tiếp xúc với oxy không khí tạo thành CuO

+ Bật máy lọc chân không để dung dịch Felling được hút nhanh Trong quá trình lọc luôn giữ một lớp dung dịch trên giấy lọc để bỏa vệ kết tủa Cu2O ở trên bề mặt giấy

+ Sau đó từ từ khoảng 20ml nước cất vào bình nón, lắc nhẹ và chắt nước rửa tủa tương tự như trên Quá trình rửa tủa lặp lại 3 lần

- Sau khi rửa tủa thực hiện quá trình hòa tan tủa như sau:

+ Thay bình hút lọc cũ bằng bình mới

+ Đổ dung dịch Fe2(SO4)2 đã hòa tan kết tủa Cu2O trong bình nón lên trên lớp cặn còn lại trên phễu

+ Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)2 cho đến khi không còn kết tủa trong bình nón và trên phễu

+ Hút xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nước cất đun sôi, hút cả xuống bình lọc

- Lấy bình lọc ra và chuẩn độ dung dịch sắt II hình thành bằng dung dịch KMnO4 0,1N cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 15 giây

- Đọc số ml KMnO4 0,1 N đã dùng và đem tra bảng để có lượng đường glucose

 Tính kết quả: