Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virus epstein - barr trong ung thư vòm mũi họng

Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virus epstein - barr trong ung thư vòm mũi họng

Bộ giáo dục vμ đμo tạo Bộ y tế

trường đại học y hμ nội

nguyễn đình phúc

nghiên cứu chẩn đoán lâm sμng vμ gen virus epstein - barr trong ung thư vòm mũi họng

Chuyên ngμnh : Tai mũi họng

Mã số : 3.01.30

Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

Hμ nội - 2006

Công trình được hoàn thành tại :

bộ môn tai mũi họng - trường đại học y hμ nội

bệnh viện tai mũi họng trung ương Viện công nghệ sinh học – viện khoa học công nghệ việt nam

Người hướng dẫn khoa học : PGS TS Phạm Khánh Hoà

GS TSKH Đái Duy Ban

Phản biện 1 : GS TS Trần Hữu Tuân

Phản biện 2 : GS TS Lê Huy Chính

Phản biện 3 : PGS TS Đinh Duy Kháng

Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhμ nước tổ

chức tại Trường Đại học Y Hμ Nội

Vμo hồi: 14 giờ, ngμy 29 tháng 12 năm 2006

Có thể tìm hiểu luận án tại :

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Thông tin Y học Trung ương

- Thư viện Trường Đại học Y Hμ Nội

- Thư viện Bệnh viện TMH Trung ương

- Thư viện Viện Công nghệ Sinh học (VKHCNVN)

DANH MỤC CễNG TRèNH NGHIấN CỨU LIấN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Nguyễn Đỡnh Phỳc và CS (2006), “Mối quan hệ của chủng EBV

(EB45VN) của Việt Nam với cỏc chủng trong vựng và thế giới”,

Tạp chớ Y học Việt Nam, Tập 326, số 9/2006, tr 16-20

2 Nguyễn Đỡnh Phỳc (2005), “Identify the presentation of the EBV

gene in nasopharyngeal cancer biopsy tissue by PCR”, The 11 Asean ORL head neck surgery congress, p 89

3 Nguyễn Đỡnh Phỳc, Đỏi Duy Ban (2001), “ Genetic engineering

in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma”, International workshop on biology Hanoi, Vietnam, tome 2 tr 342-345

4 Nguyễn Đỡnh Phỳc, Phạm Khỏnh Hũa (2001), “Nghiờn cứu những

chẩn đoỏn nhầm lẫn và cạm bẩy lõm sàng trong ung thư vũm mũi

họng”, Tuyển tập cụng trỡnh khoa học NCS ĐHYHN, tập 6A, NXB Y

Học, tr 6-9

5 Nguyễn Đỡnh Phỳc, Đỏi Duy Ban (2001), Phỏt hiện sự cú mặt

của gen EBV trong mụ sinh thiết ung thư vũm họng bằng phản

ứng tổng hợp chuỗi”, Tuyển tập cụng trỡnh khoa học NCS ĐHYHN, tập 6A, NXB Y Học, tr 10-14

6 Nguyễn Đỡnh Phỳc (2000), “Những dấu hiệu gợi ý sớm trong ung

thư vũm mũi họng”, Nội san Tai Mũi Họng, tr 16-19

7 Nguyễn Đỡnh Phỳc (2000), “ Nghiờn cứu những chẩn đoỏn nhầm

lẫn và cạm bẩy lõm sàng trong ung thư vũm mũi họng”, Hội nghị TMH Việt-Phỏp lần thứ 5, tr 35

8 Nguyễn Đỡnh Phỳc (2000), “Phỏt hiện sự cú mặt của gen EBV

trong mụ sinh thiết ung thư vũm họng bằng phản ứng tổng hợp

chuỗi”, Hội nghị Việt Phỏp lần thứ 5, tr 33-34

9 Nguyễn Đỡnh Phỳc (1999), Nhận xột bước đầu về sự cú mặt của

gen virus EBV trong mụ sinh thiết ung thư vũm mũi họng”, Nội san Tai Mũi Họng, số 2 tr 62-64

10 Nguyễn Đỡnh Phỳc (1993), “Ung thư vũm mũi họng-Nhận xột

lõm sàng qua 410 bệnh nhõn điều trị tại Viện Tai Mũi Họng TƯ”,

Tạp chớ nghiờn cứu Y học ĐHYHN, tr 75-79

Những chữ viết tắt trong luận án

BL Burkitt’s lymphoma U lympho xương hàm trên

DNA Desoxy ribonucleic acid DNA

EA Early antigen Kháng nguyên sớm

EBER EB encoded latent infection

membran protein regulator RNA

RNA của EBV điều chỉnh protein màng gây nhiễm trùng tiềm tàng

EBNA Epstein Barr virus nuclear antigen Kháng nguyên nhân EBV

EBV Epstein Barr virus Virus Epstein Barr

Gp Glycoprotein Glycoprotein

GPB Giải phẫu bệnh

HLA Humain leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người

HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người

HSV Herpes simplex virus Virus herpes thông thường

IR Internal repeat Vùng lặp lại trong

IM Infectious mononucleosis Bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng

LCL Lymphoplastoid cell line Dòng tế bào lympho nhiễm trùng muộn

LM Lymphomalin Bệnh hạch ác tính

LMP Latent membral protein Protein màng tiềm tàng

MBH Mô bệnh học

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi

RNA Ribonucleic acid Ribonucleic acid

TNMS Tumor, Node, Metastasis, Stade Khối u, hạch, di căn xa, giai đoạn

US Unique courte Vùng ngắn đơn độc

UL Unique long Vùng dài đơn độc

UCNT Undifferentiated carcinoma

nasopharyngeal type

Ung thư biểu mô không biệt hóa vòm mũi họng

VADS Voie aero-digestif superieure Đường tiêu hóa và hô hấp trên

VCA Viral capsid antigen Kháng nguyên vỏ capsid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vũm mũi họng là một khối u ỏc tớnh xuất phỏt từ lớp biểu

mụ phủ của vựng vũm mũi họng (NPC), được xếp vào khối u của

đường tiờu hoỏ và hụ hấp trờn (VADS), là một trong 5 loại ung thư

phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp nhất trong vựng

tai mũi họng Trờn thế giới, ung thư vũm hay gặp ở cỏc nước vựng

Đụng nam Á và phớa Nam Trung Quốc [32] [34] [38] [41] [44] [192] [198] [206] [226] Cỏc bệnh nhõn thường đến khỏm và được chẩn đoỏn ở giai đoạn muộn của bệnh, làm hạn chế kết quả điều trị và ảnh hưởng xấu đến tiờn lượng Qua nghiờn cứu của cỏc tỏc giả trong và ngoài nước, đó phỏt hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số

hệ gen hoàn chỉnh của EBV trong cỏc mụ sinh thiết ung thư vũm mũi họng thuộc cỏc type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1),

EB (CN)… Cỏc chủng virus này cú phõn bố khỏc nhau theo cỏc vựng trờn thế giới Chỳng cú độc tớnh và đặc tớnh gõy bệnh khỏc nhau Ở Việt Nam, cho đến nay đó xỏc định được chủng EBV giống chủng của chõu Âu B95-8 [49][50] Để gúp phần tỡm hiểu thờm những đặc điểm lõm sàng, sự cú mặt của EBV trong tổ chức ung thư vũm mũi họng và định loại virus Epstein Barr gõy bệnh trờn người Việt Nam,

chỳng tụi tiến hành luận ỏn “Nghiờn cứu chẩn đoỏn lõm sàng và

gen virus Epstein – Barr trong ung thư vũm mũi họng’’ : Mục tiờu nghiờn cứu:

1 Nghiờn cứu về cỏc triệu chứng, hỡnh thỏi tổn thương thực thể, cỏc chẩn đoỏn nhầm và cạm bẫy lõm sàng nhằm rỳt kinh nghiệm cho chẩn đoỏn

2 Phỏt hiện sự cú mặt của gen EBV trong cỏc mụ sinh thiết, giải trỡnh trỡnh tự gien, tỡm hiểu thờm những chủng type EBV trờn bệnh nhõn ung thư vũm mũi họng ở miền Bắc Việt Nam

3 Đối chiếu kết quả: chẩn đoỏn lõm sàng, chẩn đoỏn mụ bệnh học

và chẩn đoỏn gen EBV Từ những luận chứng khoa học trờn đưa

ra những đề nghị về chẩn đoỏn sớm và những phối hợp nghiờn cứu trong ung thư vũm mũi họng

NHỮNG ĐểNG GểP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Đó phỏt hiện được chủng EBV (EB45VN) lần đầu tiờn ở bệnh

nhõn UTVMH miền Bắc Việt Nam, số đăng ký Ngõn hàng gen DQ516382 (đồng nhất với chủng GD1-Nam Trung Quốc–Ngõn hàng gen AY961628)

2 Đó phỏt hiện được trong 8 mẫu ung thư biểu mụ tuyến vỳ cú

EBV (PCR(+)) với cặp mồi EBK1F – EBK2R

3 Dấu hiệu nuốt vướng trong hạch di căn khoảng bờn họng cũng

cú thể coi là một gợi ý sớm để định hướng chẩn đoỏn lõm sàng trong UTVMH

• Cần khỏm kiểm tra vũm họng, theo dừi định kỳ cho cỏc

trường hợp VTGTD, liệt thần kinh sọ, đau đầu kộo dài, rối

loạn tuần hoàn nóo và khối u khoảng bờn họng để chẩn đoỏn

sớm, hoặc loại trừ UTVMH

• Đó đưa ra được một số nhận định về chẩn đoỏn lõm sàng, đối

chiếu chẩn đoỏn gen EBV với MBH và lõm sàng Đúng gúp

vào chẩn đoỏn sớm và hiểu biết tiến bộ hơn về UTVMH

Cấu trúc luận án: Luận án gồm 152 trang, với 50 bảng, 17 biểu

đồ, 12 hình, 2 sơ đồ, 16 ảnh minh hoạ Có 250 tμi liệu tham khảo

gồm: 76 tμi liệu tiếng Việt, 174 tμi liệu tiếng nước ngoμi Ngoμi phần

đặt vấn đề 2 trang; kết luận vμ kiến nghị 3 trang, đóng góp mới của

luận án 1 trang; luận án gồm 4 chương: Chương 1- Tổng quan 34

trang; Chương 2- Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 20 trang;

Chương 3-Kết qủa nghiên cứu 45 trang; Chương 4- Bμn luận 47 trang

Chương 1 Tổng Quan

1.1 Lịch sử nghiên cứu về ung thư vòm mũi họng

1.1.1 Trờn thế giới : UTVMH cú từ hơn 300 năm trước cụng

nguyờn, khảo cổ cho thấy tổn thương bào mũn xương đỏy sọ ở cỏc

xỏc ướp của người Ai Cập, tổn thương đú cú liờn quan đến khối u

đỏy sọ Khối u của người Quảng Đụng (Kwang Tung Tumor), Oscart

Thomson (1923) đó lý giải là liờn quan đến UTVMH Năm 1964

Epstein – Barr tỡm ra virus trong B.L., vào năm 1966 Old phỏt hiện ra

sự liờn quan của virus Epstein – Barr với ung thư vũm, từ đú cú nhiều

nghiờn cứu về lĩnh vực này Vào năm 1980, kỹ thuật sinh học phõn tử về

phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) ra đời Kể từ đú cú nhiều cụng trỡnh

nghiờn cứu phỏt hiện sự cú mặt của gen EBV trong tổ chức u, trong hạch

cổ, trong mỏu và trong huyết thanh của bệnh nhõn UTVMH : Muray

(2001), Zeng (2005), Zhong (2006)

1.1.2 Ở Việt Nam : Nghiờn cứu và giảng dạy về UTVMH, người

khởi xướng là Trần Hữu Tước, Phạm Thụy Liờn, Đặng Hiếu Trưng,

Vừ Tấn Đó xuất hiện sự hợp tỏc nghiờn cứu Việt – Phỏp : hội nghị

12/1983 Phan Thị Phi Phi, Đỏi Duy Ban, Trương Nam Hải, Phạm

Thỳy Hồng và CS đó phỏt hiện được gen của virus Epstein – Barr

trong mụ sinh thiết khối u vũm họng, đó mở ra nhiều triển vọng mới

nghiờn cứu về UTVMH

1.2 Giải phẫu ứng dụng trong UTVMH

Họng mũi nằm ở ngay dưới đỏy sọ, hoàn toàn thụng khớ với hốc mũi qua cửa mũi sau Cú cỏc thành trước, trờn sau, bờn, dưới

Bạch mạch : Cỏc nhúm hạch hay gặp: Cảnh trong, gai, dưới

hàm, hạch sau họng bờn, cổ ngang

Liờn quan giải phẫu của họng mũi : Mũi xoang, đốt sống cổ,

đỏy sọ, khoảng bờn hàm họng, họng miệng

1.3 Biểu mô phủ vùng vòm mũi họng : Biểu mụ hụ hấp cú lụng

chuyển cũn gọi là biểu mụ trụ cú tơ, biểu mụ Malpighi, biểu mụ trung gian (chuyển tiếp)

1.4 Dịch tễ học của UTVMH : Cú 3 vựng mắc khỏc biệt nhau trờn

thế giới, vựng Đụng Nam chõu Á cú tần số mắc cao nhất Tuổi tăng dần từ 20 tuổi và đạt đỉnh cao ở 40-50 tuổi [19][32][38][41][70] Nam gấp 2-3 lần nữ

Cỏc giả thuyết nguyờn nhõn của UTVMH : Đó cú nhiều

cụng trỡnh nghiờn cứu về EBV, nú được coi như là virus gõy ra ung thư đầu tiờn ở loài người [182][183][184][185][195] [203]

1.5 Virus Epstein Barr và UTVMH

EBV thuộc loại virus DNA với 2 sợi xoắn, cú khoảng 172 KB Hai chuỗi DNA được chứa đựng trong một vỏ capsid Hệ gen của EBV cú 6 tổ hợp gen mó hoỏ cho cỏc loại protein khỏng nguyờn: Khỏng nguyờn nhõn, ký hiệu là EBNA: (1, 2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mó hoỏ cho protein màng (LMP-1, LMP-2A và LMP-2B) (Muray và cs, 2001) [168] Sỏu protein EBNA cú liờn quan đến vai trũ xõm nhập và nhõn lờn của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, cũn 3 loại protein LMP liờn quan đến chu kỳ EBV trong dũng tế bào Lympho B đó chuyển đổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dũng tế bào mầm gõy nhiễm trựng muộn (LCL) Trong dũng tế bào LCL, EBNA được sao chộp trong một ARN thụng tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đú được phõn cắt thành cỏc EBNA thành phần độc lập (Hỡnh 1.4)

1.6 Bệnh học lâm sàng của UTVMH

Hỏi bệnh và khai thỏc bệnh sử : Chỳ ý dịch tễ học lõm sàng Cỏc

dấu hiệu gợi ý sớm : Đau đầu, ngạt mũi, Xỡ mỏu mũi và khịt khạc mỏu, ự tai, nghe kộm, hạch cổ to

Chẩn đoán hình ảnh : Tư thế Hirtz, sọ nghiêng, C.T Scanner, MRI

Chẩn đoán mô bệnh học : Theo phân loại của WHO (1978)

[38][56][66][72][104][113][114][202]: Type I (KBMSH), type II

(KBMKSH), type III (UCNT)

Chẩn đoán miễn dịch học : IgA/VCA (kháng nguyên vỏ),

IgG/EA (kháng nguyên sớm), IgG/EBNA (kháng nguyên nhân)

Chẩn đoán giai đoạn (UICC 2002) [202]

Chẩn đoán phân biệt : U đáy sọ, lao hạch, lác mắt

Chẩn đoán nhầm lẫn và những cạm bẫy lâm sàng của

UTVMH: Với ung thư sàng hàm, VTGTD, u não, lác mắt, lao hạch

Điều trị : Tia xạ, hoá chất, miễn dịch, phẫu thuật

Tiên lượng : Nếu phát hiện sớm, có tiên lượng tốt

Phòng bệnh : Phát hiện sớm UTVMH, phòng bệnh và chăm sóc

sức khoẻ ban đầu

Ch−¬ng 2 §èi t−îng

vμ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.1 §èi t−îng nghiªn cøu

2.1.1 Số lượng bệnh nhân

Mục tiêu 1: Bao gồm 200 bệnh nhân được khám lâm sàng và

khẳng định chẩn đoán bằng mô bệnh học là ung thư vòm mũi họng

(Phụ lục 1)

Mục tiêu 2: Bước 1: Bao gồm 91 bệnh nhân có chẩn đoán lâm

sàng và mô bệnh học là UTVMH, được lựa chọn ngẫu nhiên trong số

200 bệnh nhân nói trên để nghiên cứu phát hiện gen của EBV trong mô

sinh thiết vòm với cặp mồi TH1 và TH2 (Phụ lục 2) Bước 2: Chọn

ngẫu nhiêu 40 bệnh nhân trong số 91 đối tượng của bước 1 để nghiên

cứu cấu trúc gen và tìm hiểu chủng, type EBV với các cặp mồi

EBK1F, EBK2R và EBV1F, EBV3F, EBV2R và EBV4R (Phụ lục 3)

Mục tiêu 3 : Đối chiếu các hình thái tổn thương và các dấu hiệu

gợi ý sớm (200 bệnh nhân), đối chiếu với chẩn đoán mô bệnh học và

lâm sàng (91 bệnh nhân)

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân : Bệnh nhân phải có chẩn

đoán lâm sàng và mô bệnh học phù hợp là UTVMH

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân : Mô bệnh học âm tính, không

thực hiện nghiên cứu theo dõi dọc

2.2 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.2.1 Cỡ mẫu : Chọn cỡ mẫu không xác suất, loại mẫu mục đích

(không có yêu cầu tính cỡ mẫu)

2.2.2 Biến số nghiên cứu : Chọn biến số nghiên cứu là các biến định

lượng, định tính, mô tả mối quan hệ nhân quả của các biến độc lập và phụ thuộc

2.2.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng : Sử dụng phương pháp nghiên cứu

ngang, mô tả lâm sàng

2.2.3.2 Nghiên cứu chẩn đoán gen EBV : Sử dụng phương pháp

nghiên cứu ngang, mô tả kết quả thực nghiệm để tìm căn nguyên,

a Chất liệu nghiên cứu: Mô tổ chức ung thư vòm, dùng để chẩn

đoán mô bệnh học, nghiên cứu gen

b Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất : Của Viện

Công nghệ sinh học, của hãng QIAGEN (Mỹ), Invitogen, Genset, Sigma (Mỹ)

2.2.4 Qui trình thực hiện nghiên cứu gen EBV

2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 2.2.4.2 Phát hiện sự có mặt của gen EBV bằng cặp mồi TH 1 và TH 2

2.2.4.3.Phản ứng PCR với cặp mồi EBK1F và EBK2R, giải trình trình

tự gen Bảng 2.2 Cặp mồi của phản ứng PCR phát hiện gen EBV

Tên mồi Chuỗi mồi (20 base) Kết hợp cặp mồi phẩm PCR Độ dài sản

TH 1 5’ – AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG – 3’ Tm = 77,5oC

TH 2 5’ – GCTTGGATGGCGGAGTCAGCGACGG – 3’ Tm = 83,3o

C

TH 1 / TH 2 240bp

EBK1F 5’-GTCATCATCATCCGGGTCTC - 3’ Tm = 56o C

EBK2R 5’-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG - 3’ Tm = 56o C

EBK1F

- EBK2R

270 bp

EBV1F 5’-ATCGTGGTCAAGGAGGTTCC - 3’ Tm = 56o C

EBV2R 5’-ACTCAATGGTGTAAGACGAC - 3’ Tm = 56o C

EBV3F 5’-AAGGAGGGTGGTTTGGAAAG - 3’ Tm = 56o C

EBV4R 5’-AGACAATGCACTCCCTTAGC - 3’ Tm = 56o C

EBV1F/EBV3F

- EBV4R/EBV2R (PCR lång)

209 bp

Mụ hỡnh nghiờn cứu chẩn đoỏn gen virus Epstein - Barr

Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi EBK1F-EBK2R và

mồi lồng : 1 chu kỳ (95oC- 3 phỳt), 40 chu kỳ (94oC – 1 phỳt, 56oC – 50

giõy, 72oC – 3 phỳt), 1 chu kỳ (72oC – 7 phỳt), Tinh sạch sản phẩm

PCR, ghộp- nối sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng, chuyển nạp,

nuụi cấy vi khuẩn tỏi tổ hợp, tỏch chiết cỏc plasmid tỏi tổ hợp, cắt

kiểm tra bằng enzym EcoRI

Bệnh nhân UTVMH

(Bệnh viện TMH)

Mô ung thư

Tách chiết DNA

Phản ứng PCR

Cặp mồi TH 1 và TH 2

Bảo

quản

cho

nghiên

cứu

sau

nμy

Chẩn đoán MBH

Sinh thiết

- Đo quang phổ

- Điện di trên thạch Agarose

Bước 1

Bước 2

Chẩn đoán lâm sμng

- Lμm BA theo mẫu nghiên cứu

- Lμm các xét nghiệm cơ bản

Phản ứng PCR, giải trình trình tự gen Cặp mồi EBK1F – EBK2R

Truy cập Ngân hàng gen

Phân tích, so sánh kết quả, tìm hiểu chủng, type EBV

Xây dựng phương pháp PCR đối với EBV

Mẫu bệnh phẩm

UTVMH

Mẫu bệnh phẩm khả nghi UTVMH

ứng dụng PCR phát hiện EBV

sμng lọc mẫu bệnh phẩm khác

Mẫu bệnh phẩm UTBM vú

Giải trỡnh trỡnh tự và xử lý số liệu Ngõn hàng Gen [GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)]

2.2.5 Chẩn đoỏn MBH : WHO (1978)

2.2.6 Chẩn đoỏn TNM và giai đoạn S

Sử dụng phõn loại TNM theo WHO 2002 [202]

2.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

Khoa Ung bướu – BV Tai Mũi Họng TW Bộ mụn Giải phẫu bệnh Trường ĐHYHN, Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện K và BV Tai Mũi Họng TƯ.Phũng Miễn dịch học và phũng Kỹ thuật di truyền, Viện Cụng nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam Quản lý khoa học: Trường Đại học Y Hà Nội

2.4 Xử lý số liệu

Sử dụng chương trỡnh phần mềm EPI – Info 6.0 Sử dụng thuật toỏn so sỏnh hai tỷ lệ theo cụng thức kiểm định α2 và cụng thức so sỏnh theo test T – student Sử dụng cụng thức tớnh khoảng ước lượng

tỷ lệ CI (95%)= [ω ± δ] Trong đú:

ω = Tỷ lệ xuất hiện của hiện tượng nghiờn cứu

δ = Sai số của ước lượng = (1 )

( / 2)

t

n

Chương 3 Kết quả nghiên cứu

3.1 Dịch tễ học đại cương của UTVMH

3.1.1 Phân bố theo giới : nam gấp ba lần ở nữ giới

3.1.2 Phân bố theo tuổi : 40-69 (79%), hay mắc nhất 48-52 (CI =95%) 3.1.3 Phân loại theo dân tộc : Kinh (95%, dân tộc (5%)

3.1.4 Phân bố theo địa dư : Gặp ở 23 tỉnh thμnh của miền Bắc

3.2 Chẩn đoán mô bệnh học và lâm sàng UTVMH

3.2.1 Chẩn đoán MBH : UCNT (92,5%), KBMKSH (6%), KBMSH (1,5%)

3.2.2 Chẩn đoán khối u (T)

3.2.2.1 Các dấu hiệu mượn khi thăm khám : Đau đầu (91%), ù tai

(84%), ngạt mũi (75%), hạch cổ di căn (71%), nghe kém (70%), xì

máu (66%), khịt máu (63%), VTGTD (11%), khít hμm (4%), nuốt

vướng (3%), trên 50% bệnh nhân đến khám có nhiều dấu hiệu mượn

3.2.2.2 Vị trí xuất phát của tổn thương

Bảng 3.7 Vị trí xuất phát của tổn thương

Thμnh trên sau 49%, thμnh bên 50%

3.2.2.3 Hình thái tổn thương thực thể

Bảng 3.8 Hình thái tổn thương thực thể

Thể sùi nhiều hơn thể thâm nhiễm (p < 0,01)

3.2.2.4 Phân loại tổn thương khu trú tại vòm và lan ra ngoài vòm họng

Khối u khu trú tại vòm 31,5%, lan ra ngoμi vòm 68,5% (p < 0,01)

Bảng 3.10 Lan tràn ra ngoài vòm họng

Lan lên đáy sọ nhiều hơn mũi xoang (p < 0,05)

3.2.2.5 Tổn thương thần kinh sọ não

Có 39,5% liệt dây thần kinh sọ khi thăm khám lần đầu tiên : dây

V, dây VI, nhóm vận nhãn, lỗ rách sau Có thể gặp dây II, VII, VIII

3.2.2.6 Chẩn đoán khối u (T)

Bảng 3.14 Chẩn đoán khối u (T)

CI [10,5 – 20,9] [11,8 – 22,5] [8,8 – 16,6] [48,3 – 62,5]

Bệnh nhân đến khám ở giai đoạn muộn T3 (13%), T4 (55,5%)

3.2.3 Chẩn đoán hạch cổ di căn (N)

Bảng 3.15 Chẩn đoán hạch cổ di căn (N)

CI [22,9 – 35,5] [13,5 – 24,7] [1,9 – 8,0] [41,5 – 55,6]

N0 (29%), N(+) 71% : N3 48,5% Hạch Kutner gặp nhiều nhất (77,46%), nhiều dãy vμ hai bên (14,08%), gặp cả hạch di căn ở khoảng bên họng (4,23%)

3.2.4 Di căn xa (M) và chẩn đoán giai đoạn (S)

Bảng 3.18 Chẩn đoán giai đoạn (S)

Di căn xa trước điều trị 1,5% SIV chiếm 71,5%

3.2.5 Chẩn đoán nhầm và cạm bẫy lâm sàng

Bảng 3.19 Chẩn đoán nhầm trong UTVMH

Bệnh lý tai xương chũm 20 23,8 [15,6 – 33,8] < 0,001

> 0,05

Chẩn đoán nhầm 42% Các dấu hiệu dễ bị nhầm lẫn được coi lμ

“cạm bẫy” lâm sμng chính lμ các dấu hiệu mượn của mũi xoang, tai

xương chũm, VTGTD, hạch khoảng bên họng, liệt thần kinh sọ, thiếu

kinh nghiệm, “phản xạ định hướng”, UTVMH

3.3 Kết quả chẩn đoán gen EBV

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số : Gồm 91 mẫu

3.3.2 Phát hiện gen EBV bằng phản ứng PCR với cặp mồi TH 1 và TH 2

Kết quả chẩn đoán gen EBV với cặp mồi TH1 vμ TH2

Bảng 3.26 Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi TH 1 / TH 2

Tổng 91 100%

Phản ứng trùng hợp dương giữa lâm sμng, MBH, gen EBV lμ 95,6%

3.3.3 Tìm hiểu chủng type EBV trong UTVMH ở miền Bắc Việt Nam

3.3.3.1 Kết quả chẩn đoán gen EBV với các cặp mồi đặc hiệu của gen EBNA-1 (EBK1F - EBK2R) : Thực hiện phản ứng PCR thμnh

công với cả cặp mồi đơn (270bp) vμ cặp mồi lồng (209 bp)

3.3.3.2 Kết quả tách dòng sản phẩm PCR

Thực hiện tách dòng thμnh công với cả 2 sản phẩm PCR của cặp mồi đơn vμ cặp mồi lồng

ảnh 3.10: Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 0,8%

ảnh 3.11 Điện di sản phẩm tách dòng trên thạch agarose 1,0% Hình 3.1 : Giải trình trình tự plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EB45

3.3.3.3 Đoạn gen EBNA-1 của chủng EB45, EB39 và kết quả truy

cập Ngân hàng gen

Đoạn gen EBNA-1 gồm 270bp, dòng trên lμ nucleotid, dòng dưới kí hiệu của acid amin, mồi xuôi đóng khung ở biên trên, mồi ngược đóng ở biên dưới của chuỗi gen

2,3kb

564bp

209bp

2,3kb

564bp

209bp

2,3kb

564bp

209bp

2,3kb

564bp

209bp

EcoRI

Chuỗi nucleotid của chủng EB45

Hình 3.2 Trình tự nucleotid và thành phần acid amin của đoạn

gen EBNA-1 (270 bp) thu nhận từ chủng EB45

Hình 3.3 : Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotid

của đoạn gen EBNA-1 được giải trình trình tự từ mẫu bệnh phẩm EB45

Chủng EB45VN tương đồng cao với GD1 Nam Trung Quốc có

hệ số 535, gía trị 2E-149

3.3.3.4 Phát hiện chủng EBV (EB45VN) lần đầu tiên ở bệnh nhân

UTVMH miền Bắc Việt Nam

Bệnh nhân N.T T ở Nghệ An, nữ, 48 tuổi, đến khám tại Khoa

khối u, Bệnh viện Tai Mũi Họng TW ngμy 12/11/1999 Được chẩn

đoán lμ UTVMH giai đoạn T1N3M0SIV, mang bệnh án số NT 39 Chẩn

đoán mô bệnh học lμ UCNT (tiêu bản KV22-PGS Lê Đình Roanh)

Truy cập chuỗi EB45

Số đăng ký Ngân hμng Gen Tên loại virus có kết quả tương đồng Hồ sơ Giá trị

Hạch đồ có di căn của ung thư biểu mô Mô bệnh phẩm đó được tách chiết DNA vμ cho phản ứng PCR(+) với cặp mồi TH1/TH2, với cặp mồi EBK1F/EBK2R cũng cho kết quả (+) - Số khuôn DNA : EB45, thử phản ứng PCR với cặp mồi lồng EBV1F, EBV3F-EBV2R, EBV4R cũng cho kết quả (+) Tách dòng sản phẩm PCR với vector pCRđ2.1- TOPOđ

(Invitrogen Inc.) của khuẩn E.coli, giải trình trình tự gen của mẫu EB45

nμy vμ so sánh đối chiếu với các chủng EBV hiện có trong Ngân hμng

gen NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) : đã cho thấy có

thμnh phần gen đồng nhất cao với các chủng EBV khác trên thế giới,

đặc biệt đồng nhất với chủng GD1 của Nam Trung Quốc

Trước đây ở Việt Nam mới chỉ phát hiện vμ công bố chủng EBV giống với chủng EBV (B95-8) của châu Âu (như chủng EB39) Còn chủng EB45 chúng tôi mới phát hiện được thì có thμnh phần gen đồng nhất với chủng GD1 Chủng EB45-VN đã được đăng ký tại Ngân hμng gen với bản quyền xác nhận số hiệu DQ516382 ngμy 28 tháng 04 năm

2006 (Phụ lục 3B)

3.3.4 Kết quả sàng lọc các mẫu UTVMH bằng sinh học phân tử

3.3.4.1 Sàng lọc 37 mẫu UTVMH bằng phản ứng PCR với cặp mồi EBK1F-EBK2R : PCR(+) 100%

3.3.4.2 Phát hiện sự có mặt của EBV trong 6 tổn thương nghi ngờ UTVMH (Dysplasie) với cặp mồi EBK1F-EBK2R

Với 6 bệnh nhân có nghi ngờ

lμ dị sản biểu mô vòm qua thăm khám lâm sμng vμ chẩn đoán mô

bệnh học lμ dysplasie (đã sinh thiết

3 lần) Cả 6 trường hợp nμy đều cho phản ứng PCR (+) : gồm số PCR 8,13 (bản gen A); 17 (bản gen B);

30 (bản gen C) ảnh Phụ lục 4 vμ 36,

42 (bản gen D ảnh 3.12)

ảnh 3.12 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBK1F, EBK2R

Số PCR 36, 42 của hai mô sinh thiết vòm nghi ngờ UTVMH (dị sản); Số PCR BK8 và 25 của ung thư biểu mô vú; Số PCR còn lại của mô UTVMH

M (-) (+1 BK BK2 3 3 3

M 3 3 4 4 4 4 4

270 564

270 564

M (-) (+1 BK BK2 3 3 3

M 3 3 4 4 4 4 4

M (-) (+1 BK BK2 3 3 3

M 3 3 4 4 4 4 4

270 564

270 564

D

3.3.4.3 Phát hiện sự có mặt của EBV trong 8 mẫu ung thư biểu mô vú

với cặp mồi EBK1F-EBK2R : 8/8 có PCR (+)

3.4 Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng, MBH và gen EBV

3.4.1 Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng

Bảng 3.31 Đối chiếu hình thái tổn thương với các dấu hiệu lâm sàng

n

n

p

UCNT 23 92 [76,0-98,6] 159 92,4 [87,7-95,7] p>0,05

II 1 4 [0,2-18,2] 11 6.4 [3,4-10,8] p>0,05

MBH

I 1 4 [0,2-18,2] 1

Hạch cổ to 10 40 [22,4-59,8] 25 14,5 [9,8-20,4] p<0,01

Đau đầu 8 32 [16,1-51,7] 68 39,5 [32,4-47,0] p>0,05

Về tai 5 20 [7,7-38,9] 35 20,3 [14,8-26,8] p>0,05

Dấu hiệu

gợi ý sớm

Về mũi 2 8 [1,4-24,0] 44 25,6 [19.5-32,5] p>0,05

Trên sau 21 84 [65,8-94,7] 77 44,8 [37,5-52,2] p<0,001

Thành bên 4 16 [5,3-34,2] 93 54,1 [46,6-61,4] p<0,001

Vị trí

xuất phát

tổn thương

Thành dưới 0 0 2 1,2 [0,2-3,8]

Đáy sọ 11 44 [25,7-63,6] 68 39,5 [32,4-47,0] p>0,05

Mũi xoang 0 0 48 27,9 [21,6-34,9]

Họng miệng 0 0 9 5,2 [2,6-9,4]

Hố CBH 0 0 8 4,7 [2,2-8,6]

Tai giữa 0 0 2 1,2 [0,2-3,8]

Lan trμn

ổ mắt 0 0 2 1,2 [0,2-3,8]

Di căn xa M 1 0 0 3 1.8 [0,7-4,2]

Hạch cổ di căn sớm ở thể thâm nhiễm nhiều hơn thể sùi Dấu hiệu

mượn mũi vμ tai phối hợp với đau đầu Thể thâm nhiễm xuất phát ở

thμnh trên sau, lan lên đáy sọ Thể sùi xuất phát ở thμnh bên nhiều hơn

thμnh trên sau, lan ra ngoμi vòm sớm, rộng (mũi xoang, đáy sọ, họng

miệng) Di căn xa ở thể sùi gặp ngay từ lần thăm khám đầu tiên

3.4.2 Đối chiếu chẩn đoán gen EBV với MBHvà lâm sàng Bảng 3.39 Đối chiếu chẩn đoán gen EBV với MBH và lâm sàng

MBH

Vị trí xuất phát

Hình thái tổn

Lan trμn

T

Hạch cổ to (N)

S

PCR (+) ở cả 3 thể MBH, ở cả 9/9 thể thâm nhiễm PCR (+) nhiều ở thể UCNT, T4, SIV, ở hạch cổ to, lan trμn đáy sọ PCR (-) gặp

ở 4/4 thể sùi Có 6/6 biểu mô vòm dị sản có PCR (+), điều đó giúp cho sự phối hợp giữa lâm sμng, MBH, gen EBV để theo dõi định kỳ, chẩn đoán sớm UTVMH