Nghiên cứu các chỉ số sinh lý hồng cầu và những đột biến gen G6PD hồng cầu ở người thiếu hụt G6PD trên một số dân tộc tại Việt Nam

Nghiên cứu các chỉ số sinh lý hồng cầu và những đột biến gen G6PD hồng cầu ở người thiếu hụt G6PD trên một số dân tộc tại Việt Nam

Đặt Vấn đề

* Tính cấp thiết của đề tài

Trong hồng cầu, G6PD là một enzym xúc tác trong phản ứng tạo

ra NADPH - có vai trò chống oxy hóa hồng cầu Nếu thiếu hụt G6PD

sẽ dẫn tới tình trạng oxy hóa globin và protein cấu trúc của hồng cầu, gây vỡ hồng cầu Bệnh thiếu hụt G6PD thường không thể hiện bằng các triệu chứng rầm rộ, nhưng luôn có nguy cơ bùng phát nghiêm trọng khi có tác động của một số yếu tố có tính oxy hoá Khi đó bệnh

sẽ tiến triển với các triệu chứng vỡ hồng cầu, có thể dẫn đến những biến chứng nguy hiểm nhất là ở trẻ sơ sinh và phụ nữ mang thai Những nghiên cứu về G6PD đã đề cập tới nhiều khía cạnh khác nhau như đặc điểm lý hoá, các dạng phân tử của G6PD Tuy nhiên một số nghiên cứu về cơ sở phân tử của bệnh thiếu hụt G6PD mới chỉ bắt đầu được tiến hành trong những năm gần đây ở Việt Nam cho tới nay mới có một số ít công trình công bố về cơ sở phân tử của bệnh thiếu hụt G6PD như của Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trần Thị Chính và cộng sự Những nghiên cứu về vấn đề này trên các dân tộc ít người ở miền núi phía Bắc và Tây Nguyên còn quá ít

Do đó việc nghiên cứu các chỉ số sinh lý máu, tỉ lệ thiếu hụt G6PD và phát hiện những đột biến gen G6PD ở bệnh nhân thiếu hụt G6PD trên một số dân tộc người Việt nam là rất có ý nghĩa và cần thiết Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu các chỉ số sinh lý hồng cầu và những đột biến gen G6PD hồng cầu ở người bị thiếu hụt G6PD trên một số dân tộc tại Việt Nam”

* Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định một số chỉ số sinh lý hồng cầu ở người thuộc một số dân tộc tại Việt Nam

- Xác định hoạt độ G6PD hồng cầu và tỉ lệ thiếu hụt enzym này

ở người thuộc một số dân tộc tại Việt Nam

- Phát hiện một số đột biến gen G6PD ở những người thiếu hụt G6PD hồng cầu

* Những đóng góp mới của luận án

- Đã xác định được tỉ lệ thiếu hụt G6PD hồng cầu ở người thuộc dân tộc Kinh, Thái, Dao tại Điện Biên; dân tộc Kinh, Thái tại Sơn La, dân tộc dân tộc Kinh, Gia Rai tại Gia Lai

- Đã xác định được một số chỉ số sinh lý hồng cầu, hoạt độ G6PD, một số dạng đột biến gen G6PD ở dân tộc Kinh (tại Hà Nội, Sơn La, Gia Lai), Thái (tại Sơn La) và Gia Rai (tại Gia Lai)

* Bố cục của luận án

Luận án gồm 127 trang, 22 bảng và 24 hình; Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1.Tổng quan (38 trang); Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (21 trang) ; Chương 3 Kết quả (34 trang); Chương 4 Bàn luận (29 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang); Tài liệu tham khảo (58 tiếng Việt ; 94 tiếng Anh); Phụ lục (7 trang)

NADPH – có vai trò trong chống oxy hóa ở hồng cầu

1.3 Bệnh thiếu hụt G6PD trong hồng cầu

Đến nay đã có những hiểu biết đáng kể về bệnh thiếu hụt G6PD Hoạt độ G6PD hồng cầu thay đổi theo từng dân tộc và theo vùng địa lý

Các nước phát triển đã tiến hành nghiên cứu trên diện rộng để xác

định nhanh sự thiếu hụt G6PD ở trẻ mới sinh ở Việt Nam, Nguyễn Hữu Chấn đã nghiên cứu về các tính chất hoá sinh của G6PD hồng cầu Việt Nam có tỉ lệ thiếu hụt G6PD từ 0,3ữ9,0% Những người nghiên cứu đầu tiên về tỉ lệ thiếu hụt G6PD ở Việt Nam là Ngô Gia Thạch, Hoàng Văn Sơn, Đoàn Hạnh Nhân…Tỉ lệ thiếu hụt G6PD

ở một số dân tộc như sau: Mường (31%), Thổ (22,6%), Thái (19,3%), Dao (9,7%), Tày là 17,7%, Raclei là 2,92% và rất thấp ở dân tộc H’mông (0,3%) Hoạt độ G6PD (đơn vị IU/gHb/37oC) ở dân tộc Kinh, Nguyễn Hữu Chấn công bố (năm 1992) là 9,01±1,12 ở nam và 9,05±1,04 ở nữ, Hoàng Hạnh Phúc công bố (năm 1999) là 9,99±1,79

* Sinh bệnh học phân tử, triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán thiếu hụt G6PD hồng cầu

Thiếu hụt G6PD là một bệnh di truyền gen lặn liên kết giới tính, gen G6PD có 13 exon và 12 intron, dài khoảng 100 kb nằm trên nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do

đó bệnh không di truyền từ bố sang con trai

Đặc điểm lâm sàng của bệnh thiếu hụt G6PD thường không có các triệu chứng rầm rộ, nhưng luôn có nguy cơ bùng phát nghiêm trọng khi có tác động của một số yếu tố có tính oxy hoá như một số chất hoá học, một số thực phẩm, đặc biệt là các thuốc có tính oxy hoá cao như thuốc hạ nhiệt, giảm đau, thuốc điều trị sốt rét… Khi đó bệnh sẽ tiến triển với các biến chứng như tan máu, đái ra hemoglobin

Để chẩn đoán thiếu hụt G6PD cần xét nghiệm định tính hoặc định lượng hoạt độ G6PD

* Phát hiện và phân loại đột biến gen G6PD ở người

Đến nay đã phát hiện được trên 100 điểm đột biến gen G6PD Trên thế giới nghiên cứu về các dạng đột biến gen G6PD khá đầy đủ

và chi tiết Vùng Đông Nam á đã xác định được một số loại đột biến

như: Gaohe, Mahidol, Coimbra, Viangchan, Chatham, Chinese-5, Surabaya, Union, Canton, Vanualava và Kaiping

Gần đây ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự đã công

bố một số dạng đột biến như: Viangchan, Gaohe, Chinese-5, Union, Canton, Kaiping và Silent Hiroyuki M và cộng sự (năm 2007) đã tìm ra một đột biến mới trên gen G6PD (Bảo Lộc) cùng với một số dạng khác như Viangchan, Gaohe, Quing Yuan…

1.4 Tình hình nghiên cứu các chỉ số sinh lý máu của người việt nam

Các chỉ số sinh học của người Việt Nam, trong đó có các chỉ số sinh lý tế bào máu đã được tổng kết trong quyển “ Hằng số sinh học người Việt Nam” xuất bản năm 1975, quyển “ Các giá trị sinh học người Việt Nam bình thường thập kỉ 90-thế kỉ XX” xuất bản năm 2003 và nhiều công trình nghiên cứu khác trong những năm gần

đây cũng đã được công bố

Ch ơng 2 Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là người bình thường, khỏe mạnh, không

có bệnh cấp và mạn tính, trạng thái thần kinh ổn định, tâm sinh lý bình thường Tiêu chuẩn loại trừ: loại trừ các đối tượng bị thiếu máu cấp và mạn tính

- Đối tượng nghiên cứu gồm 3113 người thuộc các dân tộc: Kinh (1269 người), Thái (950 người), Dao (170 người), H’mông (497 người), Gia Rai (228 người) Xác định dân tộc của đối tượng dựa trên phiếu điều tra, cả 2 thế hệ (ông, bà, bố, mẹ) đều phải cùng một dân tộc

- Độ tuổi của đối tượng nghiên cứu từ 17ữ59 tuổi Đối tượng phải có thời gian định cư tại nơi nghiên cứu từ 10 năm trở lên

- Các đối tượng tự nguyện tham gia nghiên cứu Các đối tượng bị thiếu hụt G6PD sẽ được thông báo trực tiếp và được nhận tài liệu tư vấn về phòng và điều trị bệnh (phụ lục số 2 và 3)

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các đối tượng sinh sống ở các địa phương sau: Điện Biên, Sơn

La, Gia Lai và Hà Nội Nghiên cứu được tiến hành tại các địa điểm khám bệnh của bệnh viện TWQĐ 108 trong đợt công tác khám chữa bệnh tại tỉnh Điện Biên

- Tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108

- Tại bệnh viện Quân y 6, Quân khu II

- Tại bệnh viện 211, thành phố Pleiku - tỉnh Gia Lai

- Tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

* Thiết kế nghiên cứu

- Tại các địa điểm nghiên cứu tổ chức khám lâm sàng, lựa chọn

đối tượng Lấy máu các đối tượng nghiên cứu làm xét nghiệm các chỉ

số hồng cầu và xác định thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật formazan

- Lấy ngẫu nhiên 40 mẫu theo từng nhóm (phân nhóm theo giới, dân tộc và địa điểm nghiên cứu) để định lượng hoạt độ G6PD

- Lấy các mẫu có kết quả formazan dương tính, định lượng hoạt

độ G6PD, để đánh giá mức độ thiếu hụt G6PD

- Kiểm tra lại độ nhạy, độ đặc hiệu của kĩ thuật formazan

- Lấy các mẫu máu có hoạt độ G6PD thấp, tách ADN, phát hiện

đột biến gen G6PD theo 2 phương pháp : PCR-MPTP và đọc trình tự

* Các chỉ số nghiên cứu và các trang thiết bị, hóa chất cần thiết

Các chỉ số nghiên cứu : Một số chỉ số sinh lý hồng cầu Tỉ lệ

thiếu hụt G6PD Hoạt độ G6PD Dạng đột biến gen G6PD

Các trang thiết bị và hóa chất: Trang thiết bị đầy đủ cho xác

định các chỉ số hồng cầu, hoạt độ G6PD, đột biến gen… Tất cả các

hóa chất, chất chuẩn sử dụng đều có độ tinh sạch PA, được mua từ các hãng có uy tín như Randox, In vitrogen Sigma, Abbott …

* Phương pháp kĩ thuật xác định các chỉ số nghiên cứu

Xác định các chỉ số tế bào máu ngoại vi, kĩ thuật formazan, định lượng G6PD Tách chiết ADN tổng số, xác định hàm lượng ADN,

điện di ADN, phản ứng PCR khuếch đại các exon, kĩ thuật MPTP phân tích các đột biến, đọc trình tự ADN

Chương 3 : Kết quả nghiên cứu

3.1 một số chỉ số Sinh lý hồng cầu của một số dân

tộc tại Việt Nam

3.1.1 Một số chỉ số hồng cầu của người Kinh định cư tại Hà Nội

Bảng 3.1 Một số chỉ số hồng cầu (X ±SD) của nam và nữ dân tộc

Kinh định cư tại Hà Nội

Kết quả bảng 3.1 cho thấy: Các chỉ số hồng cầu trong máu ngoại

vi của nam dân tộc Kinh đều lớn hơn so với các chỉ số này ở nữ

Chỉ số

nghiên cứu

Nam (n=82)

3.1.2 Một số chỉ số hồng cầu của người Kinh, Thái và Gia Rai

Bảng 3.2 Một số chỉ số hồng cầu (X ±SD) của nam và nữ dân tộc

Kinh và dân tộc Thái định cư tại Sơn La

Chỉ số

NC [1] Nam(n=51) [2] Nữ (n=44) [3] Nam(n=52) [4] Nữ(n=49)

4,99±0,39 4,63±0,34 5,25±0,46 4,79±0,42 RBC

(T/l) p(1-2) < 0,001; p(2-4) < 0,05; p(1-3) < 0,01; p(3-4) < 0,001

150,67±11,37 143,50±9,05 143,58±11,39 139,18±9,17 HGB

(g/l) p(1-2) < 0,01; p(2-4) < 0,05; p(1-3) < 0,01; p(3-4) < 0,05

0,439±0,033 0,403±0,028 0,436±0,028 0,401±0,023 HCT

(l/l) p(1-2) < 0,001; p(2-4) > 0,05; p(1-3) > 0,05; p(3-4) < 0,001

88,10±4,90 87,18±3,62 83,60±7,19 83,63±6,53 MCV

(fl) p(1-2) > 0,05; p (2-4) < 0,01; p(1-3) < 0,001; p(3-4) > 0,05

30,26±2,31 30,84±2,41 27,79±2,63 29,38±2,86 MCH

(pg) p(1-2) > 0,05; p(2-4) < 0,01; p(1-3) < 0,001; p(3-4) < 0,01

343,49±17,47 353,93±11,22 329,14±14,98 349,47±12,89 MCHC

(g/l) p(1-2) < 0,01; p(2-4) > 0,05; p(1-3) < 0,001; p(3-4) < 0,001

Bảng 3.3 Một số chỉ số hồng cầu (X ±SD) của nam và nữ dân tộc

Kinh và dân tộc Gia Rai định cư tại Gia Lai

Chỉ

số NC

[1] Nam (n=70)

[2] Nữ

(n=53)

[3] Nam (n=50)

[4] Nữ (n=50) 4,95±0,36 4,32±0,36 5,23±0,35 4,59±0,35 RBC

(T/l) p(1-2)< 0,001; p(2-4)< 0,001; p(1-3)< 0,001; p(3-4)< 0,001

147,64±9,79 128,08±11,04 147,44±11,99 126,78±9,52 HGB

(g/l) p(1-2) < 0,001; p(2-4) > 0,05; p(1-3) > 0,05; p(3-4) < 0,001

0,431±0,025 0,376±0,031 0,442±0,035 0,378±0,022 HCT

(l/l) p(1-2) < 0,001; p(2-4) > 0,05; p(1-3) > 0,05; p(3-4) < 0,001

87,72±4,12 86,65±3,13 84,26±5,45 82,59±5,41 MCV

(fl) p(1-2) > 0,05; p(2-4) < 0,001; p(1-3) < 0,001; p(3-4) > 0,05

30,25±1,87 29,52±1,58 28,37±2,52 27,44±2,52 MCH

(pg) p(1-2) < 0,05; p(2-4) < 0,001; p(1-3) < 0,001; p(3-4) > 0,05

345,60±12,33 339,42±11,14 332,16±16,76 331,30±14,92 MCHC

(g/l) p(1-2) < 0,01; p(2-4) < 0,01; p(1-3) < 0,001; p(3-4) > 0,05

Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy:

- Các chỉ số RBC, HGB, HCT, MCHC của nam dân tộc Kinh và Thái đều lớn hơn so với các chỉ số này ở nữ dân tộc Kinh và Thái

- Số l−ợng hồng cầu của nam và nữ dân tộc Thái lớn hơn so với các chỉ số này ở nam và nữ dân tộc Kinh

- Các chỉ số MCV, MCH của của nam và nữ dân tộc Thái nhỏ hơn so với các chỉ số này ở nam và nữ dân tộc Kinh

Từ kết quả ở bảng 3.3 cho thấy:

- Các chỉ số RBC, HGB, HCT của nam dân tộc Kinh và Gia Rai

đều lớn hơn so với các chỉ số này ở nữ dân tộc Kinh và Gia Rai

- Số l−ợng hồng cầu của nam và nữ dân tộc Gia Rai lớn hơn so với các chỉ số này ở nam và nữ dân tộc Kinh

- Các chỉ số MCV, MCH, MCHC của của nam và nữ dân tộc Gia Rai nhỏ hơn so với các chỉ số này ở nam và nữ dân tộc Kinh

3.2 Xác định tỉ lệ thiếu hụt và hoạt độ G6PD hồng cầu ở một số dân tộc tại Việt Nam

3.2.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kĩ thuật formazan trong nghiên cứu sàng lọc tỉ lệ thiếu hụt G6PD

Hình 3.1 Hình ảnh phản ứng formazan trên khay 40 mẫu

(- Vị trí số 1 là chứng âm Vị trí số 2 là chứng dương Các vị trí từ 3ữ40 là các mẫu thử) Kết quả trên hình 3.1 cho thấy:

Thiếu hụt G6PD là1+, 2+, 3+ Se1=100% Sp1=96,06%

Thiếu hụt G6PD là 2+ và 3+ Se2=100% Sp2=98,65%

Ghi chú: Se (sensitive) là độ nhạy, Sp (specific) là độ đặc hiệu

HĐBT là hoạt độ G6PD trên người bình thường

Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:

Kết quả thu được khi chọn tất cả các mẫu dương tính để kết luận

là có sự thiếu hụt G6PD, độ nhạy (Se1) của kĩ thuật là 100%, độ đặc hiệu (Sp1) là 96,06%

Kết quả thu được khi chọn các mẫu dương tính 2+ và 3+ để kết luận là có sự thiếu hụt G6PD, độ nhạy (Se2) của kĩ thuật là 100%, độ

đặc hiệu (Sp2) là 98,65%

Chúng tôi lấy tiêu chuẩn các mẫu có kết quả phản ứng formazan dương tính 2+ và 3+, để kết luận là có sự thiếu hụt G6PD

3.2.2 Kết quả sàng lọc xác định tỉ lệ thiếu hụt G6PD hồng cầu

trên một số dân tộc Việt Nam bằng kĩ thuật formazan

Bảng 3.5 Kết quả sàng lọc tỉ lệ thiếu hụt G6PD ở nam và nữ ở một số

Thái [2]

Gia Rai[3]

Dao [4]

H’mông [5]

Kết quả trên bảng 3.5 cho thấy: Tỉ lệ thiếu hụt G6PD cao nhất

ở dân tộc Thái là 7,26% và thấp nhất ở dân tộc H’mông là 0,60%

3.2.3 Hoạt độ G6PD hồng cầu ở một số dân tộc Việt Nam

Bảng 3.6 Hoạt độ G6PD ở người Kinh tại Hà Nội

[4] Nữ

(n=36)

Chung (n=72)

250,26 ±28,09 248,71± 27,46 8,35±0,96 8,55±0,87 8,45 ± 0,92

p (1-2) > 0,05 p (3-4) > 0,05

Bảng 3.7 Hoạt độ G6PD (đơn vị tính IU/gHb) ở người Kinh và người

Thái định cư tại Sơn La

Kinh (Sơn La) Thái (Sơn La) Chỉ số

p(1+2)-(3+4) < 0,001

Bảng 3.8 Hoạt độ G6PD (đơn vị tính IU/gHb) ở người Kinh và Gia

Rai định cư tại Gia Lai

Kinh (Gia Lai ) Gia Rai (Gia Lai) Chỉ số

Kết quả trên bảng 3.6, 3.7 và 3.8 cho thấy: So sánh hoạt độ

G6PD giữa nam và nữ ở các dân tộc khác biệt không có ý nghĩa

thống kê So sánh hoạt độ G6PD giữa dân tộc Kinh với dân tộc Thái

và Gia Rai có sự khác biệt, với p<0,001

3.3 phát hiện các đột biến gen trong các trường

hợp thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật PCR

3.3.1 Kết quả tách ADN các mẫu máu có thiếu hụt G6PD

Kết quả các mẫu tách đều có hàm lượng ADN lớn hơn 300μg/ml

và tỉ lệ 2 mật độ quang đo ở 2 bước sóng 260nm/280nm lớn hơn 1,85

(tỉ lệ 2 mật độ quang này tốt nhất là từ 1,8 đến 2,0) Kết quả tách

ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%

3.3.2 Kết quả chạy PCR-MPTP tìm đột biến gen G6PD

Chúng tôi tiến hành tìm đột biến gen G6PD theo kĩ thuật MPTP lần lượt trên từng exon 2, 9, 11 là những exon thường xảy ra

PCR-đột biến ở các dân tộc Đông Nam á Tiến hành PCR lần thứ nhất để tách và khuếch đại các exon, với mỗi exon sử dụng một cặp mồi riêng Tiến hành PCR lần thứ hai (PCR-MPTP), với hai phản ứng PCR-MPTP-A và PCR-MPTP-B Phản ứng PCR-MPTP-A sử dụng các mồi xuôi không có đột biến Phản ứng PCR-MPTP-B sử dụng các mồi xuôi có đột biến dựa trên các đột biến điểm đã biết

* Tiến hành kĩ thuật PCR-MPTP trên exon 9

Exon 9 là exon thường xảy ra 2 đột biến: Viangchan và Chatham, trong đó đột biến Viangchan chiếm tỉ lệ cao nhất trong các dạng đột biến gen G6PD ở Việt Nam

Sản phẩm chạy PCR lần thứ nhất được sử dụng làm khuôn để chạy PCR-MPTP

Hình 3.2 ảnh sản phẩm điện di ADN của PCR-MPTP-A trên exon 9

(- Mẫu 1 là marker 50 Mẫu 2 là chuẩn bình thường Các mẫu

3, 4, 5, 6, 7 là các mẫu thử Mẫu 8 là chuẩn có đột biến Viangchan Mẫu 9 là chuẩn có đột biến Chatham Mẫu 10 là nước cất)

Trên hình 3.2 là một trong những hình ảnh điện di sản phẩm PCR-MPTP-A Những mẫu ADN không bị đột biến trên exon 9 sẽ lên ba vạch ở 3 kích thước khác nhau: 229bp, 146bp, 94bp, giống chuẩn bình thường Những mẫu ADN mang đột biến Chatham thì mất vạch 94bp giống chuẩn đột biến Chatham Những mẫu ADN mang đột biến Viangchan thì mất vạch 229bp giống chuẩn đột biến Viangchan

Kết quả cho thấy: Các mẫu 4, 5, 6 không có đột biến, mẫu 3 và

7 có đột biến dạng Viangchan Để khẳng định thêm cần tiến hành phản ứng PCR-MPTP-B với cặp mồi có điểm đột biến

Hình 3.3 ảnh sản phẩm điện di ADN của PCR-MPTP-B trên exon 9

(- Mẫu 1 là marker 50 Mẫu 2 là chuẩn bình thường Các mẫu 3,

4, 5, 6, 7 là các mẫu thử Mẫu 8 là chuẩn có đột biến Viangchan Mẫu 9 là chuẩn có đột biến Chatham Mẫu 10 là nước cất )

Trên hình 3.3 là một trong những hình ảnh điện di sản phẩm PCR-MPTP-B Kết quả cho thấy các mẫu 4, 5, 6 không có đột biến, mẫu số 3 và 7 có đột biến dạng Viangchan

Qua hai phản ứng PCR-MPTP A và B đã khẳng định mẫu số 3 và 7 mang đột biến Viangchan, các mẫu 4, 5, 6 không bị đột biến

Chúng tôi tiến hành xác định đột biến gen G6PD trên 30 mẫu có thiếu hụt G6PD theo kĩ thuật PCR-MPTP, trên các exon 2, 9, 11