Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng dược lý của loài uncaria macrophylla wall. ex roxb. mọc ở Trung Lào

Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng dược lý của loài uncaria macrophylla wall. ex roxb. mọc ở Trung Lào

Bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o bé y tÕ

ViÖn d−îc liÖu

====000====

k«sæn sosoulithan

Nghiªn cøu vÒ thùc vËt, thμnh phÇn ho¸ häc vμ mét

wall Ex roxb mäc ë Trung lμo

Chuyªn ngµnh : d−îc liÖu - d−îc häc cæ truyÒn M· sè : 62731001

đằng lá to (Khưa Nam Bết) là một ví dụ

Cây Câu đằng mọc rất phổ biến trong vùng đồi núi, ven bờ suối ở các tỉnh phía Bắc, một số tỉnh miền Nam và mọc nhiều nhất là các tỉnh miền Trung Lào Câu đằng được đồng bào dân tộc lào Thơng, Mông và lào Lum, tỉnh U- Đôm Xay và tỉnh Viêng Chăn dùng để chữa các bệnh: Tăng huyết áp, đau đầu chóng mặt do huyết áp cao, trị đau sung xương khớp và giảm co giật ở trẻ em khi sốt cao và đã được Trung tâm nghiên cứu cây thuốc và động vật làm thuốc của Bộ

Y tế Lào cho phép các cơ sở Y tế đưa Câu đằng vào các đơn thuốc đông y để trị bệnh tăng huyết áp, đau sưng xương khớp từ năm 1995 và cho kết quả tốt

tôi thấy cần phải nghiên cứu Câu đằng một cách toàn diện cả về thực vật học, hóa thực vật cũng như các tác dụng sinh học

Để có cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Câu đằng làm thuốc chữa

bệnh chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng dược lý của loài Uncaria macrophylla Wall ex

Roxb mọc ở trung Lào”

2 mục tiêu của luận án

* Xác định chính xác tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm vi học

của cây Câu đằng lá to (Uncaria macrophylla Wall ex Roxb.) mọc và

đang được dùng phổ biến ở Lào

* Xác định các nhóm chất hoá học, định lượng alcaloid toàn phần Chiết xuất, phân lập và nhận dạng một số hợp chất chính từ alcaloid toàn phần của cây Câu đằng

* Xác định độc tính cấp, nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp và một số tác dụng dược lý khác của alcaloid toàn phần chiết từ cành mang móc của Câu

đằng

3 ý nghĩa của luận án:

ý nghĩa khoa học: Các kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc sử

dụng cây Câu đằng làm thuốc chữa bệnh Ngoài ra, luận án còn góp phần xây dụng mô hình nghiên cứu các thuốc có tác dụng trị bệnh tăng huyết áp, rất cần

thiết cho Lào hiện nay

ý nghĩa thực tiễn: Làm cơ sở khoa học để phát triển một nguồn nguyên

liệu làm thuốc và góp phần bảo tồn tài nguyên cây thuốc của Lào

4 Đóng góp mới của luận án

4.1 Về thực vật

Đã xác định tên khoa học của cây Câu đằng lá to (Khưa Nam Bết) ở Lào

là Uncaria macrophylla Wall ex Roxb., họ Cà phê (Rubiaceae) và mô tả

các đặc điểm hình thái thực vật và đặc điểm vi học cây Câu đằng lá to Đã

bổ sung Câu đằng lá to (Uncaria macrophylla Wall ex Roxb.) vào danh

lục cây cỏ làm thuốc của Lào

4.2 Về hoá học

Đã xác định được các nhóm chất có trong cành mang móc, thân của loài

câu đằng nghiên cứu bao gồm: Alcaloid, flavonoid, tanin, terpenoid, coumarin, acid hũu cơ, phytosterol và đường khử tự do Đã định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp cân; đã phân lập được

3 chất từ cành mang móc của cây Câu đằng gồm: Uncarin E

3(Isopteropodine); Uncarin C (Pteropodine) và Mitraphylline (là dạng đồng phân lập thể của Uncarin)

4.3 Nghiên cứu về tác dụng dược lý

Về độc tính: Alcaloid toàn phần của câu đằng cho chuột nhắt uống, không có

biểu hiện độc tính cấp không tính được LD50 Điều đó đã chứng tỏ dược liệu có rất

ít độc tính cấp trên chuột thực nghiệm

Trên huyết áp:

Alcaloid Câu đằng có tác dụng hạ huyết áp trên mèo một cách rõ rệt Alcaloid Câu đằng làm tăng lưu lượng mạch đùi mèo Kết quả này là do tác dụng giãn mạch của thuốc Tác dụng hạ huyết áp của alcaloid Câu đằng có thể là do giãn mạch và ức chế thần kinh trung ương

Trên thần kinh trung ương: Alcaloid Câu đằng làm giảm hoạt động tự

nhiên trên chuột và có tác dụng hiệp đồng với thiopental vì thuốc kéo dài thời gian ngủ do thiopental gây ra trên chuột nhắt

5 bố cục của luận án

Luận án có 123 trang, gồm 4 chương, 27 bảng, 22 hình và 171 tài liệu tham khảo Các phần chính trong luận án gồm đặt vấn đề: 3 trang, tổng quan: 35 trang; đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 7 trang; kết quả nghiên cứu: 50 trang; bàn luận, kết luận và kiến nghị: 13 trang, các công trình công bố liên quan đến luận án: 1 trang (4 công trình), tài liệu tham khảo: 13 trang và 11 phụ lục với 31 phổ các loại

b nội dung của luận án chương 1: tổng quan

Thu thập, phân tích và tổng kết các tài liệu về thực vật của chi Uncaria

Schreb., thành phần hoá học, tác dụng sinh học và công dụng của một số

loài thuộc chi Uncaria Schreb., và các tư liệu về cây Câu đằng

Chương 2: Đối tượng, nội dung

vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

* Mẫu nghiên cứu (thân, cành mang móc, lá, hoa và quả) thu hái tại bản Văng Khi, tỉnh Viêng Chăn (Trung Lào) vào tháng 4 và tháng 8 năm 2001,

2002

* Bột thân và cành mang móc

* Alcaloid toàn phần chiết từ cành mang móc

2.2 Phương pháp luận, nội dung vμ phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp luận

Do đối tượng nghiên cứu là cây thuốc nên nội dung và phương pháp nghiên cứu liên quan đến nhiều chuyên ngành khoa học như thực vật học, hoá học và dược lý học, vì vậy cần sự trợ giúp của nhiều chuyên gia thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau

2.2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Tên khoa học được xác định theo hình thái so sánh Sử dụng hai tài liệu trong phân loại: Thực vật chí Đông Dương của Lecomte H (1922; 1933), Thực vật chí Trung Quốc (1999) và tham khảo thêm một số tài liệu

- Tách, phân lập một số alcaloid từ alcaloid toàn phần bằng sắc ký cột (SKC), sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) và sắc ký lỏng cao áp điều chế

- Cấu trúc các chất được nhận dạng bằng các phương pháp phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), Phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phần mềm dự đoán cấu trúc

- Độc tính cấp của alcaloid toàn phần được xác định theo phương pháp của Behrens- Karber

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của alcaloid toàn phần Câu đằng lên huyết áp

và lưu lượng mạch bằng phương pháp do huyết áp trực tiếp của Faizi (1998)

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của alcaloid toàn phần Câu đằng lên hoạt động tự nhiên của chuột bằng phương pháp lồng rung nối với biến năng đẳng trương và máy ghi 2 cần (Ugo-Basile, Italia)

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của alcaloid toàn phần Câu đằng đến giấc ngủ gây bởi thiopental trên chuột theo phương pháp của Dua P R

Các số liệu thực nghiệm được xử lý theo các phép toán thống kê ứng dụng trong Y và Dược

Chương 3: tóm tắt kết quả nghiên cứu vμ bμn luận

3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu

Các mẫu cây Câu đằng lá to (Khưa Nam Bết), được thu tập trong 2 năm, 2001 – 2002, mang các số hiệu CL-2001 và CL-2002, thu tại bản Văng Khi, huyện Văng Viêng, tỉnh Viêng Chăn (Lào)

Các mẫu nghiên cứu trên đều có lá, hoa và quả, có móc câu và lá kèm Các mẫu thu thập được hiện đang được lưu giữ tại bảo tàng dược liệu, Khoa Tài nguyên – Viện Dược liệu, Hà Nội ảnh cành mang lá kèm, móc câu, hoa và quả cây Câu đằng nghiên cứu được trình bày ở các hình 3.1, 3.2, 3.3

và 3.4

Bằng phương pháp so sánh hình thái, sử dụng các khóa phân loài loài

thuộc chi Câu đằng (Uncaria) của thực vật chí Trung Quốc, tập 71(1)

(1999) và khóa phân loại của J Pitard (1922) trong bộ ‘Thực vật chí tổng quát Đông Dương” tập III, với sự giúp đỡ của các chuyên gia thực vật cho phép chúng tôi định loại tên khoa học của cây Câu đằng nghiên cứu là

Uncaria macrophylla Wall ex Roxb – Họ Cà phê (Rubiaceae) Việt Nam

gọi là Câu đằng lá to còn ở Lào gọi là Khưa nam bết

Việc định loài này đã bộ sung một loài cây thuốc mới vào danh sách cây cỏ làm thuốc của Lào

3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu

Vi phẫu lá, móc câu và thân câu đằng nghiên cứu có các đặc điểm sau:

* Lá: Biểu bì trên và dưới có hàng tế bào hình trứng, có lông che chở đơn

bào, một lớp cutin mỏng, mô dày và các tế bào hình đa giác Mô mềm vỏ cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác Giữa gân lá có libe-gỗ, có libe Bao quanh bó libe-gỗ có cung sợi mỏng, cung sợi này rất phát triển ở các lá già

* móc: Mặt cắt hình trứng hơi dẹt Bần cấu tạo bởi nhiều hàng tế bào Mô

mềm vỏ có các tế bào hình đa giác Libe là một lớp mỏng Gỗ có các mạch

gỗ kích thước lớn, tạo thành một lớp dày, phát triển hướng tâm

* Thân: Mặt cắt hình vuông Biểu bì là một hàng tế bào hình trứng nhỏ, bề

mặt tế bào biểu bì có lớp cutin mỏng Mô mềm vỏ có tế bào hình đa giác, trong mô mềm vỏ có tế bào sợi Libe-gỗ tạo thành một dải liên tục, rất phát triển, cấu tạo bởi các mạch gỗ lớn Tầng phát sinh libe – gỗ cấu tạo bởi một hàng tế bào nhỏ Mô mềm ruột thường bị rỗng, cấu tạo bởi các tế bào hình trứng

3.1.4 Nghiên cứu đặc điểm vi học bột cành mang móc

Bột có màu vàng nhạt, không mùi, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm: Lông che chở đơn bào; mảnh mô mềm hình chữ nhật; mảnh biểu bì có các tế bào hình chữ nhật dài, thành dày; mảnh mạch mạng; mảnh mạch xoắn; tế bào mô cứng; bó sợi và các mảnh bần có màu đỏ –vàng

3.2 Nghiên cứu về hoá học

Thực nghiệm đã tìm ra 4 hệ dung môi: Hệ I: Ethylacetat : Isopropanol :

Amoniac (100 : 2 : 1); Hệ II: Cloroform : Aceton : Ethylacetat (5 : 4 :3);

Hệ III: Cloroform : Aceton (5 : 4); Hệ IV: Cloroform : Methanol ( 9:1) có

8khả năng tách tốt các alcaloid; sắc ký đồ của alcaloid ở cành mang móc và thân tương đương nhau với từng hệ dung môi Hệ I và II tách tốt hơn cả vì

cho số vết nhiều hơn, các vết cách nhau xa hơn

3.2.3 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong cành mang móc cây

Câu đằng lá to Uncaria macrophylla Wall ex Roxb

Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong cành mang móc và thân của cây Câu đằng lá to, bằng phương pháp cân được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần từ cành mang móc và

thân của Uncaria macrophylla Wall thu hái ở Lào

Cành mang móc

(độ ẩm 11,57%)

Thân cây (độ ẩm 11,86%)

Hàm lượng alcaloid (%)

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng cắn (g)

Hàm lượng alcaloid (%)

3.2.4.1 Chiết xuất alcaloid toàn phần từ cành mang móc

Cân 250g bột cành mang móc loài câu đằng lá to Loại tạp bằng ether dầu hoả trên máy Soxhlet Thấm ẩm dung dịch amoniac 25%, chiết hồi lưu alcaloid toàn phần bằng cloroform Cất thu hồi dung môi thu được cắn Hòa tan cắn bằng acid sulfuric 2% và lắc nhiều lần Được dịch nước acid, kiềm hoá bằng amoniac 25% và lắc với ether ethylic (4-5 lần) Kiềm hóa tiếp dịch nước acid trên đến pH = 9 -10 Tiếp tục chiết bằng ethylacetat nhiều lần Gộp dịch chiết ether và ethylacetat, cất thu hồi dung môi được

9cắn alcaloid Sấy cắn ở 700C trong tủ hút chân không Thu được bột alcaloid toàn phần

Alcaloid toàn phần thu được là bột có màu vàng nâu, thể chất hơi xốp, dễ hút ẩm và cho phản ứng đặc trưng với các thuốc thử của alcaloid

3.2.4.2 Phân lập các alcaloid

Các alcaloid trong alcaloid toàn phần được phân lập bằng sắc ký cột (SKC) và sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) Chất hấp phụ: Silica gel (Merck), kích thước 0,063 – 0,2 mm dùng cho SKC và silica gel GF254 (Merck), kích thước 0,04 – 0,063 mm dùng cho SKLMĐC Hệ dung môi rửa giải trong SKC: Cloroform : methanol Hệ dung môi triển khai dùng cho SKLMĐC:Cloroforn : aceton : ethylacetat (5 : 4 : 3) Dùng sắc ký lỏng cao áp điều chế để tách và tinh chế 2 chất KSO1 và KSO2, do các alcaloid thu được rất khó tách riêng

Chúng tôi đã phân lập được 3 chất, ký hiệu là KSO1; KSO2 và KSO3

3.2.5 Nhận dạng các chất được phân lập

Để nhận dạng ba hợp chất, chúng tôi đã tiến hành đo các thông số vật

lý và các loại phổ như: Hồng ngoại (IR), tử ngoại (UV), phổ khối (MS) và

bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm 1H – NMR, 13C- NMR, DEPT, COSY, HMQC, HMBC Ngoài ra, chúng tôi có sử dụng phổ mô phỏng

được xây dựng trên cơ sở phần mềm mô phỏng ACD – NMR

3.2.5.1 Nhận xét chung về các thông số hoá lý và số liệu phổ của 3 hợp

chất thu được (KSO1, KSO2, KSO3)

3.2.5.1.1 Nhiệt độ nóng chảy và độ quay cực

* Hợp chất KSO1 có nhiệt độ nóng chảy tnc: 209-211 0C

3.2.5.1.2 Phổ Hồng ngoại (IR) và tử ngoại (UV)

Phổ Hồng ngoại (đo trong KBr) của các hợp chất được ghi tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia

* Phổ tử ngoại (UV) có các đỉnh hấp thụ cực đại ở λ max= 244nm; 285

* Phổ tử ngoại (UV) có các đỉnh hấp thụ cực đại ở λ max= 244 nm; 285

Th− viện phổ khối đ−a ra dự đoán hợp chất KSO1 là Mitraphylline, với

Hình 3.5: Mitraphylline (cấu trúc phân tử hợp chất KSO1 đ−ợc đ−a bởi th− viện phổ khối)

Ghi chú: Cấu trúc trên có hai dạng tồn tại – N = C- OH ↔ - NH – C = O

(Imidic acid ↔ Amid), cùng có tên gọi là Mitraphylline

* Hợp chất KSO2

Giống hợp chất KSO1, cho pic ion phân tử [M]+ ở m/z = 368 (100) Ngoài ra còn có các pic khác với cường độ lớn có m/z lần lượt bằng: 55; 69; 77; 130; 146; 164; 180; 208; 239; 267

Thư viện phổ khối cũng đưa ra dự đoán hợp chất KSO2 là Mitraphylline (hình 3.5) với độ chính xác 64%

* Hợp chất KSO3

Hoàn toàn giống KSO1 và KSO2, phổ khối của KSO3 cũng cho pic ion phân tử [M]+ ở m/z = 368 (100) Ngoài ra còn có các pic khác với cường

độ lớn có m/z lần lượt bằng: 55; 69; 77; 130; 146; 164; 180; 208; 239; 267 Thư viện phổ khối đưa ra dự đoán hợp chất KSO3 là Mitraphylline (hình 3.5) với độ chính xác 59%

* KSO1, KSO2 và KSO3 đều có pic ion phân tử và pic cơ bản có giá trị m/z giống nhau Tuy có sự khác biệt về cường độ tường pic, nhưng số khối ứng với từng mảnh vẫn giống nhau Ngoài ra, cấu trúc KSO1, KSO2 và KSO3 được dự báo bởi thu viện phổ khối đều tồn tại ở dạng Imidic acid

* Hợp chất KSO2 và KSO3

Kết quả phân tích bộ phổ 13C- NMR của 2 hợp chất trên cho thấy chúng giống với phổ của hợp chất KSO1

Cả 3 hợp chất cùng có 21 nguyên tử C, bao gồm 4 - CH2;9- CH ; 2 - CH3

và 6 - C - Đồng thời các pic đặc trưng của KSO2 và KSO3 cũng giống nhau và giống với hợp chất KSO1

Từ các kết quả trên kết hợp với phổ khối có thể khẳng định cả 3 hợp chất KSO1, KSO2 và KSO3 cùng có công thức phân tử là C21H24O4N2

* Số liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR thực nghiệm so sánh với phổ thư viện của hợp chất tương ứng với 3 chất” KSO1; KSO2 và KSO3 được đưa

ra trong các bảng 3.2 dưới đây

15Việc xét đoán cấu trúc, dựa trên kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (HMBC, COSY) có tham khảo cấu trúc thư viện phổ khối Kết quả thu được có 2 cấu trúc phù hợp các dữ kiến của các loại phổ Hai cấu trúc

*

*

1 2

N H

N

O O

O O

*

*

1 2

(Dạng A) (Dạng B)

Hình 3.6: Hai dạng cấu trúc dự kiến của hợp chất KSO3

Hai dạng hỗ biến (Imidic acid ↔ Amid) của hợp chất thuộc loại oxindol alcaloid, thuộc nhóm Uncarin với nhiều đồng phân lập thể

Trong những điều kiện nhất định về môi trường, nhiệt độ, nồng độ có thể chuyển hoá hoàn toàn thành dạng này hay dạng khác, hoặc trạng thái cân bằng tức là sẽ tồn tại cả 2 dạng trên

Đối với hợp chất KSO3, dựa trên các dữ liệu phổ NMR có thể nhận thấy trong điều kiện ghi (dung môi CDCl3, nhiệt độ T = 300K) chỉ tồn tại một dạng hỗ biến, là dạng Amide (dạng B) Xác định chính xác dạng hỗ biến được thực hiện dựa vào phổ mô phỏng phần mềm ACD – NMR (ν 8.03) Cho thấy, nếu ở dạng Amide: δC= O = 182,30 ppm, ở dạng Imidic acid

δC*2 = 141,10 ppm, còn nếu là dạng Imidic acid: δC*1 = 64,39 ppm và δC*2 = 152,04 ppm Đối chiếu phổ thực với các kết quả mô phỏng, ta thấy ở phổ thực có sự tồn tại các pic δ= 180,666 ppm, δ = 55,538 ppm và δ = 140,594 ppm Như vậy ở điều kiện độ cộng hưởng từ, KSO3 tồn tại dưới dạng Amid

Trên phổ(IR), đỉnh hấp thụ ở 1691,29 cm-1 (ν- C= O) có cường độ lớn

Đồng thời không thấy (– OH) Như vậy trong điều kiện ghi phổ hồng ngoại, cũng chỉ tồn tại dạng Amide

Tổng kết các kết quả phân tích phổ nêu trên có thể kết luận KSO3

có cấu trúc như ở hình 3.6, dạng B

Số liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR cùng với các tương quan trong phổ 2 chiều của hợp chất KSO3 được đưa ra trong các bảng dưới đây