Nghiên cứu tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

Nghiên cứu tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

Trường đại học y hμ nội

***

Phạm Đăng Khoa

Nghiên cứu Tính đa hình thái

của một số gen nhạy cảm Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

Chuyên ngành: miễn dịch học

Mã số: 3.01.09

Tóm tắt Luận án tiến sĩ y học

Hà nội - 2006

Trường Đại học Y Hμ Nội

Người hướng dẫn khoa học: GS Vũ Triệu An

Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Hiển

Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Văn Nguyên

Phản biện 3: PGS.TS Phan Quang Đoàn

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại:

Trường đại học Y Hμ Nội

Vào hồi: 14 giờ 00, ngày 27 tháng 10 năm 2006

Có thể tìm luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội

- Thư viện Thông tin Y học Trung ương

Chữ viết tắt

bp (base pair): cặp bazơ

CD (cluster of differentiation): cụm biệt hoá

CD40L (CD40 ligand): phối tử của CD40

DNA (desoxyribonucleic acid): axit deoxyribonucleic

ds DNA (double-stranded DNA): DNA xoắn kép

HLA (human leukocyte antigen): kháng nguyên bạch cầu người

nucleotide đơn

TNF (tumor necrosis factor): yếu tố gây hoại tử u

đặt vấn đề

Tự miễn là một trong ba nhóm bệnh lí miễn dịch, được đặc trưng bởi sự xuất hiện các tự kháng thể chống lại các cấu thành của chính bản thân Bệnh tự miễn được phân ra bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan và

bệnh tự miễn toàn thân, trong đó lupus ban đỏ hệ thống (SLE) là một

bệnh tự miễn toàn thân điển hình

Lịch sử nghiên cứu về các bệnh tự miễn nói chung và SLE nói riêng có thể được chia thành 3 giai đoạn: (1) phát hiện ra các tự kháng thể hoà tan; (2) phát hiện ra các tế bào T và B tự phản ứng; (3) phát hiện mối liên quan với cơ địa và các gen nhạy cảm

Việc phát hiện ra các tự kháng thể hoà tan rồi các tế bào T và B tự phản ứng đã phần nào hé mở cơ chế bệnh sinh của bệnh tự miễn Nhưng một vấn đề cơ bản vẫn chưa được lí giải đầy đủ, đó là vì sao các tế bào T và B đã bất hoạt nay lại được hoạt hoá trở lại Vì vậy một hướng nghiên cứu mới được đặt ra là tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh ở mức độ gen học

Cho tới nay, ở Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của tự kháng thể hoà tan và vai trò của các lympho bào tự phản ứng trong cơ chế bệnh sinh của SLE Nhưng chưa có tác giả nào nghiên cứu về SLE ở mức độ gen học

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2 mục tiêu sau đây:

1 Mô tả tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm trong

bệnh lupus ban đỏ hệ thống ở người Kinh Việt nam

2 Nhận xét sự phân bố tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm ở bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống người Kinh Việt nam

Đóng góp mới của luận án

1 Là nghiên cứu đầu tiên về cơ chế bệnh sinh của SLE ở mức độ gen học

2 Lần đầu tiên đưa ra những số liệu về typ gen và alen của DRB1, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB, C4A, TNFRII và IL-10 promoter ở bệnh nhân SLE người Việt nam

HLA-3 Lần đầu tiên đưa ra nhận xét về mối liên quan giữa tính đa hình thái của các gen nêu trên với SLE ở người Việt nam

Cấu trúc của luận án

Luận án dài 104 trang, ngoài phần Đặt vấn đề, Kết luận và Kiến nghị, gồm 4 chương Chương 1: Tổng quan (33 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3: Kết quả (18 trang); Chương 4: Bàn luận (32 trang) Luận án có 124 tài liệu tham khảo, 4 phụ lục, 21 bảng, 11 biểu đồ và 9 hình

Chương 1: tổng quan tμi liệu 1.1 Bệnh tự miễn

Bệnh tự miễn là một trạng thái bệnh lí do có sự kết hợp của tự kháng thể với tự kháng nguyên mà gây ra viêm và dẫn đến tổn thương thực thể và chức năng tại tế bào, mô hay cơ quan

Hiện nay để chẩn đoán xác định bệnh tự miễn, ngoài những kĩ thuật kinh điển trong miễn dịch học, những kĩ thuật hiện đại trong sinh học phân tử đã được áp dụng Điều này không những đã giúp cho việc chẩn đoán xác định được chính xác hơn mà còn cho phép đi sâu tìm hiểu về cơ chế bệnh sinh của bệnh Những kĩ thuật đó là:

- Kĩ thuật phát hiện tự kháng thể dịch thể trong máu

- Kĩ thuật sinh thiết kết hợp với kĩ thuật sinh học, bao gồm:

+ Kĩ thuật hoá mô miễn dịch

+ Kĩ thuật lai bằng DNA

+ Kĩ thuật phân tích DNA bằng PCR

Cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn cho đến nay vẫn chưa hoàn toàn được sáng tỏ Dù sao trong cơ chế bệnh sinh của các tổn thương trong bệnh tự miễn, người ta nói nhiều tới vai trò của các tự kháng thể, vai trò của các tế bào T tự phản ứng và vai trò của cơ địa

1.2 Rối loạn miễn dịch trong bệnh SLE

SLE là một bệnh tự miễn toàn thân điển hình Cùng với sự phát triển của miễn dịch học, việc chẩn đoán và điều trị SLE cũng có nhiều tiến bộ trong mấy thập niên gần đây Các xét nghiệm, đặc biệt là các xét nghiệm miễn dịch lâm sàng, đóng một vai trò cực kì quan trọng trong việc chẩn đoán và theo dõi SLE Các xét nghiệm này nhằm phát hiện những kháng thể kinh điển và một số kháng thể khác mới được đề cập tới trong ít năm gần đây

Những nghiên cứu về phương diện tự kháng thể hoà tan và tế bào

tự phản ứng trong SLE đã phần nào làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của bệnh Để có thể tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh ở mức độ phân tử, những khảo sát về gen học là hết sức cần thiết

1.3 Gen học trong nghiên cứu SLE

SLE là bệnh đa yếu tố và có đặc tính gen học phức tạp với sự tham

gia của các gen thuộc phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (MHC) và nhiều

gen khác không thuộc MHC Các gen đã được biết trong bệnh này chỉ xác định tính nhạy cảm, không một gen riêng biệt nào là cần thiết hoặc

đủ để làm xuất hiện bệnh

1.3.1 Phương pháp nghiên cứu về gen học Bao gồm:

- Phương pháp điều tra tỉ lệ theo phả hệ, dịch tễ

- Phương pháp nghiên cứu tính đa hình thái của gen nhạy cảm Có

3 phương pháp, đó là: nghiên cứu bệnh chứng dựa vào quần thể, phân tích sự liên kết dựa vào gia đình và phân tích sự mất cân bằng liên kết dựa vào gia đình

Nhờ các phương pháp phân tích gen học nêu trên, những hiểu biết

về vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE ngày một đầy đủ hơn

1.3.2 Vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE

1.3.2.1 Vai trò của cơ địa trong SLE

Cơ địa là tổng hợp tất cả các đặc điểm hình thái và chức năng của cơ thể, những đặc điểm đó khá bền vững, có tính di truyền và quyết

định mức độ phản ứng của cơ thể trước những yếu tố xâm nhập

Ngày nay, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực miễn dịch gen học, càng ngày người ta càng thấy rõ vai trò của cơ địa trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh, trong đó có các bệnh tự miễn nói chung và SLE nói riêng Trong các locus gen tạo nên cơ địa của một cá thể, người ta nói nhiều tới vai trò của hệ thống MHC

Những mô tả đầu tiên về mối liên quan của các alen thuộc MHC lớp II với SLE đã được công bố khoảng 20 năm trước đây Những nhận xét này sau đó đã được xác nhận và thấy là HLA-DR2 và HLA-DR3 gây ra một cách riêng rẽ với nguy cơ tương đối 2-3 lần cao hơn đối với

sự xuất hiện SLE ở người Âu Mĩ ở những bệnh nhân người Mĩ gốc Phi (là chủng người HLA-DR3 không phổ biến), HLA-DR2 và HLA-DR7 được thấy có liên quan với SLE

1.3.2.2 Vai trò của đột biến gen trong SLE

Tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE, ngoài vai trò cơ địa (hệ thống MHC) như đã nói ở trên, trong những năm gần đây, người ta nói nhiều và tập trung tìm hiểu về vai trò của các gen nhạy cảm với bệnh

Đó là các gen mã cho các thành phần tham gia trong một số khâu then chốt thuộc cơ chế bệnh sinh của bệnh, ví dụ receptor với phần Fc của

IgG (FcγR), các cấu thành của hệ thống bổ thể, các cytokin liên quan trong phản ứng viêm (TNF, IL-10 ) Khi các gen này có đột biến sẽ

ảnh hưởng tới chức năng các sản phẩm do chúng mã hoá và do vậy có

ảnh hưởng tới các bệnh có liên quan

*Mối liên quan của gen m∙ hoá cho FcγR và SLE

Receptor do các gen này mã hoá dùng để gắn phần Fc của IgG

Đó là các gen nằm trên nhiễm sắc thể 1q21-24 ở người FcγR được chia thành 3 nhóm: FcγRI, FcγRII và FcγRIII Các receptor này có chức năng quan trọng trong việc kết nối đáp ứng miễn dịch dịch thể và

đáp ứng miễn dịch tế bào bằng việc chuyển phức hợp miễn dịch tới các

tế bào hiệu ứng Vì vậy, tính đa hình thái được xác định về mặt gen học có ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của các FcγR này có thể góp phần tạo nguy cơ đối với SLE

ở người, FcγRII và FcγRIII được chú ý nghiên cứu nhiều hơn vì

đó là những receptor có ái lực cao đối với IgG Cho tới nay, người ta

đã xác định được 6 biến thể khác nhau của FcγRII, chúng được mã hoá bởi 3 gen (FcγRIIA, IIB và IIC) và 2 biến thể gần giống nhau của FcγRIII (FcγRIIIA và IIIB) được mã hoá bởi 2 gen khác nhau Tính đa hình thái về gen chỉ được thấy ở các gen mã hoá cho FcγRIIA, FcγRIIIA và FcγRIIIB

FcγRIIA được biểu lộ trên màng của tế bào mono, đại thực bào, bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu FcγRIIA có 2 alen biểu lộ đồng trội, đó là do FcγRIIA có một thay đổi ở exon 4 (A hoặc G ở vị trí nucleotide 494) dẫn đến việc thay đổi 1 amino acid (Histidine [H] hoặc Arginine [R] ở vị trí amino acid 131) Alen FcγRIIA-R131 gắn với IgG2 kém hiệu quả hơn so với alen H131, do vậy gây cản trở việc thanh thải phức hợp miễn dịch

FcγRIIIA được biểu lộ trên bề mặt tế bào NK và đại thực bào, có khả năng gắn với cả 2 dưới lớp IgG1 và IgG3, giúp cho chức năng gây

độc tế bào và thực bào Tính đa hình thái thường gặp nhất của FcγRIIIA là một đột biến điểm với sự thay thế T cho G ở vị trí nucleotide 559 dẫn đến sự thay thế tương ứng của Phenylalanine (F) cho Valine (V) ở vị trí 158 Tính đa hình thái này gây ra sự thay đổi về chức năng, cá thể đồng hợp V/V có khả năng gắn IgG1 và IgG3 tốt hơn cá thể đồng hợp F/F

FcγRIIIB có hai dạng xác định bằng huyết thanh (NA1 và NA2)

do có 5 điểm khác nhau về nucleotide (G/C, C/T, A/G, G/A và G/A lần lượt ở các vị trí nucleotide 141, 147, 227, 277 và 349) và dẫn đến 4

điểm khác nhau trong chuỗi amino acid (R/N, N/S, D/N và V/I lần lượt

ở các vị trí amino acid 36, 65, 82 và 106; có một “đột biến câm” 147) Tính đa hình thái này có ý nghĩa đối với chức năng sinh lí, khả năng thực bào ở các cá thể có NA2 kém hơn ở các cá thể có NA1

C/T-*Mối liên quan của gen m∙ hoá cho bổ thể và SLE

Bổ thể bao gồm khoảng 20 protein huyết tương có chức năng gây

ra đáp ứng viêm, xử lí phức hợp miễn dịch và thải loại các vi khuẩn gây bệnh Trong nhiều năm gần đây, người ta đã chú ý đến mối liên quan chặt chẽ giữa sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể đầu của con

đường đặc hiệu (C1, C4, C2) với sự xuất hiện của SLE SLE xuất hiện

ở gần 100% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C1 và C4, ở khoảng 50% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C2 Cấu thành C4 được mã hoá bởi

30-2 gen, C4A và C4B C4A “null” có liên quan với SLE ở một số tộc người khác nhau Sự thiếu hụt thường gặp nhất là hiện tượng xoá trên diện rộng (28kb) làm mất cả gen C4A và gen 21-OH Sự thiếu hụt thường gặp thứ hai là hiện tượng ken thêm vào 2 bp ở codon 1213

thuộc exon 29 dẫn đến việc tạo thành bộ ba mã hoá stop, làm ngừng quá trình tổng hợp chuỗi protein C4A

Sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể khác (từ C3 tới C9) ít liên quan

đến SLE

*Mối liên quan của gen m∙ hoá cho TNF và SLE

Yếu tố gây hoại tử u (TNF) là yếu tố bảo vệ chống lại SLE Chức

năng của TNF thông qua 2 receptor: TNFRI và TNFRII, trong đó TNFRII liên quan nhiều tới SLE

Tính đa hình thái 2 alen dẫn đến sự thay đổi amino acid đã được thấy trong vùng exon 4 (sự thay đổi Arginine thành Proline ở vị trí 143), exon 6 (sự thay đổi Methionine thành Arginine ở vị trí 196) và exon 9 (sự thay đổi Alanine thành Threonine ở vị trí 363) của gen mã hoá cho TNFRII Trong đó chỉ có tính đa hình thái ở exon 6 là có liên quan với SLE

*Mối liên quan của gen m∙ hoá cho IL-10 và SLE

Interleukin-10 (IL-10) là một cytokin điều hoà được tạo ra bởi tế

bào T, tế bào B, tế bào mono, đại thực bào, tế bào sừng, tế bào bạch cầu ái toan, tế bào mast IL-10 có vai trò điều hoà đáp ứng miễn dịch

tế bào và dịch thể Tăng mức IL-10 được thấy có liên quan với một số bệnh tự miễn, trong đó có SLE Tính đa hình thái của gen IL-10 thể hiện ở 2 dạng microsatellit (AC)n và thay đổi nucleotid đơn (SNP).Vùng promoter của gen IL-10 có 3 SNP đáng quan tâm ở các vị trí -

819 (C/T), -592 (C/A) và -1082 (G/A) Người ta đã nói đến mối liên quan giữa typ gen và sự sản xuất IL-10; đặc biệt alen G của tính đa hình thái G/A ở vị trí -1082 thấy có liên quan với kiểu hình “sản xuất IL-10 cao” so với alen A Các SNP ở vị trí -819 và -592 xuất hiện

trong sự mất cân bằng liên kết mạnh mẽ với tính đa hình thái ở vị trí

-1082

Những hiểu biết sâu sắc và đầy đủ hơn về lĩnh vực gen học trong SLE là một cơ sở đáng tin cậy cho việc đề xuất các phác đồ điều trị mới ngày một hiệu quả hơn đối với SLE

1.4 Chiến lược điều trị đối với SLE

Điều trị SLE là sự phối hợp nhiều mặt: tuyên truyền, giáo dục; theo dõi chung về tình trạng nhiễm khuẩn và các yếu tố nguy cơ tim mạch; điều trị các biến chứng kết hợp với các phác đồ điều trị thuốc tuỳ thuộc vào từng người bệnh

Phác đồ điều trị SLE luôn được thay đổi và ngày càng có hiệu quả hơn, đó là nhờ vào sự hiểu biết ngày càng tốt hơn về cơ chế bệnh sinh của bệnh Có thể chia sự tiến bộ của các phác đồ điều trị SLE làm 3 giai đoạn lớn:

- Giai đoạn 1: các phác đồ kinh điển nhằm ức chế chung đáp ứng miễn dịch

- Giai đoạn 2: các phác đồ nhằm ức chế miễn dịch có chọn lọc

- Giai đoạn 3: các phác đồ điều trị làm thay đổi cơ địa, các phác đồ này được đề xuất nhờ những hiểu biết ngày càng sâu hơn về cơ chế bệnh sinh mức độ phân tử Ví dụ vấn đề truyền tế bào gốc tạo máu Nhìn chung các phác đồ điều trị theo hướng này còn đang ở giai đoạn thử nghiệm và kết quả còn hạn chế

Chương 2: đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Người Kinh Việt nam, gồm 2 nhóm:

2.1.1 Nhóm bệnh

Gồm 99 bệnh nhân SLE được chẩn đoán xác định tại Viện Da liễu Quốc gia, không có quan hệ về huyết thống và không mắc kèm các bệnh tự miễn khác

2.1.2 Nhóm chứng

Gồm 93 người cho máu tình nguyện tại Viện huyết học và Truyền máu TW, không mắc các bệnh tự miễn và một số bệnh khác có liên quan đến cơ địa, có sự phù hợp với nhóm bệnh về giới và tuổi

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Chiết tách và tinh khiết DNA được tiến hành tại Bộ môn Miễn dịch-Sinh lí bệnh, Trường Đại học Y Hà nội

Kĩ thuật PCR để phân tích gen được tiến hành tại Khoa Vi Miễn dịch, Trường Đại học Y Aichi, Nhật bản

sinh-2.4 Xử lí số liệu

So sánh tần suất typ gen và alen bằng kiểm định χ2

Chương 3: kết quả

3.1 Xác định typ gen của HLA-DRB1

Bảng 3.1 Tần suất các typ gen của HLA-DRB1

ở nhóm bệnh và nhóm chứng

(n=87)

Nhóm chứng (n=82)

3.2 Xác định typ gen của FcγRIIA

Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa

Đặc biệt, cá thể đồng hợp H/H131 ở nhóm bệnh là 10 (10,1%) và nhóm chứng là 32 (34,4%), sự khác biệt này có ý nghĩa với χ2=16,6 và p<0,01

Tần suất alen H131 là 94 (47,5%) ở nhóm bệnh và 114 (61,3%) ở nhóm chứng Nh− vậy, ở nhóm bệnh, tần suất alen H131 thấp hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa với χ2=7,4 và p<0,01

Bảng 3.2 Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcγRIIA

Tần suất Nhóm bệnh

(n = 99)

Nhóm chứng (n = 93)

3.3 Xác định typ gen của FcγRIIIA

Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt không có ý nghĩa với χ2= 0,36 và p>0,1

Tần suất alen ở nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt không có ý nghĩa với χ2=0,13 và p>0,1

Bảng 3.3 Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcγRIIIA

Tần suất Nhóm bệnh

(n = 67)

Nhóm chứng (n = 62)

3.4 Xác định typ gen của FcγRIIIB

Bảng 3.4 Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcγRIIIB

Tần suất Nhóm bệnh

(n = 67)

Nhóm chứng (n = 66)