Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin do Việt Nam sản xuất

Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin do Việt Nam sản xuất

Viện D−ợc liệu

-

Nguyễn thị Minh Thu

Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét vμ độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin – piperaquin do Việt Nam sản xuất

Chuyên ngành: D−ợc lý

Mã số: 62.73.05.01

Tóm tắt Luận án tiến sĩ D−ợc học

Hà Nội - 2009

Côn trùng Trung ương, Viện Dược liệu, Đại học Y Hà Nội, và Học

viện Quân y

Người hướng dẫn khoa học:

TS Trương Văn Như

PGS TS Nguyễn Trần Thị Giáng Hương

Bệnh viện Trung ương Quân đội 108

Phản biện 2: PGS TSKH Đỗ Trung Đàm

Viện Dược liệu

Trường Đại học Y Hà Nội

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp

tại Viện Dược liệu

Vào hồi 8 giờ 30 phút ngày 15 tháng 4 năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Viện Dược liệu

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương

1 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Kim Phượng, Nguyễn Văn Hùng, Đỗ Thị Phương (2006), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin do Việt Nam sản

xuất trên phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng”, Tạp chí Dược học, số 364,

8/2006, tr 31-34

2 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Lê Khánh Thuận, Nguyễn Văn Hùng, Bùi Thị Sáu (2006), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin đến phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột

nhắt trắng”, Tạp chí Dược học, số 367, 11/2006, tr 19-23

3 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Lê Khánh Thuận, Nguyễn Trần Giáng Hương, Trần Thanh Tùng (2007), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin đến huyết áp và tim cô lập của động vật thực

nghiệm”, Tạp chí Dược học, số 374, 6/2007, tr 22-26

4 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Trần Văn Hợp, Nguyễn Trọng Chăm, Nguyễn Trần Giáng Hương (2007), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin - dihydroartemisinin đến sự biến đổi hình thái gan và thận thỏ”,

Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 4, tr 43-51

5 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Vũ Văn lạp, Đinh Xuân Hương, Võ Như Phương (2007), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp

dihydroartemisinin - piperaquin đến điện tim thỏ”, Tạp chí phòng chống bệnh

sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6, tr 28-34

6 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Nguyễn Trần Giáng Hương (2007),

“Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin -

piperaquin đến quá trình sinh sản của chuột nhắt trắng”, Tạp chí Dược học, số

380, 12/2007, tr 12-17

7 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Nguyễn Kim Phượng, Đỗ Thị Phương (2008),

“Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin - dihydroartemisinin đến

tim thỏ cô lập”, Tạp chí Dược học, số 382, 2/2008, tr 32-35 & 40

8 Nguyễn Thị Minh Thu, Nông Thị Tiến, Nguyễn Mai Hương, Trương Văn Như (2008), “Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét của thuốc phối hợp

dihydroartemisinin - piperaquin”, Tạp chí Dược học, số 385, 5/2008, tr 22-27

9 Nguyễn Thị Minh Thu, Nguyễn Kim Phượng, Trương Văn Như, Đỗ Thị Phương, Nguyễn Thị Phượng (2008), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến sự phát triển hệ sinh dục của chuột

cống trắng”, Tạp chí Dược học, số 387, 7/2008, tr 19-22

10 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Nguyễn Trần Giáng Hương, Lê Minh

Đạo, Bùi Thị Sáu (2008), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến thể trạng và một số chỉ số sinh hoá, huyết

học ở thỏ”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV: Hoá sinh và sinh học

phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học

và kỹ thuật, tr 545-549

11 Nguyễn Thị Minh Thu, Trương Văn Như, Trần Thị Thanh Hương (2008), “Nghiên cứu khả năng gây đột biến nhiễm sắc thể của thuốc sốt rét phối hợp

dihydroartemisinin - piperaquin”, Tạp chí Dược liệu, số 5, tr 235-239

dục của chuột cống trắng ở hai liều 100 mg/kg/ngày x 28 ngày và 300

mg/kg/ngày x 12 ngày đầu và 200 mg/kg/ngày x 16 ngày tiếp theo

3.3 Hoạt động thần kinh trung ương của ĐVTN

Thuốc phối hợp DHA-PQP không ảnh hưởng đến hoạt động

thần kinh trung ương của chuột nhắt trắng ở liều 120 mg/kg/ngày x 5

ngày, 1 đợt và 2 đợt và chuột cống trắng ở liều 100 và 150

mg/kg/ngày, uống liên tục trong suốt quá trình nghiên cứu Thuốc có

tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương của chuột nhắt trắng ở liều

240 mg/kg/ngày x 5 ngày, 1 đợt

3.4 Huyết áp và tim cô lập của ĐVTN

Trên chó, thuốc phối hợp DHA-PQP không gây ảnh hưởng

đến huyết áp và nhịp tim chó ở hai liều 64 và 120 mg/kg

DHA-PQP không ảnh hưởng đến hoạt động của tim ếch cô

lập ở các nồng độ 16 và 32 mg/100mL, nhưng gây ngừng tim ếch cô

lập (kỳ tâm trương) ở nồng độ 53,5 mg/100mL

DHA-PQP không ảnh hưởng đến hoạt động của tim thỏ cô

lập ở nồng độ 0,001% Với nồng độ 0,002% (truyền liên tục 25 phút),

DHA-PQP gây giảm nhịp tim, lưu lượng dịch qua tim và biên độ co

bóp cơ tim thỏ cô lập Thuốc gây ngừng tim thỏ cô lập (kỳ tâm

trương) ở nồng độ 0,003%

d KIếN NGHị

1 Hoàn chỉnh thử lâm sàng trên bệnh nhân sốt rét

2 Sau khi có đủ dữ liệu tiền lâm sàng và lâm sàng, sản xuất viên nén

phối hợp DHA-PQP từ các nguyên liệu trong nước để đáp ứng nhu

cầu sử dụng thuốc phối hợp cho Dự án Quốc gia Phòng chống sốt rét

và xuất khẩu

a giới thiệu luận án

1 Đặt vấn đề

Bệnh sốt rét (SR) được y tế cộng đồng quan tâm hàng đầu và

là một trong những nguyên nhân chính gây đói nghèo tại các nước

đang phát triển Hàng năm, thế giới có khoảng 300 - 500 triệu người mắc SR và 2 triệu ca tử vong, trong đó có khoảng 1 triệu trẻ em dưới

5 tuổi ở châu Phi và Nam Sahara chết do SR Hơn 100 nước trên thế giới có lưu hành SR, hơn 2400 triệu người, xấp xỉ 40% dân số thế giới

có nguy cơ bị SR (Tổ chức Y tế thế giới, WHO, 2000)

Một trong những thách thức lớn nhất với phòng chống SR hiện nay là ký sinh trùng (KST) SR kháng thuốc Nhiều thuốc đã bị kháng, như: chloroquin, amodiaquin, sulfadoxin - pyrimethamin và quinin, thuốc chọn lọc để điều trị SR nặng và SR ác tính ở Thái Lan, Campuchia, Myanmar và ngay cả ở Việt Nam Do đó, WHO kêu gọi các nước tập trung nghiên cứu các thuốc SR mới

Các dẫn xuất của artemisinin như: dihydroartemisinin (DHA), artemether, arteether, artesunat, natri artenilat đều thể hiện hiệu lực diệt KST mạnh, cắt sốt nhanh và an toàn Tuy nhiên, nhược

điểm chính của nhóm thuốc này là với liệu trình điều trị 3-5 ngày thường có tỷ lệ tái phát cao > 25% Vì vậy, WHO đã khuyến cáo dùng phối hợp dẫn xuất ART với một thuốc SR khác có thời gian bán thải dài hơn

Thuốc phối hợp gồm: 40 mg DHA và 320 mg piperaquin phosphat (PQP), Artekin (Trung Quốc sản xuất), đã được phát triển Các thử nghiệm lâm sàng ở Campuchia và Thái Lan trên bệnh nhân

nhiễm P falciparum chưa biến chứng cho thấy, có hiệu quả cao trong

điều trị SR với thời gian sạch KST nhanh (trong vòng 72 giờ) và tỷ lệ

điều trị khỏi đạt tới 95 - 96%

Năm 2004, Viện Hoá học lần đầu tiên đã sản xuất thành công

PQ Đó là cơ sở để sản xuất thuốc SR phối hợp DHA-PQP từ nguyên

liệu trong nước, nhằm chủ động nguồn nguyên liệu Để đánh giá tính

an toàn của một thuốc SR phối hợp có khả năng chống kháng, với

nguyên liệu lần đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, cùng với ý nghĩa

góp phần bổ sung vào hồ sơ về tính an toàn của thuốc, đề tài “Nghiên

cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực

nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin -

piperaquin do Việt Nam sản xuất” được tiến hành với các mục tiêu

sau đây

2 Mục tiêu

2.1 Xác định hiệu lực (in vitro và in vivo trên chuột nhiễm

KST SR) của thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất

2.2 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của

thuốc phối hợp DHA-PQP trên động vật thực nghiệm

2.3 Đánh giá ảnh hưởng của thuốc phối hợp DHA-PQP (do

Việt Nam sản xuất) đến một số chức năng sinh sản, thần kinh trung

ương và tim mạch của động vật thực nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

falciparum và P berghei chủng nhạy và kháng chloroquin (CQ)

- Xác định độc tính cấp của DHA-PQP trên chuột nhắt trắng

- Xác định độc tính bán trường diễn: đánh giá ảnh hưởng

của DHA-PQP đến một số chỉ số sinh hoá, huyết học, chức năng gan,

thận, điện tim của động vật thực nghiệm (ĐVTN)

- Đánh giá ảnh hưởng đến di truyền: đột biến nhiễm sắc thể

(NST), quá trình sinh sản của động vật

2 Độc tính cấp và bán trường diễn của DHA-PQP trên ĐVTN:

2.1 Độc tính cấp của DHA-PQP trên chuột nhắt trắng:

Thuốc phối hợp DHA-PQP có độc tính thấp, theo đường uống liều LD0 = 1400 mg/kg, LD100 = 2800 mg/kg và LD50 = 2063,38

mg/kg (1933,62 – 2191,31 mg/kg) ở P = 0,05

ở hai liều đường uống 64 mg và 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày liên tiếp, thuốc phối hợp DHA-PQP không gây ảnh hưởng đến thể trạng và sức lớn của thỏ, không ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến chức năng gan (hàm lượng AST, ALT, protein và bilirubin toàn phần

và vi thể mô gan), chức năng thận (hàm lượng creatinin và vi thể mô thận), chức năng tạo máu (hàm lượng hemoglobin, số lượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu) và điện tim (nhịp tim, các sóng điện tim) của thỏ thực nghiệm

3 ảnh hưởng của DHA-PQP đến một số chức năng sinh sản, thần kinh trung ương và tim mạch của ĐVTN

3.1 Đột biến NST và đột biến gen ở chuột nhắt trắng:

Thuốc phối hợp DHA-PQP có khả năng gây đột biến cấu trúc NST tế bào tuỷ xương ở chuột nhắt trắng với liều đường uống 360 mg/kg/ngày ì 5 ngày (gấp 30 lần liều dùng trên người, tức liều tương

đương gấp 3 lần liều dùng điều trị trên người)

DHA-PQP không gây đột biến gen ở chuột thực nghiệm với liều 120 mg/kg/ngày ì 5 ngày ở cả ba thế hệ P, F1 và F2, thuốc không ảnh hưởng đến quá trình sinh sản, sự phát triển của phôi thai

và chuột con, không gây dị tật bẩm sinh

DHA-PQP không gây ảnh hưởng đến sự phát triển hệ sinh

10’, 15’, 20’, 25’ truyền thuốc và khi ngừng truyền thuốc tại 0’, 5’,

10’, 15’, 20’, 25’

Kết quả cho thấy, ở nồng độ 0,001%, thuốc phối hợp

DHA-PQP không ảnh hưởng đến nhịp tim thỏ, gây tăng nhẹ biên độ co bóp

cơ tim và giảm lưu lượng dịch chảy qua tim tại các thời điểm truyền

thuốc và sau khi ngừng truyền thuốc so với thời điểm ban đầu, nhưng

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P (i-0’) > 0,05)

ở nồng độ 0,002%, thuốc phối hợp DHA-PQP gây giảm nhịp

tim, giảm lưu lượng dịch qua tim và giảm biên độ cơ tim thỏ Trong 20

phút đầu truyền thuốc, nhịp tim và lưu lượng dịch nuôi qua tim thay đổi

không có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (P > 0,05), nhưng từ phút 25

và sau khi ngừng truyền thuốc các chỉ số này giảm có ý thống kê so với

trước khi truyền (P (i-0’) < 0,05 và < 0,01) Đặc biệt, biên độ co bóp cơ

tim thỏ giảm mạnh từ phút thứ 10 trở đi, các giá trị P (i-0’) < 0,05, <

0,01 và < 0,001

ở nồng độ 0,003%, DHA-PQP cũng làm chậm nhịp tim,

giảm biên độ co bóp cơ tim rõ rệt và nhanh chóng gây ngừng tim thỏ

cô lập ở kỳ tâm trương

C kết luận

1 Hiệu lực trên KST SR in vitro và in vivo:

- Thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất có hiệu

lực in vitro cao với P falciparum đơn dòng T996 (nhạy CQ) và

phân lập K1 (kháng CQ), với IC50 là 4,1 và 2,5 nmol/L và MIC là

8,8 và 4,4 nmol/L

- Trên chuột nhắt trắng nhiễm P berghei chủng kháng CQ

(K70), thuốc phối hợp DHA-PQP, với tổng liều 584 mg (64,89 mg

DHA và 519,11 mg PQP) /kg/3 ngày, có tác dụng điều trị khỏi 90%

chuột nhiễm P berghei

- Đánh giá ảnh hưởng của DHA-PQP đến một số chức năng hoạt động của hệ thần kinh trung ương ĐVTN

- Đánh giá ảnh hưởng của DHA-PQP đến huyết áp và tim

cô lập của ĐVTN

4 đóng góp mới của luận án

- Đã nghiên cứu hiệu lực và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp DHA-PQP, với nguyên liệu được sản xuất tại Việt Nam

- Chứng minh trên thực nghiệm, thuốc phối hợp DHA-PQP

do Việt Nam sản xuất có hiệu quả cao trên KST SR và an toàn, là cơ

sở để sản xuất và sử dụng thuốc trên bệnh nhân sốt rét từ nguồn nguyên liệu chủ động trong nước, không phải nhập khẩu

- Đã phát hiện khả năng gây đột biến nhiễm sắc thể tế bào tuỷ xương của chuột nhắt trắng ở liều gấp 30 lần liều dùng trên người (360 mg/kg/ngày ì 5 ngày)

- Đã xác định: ở liều 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày và 300 mg/kg/ngày ì 12 ngày đầu + 200 mg/kg/ngày ì 16 ngày sau, DHA-PQP an toàn với sự phát triển cơ quan sinh dục của chuột cống trắng

- Đã phát hiện, thuốc phối hợp DHA-PQP ở nồng độ 53,5 mg/100 mL và 0,003% (truyền liên tục 25 phút) gây ngừng tim ếch và tim thỏ cô lập ở kỳ tâm trương

5 bố cục của luận án

Luận án gồm 4 chương, 140 trang, 47 bảng, 31 hình, 1 phụ lục, và 172 tài liệu tham khảo Đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 31 trang,

đối tượng, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết quả nghiên cứu 51 trang, bàn luận 29 trang, kết luận và đề nghị 3 trang; các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 3 trang, tài liệu tham khảo 22 trang, phụ lục 8 trang

B nội dung của luận án

Chương 1 Tổng quan Tổng kết tài liệu của các tác giả trên thế giới và trong nước về

bệnh sốt rét và tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam (điểm vài

nét), sơ lược về tình hình KST SR kháng thuốc, cơ chế kháng, lịch sử

phát triển thuốc SR và vaccin SR; về dược lý và độc tính của dẫn xuất

artemisinin (trong đó có DHA), PQP và thuốc phối hợp có chứa hai

thành phần DHA-PQP và khả năng sản xuất DHA-PQP từ nguyên

liệu chủ động trong nước

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Bột DHA và PQP (Viện Hoá học sản xuất), đạt tiêu chuẩn cơ sở

(phiếu kiểm nghiệm số 212/KĐ và 610-TCH, theo thứ tự)

- Bột PQP (ký hiệu là PQPW) và CQ: của WHO cung cấp

- Viên nén phối hợp gồm 40 mg DHA và 320 mg PQP, XNDPTƯ

I sản xuất, lô NC 010905 (tiêu chuẩn cơ sở 04 Z1 - 14 - 04)

- Thuốc được tạo hỗn dịch với dung môi gôm arabic 1%, liều

lượng thuốc tính theo phương pháp ngoại suy liều có hiệu quả tương

đương giữa người và ĐVTN

- KST SR: Plasmodium falciparum chủng nhạy CQ (T996) và

phân lập kháng CQ (K1), chủng P berghei kháng CQ (K70)

- ĐVTN: chuột nhắt trắng Mus musculus L (chủng Swiss), 4-5

tuần tuổi, chuột cống trắng Rattus norvegicus B còn non, 5-6 tuần

tuổi, thỏ trưởng thành Oryctolagus cunniculus L., 2 tháng tuổi, chó

trưởng thành 10-12 kg, ếch 200 ± 30 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Nghiên cứu hiệu lực của DHA, PQP, PQPW và thuốc phối

hợp DHA-PQP trên KST SR:

hưởng của các hỗn dịch có nồng độ 16, 32 và 53,5 mg/100mL đến hoạt động của tim ếch cô lập Kết quả được thể hiện ở bảng 3.38

Bảng 3.38 ảnh hưởng của DHA-PQP đến tần số (lần / phút) và biên

độ (cm) của tim ếch cô lập

Các chỉ số nghiên cứu Nhịp tim (lần / phút) Biên độ (cm) Nhóm nghiên

thuốc

Sau nhỏ thuốc

Trước nhỏ thuốc

Sau nhỏ thuốc

16 mg/100mL (n = 16)

21,3±3,8 19,7±3,9 1,7±0,5 1,9±0,5

32 mg/100mL (n = 19)

24,9±4,0 24,2±3,8 1,3±0,5 1,6±0,6

ở nồng độ 16 và 32 mg/100mL, sau khi nhỏ thuốc, tần số tim ếch giảm nhẹ, biên độ của tim ếch có tăng lên so với trước khi nhỏ

thuốc, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05)

ở nồng độ thuốc 53,5 mg/100mL, nhịp tim giảm rất rõ rệt, biên độ của tim ếch lúc đầu có tăng lên nhưng sau đó giảm đi rất nhanh và tim ếch ngừng hoạt động ở kỳ tâm trương Chứng tỏ, DHA-PQP không ảnh hưởng đến hoạt động của tim ếch cô lập ở nồng độ 16

và 32 mg/100mL

3.8.3 ảnh hưởng của thuốc phối hợp đến tim thỏ cô lập:

Truyền liên tục hỗn dịch thuốc DHA-PQP qua hệ thống nuôi tim thỏ cô lập ở các nồng độ 0,001%, 0,002% và 0,003% trong 25 phút Cứ 5 phút 1 lần, ghi các giá trị nhịp tim, lưu lượng dịch thuốc qua tim và biên độ co bóp cơ tim Các thời điểm theo dõi là: 0’, 5’,

với lô 100 mg/kg Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa

thống kê giữa các lô uống thuốc so với lô chứng (P > 0,05)

Thuốc phối hợp DHA-PQP ở hai liều 100 và 150 mg/kg/ngày

đều làm giảm số lần lẩn tránh kích thích, tăng thời gian chịu kích

thích và giảm thời gian lưu giữ phản xạ của chuột ở các lô uống thuốc

so với lô chứng, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P >

0,05) ở ngày 4, số lần lẩn tránh của lô uống DHA-PQP 150

mg/kg/ngày giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P = 0,03); ở

ngày 5, số lần lẩn tránh ở cả hai lô 100 và 150 mg/kg giảm có ý nghĩa

thống kê so với lô chứng (P < 0,05) và thời gian tiềm tàng của lô (3)

lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P = 0,0132), tuy nhiên ở

những ngày sau sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05)

Các kết quả trên cho thấy, nhìn chung ở hai liều đã nghiên

cứu, DHA-PQP không ảnh hưởng đến hoạt động thần kinh trung ương

của chuột cống trắng

3.8 ảnh hưởng của DHA-PQP đến huyết áp và tim cô lập ĐVTN

3.8.1 ảnh hưởng của DHA-PQP đến huyết áp chó:

Theo dõi huyết áp và sự thay đổi tần số tim chó liên tục trong

6 giờ sau khi uống thuốc Ghi huyết áp (động mạch đùi) và nhịp tim

tại các thời điểm: trước uống thuốc, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 180

phút, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ sau khi uống thuốc qua máy Power lab

4/20 ADI Instruments Kết quả cho thấy, thuốc phối hợp DHA-PQP ở

cả hai liều 64 mg/kg (tương đương gấp 2 lần liều điều trị trên người)

và 120 mg/kg đều không gây ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến

huyết áp và nhịp tim chó tại các thời điểm sau khi uống thuốc so với

trước khi uống và giữa các lô uống thuốc so với lô chứng (P > 0,05)

3.8.2 ảnh hưởng của thuốc phối hợp đến tim ếch cô lập:

Từ hỗn dịch gốc DHA-PQP 160 mg/100mL, lần lượt thử ảnh

Thử nghiệm in vitro theo phương pháp 48 giờ của Phuc Nguyen Dinh, thử nghiệm in vivo theo phương pháp của Viện Sốt rét

- KST - CT trung ương và WHO

2.2.2 Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của DHA-PQP:

- Độc tính cấp: tiến hành trên chuột nhắt trắng, bằng đường

uống, theo phương pháp cổ điển Kết quả tính theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên chương trình Probit

- Độc tính bán trường diễn: tiến hành trên thỏ, dùng đường

uống, theo hướng dẫn của Bộ Y tế và OECD

2.2.3 Nghiên cứu các độc tính đặc biệt của DHA-PQP trên ĐVTN:

- ảnh hưởng đến đột biến nhiễm sắc thể: tiến hành trên chuột

nhắt trắng, nhiễm sắc thể tuỷ xương và tinh hoàn được làm theo phương pháp của Ford và Evans

- ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển của chuột nhắt trắng: dùng kỹ thuật liều chết trội của Bateman

- ảnh hưởng đến sự phát triển các cơ quan sinh dục ở chuột cống trắng: dùng phương pháp thử nghiệm chất hướng sinh dục của

Segaloff

- ảnh hưởng đến một số chức năng hoạt động thần kinh trung

ương của ĐVTN: phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt

trắng và phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng tiến hành theo phương pháp của Bộ Y tế

- ảnh hưởng đến huyết áp và tim cô lập của ĐVTN: ảnh

hưởng đến huyết áp chó theo phương pháp của Đại học Y Hà Nội,

đến tim ếch cô lập theo phương pháp Strawb và tim thỏ cô lập theo phương pháp của Langendorff

2.2.4 Xử lý số liệu:

- Xác định các giá trị IC theo phần mềm probit của

Wernsdorfer, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo tiêu chuẩn của Beal

và Thaithong, tính mật độ KST theo WHO, liều độc (LD50) tính trên

chương trình Probit của Michel Raymond

- Các kết quả nghiên cứu độc tính được biểu thị bằng trị số

trung bình +/- độ lệch chuẩn (M ± SD)

- Số liệu nghiên cứu đột biến nhiễm sắc thể được xử lý thống

kê bằng chương trình EPI-INFO, sử dụng test χ2

- Xử lý thống kê các số liệu nghiên cứu khác bằng chương

trình Excel (Microsoft XP), với cỡ mẫu nhỏ (< 30), sử dụng t-test

Student và Fisher’s exact test để so sánh các số liệu trước, trong, sau

thử nghiệm và giữa lô dùng thuốc với lô chứng

Chương 3 kết quả nghiên cứu

3.1 Hiệu lực trên KST SR in vitro và in vivo:

3.1.1 Hiệu lực in vitro:

Đáp ứng in vitro của các chủng P falciparum nhạy và kháng

CQ (T996 và K1) với thuốc SR được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Hiệu lực in vitro của các chủng P falciparum với DHA,

PQP, PQPW và phối hợp DHA-PQP

Chủng

DHA-PQP

DHA-PQP

T996 3,9 41,8 38,7 4,1 8,75 80 80 8,8

Các giá trị IC50 của PQP trên hai chủng T996 và K1 cao hơn

của PQPW, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, P > 0,05

DHA đơn thuần và thuốc phối hợp DHA-PQP có hiệu lực in vitro cao

với P falciparum, với IC50 và MIC trên chủng nhạy CQ cao hơn so

Số ngày tập, số lần tập để phản xạ hình thành và bền vững và

số lần tập để dập tắt phản xạ ở các lô uống DHA-PQP và lô chứng

khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Thời gian chuột

chạy tới đích ở các lô 2 và 4 tăng lên không có ý nghĩa thống kê so

với lô chứng (P > 0,05) Còn ở lô 3, thời gian tới đích tăng lên có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,01) Chứng tỏ, thuốc phối hợp

DHA-PQP có xu hướng ức chế hệ thần kinh trung ương chuột nhắt trắng ở liều 240 mg/kg/ngày x 5 ngày, 1 đợt

3.7.2 Phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng:

Số ngày để tập phản xạ và thời gian lưu giữ phản xạ được thể hiện ở bảng 3.32 và 3.34

Bảng 3.32 ảnh hưởng của DHA-PQP đến thời gian hình thành phản

xạ (ngày)

(n = 13)

100 mg/kg (2) (n = 11)

150 mg/kg (3) (n = 11)

Số ngày 6 ± 3,9 7,9 ± 4,2 7,8 ± 4,7

Giá trị P P (1-2) > 0,05 P (2-3) > 0,05 P (1-3) > 0,05

Thời gian hình thành phản xạ của chuột ở các lô uống thuốc liều 100 và 150 mg/kg/ngày (uống liên tục trong suốt quá trình nghiên cứu) kéo dài hơn so với lô chứng, nhưng sự khác biệt này

không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05)

Bảng 3.34 ảnh hưởng của DHA-PQP đến thời gian lưu phản xạ

(n = 13)

100 mg/kg (2) (n = 11)

150 mg/kg (3) (n = 11)

Số ngày 2,5 ± 1,9 2,2 ± 1,8 1,7 ± 1,1

Giá trị P P (1-2) > 0,05 P (2-3) > 0,05 P (1-3) > 0,05

ở cả hai lô uống thuốc, thời gian lưu phản xạ đều giảm đi so với lô chứng, ở lô 150 mg/kg, số ngày để phản xạ tắt nhanh hơn so

thường về hình thái đại thể các cơ quan

Trọng lượng của các cơ quan sinh dục (quy về 100 g súc vật)

giữa các lô uống thuốc khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô

chứng Kết quả trên cho thấy, DHA-PQP có hiện tượng tích luỹ khi

dùng kéo dài và ở hai liều đã nghiên cứu DHA-PQP không ảnh hưởng

đến sự phát triển hệ sinh dục của chuột cống trắng

3.7 ảnh hưởng của DHA-PQP đến hoạt động thần kinh trung

ương của ĐVTN

3.7.1 Phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng:

Các kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.31

Bảng 3.31 ảnh hưởng của thuốc phối hợp DHA-PQP đến phản xạ

(PX) tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng

Các chỉ số nghiên cứu Lô nghiên cứu

(n = 10)

Số ngày tập

để hình thành PX

Số lần tập

để hình thành PX

Thời gian tới đích (giây)

Số lần tập để tắt PX

(1): Chứng 22,8±7,6 68,3±22,9 33,2±8,8 3,4±1,2

(2): DHA-PQP

120 mg/kg/ngày

x 5 ngày (1 đợt)

24,2±8,5 72,5±25,4 39,2±10,1 3,8±0,9

(3): DHA-PQP

240 mg/kg/ngày

x 5 ngày (1 đợt)

25,4±7,9 76,3±23,8 47,8±8,9 4,1±1,7

(4): DHA-PQP

120 mg/kg/ngày

x 5 ngày (2 đợt)

21,1±4,6 63,3±13,8 35,1±5,5 4,0±1,1

P (2-1),(4-1) *

P (3-1) **

> 0,05 > 0,05 * > 0,05

** < 0,01

> 0,05

với trên chủng kháng CQ Điều này là do giữa DHA và CQ có tương quan nghịch, trong khi đó PQP và CQ có hiện tượng kháng chéo nên

ở chủng nhạy CQ, IC50 và MIC thấp hơn so với ở chủng kháng CQ

3.1.2 Hiệu lực in vivo:

ở nhóm chứng âm (chuột uống gôm arabic 1%), mật độ KST tăng dần, đến ngày 17 bắt đầu có chuột chết và 100% chuột chết vào ngày 28 Nhóm chứng dương (điều trị bằng CQ tổng liều 490 mg/kg/7 ngày) không có tác dụng ức chế KST, diễn biến sự phát triển KST tương đương với chứng âm, KST tăng cao và chuột chết 100%

DHA đơn thuần chỉ có tác dụng ức chế KST phát triển, mật

độ KST giảm thấp trong tuần đầu điều trị, sau đó tái phát 100% ở 3 tuần tiếp theo và chuột chết 100% Nhóm được điều trị bằng PQP đơn thuần, với liều 510 mg/kg/3 ngày, chuột sạch KST hoàn toàn vào ngày 4, tái phát lại 20% với mật độ KST thấp và chuột sống 100% tại ngày 28 Còn ở nhóm chuột được điều trị bằng thuốc phối hợp DHA-PQP, tổng liều 584 mg/kg/3 ngày (64,89 mg/kg DHA và 519,11 mg/kg PQP), các chuột sạch KST hoàn toàn vào ngày 3, tái phát 10%

ở ngày 14 với mật độ KST rất thấp (0,007% hồng cầu nhiễm) và 100

% chuột sống sót đến N28 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Hiệu lực in vivo của thuốc SR với P berghei kháng CQ

Lô thử nghiệm (n = 10) % chuột

chết

Tỷ lệ tái phát (%)

% chuột sống

đến N28

DHA 74 mg/kg/3 ngày 100 100 0 PQP 510 mg/kg/3 ngày 0 20 100 DHA-PQP 584 mg/kg/3 ngày

0 10 100

DHA ở liều 74 mg/kg/3 ngày gây tái phát 100% số chuột,

PQP (510 mg/kg/3 ngày) và thuốc phối hợp DHA-PQP (584 mg/kg/3

ngày) cho tỷ lệ điều trị khỏi tương ứng là 80% và 90%

Liều lượng của DHA và PQP trong thuốc phối hợp tương tự

như khi điều trị riêng rẽ từng thuốc, thậm chí liều DHA còn hơi thấp

hơn so với DHA đơn thuần, cho thấy, khi dùng phối hợp DHA và

PQP, hiệu quả điều trị đã tăng lên rõ rệt so với khi dùng riêng rẽ từng

thành phần Các kết quả trên cũng chứng tỏ, DHA-PQP do Việt Nam

sản xuất có hiệu lực cao trên KST SR

3.2 Độc tính cấp đường uống của thuốc phối hợp DHA-PQP:

Tiến hành trên chuột nhắt trắng, với liều đường uống từ 1400

- 2800 mg/kg Sau khi uống thuốc khoảng 30 phút, các chuột giảm

hoạt động, nằm im, không ăn uống Những chuột uống DHA-PQP

liều cao có hiện tượng xù lông, co giật mạnh trước khi chết, hoảng

hốt và đặc biệt bị kích thích bởi tiếng động Hầu hết chuột chết trong

vòng 24 giờ đầu tiên Một số chuột chết muộn, ở ngày thứ 3 sau khi

uống thuốc Toàn bộ số chuột chết ở các lô được mổ để quan sát đại

thể các cơ quan tim, gan, thận, phổi, bàng quang, ruột: không phát

hiện thấy bất thường về hình thái đại thể hoặc xung huyết ở các cơ

quan trên Số chuột còn sống sót sau khi dùng thuốc được theo dõi

tiếp cho đến hết ngày thứ 7 với các biểu hiện về hoạt động, ăn uống

và bài tiết ở các ngày sau bình thường

Liều cao nhất không gây chết chuột là LD0 = 1400 mg/kg và

liều thấp nhất gây chết 100% số chuột là LD100 = 2800 mg/kg

LD 50 (DHA-PQP) = 2063,38 (1933,62 - 2191,31) mg/kg ở P = 0,05

Liều gây chết 50% số súc vật thí nghiệm của DHA-PQP trên

chuột nhắt trắng (bằng đường uống) là LD50 = 2063,38 mg/kg, với

giới hạn dưới là 1933,62 mg/kg và giới hạn trên là 2191,31 mg/kg

3.5 ảnh hưởng của DHA-PQP đến quá trình sinh sản và phát triển của chuột nhắt trắng:

Thử nghiệm được tiến hành trên 3 thế hệ chuột nhắt trắng: P (thế hệ cha mẹ), F1 và F2; với các lô thử thuốc gồm: chuột cái uống thuốc ghép với chuột đực không uống thuốc, cả chuột cái và đực uống thuốc, và chuột cái không uống thuốc ghép với chuột đực uống thuốc,

được so với lô chứng Kết quả cho thấy, ở cả 3 thế hệ, tỷ lệ thụ thai,

số thai của mỗi chuột mẹ, số chuột con ở mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình của chuột con và số ngày cần thiết để chuột con sinh ra đạt trọng lượng 20g ở các lô uống thuốc so với lô chứng khác nhau không

có ý nghĩa thống kê (các giá trị P > 0,05) Không phát hiện thấy thai

chết sớm, thai chết muộn, thai bị dị tật hay dị tật bẩm sinh ở các chuột con được sinh ra Chứng tỏ, thuốc phối hợp DHA-PQP ở liều

120 mg (13,33 mg DHA và 106,67 mg PQP) /kg/ngày ì 5 ngày liên tiếp (tương đương liều dùng điều trị trên người) không gây đột biến gen ở chuột nhắt trắng bằng kỹ thuật liều gây chết trội

3.6 ảnh hưởng của DHA-PQP trên sự phát triển cơ quan sinh dục của chuột cống trắng:

ở liều cao, 400 mg (44,44 mg DHA và 355,56 mg PQP) /kg/ngày, toàn bộ 12 chuột cái và 10 chuột đực lần lượt chết sau khi

có 7 - 13 ngày liên tiếp uống DHA-PQP Do đó, liều lượng thuốc ở lô tiếp theo giảm đi còn 300 mg (33,33 mg DHA và 266,67 mg PQP) /kg/ngày ì 12 ngày đầu + 200 mg (22,22 mg DHA và 177,78 mg PQP) /kg/ngày ì 16 ngày sau và lô 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày Sau

28 ngày uống thuốc liên tục, phân lập các tổ chức tươi, quan sát đại thể các cơ quan sinh dục chuột cống cái (buồng trứng, tử cung và vòi trứng) và chuột cống đực (tinh hoàn, tuyến tiền liệt, túi tinh và cơ nâng hậu môn) ở cả hai lô uống thuốc, nhận thấy không có bất