Nghiên cứu nhận dạng pháp y bằng phương pháp hình thái học và phân tích ADN một số locus STR ở người Việt

Nghiên cứu nhận dạng pháp y bằng phương pháp hình thái học và phân tích ADN một số locus STR ở người Việt

Bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o Bé quèc phßng

häc viÖn qu©n y

NguyÔn v¨n Lîi

Nghiªn cøu nhËn d¹ng ph¸p y b»ng

ph−¬ng ph¸p h×nh th¸i häc vμ ph©n tÝch

ADN mét sè locus STR ë ng−êi ViÖt

Chuyªn ngµnh: Gi¶i phÉu ng−êi

M· sè: 62.72.01.10

Tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ y häc

Hμ néi - 2009

Công trình được hoàn thành tại Học Viện Quân Y

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Văn Huy

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Học viện Quân y

vào hồi 8 giờ 30 ngày 24 tháng 6 năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện quốc gia

Thư viện Học Viện Quân Y

Đặt vấn đề

Nhận dạng cá thể người trong pháp y là quá trình phân tích các đặc

điểm đặc trưng của con người để xác định một cá thể trong một nhóm

đối tượng nhất định nào đó

Trong quá trình giám định pháp y nhận dạng cá thể là bước đầu tiên quan trọng nhằm xác định chính xác cá thể trước khi tiến hành giám

định các thương tổn Có nhiều phương pháp nhận dạng khác nhau Việc

sử dụng các phương pháp tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể

Phương pháp hình thái học căn cứ vào các đặc điểm hình thái của cơ thể con người, phương pháp phân tích ADN dựa trên đặc trưng cấu trúc

và tính đa hình của phân tử ADN để nhận dạng cá thể người Phương pháp ADN có độ chính xác cao và có thể áp dụng được cho nhiều loại mẫu sinh phẩm pháp y, đặc biệt với các mẫu sinh phẩm không nguyên vẹn, số lượng ít, chất lượng bị suy giảm - mà các phương pháp hình thái học không thể thực hiện được

ở Việt Nam nhiều nhà khoa học có những công trình nghiên cứu về nhận dạng cá thể người bằng hình thái học và các locus ADN phục vụ cho giám định nhận dạng pháp y hình sự Nhưng số lượng công trình nghiên cứu được ứng dụng trong nhận dạng pháp y còn chưa nhiều, công tác nhận dạng bằng hình thái học chưa thực sự thống nhất và trở thành hệ thống, chưa có tác giả nào công bố nghiên cứu locus TH01 và D16S539 trên người Việt (Kinh) ứng dụng trong nhận dạng cá thể Vì vậy để không ngừng hoàn thiện về kỹ thuật, làm chủ công nghệ, đồng thời triển khai được rộng rãi, tiết kiệm thời gian, kinh phí và đem lại hiệu quả cao trong công tác giám định nhận dạng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu:

- Đánh giá hiệu quả nhận dạng cá thể bằng phương pháp hình thái học

- Tối ưu hoá thành phần phản ứng PCR đơn, PCR phức, tạo thang allele và khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 và D16S539 ở người Việt (Kinh) sử dụng trong nhận dạng cá thể

ý nghĩa thực tiễn vμ đóng góp của luận án

Đề tài có tính cấp thiết và thực tiễn, đã có những đóng góp mới cho khoa học nhận dạng cá thể người trong pháp y ở Việt Nam

Về kết quả luận án:

1 Đã đánh giá được hiệu quả, mức độ, phạm vi và giá trị nhận dạng cá thể người của các phương pháp nhận dạng thông qua khám nghiệm hình thái, qua đặc điểm mô tả, phương pháp phân tích vân da, phương pháp lồng ảnh bằng gương bán mạ, phương pháp phân tích ADN và phương pháp kết hợp hình thái và phân tích ADN

2 Đã có những đóng góp cho công tác nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật ADN: tối ưu hoá được phản ứng PCR đơn, PCR phức hợp hai locus, tạo được thang allele và khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 và D16S539 ở người Việt (Kinh) sử dụng trong nhận dạng cá thể Những kết quả đóng góp mới mang tính hệ thống và làm cơ sở để hoàn thiện phương pháp hình thái học và ADN trong nhận dạng cá thể nhằm nâng cao hơn nữa hiệu quả công tác giám định pháp y ở Việt Nam

Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 140 trang

Phần đặt vấn đề 3 trang

Chương 1: Tổng quan, 29 trang; chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu, 18 trang; chương 3: kết quả nghiên cứu, 31 trang; chương 4: bàn luận, 35 trang

Phần kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang

Luận án có 19 bảng, 4 biểu đồ, 33 hình, 149 tài liệu tham khảo (tiếng việt 29, tiếng Anh 107, tiếng Đức 3, tiếng Nga 3, web internet 7)

Chương 1: Tổng quan tμi liệu 1.1 Nhận dạng cá thể trong giám định pháp y

Công tác nhận dạng chính là việc so sánh các thuộc tính, các đặc

điểm của mẫu sinh phẩm thu được với những tiêu chuẩn, những chỉ tiêu

đã biết để xác định cá thể hoặc so sánh giữa những thuộc tính, những

đặc điểm của mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp hoặc xác định chúng có cùng một nguồn gốc hay không Nếu các đặc tính được xác định giữa mẫu nghi ngờ và mẫu so sánh giống nhau thì điều đó có nghĩa là hai mẫu này có chung một nguồn gốc Nếu các đặc tính khác nhau thì có nghĩa là mẫu nghi ngờ và mẫu so sánh có nguồn gốc khác nhau

Độ tin cậy của phương pháp nhận dạng được tính toán thông qua tần suất xuất hiện của các dấu hiệu nhận dạng trong quần thể đang xem xét Vì vậy việc nghiên cứu tần suất phân bố của các dấu hiệu nhận dạng trong quần thể người nhất định đóng vai trò rất quan trọng Khi tần suất xuất hiện trong quần thể của một dấu hiệu nào đó càng cao thì giá trị nhận dạng càng thấp Ngược lại, các dạng càng hiếm gặp (tần số thấp) thì giá trị nhận dạng càng cao nghĩa là mẫu đó chỉ thuộc một vài

đối tượng trong quần thể nghiên cứu

1.2 phương pháp nhận dạng cá thể người trong pháp y

1.2.1 Phương pháp hình thái học

Phương pháp này dựa trên các đặc điểm hình thái học mang tính đặc trưng của cơ thể con người để nhận dạng Các phương pháp gồm:

* Nhận dạng cá thể người thông qua đặc điểm mô tả

Phương pháp này rất thông dụng, được ứng dụng rộng rãi không chỉ trong lĩnh vực pháp y hình sự mà còn nhiều lĩnh vực khác Trong pháp y hình sự phương pháp này được ứng dụng để xác định các nạn nhân, truy tìm tung tích kẻ phạm tội, truy tìm các đối tượng nghi ngờ dựa vào đặc điểm hình thái của khuôn mặt, mắt, mũi, môi, miệng, tai Tuy nhiên, độ chính xác của phương pháp này phụ thuộc nhiều vào tính toàn vẹn của mẫu giám định, mức độ biến đổi

của khuôn mặt và yếu tố chủ quan của người mô tả

* Phương pháp ghép ảnh

Chủ yếu được sử dụng để phác thảo nhanh hình dạng khuôn mặt của

đối tượng nghi ngờ dựa trên bộ ảnh có sẵn và đã được phân loại Phương pháp này đòi hỏi phải tập hợp được một album ảnh lớn, phân loại đày đủ và chi tiết mới đem lại hiệu quả Độ chính xác phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố chủ quan của người mô tả và bộ ảnh có sẵn

* Phương pháp tái tạo lại khuôn mặt từ hộp sọ

Phương pháp này nhằm phục chế lại hình ảnh khuôn mặt của người trước lúc chết trên nền xương sọ bằng đất sét hoặc kỹ thuật vi tính trong trường hợp chỉ có mẫu xương sọ giám định và không có mẫu so sánh Yêu cầu của phương pháp này là xương sọ phải còn tương đối nguyên vẹn và phải xây dựng được mối liên hệ giữa các phần của khuôn mặt và mối tương quan chặt chẽ về độ dày, mỏng của mô mềm vùng mặt theo

* Phương pháp vân da

Phương pháp này dựa trên những đặc điểm vân da đầu ngón tay của các cá thể Phương pháp nhận dạng qua so sánh đường vân được sử dụng trong cơ quan cảnh sát hình sự và cơ quan pháp y ở nước ta cũng như trên thế giới Việc nhận dạng và xác định chính xác cá thể trở nên

dễ dàng khi chúng ta có hồ sơ vân da lưu trữ và có đầy đủ dấu vân da của tất cả mười đầu ngón tay

1.2.2 Cơ sở khoa học của phân tích ADN trong nhận dạng cá thể

Đặc tính cá thể không chỉ thể hiện trên các đặc điểm hình thái mà còn thể hiện ở cấu trúc phân tử ADN Nhận dạng cá thể người qua phân

tích ADN chủ yếu được thực hiện trên các dấu chỉ thị ADN (marker DNA), đó là sự khác nhau về trình tự và kích thước các đoạn ADN ở các cá thể Thực chất là sự khác nhau về số lượng và trình tự xắp xếp của 4 loại nucleotid (A, T, G, C) trong phân tử ADN của mỗi cá thể Đó

là cơ sở để xác định cá thể

Nhiễm sắc thể được bảo toàn trong mỗi thế hệ và được di truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác Con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền thông qua 23 nhiễm sắc thể từ tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng của mẹ Đó là cơ sở để xác định quan hệ huyết thống cha (mẹ) - con

1.3 locus ADN sử dụng trong nhận dạng cá thể người

1.3.1 Khái niệm các đoạn lặp và STR

Phân tử ADN của tế bào có chứa các trình tự lặp lại Trên mỗi locus ADN của các cá thể khác nhau có số lượng trình tự lặp lại khác nhau Các đoạn ADN có các trình tự lặp từ 10 - 100 bp gọi là VNTR (variable number of tandem repeats), ví dụ locus D1S80 có đoạn lặp là bội số của 16 nucleotid, locus này chứa các allele từ số đơn vị lặp lại 14 lần đến 41 lần Trình tự lặp lại là GAGGA CCACC AGGAA G

Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 - 6 bp được gọi là các đoạn lặp lại ngắn - STR (short tandem repeat) Các cấu trúc VNTR hay STR

được di truyền qua các thế hệ, mang tính bảo thủ cao và tính đặc trưng cá thể

Để một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác

định cá thể phải thỏa mãn những yêu cầu là:

- Khả năng phân biệt cao (lớn hơn 0,9) và các dạng dị hợp tử quan sát được trong quần thể lớn hơn 70%

- Nằm trên vùng nhiễm sắc thể riêng biệt

- Dễ dàng khuếch đại bằng PCR

- Đặc tính trượt allele khi PCR thấp

- Đoạn ADN được khuếch đại trong khoảng 90 - 500 bp

1.3.2 Locus STR sử dụng trong nhận dạng cá thể người

Hệ thống locus STR sử dụng trong nhận dạng được chia làm 4 loại:

- Loại thứ nhất: trình tự lặp lại đơn giản gồm một loại trình tự lặp, ví dụ: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

- Loại thứ hai: trình tự lặp lại đơn giản nhưng số allele không thực sự

đồng nhất, ví dụ: TH01, D18S51, D7S820

- Loại thứ ba: trình tự lặp lại kết hợp với các allele không đồng nhất,

ví dụ: vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

- Loại thứ tư: trình tự lặp lại phức tạp, ví dụ: D21S11, LPL

* Locus TH01 có trình tự lặp lại bộ 4 nucleotide (TCAT) nằm ở vùng intron 1 của gen Tyrosine hydroxylase trên nhánh ngắn NST 11 Locus mang tên TH01 xuất phát từ chữ cái đầu của enzym Tyrosine hydroxylase và vùng intron 1 (hay 01) TH01 còn mang tên khác đó là TC11 hoặc HUMTH01 Locus TH01 thuộc loại thứ hai trong hệ thống STR sử dụng trong nhận dạng cá thể TH01 bao gồm 7 allele (allele 5 - 11) xuất hiện trong quần thể người và có một biến thể của allele số 10

được gọi là allele 9.3, do allele số 10 bị mất một bazơ

* Locus D16S539 thuộc loại thứ nhất trong hệ thống STR Chúng có trình tự lặp lại bộ 4 nucleotide (GATA) nằm trên nhánh dài NST 16 ở vị trí trình tự đơn số 539 Vì locus này không nằm trong vùng mã hoá nào của nhiễm sắc thể 16 nên mang tên D16S539 Chúng có 11 allele, đầu tiên là allele số 5 tiếp theo là allele số 8 đến allele 15 (rất hiếm allele số

6 và số 7)

Chương 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu phương pháp giám định nhận dạng

193 cá thể người Việt được giám định nhận dạng tại Viện Pháp Y Quân đội, thời gian từ 2003 - 2007, trong đó có 188 nam và 5 nữ, tuổi

từ 18 - 50 Tiêu chuẩn lựa chọn dựa vào phương pháp giám định nhận dạng đã tiến hành:

Phương pháp nhận dạng bằng hình thái học: 168

Phương pháp nhận dạng bằng phân tích ADN: 23

Phương pháp nhận dạng bằng hình thái học kết hợp ADN: 2

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu một số locus STR ở người Việt

280 mẫu máu tĩnh mạch của những người khoẻ mạnh không có quan

hệ huyết thống được lấy trong các đợt khám sức khoẻ và của những người liên quan đến nạn nhân trong trận bão Chan chu (5/2006) do Viện Pháp Y Quân đội cung cấp

Đánh dấu các điểm trên xương sọ và ảnh chân dung, điều chỉnh xương sọ và ảnh chân dung sao cho các điểm đánh dấu trùng khớp với nhau giữa ảnh và xương sọ bằng cách quan sát qua gương bán mạ

2.2.1.5 Nhận dạng cá thể người bằng vân da

Phóng to bản in vân da cần nhận dạng và bản in vân da lưu trữ lên cùng một kích cỡ Đánh dấu 3 điểm trên hai bản in vân da rồi đặt chồng lên nhau và quan sát Nếu trùng khít thì tiếp tục đánh dấu các điểm khác rồi đặt chồng lên nhau và quan sát

2.2.2 Nghiên cứu locus TH01 và D16S539 ở người Việt (Kinh)

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/chloroform

Phương pháp tách chiết ADN từ máu toàn phần theo quy trình tách chiết của AFDIL và Comey C.T

2.2.2.2 Phương pháp PCR

Thành phần trong PCR bao gồm: ADN khuôn; cặp mồi đặc hiệu locus; dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); ADN - polymerase chịu nhiệt; dung dịch đệm (Buffer) và MgCl2

PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn của 1 chu kỳ: biến tính, gắn mồi

và tổng hợp Số chu kỳ PCR là 25 - 40

Trình tự mồi TH01: 5'- GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC CTC-3'

5'- GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3' Trình tự mồi D16S539: 5'- GAT CCC AAG CTC TTC CTC TTC C-3'

5'- CGT TTG TGT GTG CAT CTG TAA G-3'

2.2.2.3 Phương pháp điện di và phát hiện băng ADN

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide

để kiểm tra

Điện di phân tách sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide biến tính 5% và nhuộm bạc để xác định kiểu gen của các cá thể

2.2.2.4 Phương pháp chế tạo thang allele

Phương pháp chế tạo thang allele dựa trên sự kết hợp các allele được lựa chọn trong nghiên cứu quần thể Các allele được pha trộn và khuếch

đại đồng thời để tạo ra sản phẩm PCR có chứa các allele chung cần thiết của locus STR

Các bước tiến hành chế tạo thang allele bao gồm:

- Khảo sát và tìm kiếm các allele của locus ADN nghiên cứu

- Lựa chọn và tiến hành phản ứng PCR các allele cần thiết

- Tinh sạch allele

- Xác định allele bằng phương pháp giải trình tự

- Tạo thang allele bằng phương pháp trộn mẫu hoặc bằng PCR

2.2.2.5 Xác định và khảo sát tần suất allele quần thể

(TSAL: tần suất allele, i: ký hiệu allele)

2.2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu:

Sử dụng phương pháp thống kê y học thông thường và xử lý thống kê trên phần mềm Stata 7.0

3.1.2 Tỷ lệ áp dụng các phương pháp hình thái học trong giám

định nhận dạng pháp y

Trong tổng số 168 trường hợp được giám định nhận dạng bằng phương pháp hình thái học; phương pháp nhận dạng chủ yếu là nhận dạng thông qua đặc điểm mô tả gồm 161 trường hợp, chiếm 95,8%; 3 trường hợp được nhận dạng bằng phương pháp phân tích vân da, chiếm 1,8%; 3 trường hợp nhận dạng tuổi, giới qua khám nghiệm pháp y, chiếm 1,8% và 1 trường hợp được nhận dạng bằng phương pháp lồng

ảnh, chiếm 0,6%

TSAL =

3.1.3 Kết quả giám định của các phương pháp nhận dạng

Trong giám định pháp y sử dụng phương pháp hình thái học đã xác

định được 164 trường hợp, chiếm 90,7% số cá thể nghiên cứu; phương pháp phân tích ADN xác định được 15 trường hợp, chiếm 8,4%; phương pháp hình thái kết hợp phương pháp phân tích ADN xác định 2 trường hợp, chiếm 1,1%

3.1.4 Giám định nhận dạng qua khám nghiệm pháp y

Được áp dụng với tất cả các mẫu giám định là các xương sọ còn nguyên vẹn Qua khám nghiệm pháp y chỉ nhận dạng được độ tuổi, giới tính và chưa xác định được cá thể nếu không có mẫu so sánh

Với bộ xương nói chung và xương sọ nói riêng khám nghiệm pháp y xác định được độ tuổi, giới tính và các đặc điểm trên xương Khi so sánh không thấy sự phù hợp giữa đặc điểm nhận dạng thu được với những thông tin về độ tuổi, giới tính của đối tượng cần nhận dạng chúng ta có thể loại trừ đối tượng giám định và không cần tiến hành các bước nhận dạng tiếp theo

Trường hợp có nhiều người chết cần nhận dạng, các phần thi thể hoặc hài cốt bị tách rời và lẫn lộn với nhau, khám nghiệm pháp y giúp chúng ta có thể phân loại được mẫu giám định, sắp xếp các phần và các

bộ phận của tử thi hoặc hài cốt nhằm làm giảm số lượng mẫu cần giám

định và tạo điều kiện cho các bước giám định nhận dạng tiếp theo

3.1.5 Nhận dạng cá thể bằng phương pháp lồng ảnh

3 trường hợp nhận dạng bằng phương pháp lồng ảnh với các mẫu giám định là chiếc xương sọ còn nguyên vẹn và có mẫu so sánh là ảnh chân dung của người mất tích Kết quả trùng khít ảnh chân dung với xương sọ Vì vậy đã xác định được chiếc xương sọ thuộc về người mang ảnh chân dung nhưng chưa xác định được danh tính Do đó phải kết hợp với phương pháp phân tích ADN để xác định cá thể

3.1.6 Nhận dạng cá thể qua các đặc điểm mô tả

161 trường hợp nhận dạng bằng đặc điểm mô tả chúng tôi thấy nhận dạng bằng đặc điểm mô tả là phương pháp khá đơn giản, dễ tiến hành

và cho phép xác định cá thể trong trường hợp khuôn mặt tử thi còn nguyên vẹn, chưa bị biến đổi và các đặc điểm mô tả được phân tích một cách chi tiết, có hệ thống

Trong trường hợp khuôn mặt tử thi đã bị biến đổi, các phần của khuôn mặt bị biến dạng hoặc tách rời thì nhận dạng cá thể bằng các

đặc điểm mô tả khó khăn hơn và khả năng xác định cá thể là không cao do vậy cần phải tiến hành các phương pháp nhận dạng khác để có kết luận cuối cùng

3.1.7 Nhận dạng cá thể bằng phương pháp vân da

Qua 3 trường hợp xác định cá thể bằng phương pháp vân da, chúng tôi thấy: Nhận dạng qua so sánh vân da là phương pháp thường được tiến hành trong giám định nhận dạng cá thể và áp dụng trong trường hợp có mẫu vân da giám định và mẫu vân da lưu trữ Việc xác định cá thể trở nên dễ dàng hơn khi nhóm đối tượng được khu trú và có giới hạn

Kết quả trùng khít các đặc điểm vân da giữa mẫu giám định và mẫu so sánh cho phép xác định chính xác cá thể

3.1.8 Nhận dạng cá thể bằng phương pháp phân tích ADN

Chúng tôi đã sử dụng 2 locus TH01 và D16S536 nghiên cứu được bên cạnh các locus khác để phân tích ADN các mẫu giám định nhận dạng Qua 23 trường hợp nhận dạng bằng phương pháp phân tích ADN chúng tôi thấy:

- Phương pháp này được áp dụng trong trường hợp không thể tiến hành giám định nhận dạng bằng phương pháp hình thái học hoặc nhận dạng bằng phương pháp hình thái học nhưng chưa xác định