Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính nhanh tadalafil, sildenafil và vardenafil ngụy tạo trong thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương bằng kỹ thuật khối phổ

Áp dụng qui trình định tính đã thẩm định để phát hiện taladafil, sildenafil và vardenafil trong các mẫu chế phẩm thực phẩm chức năng thu thập tại Cần Thơ .... Biện giải cấu trúc ion mẹ v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

HUỲNH NGỌC THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NHANH TADALAFIL, SILDENAFIL VÀVARDENAFIL NGỤY TẠO TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN CƯƠNG DƯƠNG

BẰNG KỸ THUẬT KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Cần Thơ – Năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

HUỲNH NGỌC THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NHANH TADALAFIL, SILDENAFIL VÀ VARDENAFIL NGỤY TẠO TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN CƯƠNG DƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc , em xin gửi lời chân thành cám ơn

TS DS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ , người thầy tận tụy đã truyền cho em

bao nhiệt huyết cùng với rất nhiều kiến thức quý giá Thầy luôn theo dõi quan

tâm , hỗ trợ, động viên cả về vật chất và tinh thần giúp em vượt qua mọi khó

khăn trở ngại trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn các thầy cô trong liên bộ môn Hóa phân tích – Kiểm

nghiệm – Độc chất, cô Dương Thị Trúc Ly, cô Nguyễn Thị Ngọc Vân, thầy Lữ Thiện Phúc, cô Nguyễn Thị Đặng, thầy Đỗ Trung Hiền luôn giúp đỡ,

tạo điều kiện cho em có đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ, máy móc để thực hiện

đề tài

Cảm ơn các anh chị, các em học viên cùng lớp cao học Kiểm Nghiệm

2017- 2019, em Nguyễn Thị Hồng Phương K39, các em sinh viên DK40, DK42

đã giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian qua Xin cảm ơn những người bạn

trong nhóm đề tài kiểm nghiệm, cảm ơn những đồng đội khối phổ đã hỗ trợ

giúp đỡ em rất nhiều về mọi mặt

Và cuối cùng , xin cám ơn cả gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên và hỗ

trợ cho em hoàn thành thật tốt luận văn Cảm ơn những người bạn dù ở xa vẫn

luôn thăm hỏi, động viên và giúp đỡ hết lòng để em luôn tự tin và giữ vững

quyết tâm và hoàn thành mục tiêu của mình

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn khoa học của TS.DS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Các số liệu,

kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ

tài liệu nào khác

Sinh viên

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về rối loạn cương dương 3

1.2 Tổng quan về các chất ức chế PDE-5 nghiên cứu 3

1.1.1 Tác dụng dược lý 4

1.1.2 Tính chất lý hóa 5

1.1.3 Các nghiên cứu phân tích sildenafil, tadalafil và vardenafil 7

1.1.4 Tác dụng phụ và độc tính của thuốc trị rối loạn cương dương 10

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương tại Việt Nam 11

1.3 Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 14

1.3.1 Nguyên lý 14

1.3.2 Cấu tạo 14

1.3.3 Kỹ thuật ghi phổ 17

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2.Tiêu chuẩn chọn mẫu 19

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 19

2.1.4 Địa điểm - thời gian nghiên cứu 19

2.2 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn - trang thiết bị 20

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn 20

2.2.2 Trang thiết bị – dụng cụ 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1.Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm 21

2.3.2.Cỡ mẫu 21

2.3.3 Phương pháp chọn mẫu 23

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.4 Nội dung nghiên cứu 24

2.4.1.Chuẩn bị mẫu 24

2.4.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu tín hiệu SDF, TDF và VDF 24

2.4.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp 27

2.4.4.Thẩm định quy trình định tính 28

2.4.5 Áp dụng qui trình định tính đã thẩm định để định tính nhanh và đồng thời SDF, TDF, VDF trong TPCN hỗ trợ điều trị RLCD thu thập tại TP Cần thơ 29

Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu 31

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp 40

3.3 Thẩm định quy trình 43

3.3.1 Tính tương thích hệ thống 43

3.3.2 Độ dặc hiệu 43

3.3.3 Giới hạn phát hiện 45

3.5 Áp dụng qui trình định tính đã thẩm định để phát hiện taladafil, sildenafil và vardenafil trong các mẫu chế phẩm thực phẩm chức năng thu thập tại Cần Thơ 47

Chương 4 – BÀN LUẬN 49

4.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính đồng thời taladafil, sildenafil và vardenafil có trong mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương 49 4.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 49

4.1.2 Khảo sát quy trình chiết thích hợp 54

4.1.3 Biện giải cấu trúc ion mẹ và các phân mảnh con để định tính

xác nhận của TDF, SDF và VDF có trong mẫu thực phẩm chức năng 55

4.1.4 Thẩm định quy trình 60

4.1.4 Ứng dụng quy trình định tính đã thẩm định xác định taladafil, sildenafil và vardenafil có trong các chế phẩm thực phẩm chức năng thu thập 61

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Analytical communities

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức

CXP Collision cell Exit Potential Thế đầu ra

UV-Vis Ultra violet visible

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích các chất ức chế PDE-5 8 Bảng 1.2 Tóm tắt cách lựa chọn [44] 16 Bảng 2.1 Dung môi- hoá chất sử dụng trogn nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Bốn mươi mẫu thực phẩm chức năng thu thập tại TP Cần Thơ 22 Bảng 2.3 Đặc trưng khối phổ của các chất ức chế PDE-5 26

Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ tối ưu cho phân tích TDF, SDF và VDF 40

Bảng 3.2 Ion mẹ và những ion phân mảnh đặc trưng của TDF, SDF và VDF

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế

phosphodiesterase-5 (PDE-5) 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của tadalafil 5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của sildenafil 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của vardenafil 7

Hình 1.5 Cấu tạo khối phổ 14

Hình 1.6 Hệ thống khối phổ ba lần tứ cực 18

Hình 3.1 (a) Kết quả auto- tune bằng công cụ Intelligent Stat trong Masslynx 4.1 để tìm ion mẹ (ESI+) và các phân mảnh con đặc trưng của SDF, (b) phổ đồ minh họa thế cone, (c) năng lượng va đập và (d) cường độ tín hiệu của mảnh con đặc trưng m/z 99.64 32

Hình 3.2 (a) Kết quả auto- tune bằng công cụ Intelligent Stat để tìm ion mẹ (ESI+) và các phân mảnh con đặc trưng của VDF (b) phổ đồ minh họa

thế cone, (c) năng lượng va đập và (d) cường độ tín hiệu của phân mảnh ion mảnh con đặc trưng m/z 151.05 34

Hình 3.3 (a) Kết quả auto- tune bằng công cụ Intelligent Stat để tìm ion mẹ (ESI+) và các phân mảnh con đặc trưng của TDF (b) phổ đồ minh họa thế cone, (c) năng lượng va đập và (d) cường độ tín hiệu của mảnh con đặc trưng m/z 268.01 36

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra manual-tune tìm ion mẹ (ESI+) của TDF (m/z 390) và phân mảnh con đặc trưng m/z 262 và 135 37

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra manual-tune tìm ion mẹ (ESI+) của SDF (m/z 475) và phân mảnh con đặc trưng m/z 99.8 38

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra manual-tune tìm ion mẹ (ESI+) của VDF (m/z 489.1) và phân mảnh con đặc trưng m/z 151.0 38

Hình 3.7 (a) Phổ đồ MS1 của hỗn hợp chuẩn TDF, SDF, VDF (150 ppb)

(b) phổ Daughter scan của TDF, SDF, VDF ở nồng độ 150 ppb

trong dung môi ở điều kiện khối phổ tối ưu 39

Hình 3.8 Phổ Daughter scan của mẫu trắng giả lập thêm chuẩn SDF 100 ppb pha trong MeOH, ACN, ACN+ acid formic 0,1% ở điều kiện khối phổ tối ưu 41

Hình 3.9 (a) Phổ đồ MS1 và MS2 full-scan mẫu hỗn hợp chuẩn trong placebo,

(b) Phổ Daughter scan của TDF, SDF, VDF ở nồng độ 150 ppb trong mẫu

placebo điều kiện khối phổ tối ưu và quy trình chiết thích hợp 42

Hình 3.11 Phổ Daughters scan minh họa tính đặc hiệu của SDF (a) mẫu placebo, (b) SDF 50 ppb và (c) SDF 100 ppb trong placebo 44

Hình 3.13 Phổ Daughters scan minh họa tính đặc hiệu của TDF

trong mẫu placebo ở nồng độ 150ppb 45

Hình 3.14 Phổ Daughters scan minh họa LOD của VDF ở nồng độ 0.008 ppb

trong mẫu placebo 46

Hình 3.16 Phổ Daughters scan của mẫu M29-TTSN và M34-BTND 48

Hình 4.1 Các phân mảnh con trong đặc trưng cho phân tích định tính TDF bằng kỹ thuật MS/MS từ thư viện phổ Châu âu [56] 51

Hình 4.2 Các phân mảnh con trong đặc trưng cho phân tích định tính SDF bằng kỹ thuật MS/MS từ thư viện phổ chuẩn châu Âu [56] 51

Hình 4.3 Các phân mảnh con trong đặc trưng cho phân tích định tính VDF bằng kỹ thuật MS/MS từ thư viện phổ chuẩn châu Âu [56] 52

Hình 4.4 Biện giải cấu trúc các phân mảnh con của TDF 57

Hình 4.5 Biện giải cấu trúc các phân mảnh con của SDF 58

Hình 4.6 Biện giải cấu trúc các phân mảnh con của VDF 59

…Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết mẫu 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sức khỏe là một tài sản vô giá của con người, khi xã hội ngày càng

phát triển thì nhu cầu về bảo vệ và nâng cao sức khỏe càng được quan tâm

hơn Chính vì thế các thực phẩm chức năng ngày càng có cơ hội để phát triển Ngoài các thực phẩm chức năng có nguồn gốc sinh học

và bán tổng hợp thì các thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược có ưu

thế phát triển hơn cả vì tính hiệu quả và an toàn đã được chứng minh

Nắm bắt xu hướng đó, các cơ sở sản xuất thực phẩm chức năng đã đưa

ra thị trường rất nhiều mặt hàng đáp ứng nhu cầu thị hiếu của người tiêu

dùng Tuy nhiên vì mục đích thu lợi nhuận cao, giảm nhanh triệu chứng một

số nhà sản xuất, cơ sở khám chữa bệnh không chân chính đã ngụy tạo các

hoạt chất tân dược như: glucocorticoid điều trị viêm thấp khớp, các hoạt chất

điều trị tiểu đường, cao huyết áp, hoạt chất điều trị rối loạn cương

dương… vào thực phẩm chức năng nhằm đánh lừa người tiêu dùng về hiệu

quả điều trị lúc đầu nhưng để lại nhiều biến chứng và tác dụng phụ nguy

hiểm đến tính mạng khi sử dụng thời gian lâu dài , tạo ra những gánh nặng

to lớn cho người bệnh và ngành y tế [6], [7]

Việc ngụy tạo các hoạt chất có tác dụng điều trị rối loạn cương dương

(sildenafil, taladafil, verdanafil) vào chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng ngày càng phổ biến, tinh vi và khó phát hiện do đặc điểm các nền mẫu đông dược và thực phẩm chức năng này phần lớn là chiết xuất của

hỗn hợp nhiều chất phức tạp từ cây thực vật, hàm lượng hoạt chất ngụy tạo thấp

và nhiều loại khác nhau nên việc phát hiện sự ngụy tạo này gặp nhiều khó khăn

Chỉ có một vài nghiên cứu định tính bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng [8], định

lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò Uv-Vis [9]

Do đó, việc xây dựng một phương pháp phân tích có thể áp dụng phát

hiện nhanh, chính xác, đặc hiệu, nhạy và đồng thời các hoạt chất sildenafil,

taladafil, verdanafil điều trị rối loạn cương dương ngụy tạo vào chế phẩm

đông dược, thực phẩm chức năng là một yêu cầu hết sức cần thiết Vì thế,

thúc đẩy việc nghiên cứu tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương

pháp định tính nhanh tadalafil, sildenafil và vardenafil ngụy tạo trong thực

phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương bằng kỹ thuật khối

phổ”

Với các mục tiêu :

1 Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện đồng thời tadalafil, sildenafil,

vardenafil ngụy tạo trong thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn

cương dương bằng phương pháp khối phổ theo hứng dẫn của EC-657/2002

2 Ứng dụng qui trình đã thẩm định để phát hiện đồng thời tadalafil,

sildenafil và vardenafil có thể ngụy tạo trên 40 mẫu thực phẩm chức năng

hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương lưu hành trên thị trường TP Cần Thơ

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về rối loạn cương dương

Rối loạn cương dương là một rối loạn chức năng tình dục ở nam giới, là tình trạng dương vật không cương cứng lên được hoặc không đủ cương cứng

để thực hiện quá trình giao hợp

Rối loạn cương dương là một bệnh lý xảy ra ở nam giới xuất hiện từ ngàn đời xưa và đang ngày càng phổ biến hiện nay Bệnh lý này không phải là một bệnh quá nguy hiểm ảnh hưởng tới sức khỏe, tính mạng của nam giới, tuy nhiên

nó ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cuộc sống cũng như bản lĩnh và niềm tin của người đàn ông

Theo một vài nghiên cứu cho thấy rối loạn cương dương có thể xuất hiện

ở khoảng 50% nam giới từ 40 đến 70 tuổi Người ta cũng ước tính khoảng 150 triệu nam giới trên toàn thế giới có rối loạn cương dương Nam giới tuổi dưới

40 bị rối loạn cương dương khoảng 40%

Tại Việt Nam, tình trạng rối loạn cương dương ngày càng phổ biến và ngày càng có xu hướng trẻ hóa, nam giới ở độ tuổi 18-20 cũng có nguy cơ mắc bệnh thậm chí còn có chiều hướng gia tăng mạnh

1.2 Tổng quan về các chất ức chế PDE-5 nghiên cứu

Các chất ức chế PDE-5 được khuyến cáo điều trị đầu tay cho rối loạn cương dương Tuy nhiên, không nên sử dụng các chất này ở nam giới đang có triệu bệnh lí suy tim nặng, đau thắt ngực không ổn định, có tiền sử đột quỵ, nhồi máu cơ tim hoặc những người có huyết thấp (<90/50mmHg), suy gan nặng Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc ức chế PDE-5:

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế

phosphodiesterase-5 (PDE-5) Sau giai đoạn kích thích tình dục, làm tăng sản sinh nitric oxide (NO) từ

tế bào thần kinh hoặc tế bào nội mô mạch máu Điều này làm tăng quá trình chuyển hóa guanosine triphosphate (GTP) thành cyclic guanosine monophosphate (cGMP), làm giãn các mạch máu ở thể hang, tạo điều kiện cho quá trình cương cứng PDE-5 là một enzyme phân hủy cGMP, vì vậy các chất

ức chế PDE-5 sẽ ngăn cản quá trình thủy phân cGMP, làm tăng tác dụng giãn mạch của NO, làm tăng cường khả năng cương dương cho các bệnh nhân bị rối loạn cương dương

1.1.1 Tác dụng dược lý

Sildenafil, tadalafil và vardenafil là 3 hoạt chất có khả năng ức chế

PDE-5 nên được sử dụng để điều trị rối loạn cương dương Ngoài ra, sildenafil và tadalafil còn được sử dụng để cải thiện khả năng vận động ở người trưởng thành khi có triệu chứng tăng huyết áp động mạch phổi (pulmonary arterial hypertension – PAH: áp lực máu cao trong mạch máu đến phổi và gây ra khó

Kích thích tình dục

Nitric oxide

GTP Guanylyl cyclase

Protein

Protein

cGMP PDE-5

5‟-GMP

kinase G

Protein P Giảm Ca 2+

Giãn mạch máu thể hang Chất ức chế PDE-5

thở, chóng mặt, mệt mỏi) Sildenafil và tadalafil điều trị chứng PAH bằng

cách giãn mạch phổi và giúp máu lưu thông dễ dàng hơn

Dù ba chất này có cùng cơ chế hoạt động, nhưng do sự khác biệt về cấu

trúc phân tử (sildenafil và vardenafil có cấu hóa học tương đối giống nhau

nhưng tadalafil lại rất khác) dẫn đến sự khác nhau về dược động học và hiệu

quả lâm sàng Tadalafil có thời gian tác dụng kéo dài hơn, ít tác dụng phụ hơn

và quá trình hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Ba chất này thuộc chung

nhóm chất gọi là nhóm chất ức chế phosphodiesterase (PDE), có nhiều tác dụng

phụ và là những thuốc phải kê đơn và khi sử dụng phải được sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ điều trị

1.1.2 Tính chất lý hóa

Tadalafil [20], [23]

Tên khoa học:

(6R-12αR)-6-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2,3,6,7,12,12α-hexahydro-2- methyl-pyrazino [1‟,2‟:1,6] pyridol[3,4-b]indole-1,4-dione

pKa = 0,85

Công thức: C22H19N3O4

Phân tử lượng: 389,404 g/mol

Tính chất: Bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong nước, tan không đáng kể

trong methanol, acetone và ethanol, tan tốt trong acetonitrile

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của tadalafil

Phân tử lượng: 474,6 g/mol

Tính chất : bột kết tinh trắng đến trắng xám nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nước và ethanol, tồn tại dưới dạng muối với acid citric

Phân tử lượng: 488,604 g/mol

Tính chất : bột kết tinh màu trắng đến trắng nhạt, không mùi, vị đắng, tan trong nước và ethanol, tồn tại dưới dạng muối hydroclorid

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của vardenafil 1.1.3 Các nghiên cứu phân tích sildenafil, tadalafil và vardenafil

Trên thế giới: đã có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện các chất sildenafil,

vardenafl, tadalafil và các chất có cấu trúc tương tự Phương pháp phổ biến nhất

để phân tích sildenafil, tadalafil, vardenafil và các hợp chất ức chế PDE-5 tương

tự là sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò dãy diod quang [22], [29],

[40] hoặc đầu dò khối phổ [20],[21],[23], [30]

Tại Việt Nam: hiện nay chưa có quy trình định tính, định lượng các hoạt

chất ngụy tạo nhóm PDE-5 này trong chế phẩm thực phẩm chức năng, đông dược trong các tài liệu chính thống như TCVN, DĐVN 5 [4] Chỉ có một số nghiên cứu phân tích các thành phần này bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [8], sắc ký lỏng ghép nối đầu dò UV [10] cho độ nhạy, tin cậy thấp

hơn phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ Các nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích các chất ức chế PDE-5

30‟ , sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm

Viên nén

Viên

nang

UPLC- MS/MS

Cột C18 (2,1 mm × 100

mm, 1,7 μm) Pha động:

✓ Kênh A: amonium acetat 10mM/H2O

✓ Kênh B: ACN/MeOH (50:50)

Tốc độ 0,550 ml/phút

Thể tích bơm 5 µL

Cân 0,5 g mẫu Chiết bằng MeOH:H2O (50:50), siêu âm trong

20‟ , ly tâm

3000 vòng/phút trong

10 phút, sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm

[26]

Cột C18 (2,1 mm × 100

mm, 2,6 μm) Pha động:

✓ Kênh A: 10 mM NH4OH và 0,1% FA/

H2O

✓ Kênh B:10 mM NH4OFor và 0,1% FA/

ACN:MeOH (50:50) Tốc độ dòng 0,3 ml/phút

Thể tích bơm 3 µL

Cân 1,0 g mẫu Chiết bằng ACN:H2O, lắc, votex trong 15‟ , ly

tâm > 3000 vòng/phút trong 5 phút, pha loãng

đến nồng độ thích hợp, sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm

0,1%/H2O

Tốc độ dòng 0,4 ml/phút Thể tích bơm 1 µL

Cân khoảng 1 đơn vị mẫu Chiết bằng ACN:H2O (50:50), siêu âm 15‟ , sau

đó lọc qua màng 0,2 µm

Cột C18 (5 μm) Pha động:

acetat 20mM và acid formic 0,1%/H2O

Tốc độ dòng 0,2 ml/phút

Thể tích bơm 5 µL

Mẫu lỏng lọc qua màng 0,45 µm

Pha loãng dịch lọc với MeOH đến nồng

và chính xác cao

Do đó, nghiên cứu của đề tài được thực hiện thành công sẽ là một quy trình định tính có tính mới và góp phần cung cấp quy trình phát hiện nhanh,

đồng thời, tin cậy các hoạt chất điều trị RLCD ngụy tạo trong mẫu thực

phẩm chức năng và đông dược, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm

và sức khỏe người tiêu dùng

1.1.4 Tác dụng phụ và độc tính của thuốc trị rối loạn cương dương

Bệnh nhân không được uống chất ức chế men PDE-5 nếu đang sử dụng

thuốc nitrat làm giãn mạch vành tim, do tác động giãn mạch hiệp đồng Bệnh

nhân có bệnh mạch vành ổn định có thể sử dụng chúng an toàn Bệnh nhân suy

gan, suy thận, trên 65 tuổi hay đang dùng những thuốc ức chế men P450 3A4

như cimetidin, erythromycin và ketoconazol phải khởi đầu uống sildenafil,

vardenafil, tadanafil ở liều thấp rồi tăng liều từ từ để đạt hiệu quả cương cứng

mong muốn [ 7], [34].

Người lớn tuổi bị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và đang được điều trị

bằng thuốc ức chế chọn lọc alpha nếu dùng thêm các thuốc ức chế men PDE5

để trị cương yếu thì cần thận trọng (thận trọng chứ không cấm như với thuốc

nitrat) vì uống cùng lúc hai thuốc này có thể làm huyết áp giảm

Tác dụng phụ thường gặp khi sử dụng các thuốc ức chế PDE 5:

Hay gặp nhất là mặt đỏ phừng phừng do giãn mạch máu ở mặt, như mới

uống rượu hay như người mới ra nắng Tiếp đến là nhức đầu do giãn mạch máu

ở não Khi đó, nếu uống paracetamol có thể giúp đỡ nhức đầu

Mắt nhìn xanh loe lóe là một tác dụng phụ khác của thuốc, do chúng tác

động lên men PDE5 tại võng mạc nhưng nếu dùng thuốc vào buổi tối, sáng ra

thuốc tan hết, mắt chẳng hề ghi nhận thay đổi nào Khoảng 20-30% bệnh nhân

dùng thuốc ức chế men PDE5 bị một trong các tác dụng phụ trên

Người bệnh tăng huyết áp vẫn uống các thuốc trị rối loạn cương được nếu

huyết áp được duy trì ổn định và tim bệnh nhân đủ mạnh (chẳng hạn đi bộ 2-3

tầng không nghỉ) Tốt nhất nên uống thuốc ức chế men PDE5 cách thuốc hạ huyết áp vài giờ Điểm cần lưu ý là nếu bệnh nhân đang uống thuốc làm giãn mạch vành tim do mạch máu tim bị hẹp (rất hay phối hợp cùng với thuốc điều trị tăng huyết áp), nhất là những thuốc có nitrate, thì đừng uống thuốc ức chế men PDE5, do uống chung hai thuốc này có thể khiến huyết áp hạ quá nhanh, làm bệnh nhân lơ mơ, ngất, rồi tử vong do bệnh nhân gặp các bệnh tim mạch: nhồi máu cơ tim cấp, tai biến mạch máu nặng, hạ huyết áp đột ngột [9]

Năm 2005, thế giới ghi nhận có bệnh nhân phát hiện ra là mình bị mù sau khi uống sildenafil, vardenafil, tadanafil Tuy nhiên, sau khi truy cứu, các bác

sĩ nhận thấy những người bị mù thường chỉ mù một mắt, có thể bớt dần dần (mắt sáng trở lại) do dây thần kinh thị giác bị thiếu máu Đây là bệnh vẫn thỉnh thoảng gặp ở những người bị đái tháo đường, tăng huyết áp

Do vậy, các bác sĩ đã kết luận những người uống thuốc trị cương dương

mà bị mù chỉ là chuyện trùng hợp Để thận trọng, những người bị đái tháo đường, tăng huyết áp nếu có bị rối loạn cương thì nên khám mắt trước khi dùng thuốc

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương tại Việt Nam

Cùng với sự phát triển của thị trường thực phẩm chức năng, những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên được giới thiệu với tác dụng tăng cường sinh

lý nam giới cũng tăng trưởng mạnh mẽ cả về số lượng mặt hàng và giá trị, tuy nhiên kèm theo đó cũng là sự gia tăng của những báo cáo phát hiện việc trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 Ở Hàn Quốc [27], một nghiên cứu tiến hành trong 4 năm (2009-2012) trên 164 mẫu thực phẩm chức năng được quảng cáo tăng cường sinh lý nam giới cho thấy 77 mẫu phát hiện có chứa chất ức chế PDE-5 gồm có 55 mẫu phát hiện tadalafil, 36 mẫu phát hiện sildenafil, 17 mẫu

phát hiện tadalafil và đồng phân (aminotadalafil, chloropretadalafil, octylnortadalafil [24]

Năm 2010 Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số 160⁄QĐ-ATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số 16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Khải Việt Hương cảng Canh Công Phu” Nguyên nhân là vì sản phẩm này có chứa hoạt chất sildenafil hàm lượng 4 mg/g, dù được quảng cáo trên mạng là “100% từ thảo dược…”

Năm 2014, Cục an toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo New của Công ty TNHH Thương mại Dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) và sildenafil (123 mg/viên) Và gần đây nhất là sản phẩm “Thận lực phiến” của công ty cổ phẩn Dược phẩm Khang Đạt, cục an toàn thực phẩm đã phát hiện trong sản phẩm này chứa sildenafil với hàm lượng 18,18mg/viên

Năm 2016, Cục an toàn thực phẩm, Bộ Y tế vừa cho dừng lưu thông lô sản phẩm thực phẩm chức năng (TPCN) bảo vệ sức khỏe Uy Mãnh Nang, số lô

0116, NSX:20/01/2016, HSD: 19/01/2019 của Công ty TNHH XNK

Thiết bị y tế Minh Bang Việt Nam (số 709 Giải Phóng, Giáp Bát, Hoàng Mai, Hà Nội) do có chứa chất cấm sildenafil Đồng thời, yêu cầu thu hồi các sản phẩm vi phạm này Xử phạt Công ty TNHH SXTM và DV Tinh Tấn ở quận Tân Bình, TPHCM vì nhập khẩu, bán ra thị trường lô sản phẩm TPCN viên Happygra có chứa chất sildenafil và kinh doanh lô sản phẩm TPCN viên Happygra vi phạm quy định về ghi nhãn hàng hóa với mức phạt 62 triệu đồng [8]

TPCN là mặt hàng bán không cần kê đơn, không kiểm soát được hàm lượng

Vì thế nếu sử dụng quá liều vardenafil sẽ vô cùng nguy hại, nhất là người bệnh tim mạch, có nguy cơ làm tăng nhịp tim, tăng lượng máu đến các cơ quan khác Gần đây, sản phẩm “Avena plus” của công ty TNHH MTV đầu tư và thương mại xuất nhập khẩu Việt Nam Canoves đã bị Viện kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia phát hiện có chứa sildenafil và cục An toàn thực phẩm đã ra quyết định tạm dừng lưu thông, thu hồi lô sản phẩm trên Ngày 3/ 10 / 2017 lực lượng PC49 đã phối hợp với Đội chống hàng giả (Chi cục Quản lý thị trường TP Cần Thơ) kiểm tra một công ty dược phẩm ở đường Nguyễn Văn Cừ nối dài (phường An Bình) Tại đây, cảnh sát tiếp tục phát hiện 24 loại thực phẩm chức năng, trong đó có nhóm hỗ trợ điều trị RLCD

và các thuốc tân dược khác với số lượng 98.450 viên và 111 chai không có hóa đơn, chứng từ chứng minh nguồn gốc, xuất xứ

Chiều 13-12-2017, Phòng Cảnh sát môi trường Công an TP Cần Thơ cho biết: Qua công tác nắm tình hình và nguồn tin của người dân, Phòng Cảnh sát môi trường cùng Phòng An ninh kinh tế phát hiện tại một căn nhà thuộc khu nhà trọ A.N (đường 3 Tháng 2, phường Hưng Lợi, quận Ninh Kiều) thường xuyên kinh doanh, buôn bán TPCN không rõ nguồn gốc, không đảm bảo chất lượng an toàn cho người sử dụng Cùng với hoạt chất sildenafil, cơ quan chức năng còn phát hiện cả hoạt chất vardenafil, một tân dược bị cấm nhưng vẫn được các cơ sở lén lút sử dụng trong một số loại thực phẩm chức năng

Qua thực trạng sử dụng TPCN hiện nay cho thấy vấn đề về sản xuất, trộn trái phép thuốc tân dược (glucocorticoid, thuốc điều trị RLCD, Hạ đường huyết,…) và quản lí TPCN ngày càng mang tính thời sự và cấp bách hơn bao giờ hết

1.3 Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực

1.3.1 Nguyên lý

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Với phương pháp phổ khối lượng, người ta “phá hủy” các phân tử để nghiên cứu Các hợp chất được đưa vào thiết

bị tạo ra một phổ khối đặc trưng, có thể được sử dụng để nhận dạng hoặc xác định cấu trúc Máy phổ khối lượng được chế tạo với ba nhiệm vụ cơ bản là : Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (làm bay hơi mẫu nghiên cứu ở áp suất thấp và ở nhiệt độ thích hợp) Tạo ra các ion từ các phân tử khí đó

Cuối cùng là phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng/điện tích (m/z e) của chúng Bởi vì xác xuất tạo thành các ion có z >1 là rất nhỏ và vì e = const (e là điện tích của một electron) do đó thông thường m/ze chính là khối lượng của ion [8], [23], [41]

1.3.2 Cấu tạo

Hình 1.5 Cấu tạo khối phổ

Nguồn ion hóa

Bộ phận phát hiện

Bộ phân tích khối

Bộ nạp mẫu (inlet): Chuyển các chất cần phân tích vào nguồn ion hóa của

thiết bị khối phổ

Nguồn ion hóa (ion source): Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân

tử mang điện tích hoặc bắn phá, phân mảnh các phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS Mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định

Tỷ số m/z là thông số quan trọng trong định tính và định lượng Các yếu

tố chính ảnh hưởng đến việc lựa chọn kiểu ion hóa là độ phân cực, khối lượng phân tử và độ bền nhiệt của chất cần phân tích.Nếu chọn một kiểu ion hóa không phù hợp sẽ không ghi được phổ, hoặc phổ kém chất lượng

Phần lớn các mẫu sẽ được phân tích lần đầu để ghi phổ ion dương, tuy nhiên, phổ ion âm sẽ có ích khi các phân tử tích điện âm bền vững hơn phân tử tích điện dương tương ứng và có thể cung cấp thông tin cấu trúc bổ trợ nhờ vào các quá trình phân mảnh khác nhau Nhìn chung, quá trình ion hóa mạnh, như ion hóa electron, có thể tạo ra nhiều ion phân mảnh và có thể tín hiệu của mảnh phân tử thấp; quá trình ion hóa yếu hơn, như ion hóa phun mù, tạo ra ít phân mảnh với cường độ mảnh phân tử cao

Đặc điểm nguồn ion hóa ESI: Có khả năng ion hóa bất kỳ hợp chất có tính bazơ (ở thể khí) để nhận một proton hoặc một cation khác (kiểu ion hóa dương) hoặc tính acid để mất một proton (kiểu ion hóa âm) Cơ chế tạo thành ion dương

do sự gắn thêm cation (H+, Na+, NH4+,…), tạo thành ion âm do mất proton hoặc gắn thêm các anion Vì vậy sẽ tạo thành các ion dương đặc trưng là [M+H]+, [M+Na]+, [M+nH]n+, còn các ion âm đặc trưng là [M-H]-, [M+X]- Quá trình phân mảnh với năng lượng thấp, cho ít phân mảnh Để phân mảnh nhiều hơn, người ta dùng MS/MS hoặc có thể tăng điện thế nguồn Mẫu cần được hòa tan trong một dung môi thích hợp Dung môi điển hình là nước trong dung môi hữu

cơ, có thể thêm chất phụ hoặc chất điện ly (như acid formic, amoni acetat,…)

[26 ]

Bộ phân tích khối (mass analyzer): Các ion tạo thành được gia tốc và tách

riêng theo tỉ số m/z nhờ tác dụng của từ trường, điện trường đi đến bộ phận

phát hiện

Bộ phận phát hiện ion (detector): chuyển các ion đến đầu dò, khuếch đại

thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của khối phổ

Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system)

Người phân tích cần lựa chọn cách đưa mẫu, nguồn ion hóa và bộ phận

phân tích phù hợp, xác định dựa trên tính chất của mẫu phân tích

Việc lựa chọn bộ phận ESI hay phân tích khối phụ thuộc vào nhiều yếu tố, được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Tóm tắt cách lựa chọn [44]

Kỹ thuật đưa

Bộ phân tích khối

Yếu tố để

chọn lựa

Bản chất của hợp chất cần phân tích:

tính tan, tính bay hơi, tính bền với nhiệt

Bản chất của hợp chất cần phân tích: tính phân cực, tính tan, tính bền với nhiệt, khối lượng phân tử

Có yêu cầu phân mảnh không

Khoảng khối

Độ phân giải khối Tốc độ quét Giới hạn phát hiện Khoảng phát hiện

Yếu tố

chính ảnh

hưởng

Bản chất của hợp chất cần phân tích:

tính tan, tính bay hơi, tính bền nhiệt Hiệu ứng bộ nhớ

Điện thế áp vào Dung môi sử dụng Các chất thêm vào, chất điều chỉnh

Chuẩn khối

Độ phân giải khối Năng lượng đặt vào

Hàm lượng, nồng

độ của mẫu

1.3.3 Kỹ thuật ghi phổ

Trong phân tích khối phổ, việc xác định chính xác một ion rất quan trọng

cho việc xác định được hợp chất cần phân tích Một hợp chất xác định trong

những điều kiện nhất định sẽ cho một ion có số khối nhất định trên phổ đồ

Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ có thể xuất phát từ nhiều

hợp chất khác nhau

Vì vậy trong phân tích một hỗn hợp hoặc lẫn nhiều tạp chất nếu điều kiện

sắc ký chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số

khối trên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng Lúc này, khối phổ nhiều lần có thể cho

kết quả chính xác hơn khối phổ một lần

Quét phổ toàn phần (full scan): Thao tác với chế độ này, đầu dò sẽ nhận

tất cả các mảnh ion cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá

trình phân tích Thường dùng để định danh hoặc phân tích khi chất có nồng độ

đủ lớn Với đầu dò khối phổ ba lần tứ cực, chế độ full scan MS được lựa chọn

để khảo sát ion mẹ, chế độ full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành,

thường dùng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất [44]

Selected Ion Monitoring (SIM): Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi

nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định SIM chỉ cho

tín hiệu các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không dùng để định danh

hay so với các thư viện có sẵn Với đầu dò khối phổ ba lần tứ cực, SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion

mẹ [10]

Selected Reaction Monitoring (SRM), Multiple Reaction Monitoring

(MRM): là hai kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được dùng SRM dùng

cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh

ra, cô lập một mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập

đó ở tứ cực thứ hai (buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập hai hoặc nhiều ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ ba và đưa vào đầu dò để phát hiện Thực tế, MRM được sử dụng nhiều hơn SRM [18], [45]

Chế độ ion con (daughter mode): chế độ được sử dụng nhiều nhất trong

chế độ MS/MS, xác định một ion đưa vào buồng va đập để tạo các mảnh con,

từ đó xác định cấu trúc Thường dùng trong các trường hợp: phát triển phương pháp cùng với MRM, biện giải cấu trúc (như peptid) [45]

Bộ phân tích khối ba lần tứ cực

Gồm ba tứ cực ghép nối với nhau Tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion phân tử với m/z nhất định để chuyển đến tứ cực thứ 2 (Q2, còn gọi là buồng va chạm) Ở Q2, các ion phân tử chạm với khí trơ có mặt (N2, Ar…) cùng với năng lượng thích hợp phân ly tạo ra tạo ra các ion sản phẩm Sau đó, tất cả các ion sản phẩm được chuyển đến tứ cực thứ 3 (Q3) Q3 có cấu tạo giống Q1, tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện Bộ phân tích khối ba tứ cực có thể thực hiện MS/MS

Hình 1.6 Hệ thống khối phổ ba lần tứ cực

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tadalafil, sildenafil, vardenafil : 3 hoạt chất ngụy tạo trong TPCN

Các mẫu thực phẩm chức năng có tác dụng bổ thận, tráng dương, tăng cường sinh lý nam giới đang lưu thông trên thị trường TP Cần Thơ

2.1.2.Tiêu chuẩn chọn mẫu

Mẫu cho nghiên cứu xây dựng thẩm định qui trình định tính (mẫu trắng

giả lập): Mẫu TPCN có tác dụng bổ thận, tráng dương, tăng cường sinh lý nam

giới với thành phần cây thuốc đại diện nhất, lưu hành hợp pháp được cấp phép

bởi cục ATVSTP

Mẫu cho ứng dụng quy trình phân tích: mẫu thực phẩm chức năng có tác

dụng bổ thận, tráng dương, tăng cường sinh lý nam giới đang lưu hành trên địa

bàn TP Cần Thơ

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Mẫu cho nghiên cứu phát triển phương pháp: Mẫu TPCN không có số

đăng ký lưu hành cấp bởi phép bởi cục ATVSTP

Các mẫu TPCN bị ẩm móc, hư hỏng trong quá trình bảo quản trước khi

tiến hành thực nghiệm

2.1.4 Địa điểm - thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: liên bộ môn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất,

Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

Thời gian nghiên cứu: 08/2018 – 08/2019

2.2 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn - trang thiết bị

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn

Bảng 2.1 Dung môi- hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

Chất chuẩn đối chiếu

- Sildenafil citrat: hàm lượng 98,35%, nguyên trạng, CAS number

WS.0214265.02, bảo quản 2 – 80C tránh ánh sáng, được cung cấp bởi Viện

kiểm nghiệm thuốc Trung ương

- Tadalafil: hàm lượng 97,65%, nguyên trạng, CAS number WS.0215264.02, bảo quản 2-80C tránh ánh sáng , được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc

2.2.2 Trang thiết bị – dụng cụ

1 Hệ thống khối phổ Waters Xevo TQD

3 Cân phân tích OHAUS Explorer Pro, d = 0.1mg, max

4 Cân hồng ngoại AND MX – 50 d = 0.01%g, max 51g Nhật

7 Máy cô quay chân không Hei – VAP Value của

9 Micropipette Efpendorf 1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl Đức

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm

2.3.2.Cỡ mẫu

Mẫu nghiên cứu xây dựng quy trình định tính nhanh: 52 mẫu

Mẫu thực phẩn chức năng và đông dược ứng dụng quy trình định tính để phát hiện sự ngụy tạo thu thập là 40, mỗi mẫu phân tích 3 lần, số mẫu đã phân tích cho ứng dụng là 120

40 mẫu chế phẩm thuốc từ dược liệu và thực phẩm chức năng từ dược liệu điều trị (hoặc hỗ trợ điều trị) điều trị RLCD được thu thập trên thị trường, được mã hóa và trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Bốn mươi mẫu thực phẩm chức năng thu thập tại TP Cần Thơ

Quận Ninh Kiều

Quận Cái Răng

Hongkong

2.3.3 Phương pháp chọn mẫu

Mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng được lấy mẫu và mua

mẫu ngẫu nhiên tại các cơ sở sản xuất, kinh doanh thuốc trên địa bàn thành phố Cần Thơ

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Masslynx 4.1 Các công thức cấu tạo

được vẽ và xác định cấu trúc bằng phần mềm CS Chemdraw drawing Pro

12.0.2

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1.Chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn gốc: Với mỗi chất sildenafil, tadalafil, vardenafil, tiến hành cân chính xác khoảng 10,0 mg chất chuẩn, hòa tan bằng ACN và định mức trong bình định mức 10,00 ml được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 ppm Bảo quản ở nhiệt độ 0oC đến khi dùng

Dung dịch hỗn hợp chuẩn làm việc: từ dung dịch chuẩn gốc, pha các mẫu chuẩn có nồng độ các chất phân tích từ 1-500 ppb bằng cách pha loãng với dung môi pha mẫu đến nồng độ phù hợp Dung dịch hỗn hợp chuẩn làm việc được bảo quản ở 00C đến khi dùng

Mẫu trắng giả lập: Do nền mẫu là thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược nên thành phần nền mẫu của các sản phẩm rất đa dạng Vì vậy trong

đề tài này chúng tôi khảo sát thành phần nền mẫu của 10 mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, sau đó chọn nền mẫu có tính đại diện nhất và không chứa các chất sildenafil, tadalafil và vardenafil làm mẫu placebo Sau đó tiến hành chiết theo quy trình chiết

Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn của TDF, SDF, VDF được thêm

vào mẫu trắng giả lập ở nồng độ thích hợp (1-500ppb) để xây dựng và thẩm định phương pháp

Mẫu thử: 40 mẫu thực phẩm chức năng có tác dụng bổ thận, tráng dương,

tăng cường sinh lý nam giới đang lưu thông trên thị trường TP Cần Thơ Mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu thực được xử lý theo quy trình chiết mẫu thích hợp

2.4.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu tín hiệu SDF, TDF và VDF

Thăm dò điều kiện từng chất chuẩn riêng lẻ để thu được ion mẹ và phân mảnh con có cường độ tín hiệu tối ưu, rồi tìm điều kiện phân tích chung cho hỗn hợp các chất

Các thông số khối phổ cần khảo sát:

- Kiểu ion hóa ESI: dương (ES+) hay âm (ES-)

- Thế mao quản (capillary voltage): 2 – 4,5 kV

- Thế cone (cone voltage): 10 – 80 V

- Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time): 0,1 – 0,5 giây

- Năng lượng va chạm (collision cell energy): 10 – 40 eV

- Tốc độ dòng khí phun (nebulizer gas flow)

- Nhiệt độ khí bay hơi (desolvation temp): 100 – 500°C

- Tốc độ dòng khí bay hơi (desolvation gas flow): 50 - 1000 L/giờ

- Xác định ion mẹ: bằng chế độ fullscan

- Xác định ion phân mảnh: chế độ MS/MS scan Khảo sát lần lượt các ion mẹ được chọn cho ra các phân mảnh và chọn phân mảnh đặc trưng (daughter scan)

Khảo sát dung môi pha mẫu: Thay đổi lần lượt các hệ dung môi: methanol, acetonitril, methanol-nước, acetonitril-nước Nếu kết quả là hỗn hợp acetonitrile-nước hoặc methanol-nước, tiếp tục khảo sát từng tỉ lệ 1:9, 2:8, 3:7, 4:6 của hỗn hợp

Khảo sát ảnh hưởng pH của dung môi pha để tăng khả năng phân ly, dự kiến chọn acid formic làm chất điều chỉnh pH cho khảo sát Tiến hành thêm vào dung môi pha mẫu acid formic 0,1% và tiến hành khảo sát các ion mẹ, ion phân mảnh đặc trưng ở cả hai nguồn ion hóa ESI+ và ESI-

Khảo sát các thông số khối phổ

Dựa vào bảng đặc trưng khối phổ của một số chất ức chế PDE-5 đã được hội đồng Dược điển Mỹ công bố ở bảng 2.3 đồng thời trên cơ sở tham khảo một số các nghiên cứu đã công bố quá trình phân mảnh của các chất ức chế PDE-5 [26]

Bảng 2.3 Đặc trưng khối phổ của các chất ức chế PDE-5

standard C22H19N3O4 389.12 390.15 268, 240, 169 Vardenafil

2.4.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp

Nhằm chứng minh tính đặc hiệu của phương pháp với mẫu thử giả lập thì qui trình chiết sẽ loại tạp không làm ảnh hưởng đến các pic sildenafil, tadalafil, vardenafil tìm thấy Quá trình chiết này đảm bảo chiết được nhiều nhất các chất phân tích trong mẫu, phương pháp chiết phải đơn giản, dễ thực hiện, thời gian ngắn

Khảo sát qui trình chiết thích hợp: Các dung môi, hệ dung môi có thể hòa tan tốt và tăng khả năng ion hóa của các chất phân tích dự kiến khảo sát: methanol, acetonitrile, methanol-nước, acetonitrile-nước, acetonitrile-nước hoặc methanol- nước, MeOH + 0.1% acid formic, MeOH – nước + 0.1% acid formic, ACN – nước + 0.1% acid formic

Thăm dò quy trình chiết SDF, TDF, VDF từ các chế phẩm

Lọc qua màng lọc 0,22µm, tiêm trực tiếp vào đầu dò MS/MS

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết mẫu

2.4.4.Thẩm định quy trình định tính

Theo hướng dẫn của EC-657/2002 [54], để xác nhận một chất bằng kỹ thuật khối phổ 3 lần tứ cực cần phải tìm được ion ban đầu và ít nhất 03 phân mảnh đặc trưng của ion này, được biện giải phù hợp cấu trúc hay so với thư viện phổ chuẩn đã được công bố Sau khi tìm ra điều kiện khối phổ tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình định tính theo hướng dẫn của AOAC [16] bao gồm: khảo sát tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện

hệ thống bao gồm chứng minh độ phân giải phù hợp với các điều kiện chấp thuận

Độ đúng khối được minh chứng bao gồm trong phép thử tính tương thích

hệ thống của quy trình hoặc là một phần của thẩm định hiệu năng thiết bị Độ đúng khối hoặc được chấp nhận ở mức ±0.5 đơn vị khối với các ion đơn điện tích từ một chuẩn biết trước là đủ cho hầu hết các ứng dụng Nếu độ đúng khối được yêu cầu cao hơn cho quy trình, các điều kiện phù hợp là đặc trưng [41]

2.4.4.2 Độ đặc hiệu, tính chọn lọc

Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến phân tích nhiều chất trong cùng một quy trình Tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu do các phương pháp phân tích thường có nhiều chất cùng xuất hiện, nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

Thực hiện phân tích trên các mẫu dung môi, mẫu trắng, mẫu hỗn hợp chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn lần hai Yêu cầu mẫu dung môi, mẫu trắng không cho tín hiệu của chất phân tích, mẫu trắng thêm chuẩn cho các mảnh đặc trưng của chất phân tích ở các kiểu quét MS, MS/MS

và daughter giống mẫu hỗn hợp chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn lần hai có các mảnh đặc trưng với cường độ tín hiệu tăng lên rõ rệt so với mẫu trắng thêm chuẩn

2.4.4.3 Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp có thể định tính được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tín hiệu chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu nền

Phương pháp: pha loãng nồng độ chất phân tích

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền LOD được chấp nhận tại nồng độ mà S/N=3

Thực hiện: Khảo sát trên mẫu chuẩn và mẫu giả lập thêm chuẩn ở những nồng độ khác nhau ở điều kiện tìm được Bắt đầu với nồng độ cao rồi pha loãng dần Giới hạn phát hiện được xác lập tại nồng độ tín hiệu của mảnh mẹ và mảnh con phát hiện được và phân biệt với đường nền (tỉ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) bằng 3) LOD cần nhỏ hơn so với liều 1 lần của các chất ức chế PDE 5

2.4.5 Áp dụng qui trình định tính đã thẩm định để định tính nhanh và đồng thời SDF, TDF, VDF trong TPCN hỗ trợ điều trị RLCD thu thập tại

TP Cần thơ

Áp dụng qui trình định lượng đã thẩm định để phát hiện SDF, TDF và

VDF có thể có trong 40 mẫu chế phẩm đông dược