Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và khảo sát độ ổn định của viên nén bao phim thực phẩm chức năng chứa cao chiết lá sầu đâu ăn lá (azadirachta indica a juss)

TRẦN NGỌC DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM VÀ KHẢO SÁT ĐÔ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NÉN BAO PHIM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA CAO CHIẾT LÁ SẦU ĐÂU ĂN LÁ Azadirachta indica A.Juss LUẬ

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng

Viên nén bao phim thực phẩm chức năng chứa cao lá Sầu đâu ăn lá tại An Giang (VNSĐ) đƣợc sản xuất tại liên bộ môn Bào chế - Công nghiệp dƣợc, khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Thành phần công thức của viên nén thể hiện nhƣ sau:

Cao đặc lá Sầu đâu 155 mg

Tá dƣợc hút X, Ditab, PVP K30, Magiestearat, Aerosil, MgCO3, tá dƣợc Y vừa đủ 396,6 mg cho 1 viên

Hình 2.1.Viên nén bao phim chứa cao lá Sầu đâu 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Viên nén bao phim thực phẩm chức năng có chứa cao lá Sầu đâu ăn lá.Chọn mẫu đại diện cho từng lô sản xuất

Các chế phẩm không đạt yêu cầu về cảm quan

Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Tỉnh Cần Thơ

Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Tỉnh Sóc Trăng.

Phương pháp nghiên cứu

03 lô viên nén chứa cao lá Sầu đâu, mỗi lô 5000 viên

Cỡ mẫu cần thiết cho đề tài thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Số lƣợng mẫu cho mục tiêu của đề tài

Mỗi lô (viên) Tổng 3 lô (viên)

Mục tiêu 1: xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm VNSĐ 125 375

Mục tiêu 2: khảo sát độ ổn định của VNSĐ

2.2.3.Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử - Trang thiết bị

Các hóa chất và trang thiết bị đƣợc sử dụng trong đề tài đƣợc trình bày nhƣ bảng 2.2, 2.3

Bảng 2.2 Danh mục chất chuẩn, hóa chất, dung môi

STT Hóa chất Độ tinh khiết Xuất xứ

3 Nước cất 2 lần Siêu sạch

Bảng 2.3 Danh mục các trang thiết bị

STT Tên thiết bị Hãng Xuất xứ

1 Cân phân tích AND HM202 (5 số) AND Nhật

2 Cân phân tích Precisa XB220A (4 số) PRECISA Thụy SĨ

3 Máy ly tâm REXMED RCT-500 / Đài Loan

4 Bể siêu âm khử khí SONICA 3200

5 Tủ vi khí hậu D02833IDE MEMMERT Đức

6 Máy thử độ rã SOTAX DT3 SOTAX Thụy SĨ

7 Máy lọc nước siêu sạch THERMO Mỹ

8 Buồng soi UV CAMAG Thụy Sĩ

9 Máy HPLC SHIMADZU LC-20AD, đầu dò PDA, cột Phenomenex C18

2.2.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nén TPCN chứa cao lá Sầu đâu Định tính:

P ương p p HPLC: sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic của dung dịch chuẩn

P ương p p sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu, cùng Rf với vết trên sắc ký đồ của dung dịch dịch chuẩn

Bản mỏng: Silica gel G F254, kích thước 5 x 10 cm

Bình khai triển: Bình sắc ký tròn

Khảo sát hệ dung môi khai triển:

Hệ ethyl acetat – acid formic – nước (15:1:1)

Hệ chloroform – methanol – acid formic (5:5:3 giọt)

Dung dịch thử: Lấy 10 mL dịch chiết thu đƣợc ở phần định lƣợng, cô trên cỏch thủy cũn khoảng 1mL sau đú chấm lờn bảng mỏng 20àl

Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 1mL dung dịch chuẩn gốc (ở phần định lƣợng) pha loóng thành 4mL với methanol (TT) Chấm lờn bảng mỏng 20 àl Triển khai trong các hệ dung môi khảo sát Định lượng: Xây dựng quy trình định lƣợng chất đánh dấu rutin trong viên nén chứa cao lá Sầu đâu bằng HPLC bao gồm: khảo sát điều kiện sắc ký, khảo sát quy trình xử lý mẫu và thẩm định quy trình

Khảo s t điều kiện sắc ký:

Dựa trên nghiên cứu điều kiện sắc ký của tác giả Bùi Thanh Ngân Tạo [19] tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký gồm: bước sóng phân tích, tỉ lệ pha động, nhiệt độ cột sao cho đạt yêu cầu về quy trình đảm bảo đạt các thông số sắc ký theo hướng dẫn của ICH

-Bước sóng phân tích: khảo sát trong khoảng bước sóng 200 – 400 nm -Hệ pha động khảo sát: MeOH – nước acid formic pH 3,0 với các tỉ lệ pha động khảo sát bao gồm: 35:65; 37:63; 40:60

-Nhiệt độ cột: khảo sát nhiệt độ phòng, 30 o C, 40 o C và 50 o C

Khảo sát quy trình xử lý mẫu:

Dựa trên nghiên cứu xử lý mẫu cao đặc lá Sầu đâu của tác giả Trần Hoàng Yến bằng phướng pháp siêu âm với dung môi chiết là methanol [22], tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu viên nén chứa cao lá Sầu đâu bằng phương pháp siêu âm, dung môi methanol với các điều kiện khảo sát bao gồm: thể tích dung môi (20 mL, 30 mL, 40 mL), thời gian chiết (20 phút, 30 phút, 40 phút), nhiệt độ chiết (40 o C, 50 o C, 60 o C), số lần chiết (2 lần, 3 lần, 4 lần)

Thẩm địn quy trìn địn lượng:

Tiến hành theo hướng dẫn của ICH và mức chỉ tiêu của AOAC, thẩm định quy trình phân tích để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến [33]

Có nhiều tài liệu hướng dẫn về thẩm định quy trình, trong đó hướng dẫn Q2 (R1) tháng 11 năm 2005 của ICH cần cho thẩm định quy trình phân tích định lượng bao gồm: Tính tương thích hệ thống, Tính đặc hiệu, Tính tuyến tính và miền giá trị, Độ chính xác, Độ đúng, Giới hạn phát hiện, Giới hạn định lƣợng

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử 6 lần liên tiếp, xác định RSD của các thông số sắc ký: tR, S, AS, RS và k’ Xử lý thống kê các kết quả thu đƣợc Đánh giá kết quả: Độ phân giải: Rs ≥ 1,5 Hệ số bất đối: AS trong khoản 0,8 – 1,2 Độ lệch chuẩn tương đối RSD% của các thông số sắc ký: t R , S, k’, R s , A s

≤ 2%.Quy trình đạt tính tương thích hệ thống khi các thông số đạt yêu cầu và giá trị RSD% qua 6 lần tiến hành tiêm mẫu liên tiếp của các thông số mẫu chuẩn và mẫu thử ≤ 2% ín đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng, mẫu thử thêm chuẩn, pha động ở cùng điều kiện sắc ký thích hợp tìm đƣợc Đánh giá kết quả:Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn phải có pic với tR tương đương với nhau Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động không xuất hiện pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn.Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn: phải có sự tăng lên r rệt về chiều cao hay diện tích pic Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu thử có thời gian lưu tương đương với pic trong mẫu chuẩn phải giống nhau hoặc phù hợp với nhau.Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic phải cho kết quả các pic trong mẫu thử có t R tương đương với t R của các pic trong mẫu chuẩn đều có độ tinh khiết > 99%.Kiểm tra độ tương thích phổ UV-Vis của các pic mẫu thử so với các pic có cùng thời gian lưu trong mẫu chuẩn phải cho kết quả độ tương thích trên 99%

Tính tuyến tính và miền giá trị:

+ Sử dụng dung dịch chuẩn gốc rutin để tiến hành pha giai mẫu chuẩn với 6 nồng độ khác nhau

+ Tiến hành sắc ký 6 mẫu trên bằng điều kiện sắc ký đã xác định, mỗi mẫu tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình diện tích đỉnh của mỗi mẫu

+ Vẽ đường thẳng biểu diễn tương quan giữa diện tích đỉnh theo nồng độ chất phân tích

+ Xác định các hệ số: a (độ dốc), b (tung độ gốc), R 2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy (y = ax + b) Đánh giá kết quả:

Tính tuyến tính thường được chấp nhận khi 0,995 ≤ R 2 ≤ 1

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy bằng kiểm định F và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình bằng kiểm định T

Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn địn lượng (LOQ):

Cách tiến hành: Pha loãng dần mẫu chuẩn đến nồng độ thấp hơn Chuẩn bị mẫu trắng Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu trắng Đánh giá kết quả: LOD đƣợc xác định tại nồng độ mà ở đó chiều cao của pic hoạt chất gấp 2 đến 3 lần so với độ nhiễu đường nền

LOQ đƣợc xác định tại nồng độ mà ở đó chiều cao của pic hoạt chất gấp 10 lần so với độ nhiễu đường nền Độ đúng:

Cách tiến hành:Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử bằng phương pháp đã khảo sát.Chuẩn bị mẫu thử thêm chuẩn: lần lƣợt thêm vào 3 mẫu thử dung dịch chuẩn rutin có nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ rutin có trong mẫu thử.Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập để tìm tỉ lệ phục hồi Đánh giá kết quả:Dựa vào diện tích của đỉnh thu đƣợc để xác định hàm lƣợng mẫu thử, thử thêm chuẩn.Từ đó tính ra tỉ lệ phục hồi của phương pháp định lƣợng theo công thức:

Trong đó Y: tỷ lệ phục hồi (%)

Xr: lƣợng tìm thấy thực tế

Xa: lƣợng cho vào trên lý thuyết

Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% thì quy trình định lƣợng càng có độ đúng cao (yêu cầu tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng 95% – 105%) Độ chính xác:

Cách tiến hành: Chuẩn bị 6 mẫu thử chứa cao lá Sầu đâu nhƣ phần khảo sát tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập với 6 mẫu thử trên Đánh giá kết quả:Xác định hàm lƣợng trong mỗi mẫu thử.Tính Xtb, RSD% với yêu cầu RSD% ≤ 5%

Các chỉ tiêu kiểm nghiệm xây dựng theo DĐVN V

Đạo đức trong nghiên cứu

Lấy mẫu theo đúng qui trình nghiên cứu, đảm bảo tính trung thực trong việc lấy mẫu

Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm đƣợc giữ bí mật tuyệt đối

Không công bố kết quả thực nghiệm khi chƣa đƣợc sự cho phép của các cơ quan có thẩm quyền Kết quả nghiên cứu đảm bảo tính chính xác, trung thực, khách quan.

KẾT QUẢ

Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nén TPCN chứa cao lá Sầu đâu

3.1.1 Kết quả xây dựng quy trìn định tính viên nén TPCN chứa cao lá Sầu đâu

Phương pháp sắc ký lỏng:

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg rutin chuẩn vào trong bình định mức 50 mL, hòa tan và pha loãng bằng methanol (TT) đến định mức, trộn đều Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thu đƣợc vào bình định mức 20,0 mL, thêm chính xác 10 mL acid formic 0,1 %( pH= 3) định mức bằng methanol đến vạch, trộn đều

Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lƣợng trung bình và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lưọng bột viên tương ứng với khoảng 5 viên chuyển vào trong ống ly tâm thêm 10 mL chloroform (ly tâm với tốc độ 3000 vòng/10 phút), loại bỏ lớp chloroform, chuyển toàn bộ bột thuốc trong ống ly tâm vào erlen nút mài 250mL thêm 30 mL methanol (TT), chiếc siêu âm 50 0 C/30 phút (thực hiện 3 lần), gọp dịch chiết cho vào bình định mức 100 mL và thêm methanol (TT) đến định mức, trộn đều, lọc qua giấy lọc, bỏ phần dịch lọc đầu Hút chính xác 10,0 mL dung dịch thu đƣợc thêm Acid formic 0,1 % ( pH=3) thành 20,0 mL (dung dịch A), trộn đều hút 10mL dung dịch A cho vào ống ly tâm thêm 4mL n-hexan đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/3 phút, gạn bỏ lớp n- hexan, Lấy lớp dung dịch A lọc qua màng loc 0,45àm, tiờm sắc ký Điều kiện sắc ký:

Hệ thống máy HPLC SHIMADZU 20AD, đầu dò PDA

Pha động: Methanol-acid formic 0,1% pH =3 (37: 63)

Dung môi pha mẫu: Methanol-acid formic 0,1% pH =3 (50: 50)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm

Tốc độ dòng: 1 mL/phút

Kết quả khảo sát thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử trên 3 lô được thể hiện nhƣ bảng 3.1, hình 3.1, 3.2

Bảng 3.1 Kết quả thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử của các lô

Hình 3.1 Sắc ký đồ (1) của mẫu chuẩn và (2) của mẫu thử

Hình 3.2 Phổ UV (1) của mẫu chuẩn và (2) của mẫu thử

Từ đó, xác định yêu cầu khi định tính bằng HPLC là mẫu thử phải xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic rutin trên mẫu chuẩn

Phương pháp sắc ký lớp mỏng:

Từ kết quả sắc ký hình 3.3 trong hai hệ dung môi khảo sát, lựa chọn hệ dung môi MeOH - cloroform (50:50, thêm 3 giọt acid formic) cho quá trình định tính rutin do cho hệ dung môi này cho kết quả vết rutin gọn, rõ ràng trên bản mỏng dưới đèn UV 254nm (Hình 3.3)

Từ đó, yêu cầu khi định tính với hệ dung môi MeOH - cloroform (50:50, thêm

3 giọt acid formic) là mẫu thử phải cho vết có trị số Rf khoảng 0,7 và tương ứng với vết rutin trong mẫu chuẩn khi soi dưới đèn UV 254 nm

Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính trên bản mỏng

1 Mẫu thử; 2 Mẫu chuẩn rutin

Hệ A: Methanol - cloroform (50:50, thêm 3 giọt acid formic)

Hệ B: Ethyl acetat - acid formic - Nước (15:1:1)

3.1.2 Xây dựng quy trìn địn lượng trên viên nén TPCN chứa cao lá Sầu đâu bằng p ương p p HPLC

Khảo sát điều kiện sắc ký:

Bước sóng địn lượng: Do rutin có cấu trúc vòng thơm, hấp thu tốt trong vùng UV nên lựa chọn khoảng bước sóng từ 200 – 400 nm để khảo sát, lựa chọn bước sóng phân tích là 254 nm, cũng là cực đại hấp thu của rutin, bước sóng này cho đường nền ít nhiễu và pic rutin có tín hiệu hấp thu cao

P a động: Dựa nghiên cứu của tác giả Bùi Ngân Tạo [19] và Trần Hoàng Yến

[22 khi định lƣợng rutin trong cao lá Sầu đâu, lựa chọn thành phần pha động là MeOH – acid formic 0,1% pH 3,0 để tiếp tục khảo sát tỉ lệ pha động Kết quả khảo sát các tỉ lệ pha động khác nhau đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 3.2, phụ lục1.1.Từ đó, lựa chọn tỉ lệ pha động phù hợp cho phân tích là 37:63

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát mẫu thử tại pH đệm 3,0 STT Tỉ lệ pha động Thời gian lưu (phút) Hệ số phân giải

Nhiệt độ cột: Khảo sát buồng điều nhiệt tại nhiệt độ phòng, 30 o C, 40 o C và

50 o C Từ đó, lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho sắc ký là 30 o C, giúp ổn định tốt các thông số sắc ký, cho giá trị thông số Rs và As của rutin đạt yêu cầu

Từ các kết quả khảo sát trên,xác định điều kiện sắc ký phù hợp cho quy trình định lƣợng nhƣ sau:

-Hệ thống sắc ký lỏng Shimazdu, đầu dò PDA

-Pha tĩnh: Cột sắc ký Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 m)

-Pha động: tỉ lệ dung môi MeOH -acid formic 0,1% (pH = 3) (37: 63)

-Dung môi pha mẫu: MeOH-acid formic 0,1% (pH = 3) (50: 50)

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút

-Bước sóng phát hiện: 254 nm

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Kết quả tối ƣu hóa quy trình xử lý mẫu viên nén chứa cao lá sầu đâu bằng phương pháp siêu âm được trình bày ở hình 3.4 Dựa trên đồ thị hình 3.4, điều kiện chiết tối ƣu đƣợc lựa chọn là: thể tích dung môi methanol là 30 mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ chiết 50 o C và số lần chiết là 3

Kết quả khảo sát hiệu suất chiết của phương pháp chiết siêu âm với 30 mL methanol, ở 50 o C, trong 30 phút và chiết lặp lại 3 lần đƣợc thể hiện trong phụ lục 1.3 Từ phụ lục 1.3, nhận thấy hiệu suất chiết rutin nằm trong khoảng 90 –

107 % với giá trị RSD% < 2%, đạt yêu cầu để tiến hành thẩm định theo hướng dẫn ICH

Hình 3.4 Kết quả tối ưu hóa quy trình chiết bằng phương pháp siêu âm Thẩm định quy trình định lƣợng: ín tương t íc ệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn rutin và 6 lần dung dịch thử viên nén cao lá sầu đâu trên hệ thống HPLC với các điều kiện đã lựa chọn Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3 và phụ lục 2.1, 2.2

Bảng 3.3 Kết quả tính tương thích hệ thống

Thông số tR (phút) S (mAU) H N k’ Rs As

Nhận xét: Kết quả bảng 3 cho thấy RSD% < 2%; As từ 0,8 đến 1,5; Rs > 1,5; N > 2000 Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống

Hình 3.5 : Chồng sắc ký đồ tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn

Hình 3.6 : Chồng sắc ký đồ tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Tính đặc hiệu:

Phân tích 05 mẫu: dung dịch chuẩn, dung dịch thử, thử thêm chuẩn, mẫu dung môi pha mẫu và mẫu dung môi pha động trên hệ thống HPLC Kết quả đƣợc trình bày trong các hình 3.7, 3.8, 3.9 và bảng 3.4

Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của rutin

1 Mẫu chuẩn, 2 Mẫu thử, 3 Mẫu thử thêm chuẩn,

4 Dung môi pha mẫu, 5 Pha động

Hình 3.8 Phổ UV (1) mẫu chuẩn và (2) mẫu thử

Hình 3.9 Phổ 3D (1) mẫu chuẩn và (2) mẫu thử

Bảng 3.4 Diện tích đỉnh và độ tinh khiết pic rutin

Mẫu Diện tích đỉnh Độ tinh khiết pic

Trên sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu của rutin mẫu chuẩn và mẫu thử xấp xỉ nhau Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic rutin tách hoàn toàn các pic khác.Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu và dung môi pha động không xuất hiện pic có thời gian lưu của rutin trên mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn

Phổ UV tại thời gian lưu rutin của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau và có

1 2 cùng cƣc đại hấp thu

Pic của rutin trên mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn đều đạt độ tinh khiết pic (lớn hơn 99%)

Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tăng r rệt về chiều cao và diện tích pic so với mẫu thử và mẫu chuẩn

Nhƣ vậy, quy trình định lƣợng rutin trong viên nén chứa cao lá sầu đâu có độ chọn lọc cao, đạt yêu cầu trong phân tích

Tiến hành phân tích 07 dung dịch chuẩn rutin có nồng độ từ 2,5g/mL, đến 50g/mL trên hệ thống HPLC.Mỗi nồng độ tiêm 2 lần, lấy giá trị trung bình diện tích pic của rutin, thu đƣợc kết quả (xem phụ lục).Tính toán và xử lý số liệu bằng phương pháp hồi qui tuyến tính để xác định đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ rutin và diện tích pic, thu đƣợc bảng kết quả nhƣ hình 3.10 và phụ lục 2.3, 2.4

Hình 3.10 Đồ thị hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ rutin

Phương trình hồi quy được kiểm tra sự phù hợp và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình, kết quả được trình bày ở phụ lục 2.4

Qua kiểm định Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê với ta = 1143,28>

Nồng độ (àg/mL) t0,05(5) = 2,571, hệ số b không có ý nghĩa về mặt thống kê nên bị loại tb 2,61241 < t0,05(4) = 2,776.Hệ số R 2 = 0,999996 > 0,995 đạt yêu cầu

Vậy phương trình hồi quy có dạng y = 44325x

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ 2,5 – 50 g/mL, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ rutin và diện tích pic Hệ số tương quan

R = 0,999996 chứng tỏ mức độ tương quan tốt, độ tuyến tính chặt chẽ

Giới hạn phát hiện và giới hạn địn lượng: kết quả khảo sát LOD, LOQ theo tỉ lệ S/N trình bày nhƣ hình 3.11 và 3.12

Hỡnh 3.11 Sắc ký đồ LOD của rutin tại 0,1 àg/ mL

Hỡnh 3.12 Sắc ký đồ LOQ của rutin tại 0,3 àg/ mL Độ chính xác: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bao gồm độ lặp lại và độ chính xác liên ngày Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.5 và 3.6 và phụ lục 2.5, 2.6

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày (n = 6)

Khối lƣợng bột thuốc đem cân(g) Diện tích đỉnh(mAU.s) Hàm lƣợng rutin (mg/viên)

Bảng 3.6 Kết quả độ chính xác liên ngày (n)

Ngày phân tích Hàm lƣợng rutin (mg/viên) RSD%

Nhận xét:Kết quả bảng 3.5 và 3.6 cho thấy quy trình đạt độ lặp lại và độ chính xác liên ngày với giá trị RSD