Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gien của virut viêm gan B trên bệnh nhân xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan

Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gien của virut viêm gan B trên bệnh nhân xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÙI HỮU HOÀNG

ĐẶC ĐIỂM CỦA DẤU ẤN HUYẾT THANH VÀ

KIỂU GIEN CỦA VIRÚT VIÊM GAN B

TRÊN BỆNH NHÂN

XƠ GAN VÀ UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN

Chuyên ngành : Bệnh Học Nội Khoa

Mã số: 3 01 31

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2004

Công trình được hoàn thành tại:

Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS Phạm Hoàng Phiệt

2 GS Nguyễn Thị Trúc

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Văn Mùi

Viện Quân Y 103

Phản biện 2: GS.TS Hạ Bá Khiêm

Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh

Phản biện 3: GS.TS Nguyễn Thị Kê

Viện Vệ sinh Y tế Công cộng

Luận án đã được bảo vệ trước Hội Đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại:

Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

Vào lúc 13 giờ 30 ngày 17 tháng 11 năm 2004

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Khoa Học Tổng Hợp Tp Hồ Chí Minh

2 Thư viện Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

3 Thư viện Quốc Gia Hà Nội

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 3 phần chính:

• Phần 1: Mở đầu

• Phần 2: 4 chương: Tổng quan tài liệu, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu, Kết quả, Bàn luận

• Phần 3: Kết luận và Kiến nghị

Và 3 phần phụ: Tài liệu tham khảo, Danh mục các công trình của tác giả, Phụ lục

Luận án có 127 trang, 27 bảng, 5 hình và 9 biểu đồ

MỞ ĐẦU

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hiện nay hơn 350 triệu người đang bị nhiễm virút viêm gan B (VRVGB) mạn tính và 25-40% những người này sẽ tử vong do các biến chứng như xơ gan (XG) và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG hay UTG) Vì vậy, nhiễm VRVGB được xem là một vấn đề y tế toàn cầu Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh viêm gan virút B (VGVRB) với tỷ lệ nhiễm trong dân số khoảng 15-20% Trong đó, tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính ở bệnh nhân (BN) XG và UTG là 80-92%

Trước đây, việc tầm soát nhiễm VRVGB chủ yếu chỉ dựa vào dấu ấn HBsAg Trên thực tế lâm sàng, có những bệnh gan do nhiễm VRVGB mà HBsAg lại âm tính nhưng khi khảo sát các dấu ấn khác như Anti-HBc, HBV DNA có thể giúp phát hiện thêm những trường hợp bệnh gan mà trước kia được xem là “vô căn” Hiện tượng này được gọi là VGVRB tiềm ẩn

Đa số các công trình nghiên cứu trước đây ở nước ta chỉ khảo sát chung chung các đối tượng nhiễm VRVGB mạn tính hoặc chỉ tập trung vào UTG mà ít chú ý đến sự khác biệt giữa hai bệnh cảnh XG và UTG sau nhiễm VRVGB Vả lại, các dấu ấn của VRVGB chưa được nghiên cứu thật đầy đủ và nhất là chưa làm rõ mối liên hệ giữa các dấu ấn này với nhau

Ngoài các dấu ấn huyết thanh cổ điển, hiện nay với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, người ta bắt đầu quan tâm các dấu ấn về di truyền, đặc biệt là kiểu gien và các thể đột biến của VRVGB Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy kiểu gien và các thể đột biến của VRVGB có liên quan đến tiến trình XG và UTG Vấn đề kiểu gien và các thể đột biến của VRVGB, đặc biệt là thể đột biến tiền lõi vẫn còn là những khái niệm khá mới mẻ đối với các nghiên cứu trong nước

Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gien của virút viêm gan B trên bệnh nhân

xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan” nhằm các mục tiêu:

1 Xác định sự hiện diện và mối liên quan giữa các dấu ấn huyết thanh (DAHT) của VRVGB trên BN XG và UTBMTBG

2 Xác định ý nghĩa của thể đột biến tiền lõi ở BN XG và UTBMTBG

3 Xác định sự phân bố và mối liên quan giữa các kiểu gien của VRVGB với bệnh cảnh XG và UTBMTBG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các dạng cấu trúc của VRVGB:

1.2 Cấu trúc bộ gien của VRVGB và nguồn gốc của các DAHT: VRVGB thuộc họ Hepadnaviridae, được cấu tạo gồm phần vỏ là kháng nguyên (KN) bề mặt (HBsAg) và phần lõi là KN lõi (HBcAg) Bên trong lõi chứa HBV DNA và enzyme polymerase

KN “e” (HBeAg) cũng có nguồn gốc từ phần lõi Tương ứng với sự hiện diện của các KN, cơ thể sẽ sản xuất ra các kháng thể (KT) như : Anti-HBs, Anti-HBc và Anti-HBe

1.3 Ý nghĩa của các DAHT trong các giai đoạn VGVRB:

* HBsAg (+): virút đang hiện diện trong cơ thể Phản ứng chuyển huyết thanh HBs là đáp ứng của hệ miễn dịch nhằm loại

trừ HBsAg: HBsAg từ (+) chuyển sang (-) và Anti-HBs từ (-)

chuyển sang (+) Lúc đó, bệnh được xem như đã khỏi và HBs (+) chứng tỏ cơ thể đã được miễn nhiễm đối với bệnh

Anti-* HBcAg chỉ hiện diện trong tế bào gan mà không có trong máu Anti-HBc (+) rất sớm sau khi bị nhiễm VRVGB và tồn tại

trong huyết thanh khá lâu Đây là bằng chứng cho thấy BN từng

bị nhiễm VRVGB

* HBeAg (+): virút đang sao chép và bệnh có tính lây nhiễm cao Phản ứng chuyển huyết thanh HBe là đáp ứng của hệ miễn

dịch nhằm hạn chế hoạt động sao chép của virút: HBeAg từ (+)

chuyển sang (-) và HBe từ (-) chuyển sang (+) Khi HBe (+): hoạt động sao chép của VRVGB giảm đi và bệnh tạm

Anti-ổn định

* HBV DNA (+) là bằng chứng cho thấy virút đang tồn tại và

sao chép Nhiễm VRVGB “tiềm ẩn” (“occult” HBV infection) là

tình trạng mà HBsAg đã biến mất trong huyết thanh nhưng HBV DNA vẫn còn (+) kéo dài Hiện tượng này có thể xảy ra ngay cả ở các trường hợp VGVRB cấp tính tự khỏi hoặc đã thải trừ được HBsAg Do vậy, phải cảnh giác đối với các trường hợp HBsAg (-) và cần tìm thêm các DAHT khác như Anti-HBc và nhất là HBV DNA trước khi kết luận BN không có nhiễm VRVGB

* Đột biến tiền lõi là đột biến xảy ra tại gien preC, làm cho

HBeAg không được tổng hợp Vì vậy, HBeAg (-) và Anti-HBe (+) nhưng virút vẫn tiếp tục sao chép và gây bệnh mà bằng chứng là HBV DNA (+) Theo Y văn, đột biến tiền lõi có liên quan đến các tổn thương gan nặng như viêm gan bùng phát, XG và UTG

1.4 Kiểu gien của VRVGB: Dựa trên sự khác biệt ≥ 8% về trình tự nucleotide của genom, người ta phân biệt 7 kiểu gien khác nhau từ A đến G Các kiểu gien này được phân bố khác nhau tùy theo từng vùng địa dư, trong đó, kiểu gien B và C chiếm đa số ở vùng Châu Á – Thái Bình Dương và Nhật

Nhiều công trình nghiên cứu đã đề cập đến mối liên quan giữa các kiểu gien với bệnh cảnh XG và UTG (Shiina và c.s nhận thấy kiểu gien C thường gặp ở BN có tổn thương gan nặng như XG Kao và c.s cho rằng kiểu gien C thường gặp ở BN UTG > 50 tuổi, còn kiểu gien B thường gặp ở UTG < 50 tuổi; Mizokami nhận thấy kiểu gien B hiếm gặp ở BN UTG < 60 tuổi )

1.5 Nguy cơ XG ở BN VGVRB mạn tính: 15-20% BN bị nhiễm VRVGB ở tuổi trưởng thành có thể tiến triển đến XG với tần suất 2,4%/năm Nhiều yếu tố nguy cơ có liên quan đến virút và BN 1.6 Nguy cơ UTG ở người bị nhiễm VRVRB mạn tính cao gấp

223 lần so với người không nhiễm với tần suất 1,5% /năm

CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Nghiên cứu DAHT của VRVGB: chọn 100 BN XG và 100

BN UTG tại BV Chợ Rẫy (08/1999 - 04/2002), có nhiễm VRVGB: HBsAg (+) và/hoặc Anti-HBc (+)

- Nghiên cứu kiểu gien của VRVGB: chọn ngẫu nhiên 40 BN từ nhóm UTG và 30 BN từ nhóm XG Để so sánh với hai nhóm bệnh gan nêu trên, chọn thêm một nhóm gồm 30 người mang HBsAg mạn tính tại Phòng khám Viêm gan – BV ĐH Y Dược TPHCM (02/2002 - 04/2002)

* Công thức tính cỡ mẫu:

n = Z2

(1-α/2) x p (1-p) p : tỷ lệ dấu ấn VRVGB trong nhóm khảo sát

d2 d: sai số tuyệt đối cho phép

α: sai lầm loại I = 0,05

Z (1- α/2) = 1,96 2.2 Tiêu chuẩn chọn BN: các BN có bằng chứng nhiễm VRVGB: HBsAg (+) và/hoặc Anti-HBc (+), được xếp theo các nhóm:

* Nhóm XG: đủ tiêu chuẩn lâm sàng và cận lâm sàng để chẩn đoán XG

* Nhóm UTG: đủ tiêu chuẩn lâm sàng và cận lâm sàng để chẩn đoán UTG (siêu âm và/hoặc CT scanner có khối u gan, AFP

> 400ng/mL Nếu AFP < 400ng/mL phải sinh thiết gan)

* Nhóm người mang HBsAg mạn tính (để nghiên cứu kiểu gien): có men ALT, AST bình thường ít nhất 2 lần cách nhau 6 tháng Lâm sàng và xét nghiệm chức năng gan bình thường

2.3 Tiêu chuẩn loại trừ: BN XG và UTG do các nguyên nhân khác: nghiện rượu mạn tính, VGVR C [Anti-HCV(+)], VGVR D [Anti-HDV(+)], tăng sắt và ferritin trong máu

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang, mô tả và phân tích

2.4.2 Các thông số nghiên cứu cụ thể: 5 DAHT (HBsAg,

Anti-HBs, HBeAg, Anti-HBe, Anti-HBc) và HBV DNA; các kiểu gien của VRVGB (A-G)

2.4.4 Xử lý và phân tích số liệu bằng chương trình SPSS 10.0 cho

Window So sánh các tỷ lệ bằng phép kiểm χ2 hiệu chỉnh Fisher cho các số liệu nhỏ Chọn mức ý nghĩa khi giá trị p < 0.05

2.4.5 Nguyên tắc và tiêu chuẩn các xét nghiệm được thực hiện trong nghiên cứu :

- 5 DAHT (thực hiện tại Khoa Xét nghiệm Huyết học của BV Chợ Rẫy, kỹ thuật ELISA, bộ kít của BioMérieux và Phamatech)

- HBV DNA (thực hiện tại Phòng Xét nghiệm Sinh học phân tử của BV Chợ Rẫy, kỹ thuật PCR định tính, phương pháp “trong nhà” (in house), bộ kít Takara, máy Techgene, ngưỡng (+) > 103 copies/mL)

- Kiểu gien của VRVGB: gởi 100 mẫu huyết thanh sang Trung tâm Nghiên cứu và Chẩn đoán Innogenetic (Bỉ) thực hiện theo kỹ thuật INNO-LIPA (Innogenetic Line Probe Assay): Khuếch đại vùng gien đặc hiệu của kiểu gien nằm trên gien S, làm biến tính chuỗi DNA đã được khuếch đại, sau đó cho lai ghép với các đầu dò oligonucleotide đặc hiệu của kiểu gien đã gắn sẵn thành các vạch trên dải nitrocellulose Vị trí các vạch được lai ghép cho

phép xác định các kiểu gien tương ứng

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

3.1 Các DAHT của VRVGB trên BN XG và UTG:

Trong thời gian từ 08/1999 - 04/2002, số BN được nghiên cứu là 100 XG và 100 UTG có các đặc tính như sau:

Bảng 3.6: Đặc tính của dân số được nghiên cứu DAHT:

3.1.1.Các DAHT chứng minh sự hiện diện và nhiễm VRVGB ở BN

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (+) của các DAHT chứng minh có nhiễm VRVGB

Bảng 3.11: Các DAHT chứng minh sự hiện diện và nhiễm VRVGB:

Biểu đồ 3.4: Các DAHT phản ánh sự sao chép của VRVGB

3.1.3.Tỷ lệ chuyển huyết thanh HBe và tỷ lệ nghi có đột biến tiền lõi ở BN XG và UTG:

Bảng 3.14: Tỷ lệ chuyển huyết thanh HBe và tỷ lệ nghi đột biến tiền lõi ở hai nhóm XG và UTG:

Đột biến tiền lõi (+) 50% 32% 41% OR = 2,13

Đột biến tiền lõi (-) 50% 68% 59% [1,20-3,78]

Bảng 3.18: Tỷ lệ BN XG và UTG nghi đột biến tiền lõi có tăng men ALT:

ALT tăng > 60 U/L 46% (23/50) 53% (17/32)

ALT bình thường 54% (27/50) 47% (15/32)

p = 0,53

3.1.4.Tỷ lệ chuyển huyết thanh HBs ở BN XG và UTG:

Bảng 3.19: Tỷ lệ chuyển huyết thanh HBs ở hai nhóm XG và UTG:

3.2 Các kiểu gien của VRVGB ở BN XG và UTG:

Trong 100 mẫu huyết thanh gởi đi phân tích kiểu gien, chúng tôi chỉ nhận được 87 kết quả, còn 13 trường hợp không thực hiện được vì HBV DNA (-) Trong 87 BN, có 38 UTG, 24 XG và

25 người mang HBsAg mạn tính (Bảng 3.21)

Bảng 3.21: Đặc tính của dân số được nghiên cứu kiểu gien:

Kiểu gien B

46%

Không xác định 17%

Kiểu gien C 34%

Biểu đồ 3.9: Sự phân bố các kiểu gien của VRVGB

Kiểu gien B (57,1%) có tỷ lệ cao hơn kiểu gien C (42,9%):

Bảng 3.23: Phân bố kiểu gien B và C theo các nhóm:

B 6 (42,9%) 15 (78,9%) 21 (63,6%)

Tuổi

≤ 50t C 8 (57,1%) 4 (21,1%) 12 (36,4%)

0,033 5,00 (1,08-2,32)

B 4 (44,4%) 3 (75%) 7 (53,8%)

Tuổi

> 50t C 5 (55,6%) 1 (25%) 6 (46,2%)

0,559 3,75 (0,27-52,63)

B 6 (50%) 15 (78,9%) 21 (67,7%)

Tuổi

≤ 50t C 6 (50%) 4 (21,1%) 10 (32,3%)

0,127 3,74 (0,77- 18,18)

B 6 (50%) 3 (75%) 9 (56,3%)

Tuổi

> 50t C 6 (50%) 1 (25%) 7 (43,8%)

0,585 3,00 (0,23-3,70)

3.2.4 So sánh kiểu gien B và C ở nhóm XG và UTG: (Bảng 3.26)

Kiểu gien XG UTG Tổng

p = 0,654

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1 Các DAHT của VRVGB trên BN XG và UTG:

4.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Ở các nước vùng dịch tễ của

VGVRB như Việt Nam, phần lớn các bệnh gan mạn tính có liên quan đến nhiễm VRVGB Mặc dù XG và UTG có thể do nhiều nguyên nhân gây ra nhưng nếu loại trừ được một số nguyên nhân thường gặp như VGVR C, VGVR D, nghiện rượu, bệnh nhiễm sắt mô thì đứng trước một BN XG hoặc UTG có bằng chứng đã nhiễm VRVGB có thể giúp chúng ta nghĩ nhiều bệnh lý gan này có liên quan đến VRVGB

4.1.2 Thiết kế nghiên cứu: Đây là nghiên cứu cắt ngang do đó

chúng ta sẽ không thấy rõ sự biến động của các dấu ấn theo thời gian Tuy nhiên, quá trình hình thành XG và UTG sau nhiễm VRVGB có thể diễn ra hàng chục năm cho nên trên thực tế việc theo dõi sự biến thiên của các dấu ấn này rất khó thực hiện Vì vậy, trong một thời gian nghiên cứu nhất định, việc phân tích chi tiết và đầy đủ các DAHT của virút có thể giúp chúng ta phần nào có một định hướng về ý nghĩa của sự hiện diện và mối liên quan giữa các dấu ấn ở những giai đoạn diễn tiến khác nhau của VGVRB mạn tính, đặc biệt là XG và UTG

4.1.3 So sánh các nghiên cứu khác trong nước: Đa số các tác giả

chỉ khảo sát HBsAg (Trần Văn Bé, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Sào

Trung ) hoặc chỉ nêu tỷ lệ các dấu ấn miễn dịch nhưng chưa phân tích mối liên quan giữa các dấu ấn này (Trịnh Thị Minh Liên, Trịnh Thị Ngọc) Có tác giả chỉ nghiên cứu chung chung các đối tượng nhiễm VRVGB mạn tính (Đỗ Đại Hải) hoặc chỉ tập trung vào UTBMTBG (Nguyễn Sào Trung, Trần Văn Huy ) Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát đủ 5 dấu ấn miễn dịch và cả HBV DNA Ngoài ra, còn khảo sát thêm dấu ấn di truyền, đó là kiểu gien của VRVGB

4.1.4 Đặc điểm của dân số được nghiên cứu DAHT: (Bảng 3.6)

Tuổi trung bình ở nhóm XG (53,1 ± 13,2) và nhóm UTG (52,6

± 13,7) gần xấp xỉ nhau (p > 0,05) Tỷ lệ nam/nữ ở nhóm UTG (7,3/1) cao hơn hẵn so với nhóm XG (1,4/1), (p < 0,001) Trị số trung bình của ALT ở hai nhóm XG (72,0 ± 92,8) và UTG (71,4 ± 108,9) gần tương đương nhau (p > 0,05) Trị số trung bình của AST ở nhóm XG (151,3 ± 197,4) và nhóm UTG (152,8 ± 131,1) cũng tăng xấp xỉ nhau (p > 0,05) Trong nhóm UTG, trị số trung bình của AFP (716,6 ± 1395,8 ng/mL) cao hơn gấp 12 lần so với ở nhóm XG (59,5 ± 85,8), (p < 0,001)

4.1.5 Các DAHT chứng minh sự hiện diện hoặc nhiễm VRVGB:

Thông thường, khi tầm soát tình trạng nhiễm VRVGB, người ta chỉ quan tâm đến HBsAg mà ít chú ý các dấu ấn còn lại Trong nghiên cứu này, tỷ lệ HBsAg (+) ở nhóm UTG là 87%, tương đương với kết quả của Phan Thị Phi Phi (82%) và Trần Văn Huy (85%) Tỷ lệ HBsAg (+) ở nhóm XG là 74%, hơi thấp hơn của Trịnh Thị Ngọc (82%) Mặt khác, tỷ lệ HBsAg (+) ở nhóm UTG cao hơn so với nhóm XG (p < 0,001),(Bảng 3.11) Sự khác biệt này có thể do tỷ lệ chuyển huyết thanh HBs ở BN XG cao hơn ở

BN UTG (21% so với 10%, Bảng 3.19) Sự âm tính của HBsAg còn có thể do hiện tượng đột biến tại gien S; hiện tượng hòa nhập HBV DNA vào nhiễm sắc thể của tế bào gan làm biến đổi sự biểu hiện gien của HBsAg Trên lâm sàng, nhiều trường hợp XG hoặc UTG đã được chẩn đoán là “vô căn” khi chỉ dựa vào kết quả HBsAg (-) và ngay cả BN cũng chưa biết mình bị nhiễm VRVGB trước đó Như vậy, nếu chỉ dựa vào kết quả HBsAg (+) để tầm soát nhiễm VRVGB, sẽ có 26% trường hợp XG và 13% trường hợp UTG bị bỏ sót chẩn đoán

Trong khi đó, tỷ lệ Anti-HBc (+) ở BN UTG là 94%, gần bằng kết quả của Trần Văn Huy (92%) Còn ở nhóm XG, tỷ lệ này là 93%, hơi thấp hơn của Trịnh Thị Ngọc (100%) Nói chung tỷ lệ Anti-HBc (+) rất cao ở cả hai nhóm và không khác biệt nhau (p > 0,05),(Bảng 3.11) Như vậy, Anti-HBc có giá trị chẩn đoán nhiễm VRVGB cao hơn (≥ 93%) so với dấu ấn HBsAg (≤ 87%) và giá trị này không khác biệt ở cả hai nhóm XG và UTG (Biểu đồ 3.3) Ngoài ra, HBV DNA (+) cũng được xem là một dấn ấn chứng minh cho sự hiện diện của virút trong cơ thể Mặc dù đây là xét nghiệm cao cấp, đắt tiền nhưng kết quả chỉ (+) trong 70% XG và 82% UTG (Bảng 3.11) Như vậy, tỷ lệ (+) của HBV DNA trong nghiên cứu này không hơn gì so với việc tìm HBsAg đơn thuần và còn thấp hơn so với dấu ấn Anti-HBc khi muốn tầm soát nhiễm VRVGB ở BN XG và UTG (Biểu đồ 3.3)

Mặt khác, tỷ lệ HBV DNA (+) ở nhóm UTG (82%) cao hơn so với nhóm XG (70%), (p < 0,05),(Bảng 3.11) Sự khác biệt này có thể có liên quan đến phản ứng chuyển huyết thanh HBs xảy ra ở nhóm XG cao hơn nên HBV DNA sẽ (-) nhiều hơn