Đột biến gen P53 và biểu hiện protein P53, MDM2, KI67, MMP9 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam

Đột biến gen P53 và biểu hiện protein P53, MDM2, KI67, MMP9 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam

Đồng biểu hiện quá mức các protein trên liên quan với tiên

lượng xấu gồm: liên quan giữa p53/Ki67, p53/MMP9,

Ki67/MMP9 với độ mô học; giữa p53/MMP9 với di căn hạch,

với tình trạng tái phát; giữa p53/MMP9, Ki67/MMP9,

MDM2/MMP9 với tình trạng không đáp ứng xạ trị và với thời

gian sống còn ngắn

Như vậy, đột biến gen p53 và biểu hiện quá mức protein

p53, MDM2, Ki67, MMP9 thường hiện diện trong trong ung

thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam Biểu hiện quá mức

protein p53, Ki67, MMP9 và đồng biểu hiện quá mức những

protein này thường liên quan với các yếu tố tiên lượng xấu

Kiến nghị:

Dựa vào các kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi xin có

một số kiến nghị sau:

- Khảo sát hóa mô miễn dịch để cung cấp những thông tin

định hướng điều trị Ví dụ, các thông tin về biểu hiện của

protein p53, Ki67, MMP9 giúp các nhà lâm sàng trong việc

cân nhắc chỉ định xạ trị, phối hợp các mô thức điều trị và

tiên lượng bệnh

- Tiếp tục nghiên cứu về sinh học ung thư để có cơ sở thiết

lập các phác đồ điều trị (theo các biểu hiện hóa mô miễn

dịch, sinh học phân tử, v.v…) mang lại hiệu quả điều trị cao

cho mỗi người bệnh ung thư

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Ung thư niêm mạc miệng (UTNMM) là một trong mười loại ung thư thường gặp nhất ở người Việc chọn lựa điều trị chủ yếu dựa vào xếp hạng lâm sàng TNM Tuy nhiên, đây chưa phải là yếu tố tiên lượng thỏa đáng Dưới 50% bệnh nhân sống không quá 5 năm Gần đây, những tiến bộ rất nhanh trong lĩnh vực sinh học phân tử đã giúp phát hiện ra nhiều gen liên quan ung thư, ứng dụng để tìm ra những yếu tố dự đoán diễn tiến ung thư và điều trị

Đột biến gen p53 thường xảy ra trong UTNMM và dẫn đến biểu

hiện quá mức protein p53 Tuy nhiên, ở một số nước có thói quen nhai trầu phổ biến, biểu hiện quá mức protein p53 thường gặp nhưng chủ yếu do biểu hiện quá mức protein MDM2

UTNMM có đặc điểm sinh sản tế bào quá mức, xâm lấn mạnh và thường di căn hạch Hiện nay, Ki67 được xem là chất đánh dấu sinh học về sự sinh sản của tế bào, Matrix Metalloproteinase (MMP) được xem là chất đánh dấu sinh học về sự xâm lấn và di căn của ung thư

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về sinh học phân tử trong ung thư

chỉ mới bắt đầu Chưa có nghiên cứu về đột biến gen p53, về biểu

hiện của protein MDM2, Ki67, MMP9 Thực hiện nghiên cứu này chúng tôi mong muốn đạt các mục tiêu sau:

1 Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 trong UTNMM

2 Xác định tỉ lệ biểu hiện quá mức của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9 trong UTNMM

3 Phân tích sự liên quan giữa biểu hiện của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9 với độ mô học, di căn hạch, đáp ứng xạ trị, tái phát và tiên lượng sống còn toàn bộ trong UTNMM

2 Tính cấp thiết của đề tài

UTNMM có xuất độ và tử suất vẫn còn cao Việc phát hiện

các yếu tố sinh học phân tử trong ung thư đã và đang góp phần cải

thiện chẩn đoán, điều trị và tiên lượng Vì vậy, việc nghiên cứu về

những đặc điểm sinh học phân tử của UTNMM ở người Việt Nam

là cần thiết, đúng hướng và có tính khoa học, để làm sáng tỏ

nguyên nhân, diễn tiến sinh học của ung thư và mở ra hướng ứng

dụng điều trị thích hợp nhất cho mỗi người bệnh ung thư

3 Những đóng góp mới của luận án

1 Áp dụng PCR-SSCP, giải trình tự chuỗi DNA để chẩn đoán

đột biến gen p53; áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán

sự bất thường của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9

2 Đây là công trình đầu tiên trong nước phát hiện một số biến

đổi sinh học phân tử về đột biến gen p53, biểu hiện quá mức protein

MDM2, Ki67, MMP9 trong UTNMM ở người Việt Nam

3 Chứng tỏ một số đặc điểm phân tử có liên quan với sự tiến

triển của UTNMM ở người Việt Nam Khảo sát hóa mô miễn dịch

của protein p53, Ki67, MMP9 có thể cung cấp thêm một số thông

tin về đặc điểm sinh học của bướu, giúp các bác sĩ lâm sàng có

thêm cơ sở đánh giá tiên lượng và chọn lựa điều trị thích hợp

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 130 trang Ngoài phần mở đầu và kết luận còn có

bốn chương, bao gồm: tổng quan 28 trang, đối tượng và phương

pháp nghiên cứu 14 trang, kết quả 42 trang, bàn luận 41 trang Có

35 bảng, 6 biểu đồ, 34 hình, 156 tài liệu tham khảo (21 tài liệu tiếng

Việt, 1 tài liệu tiếng pháp, 134 tài liệu tiếng Anh)

Qua khảo sát 110 trường hợp ung thư niêm mạc miệng, có thể đưa ra những kết luận sau:

1 Đột biến gen p53 trong UTNMM: Đột biến gen p53 chiếm

44,4% trong 18 trường hợp UTNMM, thường xảy ra nhất tại exon 8 và đa số là đột biến sai nghĩa

2 Biểu hiện của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9 trong UTNMM: Biểu hiện quá mức của protein p53 chiếm 75,5%,

của protein Ki67 là 67,3%, của protein MMP9 là 56,4% và của protein MDM2 là 36,4% trong đó có 26,4% đồng biểu hiện quá mức với protein p53

3 Sự liên quan giữa biểu hiện của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9 và các đồng biểu hiện với diễn tiến của UTNMM:

Biểu hiện protein p53 dương tính thường gặp ở những bệnh nhân trên 60 tuổi, ở những bướu có độ mô học cao, bướu có di căn hạch, bướu có tăng biểu hiện Ki67, nhưng không liên quan với các yếu tố lâm sàng khác Biểu hiện protein MDM2 dương tính thường gặp ở những bướu có độ mô học thấp, biểu hiện protein Ki67 dương tính tăng ở những bướu có độ mô học cao và không liên quan với các yếu tố lâm sàng Biểu hiện protein MMP9 dương tính liên quan với các yếu tố tiên lượng xấu theo thứ tự: bướu không đáp ứng xạ trị, thời gian sống còn ngắn, bướu tái phát, bướu có độ mô học cao, bướu có di căn hạch

KẾT LUẬN

* p53, MDM2, Ki67: Bất kể mô thức điều trị, nhiều nghiên cứu

(Stoll 2000, Huang 2001) và nghiên cứu này không thấy sự liên

quan giữa tiên lượng với biểu hiện p53, MDM2, Ki67 Ngược lại,

một số nghiên cứu cho rằng tiên lượng xấu liên quan với biểu hiện

quá mức p53, không biểu hiện MDM2, tăng biểu hiện Ki67

* MMP9: Trong bốn yếu tố phân tử khảo sát, kết quả cho thấy biểu

hiện MMP9 có nhiều hứa hẹn là yếu tố dự đoán tiên lượng Sự liên

quan này cóù thể do sự ảnh hưởng rõ của MMP9 đối với di căn hạch

– một trong những yếu tố quan trọng nhất cho tiên lượng xấu trong

UTNMM Theo y văn, biểu hiện quá mức MMP9 trong ung thư đầu

cổ là một yếu tố dự đoán tiên lượng bất lợi, thường đồng nghĩa với

tỉ lệ sống còn thấp, thời gian sống còn ngắn (Yorioka 2002, Impola

2004, Ruokolainen 2004, Katayama 2004)

Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng cho đến nay vẫn chưa có sự

nhất quán giữa các nghiên cứu về giá trị dự đoán diễn tiến

UTNMM của p53, MDM2, Ki67, MMP9 Một trong những lý do

chính là hóa mô miễn dịch không phải là xét nghiệm khảo sát chức

năng Nghiên cứu này phát hiện một trường hợp đột biến tại vị trí

ghép nối giữa exon và intron, dẫn tới dừng phiên mã và dịch mã tại

vị trí này Protein p53 sản xuất ra ngắn hơn và bị mất chức năng,

nhưng vì không bền vững nên không thể phát hiện được qua hóa

mô miễn dịch

Do vậy, cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về sinh học phân tử

ung thư để nhanh chóng ứng dụng trong dự đoán diễn tiến ung thư

giúp chọn lựa điều trị chính xác nhất, cũng như ứng dụng điều trị

bằng những liệu pháp sinh học đặc hiệu như liệu pháp nhắm trúng

đích (phân tử), liệu pháp gen

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh học của ung thư niêm mạc miệng Tần suất UTNMM thay đổi tùy theo mỗi quốc gia, từ 2% đến 45% Xuất độ chuẩn theo tuổi của UTNMM tại Hà Nội năm

1998 ở nam giới là 0,8/100.000 và ở nữ giới là 0,3/100.000, cùng đứng hàng thứ mười Tại TPHCM, xuất độ này ở nam giới là 3,1/100.000 đứng hàng thứ sáu và ở nữ giới là 2,7/100.000

Hơn 95% bệnh nhân trên 40 tuổi Tỉ lệ nam/nữ là 1,05/1 (Bệnh viện Ung bướu TPHCM, 1993-1996) Vị trí thường gặp nhất là lưỡi (2/3 trước)

UTNMM liên quan đến một số yếu tố sau: thói quen hút

thuốc lá, uống rượu, nhai trầu, nhiễm HPV, nhiễm Candida, bức xạ

mặt trời, chấn thương do răng hay hàm giả, các tổn thương tiền ung thư gồm hồng sản, bạch sản, xơ hóa dưới niêm mạc, liken phẳng Về bệnh học, gồm carcinôm tế bào gai (90-95%), carcinôm tuyến nước bọt phụ, tuyến nhầy (5-6%), mêlanôm ác (1%), sarcôm Độ mô học tăng dần từ trước ra sau Carcinôm tế bào gai diễn tiến chủ yêáu là xâm lấn tại chỗ và di căn hạch Các dạng lâm sàng thường gặp là dạng chồi sùi, dạng loét và dạng ăn cứng

Chẩn đoán qua khám lâm sàng, sinh thiết, các kỹ thuật tế bào học, các phương tiện chẩn đoán hình ảnh y khoa, v.v… Chẩn đoán xác định dựa trên kết quả giải phẫu bệnh

Về điều trị, các mô thức tiêu chuẩn hiện nay có khả năng điều trị khỏi là phẫu thuật (cắt rộng bướu, nạo hạch cổ) và xạ trị, đơn thuần hay kết hợp Vai trò của hóa trị còn hạn chế

Tiên lượng sống còn 5 năm thấp (dưới 50%), nguyên nhân chính là do phát hiện bệnh trễ

không phụ thuộc vào protein p53, Ki67, MDM2, tương tự kết quả của một số nghiên cứu (Valente 1994, Dijkema 2000)

1.2 Đặc điểm sinh học phân tử của ung thư niêm mạc miệng

Quá trình sinh ung thư ở niêm mạc miệng là một quá trình

nhiều bước, với sự tham gia của nhiều gen * MMP9: UTNMM biểu hiện quá mức MMP9 thường ít đáp ứng

với xạ trị Kết quả nhất quán với kết quả sự liên quan giữa biểu hiện quá mức MMP9 với tiên lượng xấu trong nghiên cứu này

1.2.1 p53

Đột biến gen đè nén bướu p53 thường gặp nhất trong ung thư ở

người Trong UTNMM, tỉ lệ đột biến gen p53 phát hiện qua

PCR-SCCP là 5,4 – 67%, tỉ lệ biểu hiện quá mức protein p53 phát hiện

qua nhuộm hóa mô miễn dịch là 11 – 100% Biểu hiện quá mức

protein p53 có thể liên quan với tiên lượng xấu

4.2.4 Về dự đoán tái phát

* p53, MDM2, Ki67: Tái phát không liên quan với biểu hiện p53, MDM2, Ki67 Điều này phù hợp nhận định của nhiều nghiên cứu

* MMP9: Nghiên cứu của Ruokolainen (2004) và nghiên cứu này cho thấy bướu biểu hiện MMP9 dương tính dễ bị tái phát hơn bướu biểu hiện MMP9 âm tính Có thể chính sự tăng hoạt động của MMP9 đã giúp các tế bào bướu lan tràn nên việc điều trị khó khăn và khả năng tái phát cao

1.2.2 MDM2

Protein p53 và protein MDM2 trong tế bào liên quan với nhau

theo vòng phản hồi tự điều hòa p53-MDM2 Tỉ lệ biểu hiện quá

mức MDM2 trong UTNMM là 20 – 95,6%, thường cao ở một số nước

phổ biến thói quen nhai trầu như Myanmar (72,5%), Đài Loan

(69,3%) Kết quả của các nghiên cứu về sự liên quan giữa biểu

hiện MDM2 với tiên lượng ung thư thì mâu thuẫn nhau 4.2.5 Về dự đoán tiên lượng sống còn

Kết quả khẳng định TNM, độ mô học vẫn cần thiết và có giá trị tiên lượng để chọn lựa điều trị Tuy nhiên, thiết nghĩ mặc dù di căn hạch liên quan rõ với tiên lượng, nhưng khi đã thấy di căn hạch trên lâm sàng thì việc điều trị dù tích cực cũng đã trễ để cứu sống bệnh nhân Chính vì vậy, chúng tôi đồng ý với quan niệm của nhiều tác giả hiện nay cho rằng cần phải khảo sát những yếu tố tiên lượng mới, đặc biệt là những yếu tố phân tử, để dự đoán diễn tiến của ung thư sớm hơn, chính xác hơn

1.2.3 Ki67

Protein Ki67 chỉ hiện diện trong các giai đoạn hoạt động của

chu trình tế bào Các nghiên cứu đều ghi nhận có sự tăng biểu hiện

Ki67 trong ung thư Bướu có tỉ lệ Ki67 cao ít thuận lợi về tiên lượng

Tuy nhiên, giá trị tiên lượng của Ki67 hiện vẫn còn đang bàn cãi

1.2.4 Các matrix metalloproteinase (MMP)

Trong hơn 23 loại MMP đã biết, MMP9 (collagenase nhóm IV

92 kDa/gelatinase B) phá hủy chủ yếu collagen nhóm IV của màng

đáy, và nhiều loại chất nền khác như collagen nhóm I, II và elastin

Biểu hiện quá mức MMP9 thường gặp trong 50-60% các trường hợp

UTNMM, liên quan với di căn hạch và với tiên lượng xấu

* Đột biến gen p53: Theo Mineta (1998), đột biến gen p53 trong

ung thư đầu cổ liên quan với sự thất bại xạ trị, với tiên lượng xấu

Trong nghiên cứu này, đột biến gen p53 không liên quan với tiên

lượng, tương tự kết quả của Ahomadegbe (1995)

và di căn Có thể vì vậy, ung thư biểu hiện quá mức MMP9 thường

có độ ác tính cao Sự liên quan này đã được tìm thấy bởi nhiều tác

giả (de Vicente 2005) và trong nghiên cứu này

4.2.2 Về dự đoán di căn hạch

* p53: Ung thư di căn hạch thường biểu hiện quá mức p53 với mức

độ biểu hiện thường cao Nhận định này đã được ghi nhận trong

một số nghiên cứu (Tatemoto 1998, Yao 1999, Pande 2002) và

trong nghiên cứu này

* MDM2, Ki67: Như nhiều nghiên cứu trước đây, chúng tôi không

thấy sự khác biệt về tình trạng di căn hạch theo biểu hiện MDM2,

Ki67 Ngược lại, một số nghiên cứu cho rằng di căn hạch thường

gặp ở những bướu đồng biểu hiện p53/MDM2, tăng biểu hiện Ki67

* MMP9: Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu (Kurahara 1999,

Hong 2000, Katayama 2004) đều cho rằng có sự liên quan giữa biểu

hiện MMP9 với di căn hạch Nghiên cứu này cũng cho kết quả

tương tự Điều này có thể do MMP9 phá hủy chủ yếu collagen

nhóm IV – thành phần chính của màng đáy MMP9 tăng giúp các tế

bào ung thư dễ xuyên qua thành mạch và cho di căn Một lý do

khác nữa là MMP9 còn có thể thúc đẩy sự sinh mạch thông qua

việc giải phóng yếu tố tăng trưởng nội mô mạch (VEGF) MMP9 có

thể có vai trò quan trọng trong sự di căn hạch của UTNMM

4.2.3 Về dự đoán sự đáp ứng với xạ trị

* p53, MDM2, Ki67: Một số nghiên cứu (Couture 2002) nhận thấy

bướu có biểu hiện p53 dương tính, biểu hiện Ki67 thấp thì ít đáp

ứng với xạ trị Tuy nhiên, trong ung thư đầu cổ, giá trị dự đoán sự

không đáp ứng xạ trị của p53 dương tính hay tỉ lệ Ki67 thấp vẫn

còn đang bàn cãi Nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của xạ trị

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu dọc

2.2 Cỡ mẫu

Theo y văn và để đề tài khả thi, cỡ mẫu phù hợp để khảo sát hóa mô miễn dịch là 110 trường hợp

Trong y văn, một số nghiên cứu đột biến gen p53 có cỡ mẫu

nhỏ như nghiên cứu của Gopalakrishnan (1997) báo cáo 4 trường

hợp đột biến gen p53 trong số 10 trường hợp UTNMM, Ibrahim và

c.s (1999) tìm thấy 8 trong số 13 trường hợp UTNMM Do là nghiên

cứu đầu tiên khảo sát đột biến gen p53 ở người Việt Nam và để đề

tài khả thi (xét nghiệm rất tốn kém và phải làm ở Nhật Bản) nên cỡ

mẫu phát hiện đột biến gen p53 là 18 trường hợp

2.3 Mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu về lâm sàng, giải phẫu bệnh, hóa mô miễn dịch được tiến hành trên 110 bệnh nhân UTNMM điều trị tại Bệnh viện Ung Bướu TPHCM từ 15/7/2000 đến 15/7/2002 Trong số này, có 18 bệnh nhân từ 15/7/2000 đến 15/8/2000 được khảo sát sinh học phân

tử về đột biến gen p53

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:

- Có tổn thương ung thư nguyên phát ở hốc miệng

- Có chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm tế bào gai

- Phỏng vấn trực tiếp thói quen nhai trầu, hút thuốc, uống rượu

- Chưa được điều trị ung thư đặc hiệu

- Mẩu mô ung thư có đủ thành phần biểu mô và mô liên kết thuận lợi khảo sát hóa mô miễn dịch và sinh học phân tử

- Theo dõi được tình trạng sống còn sau điều trị cho đến ngày kết thúc ghi nhận (15/10/2004)

Đặc điểm mẫu nghiên cứu:

- Gồm 56 nam và 54 nữ Trong số này, 35 nữ có thói quen nhai

trầu và 49 nam có thói quen hút thuốc

- Thường gặp nhất ở lưỡi (2/3 trước) (47,3%), độ mô học 1 (50%),

giai đoạn trễ (65,5%) Tỉ lệ di căn hạch cổ là 50%

- 99 bệnh nhân (90%) được điều trị bằng xạ trị trong (cắm kim

radium) và/hoặc xạ trị ngoài (máy cobalt-60)

Ngoài ra, để có cơ sở nhận biết sự khác biệt về biểu hiện hóa

mô miễn dịch trong UTNMM so với trong niêm mạc miệng bình

thường, chúng tôi nhuộm hóa mô miễn dịch 26 mẩu mô niêm mạc

miệng bình thường, được sinh thiết từ nướu răng hàm dưới tại Đại

học Y Dược TPHCM trong tháng 3 và 4 năm 2002

2.4 Qui trình thực hiện

¾ Sử dụng mẫu phiếu ghi nhận thống nhất các dữ liệu gồm:

- Thói quen nhai trầu, hút thuốc, uống rượu: qua phỏng vấn

- Khám và đánh giá lâm sàng, cận lâm sàng, chẩn đoán và điều

trị ung thư (ghi lại theo hồ sơ bệnh án)

¾ Khảo sát giải phẫu bệnh

- Mẩu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay phẫu thuật bướu, được

cố định, vùi nến, cắt lát mỏng và nhuộm Hematoxylin-Eosin

thường quy tại Bệnh viện Ung Bướu TPHCM

- Chẩn đoán độ mô học theo cách đánh giá độ mô học của

Jakobsson cải biên theo Anneroth (1987)

¾ Khảo sát sinh học phân tử chẩn đoán đột biến gen p53

- Ly trích DNA: từ mẩu mô sinh thiết ở bướu nguyên phát, bằng

bộ ly trích QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), tại phòng thí

nghiệm sinh học phân tử Đại học Y Dược TPHCM

p53 dương tính Điều này có thể do protein p53 biến đổi tuy bền vững nhưng bị mất chức năng ngừng chu trình tế bào Nhờ vậy, các tế bào bướu không còn bị p53 kiểm soát nữa nên sinh sản liên tục,

thể hiện qua sự tăng biểu hiện Ki67

4.2 Về dự đoán diễn tiến UTNMM của p53, MDM2, Ki67, MMP9 4.2.1 Về độ (ác tính) mô học của UTNMM

* p53: Một số nghiên cứu (De Aráujo 1997, Thongsukai 2001) nêu lêân khi bướu biểu hiện p53 dương tính càng tăng thì độ mô học càng cao Trong nghiên cứu này, biểu hiện p53 dương tính mạnh thường gặp ở những bướu có độ mô học 2 hay độ 3 Huỳnh Anh Lan (1996) tìm thấy p53 biểu hiện dương tính mạnh trong những bướu biệt hóa kém (55,6%) hơn trong những bướu biệt hóa cao (34,8%)

* MDM2: Theo Ralhan (2000), Shwe (2001), những bướu biệt hóa kém thường biểu hiện quá mức MDM2 hay p53/MDM2 Tuy nhiên, đồng quan điểm với Schoelch (1999), với Millon (2001), chúng tôi nhận thấy bướu có độ biệt hóa kém hay độ mô học cao – một trong những yếu tố tiên lượng xấu – thường không biểu hiện MDM2

* Ki67: Theo de Vicente (2002), biểu hiện Ki67 cao thường gặp ở những bướu có độ biệt hóa kém hay vừa Kết quả nghiên cứu này cho thấy biểu hiện Ki67 có sự tương quan thuận với độ mô học Protein p53, MDM2, Ki67 ảnh hưởng chu trình tế bào Có thể chính sự bất thường của những protein này đã giúp tế bào ung thư liên tục bước vào chu trình tế bào, thể hiện chỉ số phân bào cao và độ mô học cao

* MMP9: Biểu hiện MMP9 dương tính phản ánh sự tăng hoạt động phá hủy chất nền ngoại bào, giúp các tế bào ung thư xâm lấn sâu

khác bị biến đổi trong tế bào (như protein MDM2) Nghiên cứu này

phát hiện biểu hiện quá mức MDM2 trong 62,5% các trường hợp

biểu hiện quá mức p53 nhưng không có đột biến gen p53

So sánh tình hình p53, MDM2 trong UTNMM ở một số nước châu

Á cho thấy tỉ lệ biểu hiện quá mức p53 cao Tuy nhiên, ở Ấn Độ,

Đài Loan, Myanmar, thường do tỉ lệ biểu hiện quá mức MDM2 cao;

trong khi ở Nhật Bản và nước ta, biểu hiện quá mức p53 thường liên

quan với đột biến gen p53 hơn là với biểu hiện quá mức MDM2

Bảng 4.9: Đột biến gen p53, biểu hiện p53 và MDM2 trong UTNMM

p53(+)

Biểu hiện MDM2(+)

Đột biến

gen p53(+)

Thói quen nhai trầu ở Việt Nam hiện nay đã giảm rất nhiều và

không còn phổ biến như ở Ấn Độ, Đài Loan; nhưng vẫn còn một số

người nhai trầu (chiếm 4,17% dân số nữ miền nam Việt Nam) tạo

nên sự khác biệt so với Nhật Bản và các nước phương Tây Phải

chăng vì vậy mà tỉ lệ đột biến gen p53 và tỉ lệ biểu hiện quá mức

MDM2 trong UTNMM ở nước ta nằm trong khoảng trung gian giữa

hai cực tỉ lệ cao và thấp của một bên là Nhật Bản, phương Tây, và

một bên là một số nước châu Á có thói quen nhai trầu phổ biến

4.1.7 Liên quan giữa biểu hiện p53 với biểu hiện Ki67

Tương tự kết quả của Iamaroon (2004), nghiên cứu này cho thấy

biểu hiện Ki67 dương tính thường gặp trong những bướu biểu hiện

- Các thí nghiệm tiếp theo được tiến hành tại Bộ môn Ung thư tế bào và phân tử của Đại học Y Nha Tokyo, Nhật Bản

- Phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Nghiên cứu này chỉ khảo

sát đột biến ở các exon 5, 6, 7 và 8 của gen p53 do đa số

(87%) đột biến xảy ra tại các exon này Các exon 5-8 của

gen p53 được khuếch đại qua PCR đánh dấu bằng [α32 P]-dCTP (3000 Ci/mmol) (ICN Biomedicals Inc., CA, Mỹ), thực hiện trong máy luân nhiệt qua 35 chu kỳ nhiệt gồm 94oC (1 phút), 60oC (30 giây), 72oC (30 giây).

- Đa hình chuỗi đơn DNA (SSCP): Biến tính DNA ở 80oC trong

5 phút Điện di trên gel polyacrylamide 6% ở điện thế 40 W,

25oC trong 4 giờ Chụp bản ghi hình và phân tích hình ảnh qua máy BAS 2000 (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Nhật Bản)

- Giải trình tự chuỗi DNA: Chỉ những mẫu DNA đã tìm thấy có

đột biến gen p53 mới cần thiết xác định trình tự các

nucleotide, theo phương pháp Sanger cải tiến, sử dụng bộ PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) Điện di trên gel và phân tích kết quả qua máy giải trình tự DNA tự động (Applied Biosystems Model 373A)

¾ Khảo sát hóa mô miễn dịch

- Qui trình nhuộm theo phương pháp phức hợp avidin-biotin-peroxidase (ABC) sử dụng bộ xét nghiệm Histofine (Nichirei, Nhật Bản) và các kháng thể đơn dòng kháng p53 (DO7), kháng MDM2 (IF2), kháng Ki67 (MIB1) (Dako, Đan Mạch) và kháng MMP9 (56-2A4) (Nhật Bản), được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học miệng Đại học Y Nha Tokyo (Nhật Bản)

- p53, MDM2, Ki67 dương tính khi nhân tế bào bướu nhuộm màu nâu, MMP9 dương tính khi bào tương của tế bào bướu

bắt màu nâu đậm hơn so với tế bào biểu mô bình thường

Bảng 2.4: Thang điểm đánh giá mức độ nhuộm hóa mô miễn dịch

Nhuộm Âm tính Dương tính

¾ Theo dõi đến 15/10/2004 bằng cách ghi nhận kết quả các lần

tái khám theo hồ sơ bệnh án, qua trao đổi thư và điện thoại

- Tiêu chuẩn chẩn đoán di căn hạch: dựa trên chẩn đoán lâm

sàng và/hoặc trên vi thể xác định có di căn hạch

- Tiêu chuẩn chẩn đoán đáp ứng hoàn toàn với xạ trị: Sau khi

xạ trị, bệnh nhân còn sống và không bị tái phát, hoặc nếu tái

phát thì ung thư tái phát vẫn đáp ứng với xạ trị

- Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư tái phát: Có chẩn đoán lâm

sàng tái phát tại bướu nguyên phát và/hoặc hạch cổ, và giải

phẫu bệnh của tổn thương tái phát là carcinôm tế bào gai

- Tiêu chuẩn chẩn đoán tử vong: Khi ở lần tái khám cuối cùng,

bác sĩ đánh giá ung thư diễn tiến nặng không điều trị được

nữa, hoặc người nhà báo tin bệnh nhân tử vong

- Thời gian sống còn ở bệnh nhân tử vong: Từ lúc chẩn đoán

ung thư đến ngày bệnh nhân tử vong, hay thông tin lần tái

khám cuối cùng ghi nhận diễn tiến nặng không điều trị được

- Thời gian sống còn toàn bộ ở bệnh nhân còn sống: Từ lúc

chẩn đoán ung thư đến ngày kết thúc ghi nhận nghiên cứu

¾ Xử lý dữ liệu

Nhập và xử lý dữ liệu bằng phần mềm Excel và Stata 8.0, với

kiểm định χ2, hệ số tương quan Spearman, phương pháp

Kaplan-Meier và kiểm định log-rank Liên quan được xem là có ý nghĩa

khi P < 0,05

4.1.3 Biểu hiện của protein MDM2 trong UTNMM

Tỉ lệ biểu hiện quá mức MDM2 là 36,4%, gần tương tự tỉ lệ 36,2% trong một nghiên cứu ở Nhật Bản (Yanamoto 2002), tỉ lệ 25,9% ở Trung Quốc (Ng 1999) ; nhưng thấp hơn tỉ lệ 78% ở Ấn Độ (Agarwal 1999), 69% ở Đài Loan (Huang 2000)

Kết quả cho thấy biểu hiện MDM2 không liên quan với lâm sàng Mặc dù Agarwal (1999), Huang (2001) tìm thấy tỉ lệ cao biểu hiện MDM2 nhưng vẫn không thấy sự liên quan này

4.1.4 Biểu hiện của protein Ki67 trong UTNMM

Tỉ lệ cao về tăng biểu hiện Ki67 như 80% (Schoelch 1999), 71% (Ng 1999), 62,9% (de Vicente 2002), 67,3% (nghiên cứu này) phản ánh UTNMM thường có hoạt động sinh sản tế bào ung thư mạnh Mặc dù cách chọn điểm ngưỡng quy định kết quả dương tính khác nhau, nhưng đa số các nghiên cứu trước đây và nghiên cứu này ghi nhận biểu hiện Ki67 không liên quan với giới tính, thói quen, vị trí, giai đoạn, di căn hạch

4.1.5 Biểu hiện của protein MMP9 trong UTNMM

Tỉ lệ MMP9 dương tính khá cao, trong nhiều nghiên cứu như 53,1% (Kurahara 1999), 60,9% (Guttman 2004) và trong nghiên cứu này (56,4%), cho thấy MMP9 thường tham gia trong UTNMM Cũng như nhiều nghiên cứu trước đây (Gu 2004), nghiên cứu này cho kết quả biểu hiện MMP9 không liên quan với tuổi, giới tính, thói quen, vị trí, kích thước bướu

4.1.6 Liên quan đột biến gen p53, biểu hiện p53 và biểu hiện MDM2

Theo y văn, ngoài nguyên nhân đột biến gen p53, sự trở nên

bền vững của protein p53 còn do protein của virut hoặc do protein

223, 234–258, 270–286 Nghiên cứu này phát hiện đột biến tại các

điểm nóng codon 156, 175, 237, 270

Nucleotide đột biến: Khoảng 2/3 các đột biến gen p53 trong ung

thư đầu cổ xảy ra tại các vị trí guanin Nghiên cứu này cũng cho kết

quả đột biến thường xảy ra tại các guanin của gen p53

Kiểu đột biến: Đa số là đột biến điểm, và là đột biến sai nghĩa

Protein p53 đột biến: Đa số đột biến gen p53 là đột biến sai

nghĩa sản xuất protein p53 đột biến có cấu hình bất thường, bền

vững hơn, dẫn đến tích tụ nhiều trong nhân nên biểu hiện quá mức

khi nhuộm hóa mô miễn dịch (Greenblatt 1994) Vì vậy, các nghiên

cứu đều tìm thấy tỉ lệ cao về biểu hiện quá mức protein p53 đột

biến như tỉ lệ 85% (Ahomadegbe 1995), 92% (Saranath 1999),

87,5% trong nghiên cứu này

4.1.2 Biểu hiện của protein p53 trong UTNMM

Tỉ lệ 75,5% biểu hiện quá mức p53 gần tương tự với tỉ lệ 78,9%

trong một nghiên cứu trong nước trước đây (Huỳnh Anh Lan 1996),

và với kết quả của nhiều nghiên cứu khác như 75% ở Anh (Kaur

1994), 70% ở Thái Lan (Kerdpon 2001), 63,8% ở Nhật Bản

(Yanamoto 2002) Kết quả này một lần nữa khẳng định người Việt

Nam thường có protein p53 biểu hiện quá mức khi bị UTNMM

Nghiên cứu này cũng như nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy

biểu hiện p53 không liên quan với thói quen hút huốc, nhai trầu,

thậm chí khi phân tích trên cỡ mẫu lớn như nghiên cứu của

Thongsukai (2001) trên 156 trường hợp UTNMM ở Thái Lan; cũng

như không liên quan với giới tính, vị trí, kích thước bướu, giai đoạn

lâm sàng Tỉ lệ biểu hiện quá mức p53 tăng cao có ý nghĩa ở những

bệnh nhân trên 60 tuổi, tương tự kết quả nghiên cứu của Xu (1998)

CHUƠNG 3: KẾT QUẢ

3.1 Đột biến gen p53 trong UTNMM Bảng 3.7: Đột biến gen p53 trong 18 trường hợp UTNMM

thói quen

Vị trí/ TNM/

Độ mô học

Đột biến

gen p53

Biểu hiện protein p53

- 8 trường hợp có đột biến gen p53, chiếm tỉ lệ 44,4%, gồm đột

biến tại exon 5 (2 trường hợp), exon 7 (2 trường hợp), exon 8 (3 trường hợp), exon 7 cùng exon 8 (1 trường hợp) Không gặp đột biến tại exon 6

- 100% đột biến điểm, tại codon 156, 175, 237 và 270, trong đó 66,7% đột biến tại các guanin

- Đột biến sai nghĩa gặp trong 7 trường hợp biểu hiện p53(+), đột biến ghép nối sai gặp trong 1 trường hợp biểu hiện p53(-) và

trong 1 trường hợp kèm đột biến sai nghĩa biểu hiện p53(+)

53 và tron CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1.Đột biến gen p53 và biểu hiện p53, MDM2, Ki67, MMP9

4.1.1 Đột biến gen p53 trong UTNMM

Tỉ lệ đột biến: Đột biến gen p53 khá phổ biến trong UTNMM ở

Nhật Bản (63%, Sakai 1992), châu Âu (67%, Ahomadegbe 1995), Mỹ (50%, Xu 1998) – nơi mà hút thuốc lá và uống rượu được xem là những yếu tố nguy cơ chính trong UTNMM Ngược lại, tỉ lệ này tương đối thấp ở những nước có thói quen nhai trầu phổ biến Mặc dù mẫu nghiên cứu này cũng có những bệnh nhân nhai trầu, nhưng

kết quả tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%) tương đối cao hơn ở những

nước phổ biến thói quen nhai trầu như Ấn Độ: 17 – 21% (Munirajan

1996, Saranath 1999), Đài Loan: 5,4% (Kuo 1999), Myanmar:

17,5% (Shwe 2001) Kết quả này cho thấy gen p53 của người Việt

Nam dễ bị đột biến trong quá trình sinh ung thư ở niêm mạc miệng

Dù tỉ lệ đột biến gen p53 có thể khác nhau tùy theo mỗi nước,

nhưng kết quả nghiên cứu này cũng như của các nghiên cứu trước

đây trên thế giới về đột biến gen p53 trong UTNMM đều thống

nhất những điểm sau:

Số exon đột biến: Đa số đột biến xảy ra trên một exon, mặc dù

vị trí exon dễ bị đột biến nhất thì có thể khác nhau Nhật Bản (Sakai 1992), Đài Loan (Hsieh 2001), Myanmar (Swe 2001) thường gặp đột biến tại exon 5, trong khi đó exon 8 dường như là vùng đích dễ bị đột biến nhất trong UTNMM ở người Việt Nam, cũng như ở Ấn Độ (Kannan 1999)

Codon đột biến: Đột biến thường tập trung tại các điểm đột biến

nóng như các codon 130–142, 151–164, 171–181, 193–200, 213–

Hình 3.10: Đột biến điểm gen p53 và biểu hiện quá mức p53

A Đột biến gen p53 tại exon 8 được phát hiện qua PCR-SSCP

B Đột biến điểm thay thế adenin bằng thymin được phát hiện

qua kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

C Biểu hiện quá mức p53 với mức độ mạnh (3+) (x200)

AAA

M 2 M 4 M 5 M 9 M18 M 6 M 9 M12 M15

∗

∗

B

A

A B C

Hình 3.9: Kết quả PCR-SSCP (+) cho thấy đột biến gen p53 (*)

A Đột biến tại exon 5 (mẫu số thứ tự 2, 4)

B Đột biến tại exon 7 (mẫu số thứ tự 5, 9, 18)

C Đột biến tại exon 8 (mẫu số thứ tự 6, 9, 12, 15).

C