Nghiên cứu ảnh hưởng của diclodietyl sulfid lên protein, ADN trong cơ vân, gan và tác dụng điều trị của natri thiosulfat và naturenz trên động vật thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của diclodietyl sulfid lên protein, ADN trong cơ vân, gan và tác dụng điều trị của natri thiosulfat và naturenz trên động vật thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

Nguyễn Quốc Chiến

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DICLODIETYLSULFID

LÊN PROTEIN, ADN TRONG CƠ VÂN, GAN VÀ

TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA NATRI THIOSULFAT VÀ

NATURENZ TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Độc chất

Mã số: 62 72 50 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2008

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguyễn Bằng Quyền

TS Hoàng Công Minh

Phản biện 1: GS TSKH Đái Duy Ban

Phản biện 2: GS TS Đào Văn Phan

Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Khắc Hải

Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước, họp tại Học viện quân y

vào hồi 14 giờ 00 ngày 14 tháng 7 năm 2008

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện quốc gia

- Thư viện Học viện quân y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Diclodietyl sulfid (DCDS) là chất độc gây chết người thuộc nhóm

chất độc gây loét nát, được quân đội nhiều nước trang bị chính thức

trong vũ khí hóa học DCDS được sử dụng nhiều lần từ cuối CTTG lần

thứ nhất cho tới tận những năm gần đây, để lại những hậu quả nặng nề

Với khối lượng tồn đọng lớn, theo nhiều chuyên gia, DCDS vẫn có khả

năng được sử dụng trong các cuộc xung đột vũ trang Đặc biệt gần đây

xuất hiện một nguy cơ mới là DCDS có thể được dùng vào mục đích

khủng bố

Xuất phát từ tính chất nguy hiểm của DCDS, nhiều công trình

nghiên cứu về chất độc này đã được tiến hành liên tục ở nhiều nước Ở

Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu về DCDS trong lĩnh vực y -

sinh học, song cho đến nay, một số vấn đề về tác động của DCDS vẫn

chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn DCDS là tác nhân alkyl hóa gây tổn

thương ADN, làm rối loạn tổng hợp protein, rối loạn chuyển hóa, suy

mòn Tuy nhiên, chưa thấy có tài liệu nào công bố chi tiết về những biến

đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trong các mô sinh học Do

chưa có thuốc chống độc đặc hiệu nên việc điều trị nhiễm độc DCDS

còn gặp khó khăn, chủ yếu vẫn là dùng natri thiosulfat kết hợp với điều

trị các tổn thương tại chỗ Naturenz là một chế phẩm mới được sản xuất

từ các nguyên liệu tự nhiên trong nước Naturenz có tác dụng chống oxy

hóa, cải thiện chức năng gan, tăng cường phục hồi cơ quan tạo máu, hạn

chế tổn thương do các chất độc hóa học gây nên Điều này gợi ý cho

chúng tôi thử nghiệm sử dụng naturenz để điều trị nhiễm độc DCDS

Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:

1) Xác định sự biến đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trong

mô cơ vân, gan trên động vật nhiễm độc diclodietyl sulfid

2) Đánh giá tác dụng của naturenz phối hợp với natri thiosulfat trong điều trị nhiễm độc DCDS thông qua sự biến đổi hàm lượng và thành phần protein, ADN trên động vật thực nghiệm

Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI: Đề tài có đóng góp mới về mặt khoa học là:

1 Trên chuột nhắt trắng, DCDS gây giảm nhẹ hàm lượng ADN trong gan và cơ; giảm hàm lượng protein trong gan và cơ; giảm hàm lượng nhóm -SH và hoạt độ peroxidase trong gan; gây tổn thương oxy hóa protein thể hiện ở tăng hàm lượng carbonyl protein Phát hiện một thành phần protein lạ trong cơ vân trên điện di ở ngày thứ nhất sau nhiễm độc

2 Điều trị theo hướng kết hợp chống oxy hóa bằng naturenz trên động vật nhiễm độc DCDS đã thấy có kết quả tương đối tốt theo sự biến đổi các chỉ tiêu trên

CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN:

Luận án gồm 135 trang, có 4 chương (không kể phần đặt vấn đề

và kết luận): Tổng quan; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu; Kết quả; Bàn luận Phần kết quả có 27 bảng, 6 ảnh và 12 biểu đồ Luận án tham khảo tổng cộng 183 tài liệu, trong đó 21 tài liệu tiếng Việt, 7 tài liệu tiếng Nga và 155 tài liệu tiếng Anh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung của chất độc diclodietyl sulfid

DCDS, công thức hóa học S(CH2-CH2Cl)2, được trang bị trong VKHH của quân đội nhiều nước do có độc tính cao, xâm nhập cơ thể qua nhiều đường và gây ô nhiễm kéo dài DCDS gây tổn thương alkyl hóa cho hầu hết các đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là

3 ADN và protein Gần đây người ta cũng chỉ ra một số con đường trung

gian trong cơ chế gây độc như tổn thương oxy hóa thông qua các gốc tự

do và giảm các chất chống oxy hóa, chết tế bào theo chương trình,

1.2 Độc động học của diclodietyl sulfid

DCDS thâm nhập qua da, niêm mạc khá nhanh và được phân bố

toàn thân Các phản ứng trong cơ thể gồm alkyl hóa trực tiếp, liên hợp,

thủy phân và oxy hóa DCDS được chuyển hóa và thải trừ khá nhanh,

chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng các thiodiglycol Có nhiều phương

pháp phát hiện DCDS và các sản phẩm chuyển hóa của nó trong mẫu

sinh học và môi trường, phổ biến nhất hiện nay là sắc ký khí/khối phổ

Gần đây người ta đã xác định được các ADN và protein bị alkyl hóa

1.3 Các tổn thương và biểu hiện lâm sàng trong nhiễm độc

diclodietyl sulfid

Tùy theo liều và đường nhiễm, sau thời gian tiềm ngắn, DCDS

gây các tổn thương viêm - hoại tử tại chỗ và bội nhiễm khuẩn, dẫn tới

các biểu hiện lâm sàng ở da, niêm mạc mắt và đường hô hấp, và có thể

gây tử vong DCDS hấp thu gây tác động toàn thân gồm các rối loạn

chuyển hóa, suy mòn, giảm miễn dịch, đặc biệt tác động mạnh tới các

mô tế bào đổi mới nhanh Gần đây người ta quan tâm nhiều tới các tác

động dài kỳ sau nhiễm độc, chủ yếu gồm các rối loạn bệnh lý ở da, mắt,

đường hô hấp, thần kinh ngoại vi và gây ung thư

1.4 Dự phòng và điều trị nhiễm độc diclodietyl sulfid

Hiện chưa có thuốc chống độc đặc hiệu; natri thiosulfat được

chấp nhận sử dụng làm thuốc chống độc toàn thân Nguyên tắc chung

trong cấp cứu, điều trị nhiễm độc gồm: giảm hấp thu, giảm gánh nặng

của cơ thể, và can thiệp vào các cơ chế tác động đã biết Nhiều thuốc

chống oxy hóa, trong đó có naturenz, được khẳng định có hiệu quả trong

điều trị nhiễm DCDS (Hoàng Công Minh, 2001; Bhattachrya R., 2006)

4

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình 20g

- Chất độc diclodietylsulfid do Học viện Quân y cung cấp

- Thuốc điều trị: natri thiosulfat (Merck); naturenz do Viện Công nghệ sinh học cung cấp dạng viên nén 0,50 g

2 2 Phương pháp nghiên cứu

- Phân nhóm động vật nghiên cứu: Ngoài số lượng để nghiên cứu thăm

dò, số chuột nhắt dành cho nghiên cứu các chỉ tiêu chính được chia thành 4 nhóm với ký hiệu và số lượng như sau: nhóm đối chứng (ĐC, 50 con), nhóm nhiễm độc DCDS không điều trị (DCDS, 100 con), nhóm

NĐ điều trị natri thiosulfat đơn thuần (NTS, 100 con), và nhóm NĐ điều trị thiosulfat + naturenz (NTS+Nz, 100 con)

- Phương pháp và liều gây NĐ: Chuột được gây nhiễm độc qua da 1 lần với liều 9 mg/kg thể trọng

- Liều thuốc và cách dùng: natri thiosulfat tiêm màng bụng với liều 0,5 g/kg/ngày trong 3 ngày đầu Naturenz cho uống với liều 250 mg/kg/ngày trong 30 ngày

2.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp tiến hành

- Tỷ lệ động vật sống sót: xác định bằng cách đếm số lượng còn sống vào buổi sáng, tính tỷ lệ % Thời gian sống trung bình tính trong 30 ngày Trọng lượng động vật: xác định bằng cách cân chính xác vào buổi sáng Trọng lượng gan, lách, thận: xác định bằng cách cân chính xác

ngay sau khi mổ động vật

- Hàm lượng protein trong gan và cơ vân: thông qua định lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kjeldahl Tỷ lệ hàm lượng các thành phần

protein ở cơ vân và gan theo kích thước phân tử: Xác định bằng điện di (SDS-PAGE) trong hệ đệm Tris-glycin Hoạt độ enzym peroxidase trong

gan: Xác định theo phương pháp của Josephy (1982); Kết quả biểu thị

bằng IU/mg protein Hàm lượng nhóm -SH trong gan: Xác định theo

phương pháp của Ellmann (1952); Kết quả biểu thị bằng nM/mg protein

Hàm l ượng carbonyl protein trong gan và cơ: Xác định bằng phương

pháp đo quang theo Adams (2001); Kết quả biểu thị bằng nM/mg

protein Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân: Tách chiết và định lượng

ADN theo Blin và Stafford (1976) có thay đổi, định lượng theo OD260

Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agarose 0,4%

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các chỉ tiêu nghiên cứu đều được xử lý thống kê; so sánh

thống kê giữa các nhóm DCDS - ĐC, 2 nhóm NĐ có điều trị với nhau

và với nhóm DCDS

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tỷ lệ và thời gian sống sót, thay đổi trọng lượng cơ thể, trọng

lượng gan, thận, lách động vật thực nghiệm

B ảng 3.2: Tỷ lệ chuột sống sót sau nhiễm độc với liều 9 mg/kg ở các

Nhận xét: - Ở cả hai nhóm nhiễm độc có điều trị, tỷ lệ chuột sống sót

tăng đáng kể so với nhóm không được điều trị

B ảng 3.3: Thể trọng chuột ở các nhóm nghiên cứu tại các thời điểm

ĐC(1) 20,0 ± 1,1 21,7 ± 0,9 22,6 ± 1,5 24,9 ± 1,1

NTS (3) 19,3 ± 0,7 16,0 ± 1,1 17,7 ± 0,8 18,1 ± 1,2

(NTS+Nz) (4) 19,3 ±1,0 17,7 ±1,2** 18,4 ±0,7** 20,0 ±0,7**

**: p < 0,01 (tương ứng theo p2-1, p3-2 và p4-2)

Nhận xét: - So với nhóm ĐC, nhóm DCDS có thể trọng thấp hơn ở ngày thứ 7 (giảm 21,7% so với ban đầu), ngày thứ 15 và 30 Thể trọng chuột nhóm NTS không khác biệt đáng kể so với nhóm DCDS

ở cả 4 thời điểm Thể trọng chuột nhóm NTS+Nz cao hơn so với nhóm DCDS và NTS ở 3 thời điểm sau, và đạt thể trọng ban đầu vào ngày thứ 30

B ảng 3.7: Tỷ lệ trọng lượng gan/ thể trọng chuột ở các nhóm sau nhi ễm độc tại các thời điểm khảo sát (mg/g X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 63,6 ± 5,8 63,8 ± 3,3 63,7 ± 5,2 63,4 ± 2,4 DCDS(2) 76,3 ± 9,8** 49,2 ±12,6** 53,7 ±11,1** 55,3 ±7,5**

NTS(3) 70,6 ± 8,2 56,7 ± 5,2* 56,4 ± 6,9 57,1 ± 3,6 NTS+ Nz(4) 67,3 ± 6,5* 56,8 ± 4,7* 61,0 ± 4,7* 61,3 ± 3,5*

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05 Nhận xét: - So với ĐC, nhóm DCDS có tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng cao hơn ở ngày thứ nhất và thấp hơn ở 3 thời điểm sau Nhóm NTS có tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng chỉ cao hơn so với nhóm DCDS ở ngày thứ 7 Nhóm NTS+Nz có trọng lượng gan ở ngày đầu thấp hơn và 3 thời điểm sau cao hơn so với của nhóm DCDS

B ảng 3.8: Tỷ lệ trọng lượng thận so với thể trọng chuột ở các nhóm

ĐC(1) 12,8 ± 1,5 14,4 ± 0,8 14,4 ± 1,1 14,3 ± 0,7 DCDS(2) 13,2 ± 1,5 12,3 ± 1,9** 13,7 ± 1,8 13,9 ± 2,5 NTS(3) 13,9 ± 1,7 14,1 ± 2,2* 14,0 ± 1,6 14,0 ± 1,1 NTS+ Nz (4) 13,0 ± 1,7 13,7 ± 1,8* 14,0 ± 1,7 14,0 ± 1,5

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

7 Nhận xét: - Tỷ lệ trọng lượng thận/thể trọng ở nhóm DCDS chỉ giảm

rõ rệt ở ngày thứ 7 Cả hai nhóm nhiễm độc được điều trị đều có tỷ lệ

trọng lượng thận/thể trọng ở thời điểm ngày thứ 7 cao hơn so với

nhóm không điều trị

B ảng 3.9: Tỷ lệ trọng lượng lách so với thể trọng chuột ở các nhóm

ĐC(1) 3,3 ± 0,4 4,1 ± 0,5 4,0 ± 0,3 4,0 ± 0,4

DCDS(2) 3,5 ± 0,5 2,9 ± 0,4** 3,4 ± 0,7* 3,5 ± 0,6*

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: Tỷ lệ trọng lượng lách/thể trọng ở nhóm DCDS thấp hơn

so với đối chứng ở các thời điểm ngày thứ 7, 15 và 30; nhóm NTS

cao hơn so với của nhóm DCDS ở 3 thời điểm sau; nhóm NTS+Nz

tăng liên tục và luôn tương đương hoặc cao hơn so với nhóm ĐC

3.2 Hàm lượng nitơ trong gan và cơ vân

B ảng 3.10: Hàm lượng nitơ trong gan (mg/g) chuột ở các nhóm tại

ĐC(1) 24,37 ± 0,76 24,68 ± 0,63 25,18 ± 1,03 25,19 ± 0,98

DCDS(2) 23,41 ± 1,56 23,44 ±1,43* 23,21 ±1,87** 23,29 ±1,60**

NTS+Nz (4) 23,19 ±1,96 23,58 ±1,37 25,17 ±0,78** 25,23 ±1,25**

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Hàm lượng nitơ trong gan nhóm DCDS thấp hơn đối

chứng ở ngày thứ 7, 15 và 30; Diễn biến hàm lượng nitơ có tương

8 quan thuận với diễn biến thể trọng (r = 0,81) Nhóm NTS có hàm lượng nitơ tương đương với nhóm DCDS ở tất cả các thời điểm Nhóm NTS+Nz có hàm lượng nitơ cao hơn so với nhóm NTS ở ngày thứ 30

B ảng 3.11: Hàm lượng nitơ trong mô cơ vân (mg/g) các nhóm chuột

t ại các thời điểm (X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 29,99 ± 0,92 30,77 ± 0,87 31,25 ± 0,85 31,50 ± 1,05 DCDS(2) 28,82 ± 2,01 27,44 ±1,91** 27,86 ±2,06** 28,48 ±2,17**

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05 Nhận xét: - Hàm lượng nitơ trong cơ vân nhóm DCDS giảm đáng

kể so với ĐC ở 3 thời điểm sau, và có tương quan thuận với thể trọng động vật (r = 0,98) Nhóm NTS có hàm lượng nitơ không khác biệt

so với của nhóm DCDS (p3-2 > 0,05) Ở nhóm NTS+Nz, hàm lượng nitơ tăng dần theo thời gian, đến ngày thứ 30 thì tương đương với của nhóm ĐC và cao hơn rõ rệt so với nhóm DCDS (p4-2 < 0,05) cũng như nhóm NTS (p4-3 < 0,01)

3.3 Hàm lượng protein carbonyl trong mô gan và cơ vân động vật thực nghiệm

B ảng 3.12 : Hàm lượng protein carbonyl (nM/mg) trong gan chuột ở

ĐC(1) 3,77 ± 0,54 3,15 ± 0,68 3,75 ± 0,48 3,50 ± 0,69 DCDS(2) 9,81 ± 1,91** 9,26 ± 2,35** 9,74 ± 2,09** 7,40 ± 1,84**

*: p < 0,05; **: p< 0,001 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X ±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - So với đối chứng, hàm lượng carbonyl trong gan ở hai

nhóm DCDS và NTS đã tăng gấp gần 3 lần ngay ở ngày thứ nhất; Sự

khác biệt giữa hai nhóm này chưa có ý nghĩa thống kê Nhóm

NTS+Nz có hàm lượng carbonyl thấp hơn rõ ràng so với nhóm

DCDS cũng như nhóm NTS ở các thời điểm ngày thứ 7, 15 và 30

B ảng 3.13: Hàm lượng protein carbonyl (nM/mg) trong cơ vân

chu ột ở các nhóm tại các thời điểm khác nhau (X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 3,57 ± 0,50 3,16 ± 0,70 3,42 ± 0,57 3,26 ± 0,66

DCDS(2) 9,34 ± 1,60** 9,39 ± 1,47** 8,80 ± 1,68** 6,56 ± 1,29**

NTS+Nz (4) 8,59 ± 1,84 6,70 ± 2,06** 5,35 ± 0,95** 3,34 ± 1,34**

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Nhóm DCDS và nhóm NTS có hàm lượng carbonyl

trong cơ vân tương đương nhau ở các thời điểm và cao hơn rõ rệt so

với nhóm ĐC Ở nhóm NTS+Nz, hàm lượng carbonyl ngày thứ nhất

cũng tăng cao như ở nhóm DCDS, nhưng sau đó đều thấp hơn so với

nhóm DCDS và trở về mức bình thường vào ngày thứ 30

3.4 Hoạt độ peroxidase và hàm lượng nhóm -SH trong gan

B ảng 3.14: Hoạt độ peroxidase (IU/mg protein) trong gan các nhóm

chu ột tại các thời điểm khảo sát (X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 8,83 ± 1,20 8,85 ± 1,14 9,02 ± 1,06 8,96 ± 0,97

DCDS(2) 9,23 ± 1,24 6,27 ± 1,02** 7,65 ± 0,88** 7,73 ± 1,38*

NTS+Nz (4) 9,53 ± 1,16 8,21 ± 1,34** 8,86 ± 1,54* 10,71 ± 1,92**

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hoạt độ POD thấp hơn so với nhóm ĐC

ở ngày thứ 7, 15 và 30 (p2-1 < 0,05); giảm nhiều nhất vào ngày thứ 7 (giảm 29,2%) Hoạt độ POD trong gan của nhóm NTS không khác biệt so với nhóm DCDS Nhóm NTS+Nz có hoạt độ POD tương đương với của nhóm ĐC, riêng ngày thứ 30 lại cao hơn đối chứng

B ảng 3.15: Hàm lượng nhóm sulfhydryl trong gan chuột tại các thời điểm sau nhiễm độc (nM/mg protein X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 0,31 ± 0,03 0,35 ± 0,04 0,35 ± 0,04 0,31 ± 0,03 DCDS(2) 0,28 ± 0,05 0,21 ± 0,03** 0,25 ± 0,04** 0,25 ± 0,04**

NTS+ Nz) (4) 0,30 ± 0,05 0,31 ± 0,04** 0,35 ± 0,04** 0,31 ± 0,03**

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hàm lượng nhóm -SH giảm ở ngày thứ 7 (giảm 39,5% so với ĐC), ngày thứ 15 (-27,8%) và 30 (-20,0%) Hàm lượng -SH trong gan nhóm NTS chỉ cao hơn nhóm DCDS (p3-2 < 0,01) ở ngày thứ 7 và 15 Nhóm NTS+Nz có hàm lượng -SH tự do tương đương với của nhóm ĐC tại cả 4 thời điểm và cao hơn so với nhóm NTS vào ngày thứ 15 và 30

3.5 Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân chuột

Sau khi tách chiết, các mẫu ADN gan và cơ đều có độ sạch nằm trong giới hạn cho phép định lượng (OD260/OD280 > 1,7)

11

B ảng 3.16: Hàm lượng ADN trong mô gan chuột (µg/g) tại các thời

điểm sau nhiễm độc (X ± SD, n = 10)

ĐC(1) 9617 ± 961 9721 ± 919 10461 ± 1011 10753 ± 991

DCDS(2) 9409 ± 1111 8569 ± 1066** 9447 ± 1126* 11630 ± 1706

NTS (3) 9514 ± 1369 9411 ± 885* 10504 ± 1229* 11020 ± 1301

NTS+ Nz (4) 9445 ± 986 9921 ± 926** 10309 ± 1048* 10559 ± 1170

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Hàm lượng ADN ở nhóm DCDS ngày thứ 7 và 15 thấp

hơn do với ĐC Mức độ giảm thì không lớn (≈ 13% so với ĐC)

Nhóm NTS và NTS+Nz có hàm lượng ADN cao hơn rõ rệt so với

nhóm DCDS ở các thời điểm ngày thứ 7 và 15

B ảng 3.17: Hàm lượng ADN trong mô cơ vân chuột (µg/g mô) tại

ĐC(1) 5842 ± 522 6190 ± 477 6626 ± 442 6955 ± 347

DCDS(2) 4739 ± 562** 4911 ± 555** 6766 ± 845 7046 ± 698

NTS (3) 5346 ± 552* 5570 ± 465** 6946 ± 683 7003 ± 812

NTS+ Nz (4) 5757 ± 551** 5954 ± 567** 6931 ± 652 6903 ± 791

*: p < 0,05; **: p< 0,01 (tương ứng p2-1, p3-2 và p4-2) X±SD: p4-3<0,05

Nhận xét: - Ở nhóm DCDS, hàm lượng ADN trong cơ vân thấp hơn

so với nhóm ĐC chỉ ở ngày thứ nhất và thứ 7 Hai nhóm được điều

trị có hàm lượng ADN tại các thời điểm ngày thứ nhất và ngày thứ 7

đều cao hơn rõ rệt so với nhóm DCDS

12

3.6 Hình ảnh điện di ADN tách từ gan và cơ vân chuột

Ảnh 3-1: Hình ảnh điện di ADN genom mẫu gan và cơ vân chuột các

nhóm ngày th ứ nhất và ngày thứ 7 (không dùng kit) Ký hiệu mẫu: 1 - 8:

mẫu ngày thứ 1 (lần lượt của 4 nhóm ĐC-DCDS-NTS-NTS+Nz - mỗi nhóm 2 mẫu, mẫu số lẻ là gan, số chẵn là cơ); từ 9 - 16: mẫu ngày 7 (theo 4 nhóm tương tự ngày 1); a-i: mẫu ngày 15 và k-r: mẫu ngày 30 (xếp theo thứ tự 4 nhóm như ngày 1, mẫu gan xen kẽ mẫu cơ)

Ảnh 3-2: ADN genom tách từ mẫu gan và cơ vân (xếp xen kẽ mẫu

gan-c ơ; sử dụng kit của Sigma) Nhóm ĐC (a, b, k, l, 1, 2, 9, 10), nhóm

DCDS (c, d, m, n, 3, 4, 11, 12), nhóm NTS (e, g, o, p, 5, 6, 13, 14) và

nhóm NTS+Nz (h, i, q, r, 7, 8, 15, 16) tại các thời điểm: ngày thứ nhất

(A), th ứ 7 (B), 15 (C) và thứ 30 (D)

Nhận xét: chưa phát hiện có sự thay đổi ADN nào giữa các

nhóm cũng như giữa các thời điểm Tiến hành phân tích một số mẫu

bằng kit của hãng Sigma cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng

kể về hàm lượng ADN, song hình ảnh điện di có cải thiện rõ rệt (ảnh

3-2)

3.7 Kết quả nghiên cứu protein cơ vân và gan chuột bằng điện di

Ảnh 3-4: Trắc diện mật độ quang gel điện di protein mẫu gan cả 4 nhóm

chu ột tại các thời điểm

Ảnh trái: ngày thứ 7; ảnh phải: ngày thứ 30

Trên các gel polyacrylamid sử dụng, bằng phần mềm chúng tôi đã

phân tích được từ 42 - 50 thành phần protein theo kích thước phân tử

trong các mẫu gan của động vật

B ảng 3-18: Thành phần protein trong gan chuột ngày thứ nhất

B ảng 3-19: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 7

B ảng 3-20: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 15

B ảng 3-21: Các thành phần protein trong gan chuột ngày thứ 30

Nhận xét chung: So với thời điểm ngày thứ nhất, các thành phần

protein trong gan theo kích thước phân tử xác định được ở 3 thời điểm

sau có chênh lệch không lớn Giữa các nhóm ở mỗi thời điểm có một số

khác biệt nhất định về khối lượng tương đối ở một vài thành phần, song

sự chênh lệch là không lớn và chưa có chiều hướng rõ ràng Tỷ lệ khối

lượng của từng thành phần nhìn chung chưa khác biệt đáng kể giữa các nhóm So sánh giữa các thời điểm cũng chưa thấy có sự thay đổi đáng kể nào về kích thước các thành phần cũng như khối lượng tương đối của từng thành phần

Ảnh 3-6: Trắc diện mật độ quang gel tách protein cơ vân của các nhóm

chu ột ngày thứ nhất A: Nhóm ĐC; B: nhóm DCDS

B ảng 3-22: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ nhất

Nhận xét: Cả 3 nhóm DCDS, NTS và NTS+Nz có một thành phần protein kích thước 32,2 kDa với khối lượng tương đối trung bình khoảng 1,4% mà không phát hiện thấy ở một số mẫu cơ của nhóm đối chứng Còn lại không thấy có khác biệt đáng kể nào về số lượng, kích thước cũng như khối lượng tương đối của các thành phần protein giữa các nhóm

B ảng 3-23: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 7

B ảng 3-24: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 15

B ảng 3-25: Các thành phần protein trong cơ vân chuột ngày thứ 30

Nhận xét chung: Các gel sử dụng đã tách được khoảng 40 thành phần protein của mẫu cơ vân theo kích thước phân tử, trong đó các thành phần chính là 200 - 42,8 - 35,8 - 31 - 23,2 - 16 và 10,7 kDa Tại các thời điểm, các thành phần protein trong cơ vân chuột xác định được

15 tương đối giống nhau, chưa phát hiện thấy thành phần bất thường nào ở

các nhóm gây nhiễm độc Khối lượng tương đối của một số thành phần

có dao động chút ít ở các thời điểm song không thể hiện một xu hướng

chắc chắn nào

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của chất độc diclodietyl sulfid đến động vật thực

nghiệm trên các chỉ tiêu nghiên cứu

Tác động gây chết động vật thực nghiệm của diclodietyl sulfid

Với các liều 6,5 - 9 - 11,5 và 14 mg/kg, DCDS gây chết và giảm

thời gian sống trung bình của chuột có tương quan với liều nhiễm

Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới thể trọng và trọng lượng gan, thận, lách

Nguyên nhân gây suy mòn trong nhiễm độc cho tới nay được giải

thích theo gợi ý từ những rối loạn chuyển hóa bao gồm tăng tiêu hủy các

protein và chết tế bào, hạn chế đường phân do cạn kiệt NAD+ và rối loạn

tổng hợp các enzym

Ở ngày thứ nhất, tỷ lệ trọng lượng gan/thể trọng tăng cao có thể

do gan bị xung huyết Ngày thứ 7, 15 và 30, tỷ lệ trọng lượng gan/thể

trọng thấp hơn đối chứng có thể do hậu quả của các tổn thương hoại tử,

do cạn kiệt các dự trữ glycogen, mỡ, acid amin và protein trong gan dưới

tác động của chất độc Kết quả giảm trọng lượng thận có thể liên quan

đến giảm các vật chất dự trữ (đường, lipid, protid) ở tạng và toàn bộ cơ

thể nói chung Ngoài ra trọng lượng thận giảm ở đây cũng có thể liên

quan đến các tổn thương chết tế bào, hoại tử xảy ra trong nhiễm độc Ở

nhóm nhiễm độc không được điều trị, tỷ lệ trọng lượng lách/thể trọng

chuột giảm mạnh nhất ở ngày thứ 7 (-29,3%) Nguyên nhân chủ yếu có

thể là hoại tử và chết tế bào do CĐ tác động mạnh lên các mô sinh sản

nhanh

16

Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hàm lượng và thành phần protein

trong mô c ơ vân và gan động vật

Qua kết quả của nhóm DCDS, chúng tôi nghĩ rằng có thể hàm lượng nitơ ở gan và cơ giảm theo kiểu hai kỳ, trong đó kỳ đầu giảm trong vòng 24 giờ (có hồi phục tạm thời), sau đó ổn định ở mức thấp cho tới ngày thứ 30 Trong cơ thể, DCDS tạo thành phức hợp các protein alkyl hóa, dẫn tới thay đổi cấu trúc và làm mất chức năng của chúng

Những phân tử này sẽ bị loại bỏ - chủ yếu nhờ enzym (protease), đồng

thời có sự tổng hợp bù đắp để duy trì ổn định về cấu trúc và chức năng cho các mô cơ quan Tuy nhiên, trong nhiễm độc DCDS, cả ADN có thể cũng bị tổn thương Chúng tôi cho rằng, giảm hàm lượng protein còn liên quan đến những rối loạn chuyển hóa chung, trong đó cạn kiệt NAD+ sớm gây ức chế đường phân, tăng giải phóng các enzym tiêu hủy protein nội bào, tăng tiêu thụ protein vào chuyển hóa năng lượng

- Ảnh hưởng tới hàm lượng thành phần carbonyl protein Kết quả hàm lượng carbonyl trong gan và cơ cho thấy, DCDS có tác động gây tổn thương protein do tăng gánh nặng oxy hóa khá sớm và tình trạng này còn kéo dài tới ngày thứ 30 Nguyên nhân của hiện tượng này theo các tài liệu là do mất cân bằng giữa sự hình thành và khả năng trung hòa các ROS (tăng tạo gốc tự do oxy hóa và chủ yếu do giảm GSH)

- Ảnh hưởng tới thành phần protein theo kích thước phân tử

So sánh kết quả về kích thước và khối lượng tương đối của các thành phần chính trong mẫu gan giữa các nhóm và giữa các thời điểm chưa phát hiện thấy có sự thay đổi khác lạ nào đáng kể Đối với mẫu cơ,

ở ngày thứ nhất có phát hiện một thành phần khác biệt ở cả 3 nhóm nhiễm độc, kích thước 32,2 kDa, khối lượng khoảng 1,4% Đây có thể là

sự thay đổi kích thước (cả tăng do gắn thêm các đoạn peptid hoặc giảm

do phân tử bị phân cắt) của thành phần nào đó Do mẫu chứa quá nhiều

thành phần nên riêng bằng điện di (SDS-PAGE) chỉ có thể khẳng định

những thay đổi tương đối lớn về kích thước và trọng lượng phân tử

protein

Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hoạt độ peroxidase và hàm lượng

nhóm -SH trong gan động vật

Ở ngày thứ nhất, hoạt độ POD gan nhóm DCDS có xu hướng tăng

cao, đồng thời hàm lượng carbonyl protein cũng tăng đáng kể Điều này

gợi ý rằng, gánh nặng oxy hóa tăng rất sớm, và đáp ứng tăng hoạt độ

POD có thể đã xảy ra ngay trong 24 giờ đầu, đến thời điểm phân tích thì

đã bắt đầu có ức chế tổng hợp gây giảm dần hoạt độ enzym này (cũng

như các enzym chống oxy hóa khác; Husain, 1996), phù hợp với kết quả

hàm lượng nitơ trong gan và cơ vân ngày thứ nhất

Hàm lượng nhóm -SH giảm ở ngày thứ 7, 15 và 30 do DCDS gây

alkyl hóa các nhóm chức của axit amin và protein trong đó có nhóm

-SH, do tăng mạnh các gốc tự do oxy hóa, và cũng có thể do các rối loạn

chuyển hóa protein do alkyl hóa các acid nucleic ở gan Nhiều nghiên

cứu cũng đã chứng minh một cơ chế chủ yếu khử độc DCDS trong cơ

thể là liên hợp với GSH và cystein, những chất khử giàu -SH, vì thế

giảm hàm lượng -SH là kết quả hợp lý, phản ánh sự tham gia của các

protein, enzym chứa nhóm chức này trong quá trình chuyển hóa chất độc

(Gautam A., 2006) Hoạt độ POD trong gan chuột nhóm DCDS có

tương quan thuận rất chặt chẽ với với hàm lượng nhóm -SH (r = 0,97, p

< 0,001) Tương quan này gợi ý tới khả năng giảm các dạng hoạt động

của POD phụ thuộc GSH (GPx) Trong điều kiện có tăng gánh nặng oxy

hóa, cơ thể thường có đáp ứng tăng hoạt độ POD để đối phó Nhưng ở

đây, phản ứng này có thể không xảy ra do tác động ức chế tổng hợp

protein nói chung của DCDS Khả năng này được củng cố bằng tương

quan thuận rất chặt chẽ giữa hoạt độ POD và hàm lượng nitơ trong gan (r = 0,79; p < 0,001)

Ảnh hưởng của diclodietyl sulfid tới hàm lượng ADN trong cơ vân và

gan

Hàm lượng ADN trong gan và cơ giảm là do phản ứng tiêu hủy các ADN bị tổn thương, do loại bỏ các tế bào hoại tử DCDS là chất độc gây alkyl hóa ADN trong nhân tế bào, dẫn tới các tổn thương như đứt chuỗi (đứt chuỗi đơn hoặc đứt đoạn), đột biến, tạo ADN dị hình Giảm hàm lượng ADN cũng có thể liên quan đến chết tế bào theo chương trình do DCDS Hàm lượng ADN trong gan và cơ vân giảm ở các thời điểm khác nhau có thể liên quan đến quá trình phân bố của DCDS

4.2 Tác dụng của natri thiosulfat đơn thuần và kết hợp naturenz trong điều trị nhiễm độc diclodietyl sulfid

Tác d ụng của thuốc điều trị trên các chỉ tiêu tỷ lệ sống sót, thể trọng và

tr ọng lượng gan, thận, lách

Phù hợp với các tài liệu kinh điển về điều trị NĐ DCDS, natri thiosulfat đã làm tăng được tỷ lệ chuột sống sót ở các thời điểm Điều trị kết hợp thêm naturenz không mang lại hiệu quả đáng kể, song dường như sau ngày thứ 15, chuột không bị chết thêm như khi chỉ dùng natri thiosulfat đơn thuần Mặc dù không loại trừ hoàn toàn được sự giảm thể trọng, song naturenz hạn chế đáng kể được ảnh hưởng này của DCDS, đồng thời giúp thể trọng hồi phục sớm hơn Cơ chế có thể là nhờ tác dụng hỗ trợ chống độc của naturenz (hạn chế rối loạn chuyển hóa, chống oxy hóa, làm tăng đường máu, protein máu và hàm lượng -SH)

So sánh thống kê cho thấy, điều trị bằng natri thiosulfat đơn thuần hạn chế được thay đổi trọng lượng gan chỉ ở ngày thứ 7, song cần lưu ý rằng đây cũng là thời điểm có thay đổi sâu sắc nhất Điều trị bằng natri