Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu Enzym 21-Hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh

Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu Enzym 21-Hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh

trường đại học y hμ nội

Phản biện 1 : GS.TSKH Phan Thị Phi Phi Phạm Gia Khánh

Phản biện 2 : GS.TS Nguyễn Thu Nhạn GS TS Đỗ Kim Sơn

Phản biện 3 : TS Nguyễn Trần Chiến GS TS Phạm Duy Hiển

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước tại Trường Đại học Y Hà Nội

Vào hồi 14 giờ 00 ngày 06 tháng 06 năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội

- Thư viện Thông tin Y Trung ương

- Thư viện Bệnh viện Trung ương Huế

- Thư viện Đại học Y khoa Huế

Một số công trình liên quan đến luận án

1 Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng, Bùi Phương Thảo (2005),

“Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh tăng sản thượng thận bẩm

sinh ở trẻ gái”, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 35(2), tr 99-104

2 Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thị Thương Lan

(2005), “Một số đột biến gen CYP21 và liên quan giữa kiểu kiểu hình của bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh”, Hội nghị khoa học toàn quốc 2005, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản, hướng 8.2, Bộ Khoa học Công nghệ, tr 8-11

gen-3 Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Trần Kiêm Hảo

(2005), “Kết quả điều trị bệnh TSTTBS trong 10 năm 1993-2002

tại BV Nhi Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 38(5), tr

195-9

(2006), “ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện một số đột biến gen

CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu

21-hydroxylase”, Nhi khoa, tập 14(số đặc biệt), tr 184-8

đặt vấn đề

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một trong những bệnh thuộc hội chứng sinh dục thượng thận, đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt tính một trong các enzym cần thiết sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận Thiếu enzym 21-hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất, chiếm 90-95% tất cả các trường hợp TSTTBS

Đột biến gen CYP21 gây nên thiếu hụt enzym 21-OH, bệnh di

truyền đơn gen lặn, thuộc nhiễm sắc thể thường Hiện nay, khoảng

10-15 kiểu đột biến CYP21 là hay gặp ở hầu hết các quần thể

Tuỳ mức độ thiếu hụt hoạt tính enzym 21-OH mà biểu hiện lâm sàng ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau như mất muối (mất muối), nam hoá đơn thuần (NHĐT) hay thể không cổ điển (KCĐ)

Bệnh TSTTBS nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp

sẽ dẫn đến suy thượng thận cấp đe dọa tử vong; nam hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh dục, sinh sản của bệnh nhân (BN), tâm lý của gia đình

và bệnh nhi khi lớn lên

Điều trị bệnh TSTTBS dựa vào liệu pháp hormon thay thế suốt đời

Dự phòng bệnh bằng cách sử dụng các biện pháp phòng bệnh di truyền như sàng lọc phát hiện người lành mang gen bệnh, tư vấn di truyền tiền hôn nhân, khi mang thai cho những người mang gen bệnh và chẩn

đoán trước sinh cho con

ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về tỉ lệ mắc bệnh này Tại khoa Nội tiết – Di truyền – Chuyển hoá Bệnh viện Nhi Trung ương, số lượng bệnh nhân TSTTBS vào viện ngày càng tăng, trung bình 28 trường hợp / năm từ 2000-2004 Việc ứng dụng kỹ thuật phản ứng

chuỗi trùng hợp PCR để xác định các đột biến gen CYP21 gây bệnh

TSTTBS thiếu 21-OH chỉ mới được đề cập qua 2 công trình nghiên cứu

của V T Kim Huệ và T T Nam Do vậy, cần phải tiếp tục nghiên cứu sâu hơn vấn đề này

Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh" với các

mục tiêu sau:

1 Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

2 Đối chiếu, tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân TSTTBS do thiếu enzym 21-hydroxylase

3 Phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên của gia

đình bệnh nhân thiếu enzym 21-hydroxylase

Chương 1

tổng quan tμi liệu

1.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng gen CYP21

1.1.1 Vị trí, cấu trúc gen CYP21

Gen CYP21 là thành viên của nhóm Cytochrome P450c21 Gen CYP21 gồm 2 bản sao, một bản có chức năng (CYP21 hay CYP21B)

và bản sao còn lại không có chức năng (CYP21P hay CYP21A)

Gen CYP21 và CYP21P nằm bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ

Hình 1.4 Vị trí của gen CYP21 bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ yếu MHC trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen xung quanh CYP21 Như vậy, thứ tự phân bố của các gen này như sau: RP1-C4A- CYP21P-TNXA-RP2-C4B-CYP21-TNXB (Hình 1.4)

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của gen CYP21

Mỗi gen CYP21 và CYP21P gồm 10 exon, chiều dài 3,4 kb Trình

tự nucleotide của 2 gen này tương đồng 98% ở các exon và 96% ở các

intron Gen CYP21P không hoạt động do mang một số đột biến ở vùng

điều khiển hoặc do đột biến trầm trọng ở các vùng mã di truyền

1.1.2 Chức năng gen CYP21

Gen CYP21 mã hoá enzym 21-OH gồm 494 acid amin

Quá trình tổng hợp enzym 21-OH của vỏ thượng thận như sau: đầu

tiên gen CYP21 phiên mã tổng hợp phân tử ARNm tiền thân Phân tử

này trải qua quá trình cắt các intron, nối chính xác các exon với nhau

để tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh Phân tử ARNm hoàn chỉnh được

sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH

Enzym 21-OH cùng với các enzym cholesterone desmolase, hydroxysteroid dehydrogenase, aldosterone synthase và 17β-OH tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận (Hình 1.2)

3β-1

Vị trí bắt đầu sao mã “cap site”

1.2 Sinh lý bệnh của TSTTBS

Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển progesteron thành deoxycorticosteron (DOC) và 17-Hydroxyprogesteron (17-OHP) thành 11-deoxycortisol

11-Hình 1.7 Sơ đồ rối loạn sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu enzym 21-OH

Khi thiếu enzym 21-OH, progesteron không thể chuyển thành DOC

và 17-OHP không thể chuyển thành 11-deoxycortisol (Hình 1.7) Hậu quả là quá trình tổng hợp aldosteron và cortisol bị khiếm khuyết, gây ứ

đọng các tiền chất trước chỗ tắc là progesteron, 17-OHP Qua cơ chế

điều hòa ngược sẽ kích thích tăng bài tiết ACTH, từ đó tăng sản xuất các hormon theo con đường không bị tắc (testosteron)

đặc hiệu như giảm khẩu vị, nôn, li bì và không tăng cân

Ngoài ra, bệnh nhân còn có xạm da, trẻ gái có thể phì đại âm vật và trẻ trai có thể to dương vật

1.3.2 Nam hoá đơn thuần

Thiếu enzym 21-OH ở mức độ vừa phải (1-3%) nên quá trình tổng hợp cortisol, aldosteron vẫn còn

Trẻ gái biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài Biểu hiện nam hoá thường có ngay sau khi đẻ, âm vật to, các môi có thể dính với nhau Chiều cao và tuổi xương phát triển nhanh Từ 10-11 tuổi, trẻ ngừng lớn và đạt chiều cao cuối cùng 140-150 cm Khi trưởng thành bệnh nhân thường có thân hình giống đàn ông, phát triển tuyến vú

kém, rối loạn chức năng buồng trứng và không có kinh nguyệt

ở trẻ nam, cường androgen diễn ra nhanh bắt đầu từ 2-3 tuổi, gồm các dấu hiệu dậy thì sinh dục phụ sớm như mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng cá và giọng trầm Đồng thời dương vật to nhanh, thường cương cứng, tinh hoàn vẫn nhỏ tương ứng với tuổi Chiều cao

và tuổi xương phát triển mạnh, từ 8-10 tuổi trẻ ngừng lớn Một số trẻ nam không được điều trị có thể có vết tích vỏ thượng thận đã tăng sản

1.4 Một số đột biến gen CYP21 và liên quan kiểu gen kiểu hình

Hầu hết các đột biến gen gây thiếu 21-OH là hậu quả của một trong

2 kiểu tái tổ hợp giữa 2 gen CYP21 và CYP21P: trao đổi chéo qua lại

không tương xứng trong quá trình gián phân gây mất đoạn gen; hay

chuyển đoạn gen khiến các đột biến từ CYP21P chuyển sang CYP21

Hình 1.8 Vị trí các đột biến gen CYP21 thường gặp và kiểu hình

Không cổ điển

Nam hoá đơn thuần

Mất muối

Đột biến gen CYP21 có thể chia thành 4 nhóm tùy thuộc vào mức

độ hoạt tính 21-OH

Nhóm thứ nhất (nhóm A) bao gồm các đột biến gen CYP21 trầm

trọng như mất đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa, dịch khung (như mất 8bp ở exon 3, đột biến điểm I2g ở intron 2 ) làm mất hoàn toàn hoạt tính 21-OH; thường liên quan với thể MM của bệnh, bất kể kiểu gen là đồng hợp tử hay dị hợp tử đột biến

Nhóm thứ hai (nhóm B) chủ yếu là đột biến nhầm nghĩa Ile172Asn, khiến cho hoạt tính 21-OH chỉ còn 1-2% và được tìm thấy đặc trưng ở thể NHĐT

Nhóm thứ ba (nhóm C) bao gồm những đột biến như Val281Leu, Pro30Leu và Pro453Ser tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 20-60%; những đột biến này liên quan đến thể bệnh không cổ điển

Nhóm thứ tư (nhóm D) bao gồm các đột biến chưa được sắp xếp còn lại và các đột biến mới

1.5 Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Phản ứng PCR do Kary Mullis và cs phát minh năm 1985 PCR cho phép nhân một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome đạt đến số lượng mong muốn khi biết trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép ADN Các bước cơ bản của phản ứng PCR được mô tả bởi hình 1.9 Mỗi chu

kỳ phản ứng đòi hỏi 3 bước:

+ Biến tính (denaturation): Phân tử ADN được xử lý ở nhiệt độ cao

để tách ADN khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thường là 94-950C + Gắn mồi (annealing): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy

Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn ADN khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung

+ Tổng hợp bởi Taq-polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4 loại dNTP để kéo dài sợi mồi, tổng hợp sợi ADN mới

3 bước cơ bản tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR Khi các chu

kỳ được lặp lại, các đoạn ADN vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn cho chu kỳ sau Số lượng phân tử ADN tạo ra tăng gấp

đôi sau mỗi chu kỳ Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường không quá 60

Hình 1.12 Các bước cơ bản của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

Khuếch đại gen CYP21 bằng PCR

Do giả gen CYP21P có tính tương đồng cao, việc khuếch đại gen CYP21 không dễ thực hiện Các mồi phải được chọn lựa để nhận biết các trình tự ở CYP21 mà không có ở CYP21P Hầu hết các tác giả đều sử dụng 2 đoạn mà ở đấy CYP21 khác với CYP21P Đó là đoạn 8 bp ở exon

3 của CYP21 (nhưng đã bị mất ở CYP21P) và một số các đột biến ở exon 6 (gồm các khác biệt 4 nucleotide giữa CYP21 và CYP21P) Bằng phương thức này, gen CYP21 có thể được khuếch đại thành 2 đoạn gối

chồng lên nhau (Hình 1.13)

Hình 1.13 Hai đoạn gen CYP21 được khuếch đại gối lên nhau

Sau khi khuếch đại, nhiều phương pháp khác nhau giúp phát hiện

đột biến gen có thể được sử dụng, như kỹ thuật lai oligonucleotide đặc hiệu allen, phản ứng PCR đặc hiệu allen, phản ứng phát hiện sự nối, xác định trình tự nucleotide

Chương 2

đối tượng vμ Phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng

2.1.1 Bệnh nhân

43 bệnh nhi được chẩn đoán và điều trị TSTTBS do thiếu enzym

21-OH cổ điển tại Khoa Nội tiết - Di truyền - Chuyển hoá Bệnh viện Nhi Trung ương, thời gian nhập viện từ năm 1993-2003 Chẩn đoán dựa vào lâm sàng, sinh hoá và hormon:

Sinh hoá:

- Nồng độ progesterone > 1,1 nmol/l và 17-OHP máu > 6 nmol/l

- Nồng độ testosterone máu > 1 nmol/l và 17-CS nước tiểu > 14 μmol/24giờ

- Điện giải đồ rối loạn ở thể MM, natri máu < 133 mmol/l và kali máu > 5,2 mmol/l Điện giải đồ bình thường ở thể NHĐT

2.1.2 Thành viên gia đình bệnh nhân

Chọn 5 gia đình có con bị bệnh đã được thực hiện PCR phát hiện

đột biến gen CYP21, các thành viên này gồm bố mẹ anh chị em ruột

vỡ màng tế bào và giải phóng ADN ra khỏi nhân

Sau khi ly tâm 5 phút, sẽ thu được ADN khuôn cho phản ứng PCR

2.2.1.3 Quy trình thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng PCR sử dụng một số cặp mồi đặc hiệu đối với một số đột

biến gen CYP21 hay gặp Trình tự các cặp mồi được thiết kế dựa vào trình

tự gen CYP21 đã được xác định và do hãng Proligo Nhật Bản sản xuất

Hình 2.1 Minh họa vị trí gắn các cặp mồi PCR trên gen CYP21 Trong đó, P1/P2 và P7/P8 là 2 cặp mồi để phát hiện đột biến điểm I2g

ở intron 2; A1/A2 hoặc hai cặp mồi P1/P2, P9/P10 dùng để phát hiện

đột biến mất đoạn 8bp ở exon 3; B1/B2 là cặp mồi dùng để phát hiện

đột biến Pro30Leu ở exon 1

Thành phần của mỗi phản ứng PCR gồm ADN khuôn, hỗn hợp 4 loại dNTP, dung dịch đệm MgCl2, các mồi, Taq polymerase và nước cất

nested-PCR Δ8bp

A1x B1x

P1x

wA2 wB2

Bảng 2.1 Trình tự các mồi và điều kiện khuếch đại PCR

(nucleotide đã sửa đổi được gạch dưới)

Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi P1/P2 và P7/P8 được cắt bởi enzyme

giới hạn HhaI và sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bởi enzyme giới hạn AciI

Sản phẩm PCR cuối cùng sẽ được điện di trên thạch sieve 3:1 nồng độ 4% Tuỳ độ dài các băng ADN thu được sẽ cho biết

agarose/nu-BN có đột biến gen CYP21 hay không (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Kích thước các đoạn ADN được cắt bởi enzym giới hạn

2.2.2 Đối chiếu kiểu đột biến gen và đặc điểm kiểu hình

Các BN có kết quả đột biến gen CYP21 sẽ được chia thành các

nhóm theo từng kiểu đột biến gen và đối chiếu với các triệu chứng lâm sàng MM hay NHĐT cũng như các xét nghiệm sinh hóa Từ đó xác

định mức độ nặng nhẹ của từng kiểu đột biến gen CYP21

2.2.3 Phát hiện người lành mang gen cho các thành viên gia đình

Tiến hành phản ứng PCR để phát hiện tình trạng mang gen CYP21

đột biến cho các đối tượng này với quy trình như đã nêu (Phần 2.2.1) Thăm khám tiền sử gia đình và lập sơ đồ gia hệ

Phân tích kết quả của từng kiểu đột biến gen CYP21 đối với BN và

các thành viên gia đình, từ đó nhận xét phương thức di truyền của bệnh

2.3 Xử lý kết quả

Sử dụng phần mềm vi tính Epi Info 6.04 và các phương pháp thống

kê y học thông thường trong xử lý và phân tích số liệu

Chương 3 – 4

Kết quả nghiên cứu vμ bμn luận

43 BN của 41 gia đình được chẩn đoán bệnh TSTTBS do thiếu enzym 21-OH 10 bố mẹ của 5 gia đình BN TSTTBS

Qua phân tích số liệu, chúng tôi thu được kết quả sau:

1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu

đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS, gen lặn nhiễm sắc thể thường

1.3 Tuổi bệnh nhân lúc vào viện lần đầu

Trung bình đối với BN TSTTBS là 1,5 tháng (5 ngày - 80 tháng)

Thể MM là 1,3 tháng (5 ngày-19 tháng); sớm hơn có ý nghĩa so với NHĐT là 22,0 tháng (2 tuần-80 tháng), p < 0,001

1.4 Tiền sử sản khoa và tiền sử gia đình

- 31/34 = 91,2% BN có tuổi thai đủ tháng ≥ 38 tuần

- Cân nặng lúc sinh của BN thể MM (3080 ± 427 gr) tương đương thể NHĐT ( 3166 ± 280 gr), p > 0,05

- 48,8% là con thứ hai (21 BN)

- 20,9% BN có tiền sử gia đình có con mắc bệnh tương tự

2 Kết quả phát hiện các đột biến gen CYP21 trên BN

Với một số cặp mồi đặc hiệu cho một số đột biến gen CYP21, thực

hiện PCR kết hợp enzym cắt giới hạn, chúng tôi đã phát hiện được 24

trường hợp đột biến gen CYP21; chiếm 55,8% 19 trường hợp chưa

phát hiện được kiểu đột biến gen; chiếm 44,2% Cụ thể như sau:

2.1 Đột biến điểm ở intron 2 (I2g)

Hình 3.4 Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi P1/P2 và P7/P8 sau khi

điện di trên thạch agarose /nu-sieve

A Trước khi cắt bởi HhaI, sản phẩm PCR chỉ có một băng ADN 378 bp

B Kết quả sản phẩm PCR sau khi cắt bởi enzym HhaI:

Cột 1, 5, 6, 7 chỉ có 1 băng ADN 354 bp, đồng hợp tử đột biến I2g Cột 2, 4 chỉ có 1 băng ADN 378 bp, không mang đột biến I2g

Cột 3, 8 hiển thị cả 2 băng ADN 378 bp và 354 bp, tức dị hợp tử đột biến I2g M-marker ADN φ 174/HaeIII.

Phát hiện 6 trường hợp đồng hợp tử I2g; chiếm 13,9% 7 trường hợp

dị hợp tử I2g; chiếm 16,3% số BN

378 bp

354 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Tỉ lệ allen đột biến I2g là [(6ì2)+(7ì1)]/(43ì2) = 22,1%

Các nghiên cứu khác nhau cho thấy I2g là một trong những kiểu

đột biến gen CYP21 thường gặp và là đột biến điểm thường gặp nhất của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS cổ điển

Tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên phát hiện đột biến điểm I2g Trên thế giới, đột biến này đã được tìm thấy từ năm 1988 bởi Higashi và cộng sự (cs)

Nhiều tác giả phát hiện đột biến điểm I2g với tỉ lệ tương tự kết quả của chúng tôi, theo Bachega và cs ở Brazil, tỉ lệ I2g là 20,6% Hay Tukel và cs ở Thổ Nhĩ Kỳ, là 22,5% Tại Tây Ban Nha là 20%

2.2 Mất đoạn 8bp ở exon 3 (Δ8bp)

Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi A1/A2 trên thạch agarose/nu-sieve

Cột 1, 3, 6, 10, 11, 12 hiển thị cả 2 băng ADN 158 bp và 150 bp với

giảm so với băng 150 bp M-marker ADN φ 174/Hae III

Với phương thức này, phát hiện 9 trường hợp đồng hợp tử đột biến mất đoạn 8bp; chiếm 20,9% số BN nghiên cứu

Đối với những trường hợp nghi ngờ dị hợp tử mất đoạn 8bp, chúng tôi kiểm tra mẫu ADN khuôn bằng cách thực hiện phản ứng nested-PCR sử dụng 2 cặp mồi P1/P2 và P9/P10

158 bp

150 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M